1

llati sejtek- hossz ideig l, ritkn, vagy egyltaln nem osztd sejtek, pl: neuronok

- rvid ideig l sejtek pl. blhmsejtek

Proliferci differencici sejthall: nerzis, vagy apoptzis

Sejtciklus- olyan esemnyek sorozata, mely a sejt duplikldshoz vezet, minden eukaritban hasonlan trtnik

- szablyozsnak zavara tumorkpzdshez vezet kikerl a sejt a kontroll all

Az idegrendszerben is vannak ssejtek s osztd sejtek, kis szmban, de a legtbb neuron differencilt, nem osztdik, csak elpusztul

A ktszveti fibroblasztok tipikusan nem osztd sejtek, de aktivlva jra belphetnek a sejtciklusba.

Tanulmnyozs: elszarusod laphm br pldjn

- als, bazlis rteg: osztdkpes epithelilis ssejtek az alkalmanknt osztd sejtbl az egyik utdsejt stem sejt marad, a msik gyorsan osztd sejtt alakul az sszes rteg sejtjeit ezek lltjk el, melyek a felszn fel haladva differencildnak, majd elhalnak

Sejtbiolgia - llati sejtek

Biolgia MSc

A sejtciklus fzisaiA sejtciklus lnyege: 2 db, a szli sejttel teljesen azonos utdsejt ltrehozsa

- M fzis mitzis s citokinezis: a tulajdonkppeni sejtosztds kt egyenrtk utdsejt ltrehozsa

- interfzis: a sejtosztdsok kztti intervallum. 3 szakasza:

- G1 (first gap) fzis: mitzis s a DNS replikci kztti szakasz

- S (synthetic) fzis: DNS replikci

- G2 (second gap) fzis: DNS replikci s a mitzisba val belps kztti szakasz

- G0 fzis: tbbsejtek differencilt sejtjei nem osztdnak tovbb, G0 fzisba lpnek

Ellenrz pontok, checkpoint: olyan pontok, ahol a kls hatsok szablyozni tudjk a sejtciklus egyes szakaszaiba val t- vagy belpst, illetve az apopttikus folyamatok beindulst.

2

Ellenrz pontok, checkpointBiokmiai szablyz krk, melyek detektljk a krnyezetbl rkez jeleket, illetve a sejtciklus sorn keletkez hibkat s gtoljk a sejtciklus tovbbi lpseit. 4 f ellenrzpont van:

1) restrikcis pont: a G1 fzisban a sejt letfolyamataira, s az t krlvev extracellulris mtrixxal val kapcsolatokra rzkeny: ha a sejt nem kap megfelel nvekedst serkent stimulust a krnyezetbl, nem lp tovbb a G1 fzisbl, apoptotizlhat.

2) a DNS krosodst ellenrz pont jelen van a G1, S, s a G2 fzisokban is gtoljk a sejtciklusban valtovbblpst, s/vagy apoptzist induklnak

3) DNS replikcis ellenrz pont a nem replikldott DNS-eket, vagy a replikci sorn megrekedt replikcis villkat rzkeli sok tekintetben hasonl a DNS krosodst ellenrz ponthoz, de stabilizlva a replikci sorn megrekedt replikcis villkat, elsegtheti azok kijavtst (repair-ban val rszvtel).

4) osztdsi ors sszeszerelst ellenrz pont, vagy metafzis checkpoint: a mitzis alatt kslelteti a kromoszmaszegregcit minaddig, mg minden egyes kromoszma hozz nem kapcsoldik az osztdsi orskhoz.

A G1, S, s G2 fzis ellenrzpontjai ugyanazt a stratgit kvetik.

A DNS krosodst rzkelk detektljk (ataxia-telangiectasia mutated (ATM), ataxia-telangiectasia s Rad9 related (ATR))

transzducereket: lt. protein kinzokat (Chk1 s Chk2), esetleg transzkripcis faktorokat (p53) aktivlnak gtoljk a sejtciklusban val tovbblpst a ciklin-dependens kinzok gtlsn keresztl + egyb hatsok (pl. apoptzis)

A sejtciklus szablyozsaSchizosaccharomyces pombe hasadleszt sejtosztdsnak tanulmnyozsa - cell division cycle-2+ (cdc2+) gn felismerse, ez szksges a G1 S s a G2 M tlpshez. A gn egy 34 kF proteinkinzt, a p34cdc2- kdol.

Minden eukaritban emberben tbb, mint 10 klnbz p34cdc2-homolg protein kinz nhny vesz rszt a sejtciklus szablyozsban regull alegysgk a ciklin ciklin-dependens kinzok (Cdk)

- p34cdc2 - Cdk1: G2 M tmenet szablyozsa llati sejtekben

- Cdk2: G1 S s G2 M tmenet

- Cdk4 s Cdk6: restrikcis pontokon val tmenet szablyozsa

- Cdk7: ms Cdk-k aktivlsa, rszt vesz tovbb az RNs transkripciban, a srlt DNS javtsban

- ms Cdk: transzkripcis szablyzs, neuron difefrencilds, ms Cdk-k helyettestse

Ciklinek:

