Sekvenciranje DNK
-
Upload
sanja-zukic -
Category
Documents
-
view
594 -
download
3
description
Transcript of Sekvenciranje DNK
![Page 1: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/1.jpg)
SEKVENCIRANJE DNK
Savremene metode oplemenjivanja biljaka
Sanja Zukić
![Page 2: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/2.jpg)
Sekvenciranje
Sekvenciranje u genetici je metoda kojom je moguće utvrditi redoslijed pojedinih gradivnih elemenata u velikoj molekuli.
Kod DNK i RNK utvrđuje se redoslijed nukleotida, a kod bjelančevina uvrđuje se redoslijed aminokiselina.
Između ostalog sekvenciranje se već počinje značajno koristi u modernoj dijagnostici.
Izmedju ostalog, posebno u dijagnostici rizika od nasljednih bolesti.
Da li neki potomak u svojim genima nosi promjenu naslijeđenu od predaka, a koja može značiti razvoj određene nasljedne bolesti.
![Page 3: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/3.jpg)
Sekvenciranje DNK
Sekvenciranje DNK je svojevrsan početak istrazivačke revolucije na polju genomike.
Od 1995 godine do danas je na taj način sekvenciran genom 330 različitih organizama među kojima je i čovjek.
Dešifriranje "otključavanje" genetičkog koda direktno na "izvoru", naime na nivou DNK je za naučnika uvijek jedan poseban poduhvat.
Ako je DNK sekvenca poznata, moći će se uz pomoć znanja o genetskom kodu direktno odrediti sekvenca aminokiseline kodiranog genprodukta - proteina.
![Page 4: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/4.jpg)
Do danas je razvijeno više metoda određivanja sekvenci DNK.
Ranije je to bilo veliki i skup poduhvat, dok se modernim metodama sekvenciranje danas odvija skoro automatski.
Dvije najznačajnije metode DNK sekvenciranja su:
1.Frederick Sanger tehnika elegantno koristi prirodni tok replikacije kao uzorak za sekvenciranje i ona je jos uvijek dominantno prisutna.2. Maxim-Gilbert tehnika u principu se bazira na hemijskom razlaganju pojedinih baza i u ovom trenutku je vise interesantna u povjesnom trenutku jer se sve rjeđe koristi.
Frederic Sanger:Nobelova nagrada za hemiju1980.
![Page 5: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/5.jpg)
Sanger sekvenciranje
Sanger je naime razvio dvije metode sekvenciranja nukleinskih kiselina.
Ovdje ćemo prikazati jednu od njih - dezoxi metodu koja se pojavila 1977. godine.
DNK replikacija se odvija uz pomoć DNK polimeraze koja se "ugrađuje u rastući drugi niz DNK nasuprot ležećem polinukleotidnom lancu (matrici).
Međutim ako se umjesto priorodnog nukleotida u postupku replikacije koristi kao prethodnik (2´3´DidezoxyNTP = 2´3´ddNTP), onda će nakon njegove ugradnje replikacija niza biti zavrsena.
![Page 6: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/6.jpg)
![Page 7: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/7.jpg)
To znači da nakon njega neće biti više nijedan nukleotid ugrađen u niz (lanac).
Na ovom mjestu će nastati prekid lanca. Za svaku bazu G,T,C, ili A postoji jedan
odgovarajuci 2´3´ddNTP. Dodamo li "mješavini koja se sekvencionira"
- DNK polimerazu, jean lanac polinukleotida jedne DNK, te neophodna 4 odgovarajuće dNTPs, te dodatno jedan ddNTP /npr ddTNP), nakon reakcije će nastati serija DNK lanaca od kojih se svaki završava jednim dezoxi-T.
![Page 8: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/8.jpg)
Da bi se odredile sve četiri baze biti će naravno provedena četiri različita reakcijska postupka.
Pri tome će se dobiti dijelovi lanaca (nizovi) različite dužine sa odgovarajućim prisutnim bazama.
Na kraju ćemo u svakom reakcijskom postupku elektroforezom u veoma finom acryamidnom gelu selektirati prisutne DNK nizove različite dužine.
Ovaj gel ima vrlo veliku rezoluciju tako da je moguće odvojiti DNK nizove jedan od drugog čak kada se oni razlikuju samo u jednom nukleotidu.
![Page 9: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/9.jpg)
Nizovi (lanci) DNK će biti vidljivi tek što po svakom reakcionom postupku budu radioaktivno markirani.