- ktdsk szksges a Cdk-k katalitikus aktivitshoz

- 35 kD - 130 kD proteinek, hasonl struktra: 5-5 -hlixbl ll 2 szimmetrikus domn az egyik a ciklin-box

- emberben 16 ciklin

3

Ciklin-dependens kinzok aktivitsnak szablyozsa- szigoran szablyzott

- rvid N-terminlis, hossz C-terminlis kzti hasadkban: aktv hely

- 4 aktivl mechanizmus:

ciklin kts konformcivltozs, T hurok elmozduls s foszforilci enzimaktivits stimullsa

ATP-kthely kzeli aminsav oldallncok foszforillsa gtl proteinek bektdse enzimaktivits gtls

ciklin kts csak rszleges aktivls, Cdk-aktivl kinz (CAK): teljes aktivls, foszforillja a Cdk2-cyclin A T hurkot (foszforillhat treonin oldallncrl kapta a nevt). Gerincesekben CAK: Cdk7-cyclin H

Cdk1 s Cdk2 a ciklinen kvl a C-terminlis domnjkn ktnek egy kis Cdc kinz alegysget is (Cks) nveli a szubsztrt felismers, s a Cdk-ciklin-Cks kinz ltal trtn szubsztrt foszforills hatkonysgt. A Cks proteinekfontos szerepet jtszanak ezen kvl a ciklin B s a Cdk gtl p27Kip1 lebontsban

- 2 inaktivl mechanizmus

G2: Myt1, Wee1 protein kinzok Cdk1-hez ktdnek, befolysoljk az ATP ktst s hidrolzist gtl foszforills(reverz hats: Cdc25 foszfatzok)

Cdk kis inhibitoros alegysg: ciklin-dependens kinz inhibitor (CKI Cdk-ciklin A inaktivls), Cdk4 inhibitor (INK4 -Cdk4/6-ciklin D komplex gtls - ATP-kthely zavarsval) csald ktse. A Cdk inhibitoros fehrjk sejtciklus szablyz szerepe fontos a G1 s G0 fzisban

G0 fzis- a tbbsejt ellnyek legtbb sejtje egy bizonyos feladat elvgzsre specializldik, specilis szveti struktrt alkot s tovbb nem osztdik kilp a sejtciklusbl, G0 fzisba lp nem nyugv llapot, csak nem osztdik.

- nem felttlenl vgleges )rk, hetek, lethosszig) bizonyos hatsokra visszalphetnek a sejtciklusba szigoran szablyozott folyamatok, a kontrolllatlan szaporods

tumorkpzdshez vezet

- a szvetekben mind az osztdsok helye, mind az teme

behatrolt ltalban csak az eolpusztult sejtek ptlsa;

szveti srlskor megemelkedhet az osztdsi rta

G0 fzisba val belps- differencildst indt kls hatsokra pl.: TGF- szerint/treonin kinz receptor Smad transzkripcis faktor aktivls fokozza az Ink4 csaldba tartoz Cdk inhibitor p15Ink4b expresszijt Cdk4-ciklin D s Cdk6-ciklin D komplex specifikus gtlsa, ill a Cdk4-ciklin D-hez ktd CKI osztlyba tartoz gtl peptideket leszortva a ktsbl lehetv vlik azok Cdk2-ciklin E komplexhez val ktdse, ami tovbbi sejtciklus-gtlst eredmnyez

Kontakt gtls: ha tl sok a szomszdos sejt, egszsges sejtek TGF--t termelnek, ami CKI inhibitor p27Kip1 peptidenkeresztl felfggeszti a sejtek sejtciklust.

Harntcskolt izomban: MyoD transzkripcis faktor az izomdifferencilds f szablyzja

- kzvetlen krnyezeti hatsok: pl mitognek hinya apoptzishoz, vagy G0 fzisba lpshez vezet

- tl sokszor osztdott sejt (fleg sejttenyszetben), illetve kedveztlen krnyezet regedsi folyamat

4

G0 fzisbl val kilps- kls hats: srls, vagy sejtptls (turnover)

- tanulmnyozs: sejttenyszeteken, pl.: fibroblaszt tenyszet szrummentes tpoldatban: G0 fzis, szrum jelenltben: gyors visszalps a sejtciklusba szvetsrls modellje: a srlt sejtek kzvetlen rintkeznek szrummal. Aktivls hatsra 3 expresszis hullm aktivcis kapu G1 fzisba val visszalps szablyz (restrikcis) pontja:

az 1. tbb, mint korai" gn trdsa miatt lthat, gymint: transzkripcis faktorok (Jun, fos, myc, cink ujj csald) szmos a sejt nvekedsben s osztdsban fontos gn trdst szablyozzk; szveti jrarendezdst indtfaktorok, citokinek (nvekedsi faktorok), extracellulris mtrix komponensek (fibronektin), plazmamembrn receptorok(integrinek), citoszkeletlis proteinek (aktin, tropomiozin, vimentin); angiogenezist, gyulladsos folyamatokat, vralvadst aktivl anyagok ezek elsegtik a fibroblasztok srlt terletek fel vndorlst, a szvetkrosods kijavtmechanizmusok beindulst.

a 2. hullm a kskorai gnek trdsa, ami a sejtciklus S fzisba val lpst biztostja

a 3. hullm a ksi gnek expresszija: S fzisba val belps utn, a sejt nvekedshez, osztdshoz szksges proteinek, pl. ciklin D

A 2. s 3. hullm az 1. fzisban trd gntermkek jelenltt felttelezi.

A tumorkpzdsA daganatokban genetikailag mdosult sejtklnok olyan sejtek populciit hozzk ltre, amelyekre a kontrolllatlan nvekeds jellemz. A sejtek nem tltik be eredeti funkcijukat, vgl hallhoz vezethetnek

Br a rkos megbetegedsek arnya magas, az egyedben vgbemen sejtosztdsok szmhoz kpest sejtszinten alacsonynak mondhat. Oka: tbb genetikai mdosulsnak kell ltalban egyszerre jelen lennie, hogy az egszsges sejt daganatos sejt transzformci vgbemenjen, mivel a sejtciklus folyamatai olyan szigoran szablyozottak. Tbb daganattpusban pont a szablyz mechanizmus srlse, vagy hinya mutathat ki.

Majdnem minden daganattpusnl a sejtosztds zavara a G1 fzisban vgbemen szablyz folyamatok zavarval hozhat sszefggsbe.

Kontakt gtls: megfigyelhet sejttenyszetekben: monolayert kpz sejtek, ha elrik a konfluencit kadherinek osztds gtls

A daganatos sejtek gyakran elvesztik ezt a kontrollt (mutci, vagy daganatkelt vrusok: papillomavrusok, adenovrusok, SV40 gntermkei miatt) s addig nnek, amg van tpllk

Daganatos sejtekKt gncsald aktivitsban van ltalban abnormalits:

- onkognek: sejtnvekedst s osztdst szablyoz gntermkek, tbb, mint 100, lland mitogn stimulcit utnoz hats szablyozatlan sejtosztds. Pl.: Ras MAP/ERK kinz kaszkd ciklin D tltermels, a humn daganatok 15%-nl kimutattk a mutcijt. A Ras nem megfelel aktivldsa miatt a sejt azt hiszi, hogy llandmitogn stimulus ri lland proliferci. A restrikcis pont szablyozsban szerepl proteinek (E2F1, cyclin D (az emlkarcinmk 50%-ban overexpresszlt ), Cdk4) hiperaktivitsa

- tumor szuppresszor gnek (Rb, p16): gntermkeik gtoljk az onkogneket

Rb: restrikcis pont gtlsa, mitogn stimulciig (defektes gn gyerekben: retinoblasztma, felnttben: oszteoszarkma) p16 gn mutcija gyakori daganatos sejtekben

5

ssejtek- embriogenezis sorn a megtermkenytett petesejt els osztdsaival a szervezet sszes testi sejtjv differencildni kpes embrionlis ssejtek csoportja jn ltre - az embri klnbz szveteit, szerveit hozzk ltre. A sejtek egy msik csoportja az embri tpllsra, vdelmre specializldott egyb szvetek kialakulsrt felel.

- az embrionlis ssejtek pluripotensek: szmos osztds, differencilds utn - brmely testi sejt kialaktsra kpesek

- legtbb kifejlett szvettpusban tallhatk, n. szveti, vagy felntt ssejtek (adult stem cell) sejtptls, regenerci

- ssejt: megtartja osztdkpessgt; szimmetrikus s aszimetrikus sejtosztds

- a felntt ssejtek osztdhatnak folyamatosan, pl.: epithelilis ssejtek (br, gyomor-bl traktus), vrkpz ssejtek, nvnyek merisztma sejtjei; ill. lehetnek nyugv llapotban, csak srlskor aktivldnak, pl.: mj, vzizom, IR - nem aktivldnak

Trtneti httr:

1981 - egr embrionlis ssejt derivls

1998 - humn embrionlis ssejt (be nem ltetett in vitro megtermkenytett petesejtekbl szrmaz embrikbl).

2006 - "jraprogramozott ssejtek": specializlt felntt egyedbl szrmaz testi sejtekbl genetikai mdostssal ssejtek ellltsa: induklt pluripotens ssejtek (IPSC).

Az ssejtek kt f csoportja

- embrionlis ssejtek: korai embrionlis fejldsi stdiumban lev morula, vagy 4-5 napos blasztociszta (hlyagcsra) bels sejttmegbl, az epiblasztbl szrmaz sejtekbl tovbbtenysztett sejtek. Az sszes sejttpus ltrehozsra kpesek.

Ksrletekhez: egr, vagy humn embrionlis ssejteket hasznlnak

- felntt egyedbl szrmaz ("adult") ssejtek: differencilatlan sejtek, melyek adott differencilt szvetekben fordulnak el, aktivldva osztdnak, nmagukhoz hasonl ssejteket s progenitor sejteket kpeznek, melyek az adott szvetben/szervben tallhat sejttpusok irnyba kpesek differencildni, nem kpesek a test brmely sejttpust ltrehozni. Viszonylag kis szmban, helyenknt fordulnak el a kifejlett szervezetben. Gyakran nehz ket elklnteni, ill. azonostani - alkalmazsuk nehzkes.

Pl.: csontvel, vr, szaruhrtya, retina, agy, vzizom, mj, br, gyomor-bl traktus, pankresz, kldkvr ssejtjei.