Ako se prema radioaktivno markiranom genetskom materijalu izloži (eksponira) rendgenskom filmu, moći ćemo na njemu u vidu crnih linija (traka) uočiti zapise radioaktivnih DNK nizova.
Ako je npr. kod jednog takvog niza baza A-adenin na pozicijama 45,60 i 81 onda će se i na filmu pojaviti crne linije (trake) te veličine.
Time će biti dokazano da na toj poziciji u sekvenci DNK stoji adenin.
Ako se umjesto radioaktivnog ddATP u reakcionom postupku koristi radioaktivno ddGTP te sadrži nizove dužine npr. 76,97 i 123 značiti će da se na tom mjestu nalazi baza guanin.
![Page 10: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/10.jpg)
Tako se pozicija pojedinačne baze može odrediti na osnovu pozicije označene na rendgenskom filmu u vidu crnih traka.
Za očitavanje vrijednosti su razvijeni kompjuterski programi tako da je i taj postupak veoma ubrzan i sa velikom tačnošću.
Kod Sanger metode moramo još uzeti u obzir komplementarnost baza: Ako je A ugrađen, onda je naravno osnova na originalnom DNK nizu T.
![Page 11: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/11.jpg)
dNTP
ddNTP
Sekvenciranje DNK Sanger - ovom metodom
![Page 12: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/12.jpg)
Reakcije sekvenciranja DNK slična je PCR reakcijama!
U reakcionoj smesi se nalaze: templatna DNK, Taqpolimeraza, dNTP, 5% ddNTP-a, i “prajmer”(malo parče jednolančane DNK, 20-30 nukleotida, koja se hibridizuje sa templatnom DNK).
Reakcija započinje zagrijavanjem
![Page 13: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/13.jpg)
![Page 14: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/14.jpg)
+ 5% ddNTP
![Page 15: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/15.jpg)
DNK replikacija u prisustvu 5% ddNTP
U reakcionoj sjmesi se nalazi pored sva 4 dNTP-a,5% ddNTP-a (prajmer ddTTP na slici desno)
Polimerizacija će se završiti kada se dodati ddNTP nađe na rastućem kraju (replikacija ide u smijeru 5’ka 3’).
![Page 16: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/16.jpg)
Gel elektroforegram fragmenata DNK razdvojenih po veličini
![Page 17: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/17.jpg)
Automatsko sekvenciranje DNK : svaki ddNTP je obilježen fluorescentnom bojom
![Page 18: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/18.jpg)
Gel elektroforegram
![Page 19: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/19.jpg)
Sirovi podaci automatskog sekvenciranja DNK
Zeleno: ddATP Crveno: ddTTP Žuto: ddGTP Plavo: ddCTP
![Page 20: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/20.jpg)
![Page 21: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/21.jpg)
Maxim-Gilbret metoda
Maxim-Gilbret metoda (razvijena 1977. godine) se bazira na hemijskoj razgradnji vlastitih baza. Kao prvo, jedan od krajeva DNK mora biti radioaktivno markiran. Zatim će u četiri različite reakcione posude biti realizirani postupci specifičnih razgradnji baza.
Za svaku bazu postoji specifična organsko-hemijska reakcija koja će bazu specifično razgraditi i time će, nakon još jedne hemijske reakcije koja slijedi, izazvati prekid u DNK lancu (nizu).
Ponovno će biti dobiveni fragmenti DNK čije će veličine biti tačno određene u procesu DNK gelelektroforeze.
![Page 22: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/22.jpg)
Na osnovu sekvenci baza jedne DNK, moguće je saznati sastav pripadajućeg proteina.
Pošto se DNK sekvenciranje odvija brže nego sekvenciranje proteina, danas je najčešće moguće brže upoznati (dešifrirati) sekvence proteina putem DNK sekvenciranja, nego sto je to moguće postići direktnim sekvenciranjem proteina.
DNK sekvenciranje je do danas toliko uznapredovalo, tako da je genetski materijal mnogih organizama već u potpunosti sekvenciran (npr. mnoge bakterije, kvasci, a početkom 2004. godine dešifriran je i genom čovjeka.
![Page 23: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/23.jpg)
Centri za sekvenciranje DNK
Izolovanje DNK Razdvajanje uzoraka
Roboti za sekvenciranje
Soba sa mašinama za sekvenciranje Labaratorija
![Page 24: Sekvenciranje DNK](https://reader030.fdocument.pub/reader030/viewer/2022033013/55cf9afc550346d033a44969/html5/thumbnails/24.jpg)
HVALA NA PAŽNJI!!!!!