Lehetnek:

- szomatikus, vagy testi sejteket ltrehoz

- ivari sejteket ltrehoz

6

Az ssejtek differencildsi potencilja

1. totipotens ssejteket: az sszes (embrionlis s extraembrionlis) szvet s szerv ltrehozsra kpes. Pl.: megtermkenytett petesejtet.

2. pluripotens ssejteket: cskkent potencival rendelkez ssejt, mely nem kpes extraembrionlis szvetltrehozsra, de mind 3 csralemez kialaktsra s ivarsejtek kpzsre is alkalmas. Pl: embrionlis ssejt.

3. multipotens ssejteket: cskkent potencival rendelkez ssejt, nem kpes ivarsejt ltrehozsra, de brmely mssejttpus kifejldhet belle. Ilyenek a szervezet szveti ssejtjei.

4. unipotens ssejteket: csak 1 sejttpust kpes ellltani, de kpes a megjulsra, ami megklnbzteti a nem ssejttesti sejtektl (izom-ssejtek)

Induklt pluripotens ssejtek (iPSC)

- genetikailag jraprogramozott, dedifferencild kifejlett sejtek,

- embrionlis ssejthez hasonl llapot ssejtmarkereket expresszlnak, embriogenezis korai szakaszban klnbzembri-rszeket hoznak ltre, mindhrom csralemez sejtjeit kpesek osztdsaikkal ellltani

- de nem tudni, mennyire identikusak ESC-el

Hasznosts: gygyszerfejleszts, betegsgek modellezse; ?transzplantci?

reprogramming: vrusok ltal a sejtbe juttatott jraprogramoz faktorok daganatos elfajuls veszlye

Kutats-fejleszts: nem vrus eredet clbajuttats

Hematopoetikus ssejtek- a csontvel ssejtjeinek felfedezse: sugrzssal ellt csontvelej egrbe (anmia, vrzs, gyullads) egszsges egr csontvelejt injekcizva vrsejtkpzst figyeltek meg.

A transzplantlt csontvel prekurzor sejtjei osztd sejtek kolniit hoztk ltre, melyek osztdva a vr sszes sejtes elemv differencildtak

- csontvelben nagyon kevs pluripotens hematopoetikus ssejt van, a legtbb G0 fzisban alacsony metabolizmus, nyugalmi llapot lettartam meghosszabbts stimullsra: aszimmetrikus osztds: pluripotens ssejt + elktelezett ssejtek: kolniaforml sejtek

- elktelezett ssejtek: kolniaforml sejtek kolnik ltrehozsa valamely sejttpus (vvt, vrlemezke, granulocitk, limfocitk) ltrehozsrt elktelezett vonal sejtfelszni antitestek segtsgvel elklnthetk transzplantls

- nagy szm, klnbz tpus s funkcij vrsejt ltrehozsa: emberben msodpercenknt 1 milli

- a hemopoezis minden lpst, a prolifercit s a differencildst is citokinek (eritropoetin) s nvekedsi faktorok (Wnt, Notch, FGF: fibroblaszt nvekedsi faktor, IGF: inzuliszer nvekedsi faktor) szablyozzk

Eritropoetin kinzzal kapcsolt receptor citoplazmatikus transzkripcis faktorok aktivlsa proliferci s differencilds szablyozsa

A felntt ssejtek (adult stem cell)- szimmetrikus s aszimmetrikus osztds, attl fggen, hogy mire van szksg

- specilis krnyezetre (stem cell niche) van szksge, hogy fenntartsa ssejt sttuszt szveti sejtek s extracellulris mtrix biztostja. A niche sejt kihorgonyozza az ssejtet, s biztostja szmra a szksges sejtfelsznt, a sejtciklust szablyz jeltviteli mechanizmusokban szerepl proteineket. Egyes faktorok serkentik, msok gtoljk az osztdst. A csontvelben oszteoblaszt s endothl sejtek tltik be ezt a funkcit.

7

Vzizom ssejtek- kis szm ssejt a ris sokmagv izomrostok s a bazlis membrn kztt helyezkednek el.

- srlskor a nyugv llapotban lev szatellitasejtek osztdni kezdenek regenerci

- prolifercit s differencildst serkent jelek receptor tirozin-kinzok - MAP kinz tvonal

- gtl jelek miosztatinon (TGF- csald) keresztl gtlsa izomtmeg nvekedst indukl.

- az izom szmos regenercira kpes, mert az ssejt populci regenerci alatt megjtja magt, s/vagy a vr ltal a csontvelbl, egyb szvetekbl idekerl ssejtek

ssejtek az idegrendszerben (neural stem cell)IR kicsi regenercis kpesg,

- a kamrk krl egyes agyterletek tartalmaznak ssejteket kevs szm osztdsra kpesek

Merisztma ssejtek- aszimmetrikus osztds

- gykr- s hajtscscsban

Daganat ssejtek- proliferl sejtek forrsa magyarzat arra, hogy a gyorsan osztd daganatsejteket knny elpuszttani, daganatot mgsem lehet eliminlni a ritkbban osztd daganat ssejtek miatt

Epidermlis ssejtek- br: llandan megjul szerv, nagy regenercis kapacitssal

- multipotencilis s elktelezett sejtek is rszt vesznek a sejtptlsban s a regenerciban: epidermis bazlis rszn osztd sejtek rtege aszimmetikus sejtosztds bazlis membrn fel nz sejt marad ssejt, a kifel nz sejt tbbszrs osztds utn tbb lpcsben differencildik a br klnbz rtegeit hozza ltre

- multipotencilis ssejtek a szrtszk krl figyelhetk meg a szrtsz sejtjeit hozzk ltre

- mint a tbbi felntt ssejt, relative nyugalmi llapotban van, csak a nvekedsi s difefrencil faktorok, illetve a krnyezet hatsai aktivljk

Az ssejtek gyakorlati felhasznlsaEtikai gt

- gygyts: egyedi terpia, gnterpia, srlt szvetek, szervek ptlsa, betegsgek pl.: Parkinson, Alzheimer-kr, diabetes, szvizomelhalssal jr krkpek, tumorok, gerincveli srlsek, sclerosis multiplex.

- biotechnolgiai ipar gretes terlete a tissue engineering, a szvetek s szervek ellltsa ssejtekbl. Clja olyan szvetek ellltsa, melyek segtsgvel szvbillentyk, zletek, porckorongok hozhatk ltre, hogy aztn beltetve tvegyk a beteg szvetek, szervek funkcijt.

- szerepk lehet a gnterpiban: ssejtben a hibs gnek egszsgesre val lecserlse autolg transzplantci: javtott ssejtek beltetse.

- hatkonyabb felhasznlsa rdekben: j mdszerek az ssejtek mestersges szaporthatsgra

- screening: j gygyszerek, hatanyagok hatsvizsglata.

- alapkutats:

- differencilds,

- adott irnyokba val elktelezettsg,

- modellrendszerek kialaktsa:

- rkos sejtek burjnzsa - egszsges sejtek osztdsa

- regenerci, sejthall,

- szletsi rendellenessgek htterben ll folyamatok

8

A gygyszatban alkalmazott ssejt-forrsok

Hrom terpiban alkalmazott szveti ssejt-forrs a csontvel, a perifris vr s a kldkzsinrvr.

- csontvel: fknt vrkpz ssejteket tartalmaz: vrsvrtestek, fehrvrsejtek, vrlemezkk kpzsre kpes. A csontveli ssejtek nyerse altatsban vagy gyakrabban spinlis rzstelentsben, a hts csptvisekbl, esetleg a szegycsontbl trtnik.

- perifris vr: nagy dzis, kolniastimull-faktor (CSF) elkezels hatsra a csontvelbl nagy mennyisgssejt s elktelezett eldsejt (progenitor sejt) kerl a perifris vrbe. A transzplantcira alkalmas ssejtek gyjtse a kezelst kveten a kering vrbl trtnik.

- kldkzsinrvr: fjdalom s kockzatmentes, kzvetlenl az jszltt szletst kveten a mhlepnyben s a kldkzsinrban visszamaradt vr levtele, ami egybknt a szls utn orvosi hulladkknt megsemmistsre kerl, amennyiben nem rendelkeznek az abbl kinyerhet ssejtek megrzsrl. A kldkzsinrvrbl az ssejtek kivlaszthatk s letkpesen megrizhetk, ksbbiekben brmikor felhasznlhatk esetleges betegsgek kezelse cljbl. Azonban a magzati ssejtek kzvetlen befecskendezse utn valamilyen jelre van szksg ahhoz, hogy ppen a megfelel tpus sejtekk differencildjanak, s ne pldul tumorsejtekk

A kldkzsinrvr-ssejteket emberben elszr a csontvel-elgtelensgben szenvedk kezelsre hasznltk, mivel a kldkzsinrvr-ssejtek knnyen alakulnak t csontveli sejtekk.

Az ssejtek jelenlegi gyakorlati alkalmazsa:

- elnysebb a korbban szoksos, ms emberbl szrmaz csontvelvel vgzett transzplantciknl. A kldkzsinrvr-ssejtek ilyen cl hasznostsa is ritkbban okoz kilkdst. Msrszt az eddigi tapasztalatok szerint a kldkzsinrvr-ssejtek ilyen cl alkalmazsa hatkonyabb a felnttek csontvel beltetsnl.

Az ssejteket a krosodott terletre juttatva kpesek arra, hogy a krosodott szveteket regenerlja. A csontvelrosszindulat daganatos betegsgeiben alkalmas a betegek kezelsre. Az olyan rosszindulat daganatos betegsgekben, amelyek sugrterpit s/vagy citosztatikus (kemoterpia) kezelst ignyelnek, a vrkpzszervek sejtjeinek is ersen krosodnak, a krosodott sejtek az ssejtekbl szrmaz csontvel beltetsvel ptolhatk.

Megfelel vizsglati objektum kivlasztsa- kzs eredet miatt a sejtmkds tanulmnyozshoz brmely szervezetbl szrmaz sejt hasznlhat, pl: osztds, kromoszmaszerkezet, mutci vizsglata (leszt) gombk

- specilis folyamatok, tulajdonsgok vizsglata specializldott sejtek, pl: kontraktilis fehrjk vizsglata izomsejtek, ostormozgs tanulmmyozsa Chlamydomonas fajok

- ltalnosabban hasznlt, jobban feltrkpezett vizsglati objektum tbb ismeret, genetikai trkp, feltrkpezett genom, ismert fiziolgia, bevlt vizsglati mdszerek

organizmus genom mret s

ploids genom

szekvencia gnek szma

homolg rekombinci

meiotikus rekombinci

biokmia

Gram-negatv baktrium, Escherichia coli

4.6 Mb, haploid + 4288 + - kivl

penszgomba Dictyostelium discoideum

34 Mb, haploid + 12,000 + - kivl

sarjadz leszt Saccharomyces cerevisiae

12.1 Mb, haploid + 6604 + + j

hasad leszt Schizosaccharomyces pombe

14 Mb, haploid + 4900 + + j

Nematoda Caenorhabditis elegans

97 Mb, diploid + 18,266 nehz + szegnyes

Drosophila melanogaster 180 Mb, diploid + 13,338 nehz + szegnyes ldf Arabidopsis thaliana

100 Mb, diploid + 25,706 - + szegnyes

Mus musculus 3000 Mb, diploid + 25,000 + + j

Homo sapiens 3000 Mb, diploid + 25,000 + sejttenyszet

+ j

Genetikai modellszervezetek

9

Modellszervezet

- az idelis: teljesen szekvenlt genom, ismert mdszerek a tanulmnyozsra s a manipullsra, pl gn lecserlse homolg rekombincival

- a haploid szervezetek jl hasznlhatk a mittikus osztds, s a mutcik vizsglatra, a diploid letszakasszal is rendelkezk a meiozis, ill. a meiotikus rekombinci tanulmnyozsa, rklds sarjadz s hasad lesztk jmodellszervezetek ezekre a genetikai vizsglatokra sejtbiolgiai alapkutatsok DE: egysejt, specilis letciklussal nem j modellje a tbbsejt llnyek szvetei, szervei szmra

- tbbsejt szervek szvetek mkdst modellez szervezetek: gymlcslgy, Nematoda frgek, egr, emberi sejtek tenyszetei. Fejldsbiolgiai, szvettani vizsglatok: Drosophila, Nematoda

- gerinces modell: egr, patkny, pl. idegrendszeri kutatsok; emls, humn sejttenyszetek - fiziolgia

- Arabidopsis: nvnybiolgiai vizsglati objektum: kis genom, gyors reprodukcis ciklus, genetikai vizsglatok

- modellezni kvnt szervezet (ltalban humn) modell: elnyk htrnyok, mihez kell, lettartam

humn

ms llat: emls ms gerinces gerinctelen

izollt szerv, szvet, sejt

(tenyszetben) fenntartott szerv, szvet, differencilt sejt

primer tenyszet: fibroblaszt, rendotlsejt, (valamilyen nyugv, szveti ssejtbl, vagy jraprogramozott szveti sejtbl)

sejtvonal

Sejtizollsszeparlssal, pl. vrbl

mechanikailag

enzimatikus emsztssel: valamilyen proteolitikus enzimmel (kollagenz, tripszin extracellulris mtrix bontsa)

kis szvetdarabok tpoldatba helyezse a tenyszetben nveszthet sejtek kivndorolnak a tpoldatba

Az izollt sejteket primer sejteknek nevezzk primer tenyszetek: kivve a tumoros eredeteket, ltalban limitlt letidejek, heterogn megjelens, a sejtek csak meghatrozott szm osztdsra kpesek, azutn differencilds, s/vagy regeds sejthall

Az immortalizlt sejtvonalak korltlan szm sejtosztdsra kpesek, DE vltoznak: pl. mutcik

Sejtvonalak sejtjeinek ltalnos jellemzi

- kisebbek, lekerektettek, nem tapadnak ki annyira, nagyobb a sejtmag/citoplazma arny

- gyors nvekeds, aneuploid kromoszmaszm

- ignytelenebben: tpoldat s kiatapads nem olyan fontos, szvesen n szuszpenziban

- nagyobb sejtsrsg, denzits

- fenotpusosan eltrnek a donortl

- nem expresszlnak szvetspecifikus fehrjket

10

Sejt szortrozs

microbead

preplating

Primer tenyszetbl sejtvonal kialaktsa

- tiszta tenyszet ltrehozsa: sorozatos preplating

- sorozatos passzlsokkal klnok kialaktsval, majd a klnok tovbbpasszlsval spontn transzformci

- akr embrionlis szvetbl, akr kifejlett egyedbl indthat

- transzgn onkognek segtsgvel nem szksges, mert az elbbi jl mkdik

- elnyk:

tmegtermels

differencilds megakadlyozsa, proliferci

ha szksges knnyen differenciltathat

prolifercis, s differencildsi markerek

anyagok hatsvizsglata a proliferci/differencilds folyamataira

kereskedelmi forgalomban lev izom eredet sejtvonalak

11

Sejttenyszetek formi- kitapadva nv kultrk: megfelel felsznt ignyelnek, gyakran extracellulris mtrix proteinekkel bevonva: tenyszedny, mikrokarrier, 3D krnyezet adhzis szignl kell a nvekedshez, differencildshoz. A 3D tenyszet kzel ll a szveti szervezdshez, de nehz fenntartani, pl diffzis korltok miatt

- szuszpenzis kultrk

tmenet, pl. nagyobb mennyisg ellltsa miatt

- mikrokarrier technika

gmbcskk

porzus mikrokarrier

Sejtek eltvoltsa: kells (EDTA), proteolitikus enzimek (tripszin), hipotnis kezels, hmrsklet, szonikls

- 3D hl, vagy rcs struktra

Sejttpusoka) megjelens szerint:

- epithlsejt-szer: kitapadva n, kockakszer megjelens, alakja sokszg

- limfoblaszt-szer: nem tapad ki, szuszpenzi, lekerekedett

- fibroblaszt-szer: kitapadva n, elnylt, bipolris alak

A sejttenyszetek fenntartsaSzveti sejtek, utnozni kell a szveti krnyezetet:

hmrsklet,

pratartalom,

gzok,

intersticilis folyadk fiziolgis soldat

pH

tpllk, sejt ptkvei

specilis kiegsztk: vitaminok, svnyi anyagok, hormonok, nvekedsi fakorok

+ kiegszts: gyakran emls (FBS, FCS, HS) vrszrum

- emls sejtek: 37C, 5% CO2 szigoran szablyzott: CO2 inkubtor; pH, ionsszettel, sk, glkz, aminsavak, nvekedsi faktorok tpoldat: fgg a tenyszettl, ltalnosan hasznlt GMEM, EMEM,DMEM, sterilen elksztett, trols 4C

Vdelem a fertzsek ellen: sterilits, antifunglis szerek (amfotericin B), antibiotikumok (penicillin, streptomicin)

- tpoldat csere: a sejtek metabolizmusuk sorn savanytjk a kzeget

- passzls: szuszpenzis kultrknl egyszer, letapadva nvknl: ltalban tripszin-EDTA kezels felvl sejtek sztosztsa; lt. 80-90% konfluencinl

- lefagyaszts

12

A sejtek lefagyasztsa- tartalk

- moss PBS-el, Tripszin-EDTA sejtek tpoldatban val felvtele centrifugls tpoldat + 10% DMSO-ba (DMSO: jgkristlyok kpzdse ellen vd + sejtmembrn rigiditst is cskkenti) val felvtel fagyasztshoz cryo-cs -80 C folykony nitrogn

Kiolvaszts- felolvaszts: 37 C vzfrd (centrifugls) reszuszpendls tpoldatban (ltalban magas szrumkoncentrci -20% FBS - mellett) kitapads ellenrzse 24 ra elteltvel oldatcsere, 20% FBS-el kiegsztett tpoldat, mg a tenyszet be nem indul

Gyakran hasznlt sejtvonalakHumn MCF-7 emltumor

HL 60 leukmia

HEK-293 embrionlis vese

HeLa Henrietta Lacks mhnyakrk

Femls Vero afrikai zldmajom veseepithlsejt

Cos-7 afrikai zldmajom vese

Egyb: CHO (knai) hrcsg ovrium, sf9, sf21 rovarsejtek

Sejtek letkpessgnek ellenrzseSejtszm meghatrozsa

- tenyszetet reprezentl minta vizsglata kvetkeztets a teljes tenyszet llapotra

A) direkt meghatrozs

1) sejtszmols mikroszkp alatt hemocitomter

rcsozott terlet: 3 X 3 X 0,1mm = 0,9 mm3

3 rszre osztott: 1 X 1 X 0,1mm = 0,1 mm3

- a szls ngyzetek: 4X4 ngyzetre vannak tovbbosztva:

0,25 X 0,25 X 0,1mm = 0.00625 mm3

- a kzps, ketts vonalakkal hatrolt ngyzetek 25 nagy ngyzetre vannak

osztva - oldalhossza 0,2 mm, terlete 0,2 X 0,2 X 0,1 mm = 0,004 mm3.

A ketts vonalakkal hatrolt ngyzetek sarkainl tallhat kis ngyzetek

oldalhossza - 0,05 mm, trfogata 0,05 X 0,05 X 0,1 mm = 0,00025 mm3

- tripnkkes fests: l sejt membrnja nem permebilis a festkre, csak az elpusztult sejtek festdnek meg

Az l sejtek arnynak meghatrozsa: sejtszmolssal:

l sejtek arnya % = a meg nem festdtt sejtek szma X100sszsejtszm

- hasznlhat sejtmagszmllsra is

2) elektromos/mszeres szmlls: ramlsi, vagy flow citometer sejttrmelk is, denzitometria

3) biomassza monitorozs: 4 platina elektrda alacsony rdifrekvencival intakt mb felveszi az elektromos tltseket, apr kapacitsok kapacitsmrs sejtdenzits (bioreaktorokban)

4) metabolikus aktivits mrs: NADH UV fnyben fluoreszkl

5) kpalkot eljrssal trtn meghatrozs: szmtgphez kapcsolt CCD kamera - mikroszkp

13

B) indirekt meghatrozs1) minta protein tartalmnak meghatrozsa: kolorimetrisan. Pl. Bradford assay gyors, rzkeny, pontos, megbzhat: sejtliztum + Coomassie blue szn 10 perc mlva kolorimter, vagy spektrofotomter standard proteinnel valsszehasonlts

biomassza

enzimaktivits

2) minta DNS tartalmnak meghatrozsa: DNS-hez ktd floureszcens festkkel, pl. Hoechst 33258, DAPI

3) tpoldat glkz-tartalmnak (fogysnak) meghatrozsa, vagy laktt-termels, ill O2-fogyaszts mrse. pl.: glkz-oxidz assay (glkz-oxidz, peroxidz, s festk o-dianizidin hidroklorid szines termk kolorimetris mrs), hexokinz assay (hexokinz, glkz-6-foszft deidrogenz NADH kpzds)

Proliferci sejtpusztuls nyomonkvetse1) festk felvtel: tripnkk, eritrozin B, nigrozin, fluoreszcein diacett

2) tertrazlium assay: a cellulris oxidatv metabolizmust mri a tetrazlium festk MTT segtsgvel: NAD(P)H-dependens dehidrogenz enzim hatsra sznes termk

3) kolnia formls nyomonkvetse: a legpontosabb, alacsony koncentrciban szlesztve a sejteket egy sejt egy kolnia, a kolnik mretnek nvekedse jellemzi az adott sejt prolifercijnak mrtkt

4) LDH meghatrozs: a sejt letkpessgnek cskkense sejtmembrn integritsnak romlsa sejtalkotmakromolekulk kijutsa a sejtbl a tpoldat enzimaktivitsnak mrse, pl. LDH: pirovt jelenltben trtn NADH oxidci mrse spektrofotometrisan

5) intracellulris energia vltozs: AMP ADP ATP szint mrse kromatogrfisa, vagy a luciferin-luciferz enzim rendszerrel lumineszcenciamrssel. ATP szint cskkense: sejtfunkcik romlsa

6) protein szintzis rta: radioaktvan jelzett aminosavakkal

Apoptzis mrse1) ramls citometria

2) DNS glelektroforzis: kis DNS fragmentek detektlsa

3) fluoreszcens mikroszkpia: akridin narancs + propidium-jodid: az akridin-narancs membrnpermebilis, DNS-hez kapcsoldik, emisszi: zld, a propidium-jodid csak a srlt sejtmembrnon jut t, nukleinsavakkal kapcsoldik piros ketts festds, kr alak, kondenz kromatin llomny nekrotikus sejt

4) annexin V-FITC: az apoptotikus sejtek elvesztik foszfolipid membrn aszimmetrijukat foszfatidil-szerin a sejtfelsznre kerl, annexin V-FITC konjugtum ersen ktdik a foszfatidil-szerinhez

5) TUNEL (TdT-medilt dUTP Nick End Labeling): DNS fragmentek 3OH vgnek jellse biotin-konjugltnukleotidokkal. A reakcit az exogn deoxinukleotidil terminlis treanszferz (TdT) katalizlja

6) rodamin (zld) felvtel funkcionlisan aktv mitokondriumok, propidium-jodid fests

7) kaszpz-3 aktivits mrse: apoptotikus marker cisztein-protez monoklonlis antitesttel val jells, fluoreszcens mikroszkpia

Cross-contamination keresztfertzs- sejtvonalak sszekeverednek

- sejtvonalak tisztasgnak megrzse, ellenrzse:

rgen: sejtmorfolgia mikroszkpos ellenrzse

ma: kariotipizls

fajspecifikus antign imunfluoreszcencia

izoenzim analzis

DNS fingerprint: restrikcis fragment hossz polimorfizmuson alapul, vltoz szm ismtld egysgek sszehasonltsa

PCR-alap vizsglatok: hipervaribilis DNS szekvencik, (single) nukleotid polimorfizmus

- sejtbankok

14

Sterilits fenntartsa

- steril oldatok, steril krnyezet

- steril flke: laminris, v horizontlis s vertiklis box. A legnagyobb biztonsg a vertiklis, biology safety flke a kifvott leveg HEPA filter szrt.

- inkubtor, termosztt: rovarsejttenyszet: 25-30 C , emlssejtek: 37 C, CO2 2-10% + 95% leveg szveti sejtek ignyei + a bikarbont puffer tpoldat pH-jnak szablyozsa miatt, 99% relatv pratartalom

- tpoldatok, sejttenysztsehez hasznlt oldatok tartsa 4 C-on (ht, vagy htszoba)

- enzimek, szrumok, tpoldat sszetevk: -20 C

- egyszer hasznlatos tenyszednyek: manyag flaskk (T25, T75), s petri-csszk

- egyszer hasznlatos s/vagy sterilezhet eszkzk: autoklv manyag eszkzk, hlgsteriliztor veg s fm eszkzk

- steril szrk az oldatok elksztshez

Sejttenyszetek manipullsa

A tenyszet sejtjei addig nnek, mg van tpanyag s/vagy hely.

A gyors nvekeds problmja

a tpanyagok elfogynak a tpoldatbl

megn az apoptotikus/nekrotikus (elpusztult) sejtek szma

a kzvetlen sejt-sejt kapcsolat kontakt gtlst okoz: sejtciklus nyugalmi G0 fzisba lpnek a sejtek, regeds a sejt-

sejt kapcsolat differencildst indthat el

Manipulls: tpoldat vltoztatsa, passzls, transzfekci: idegen DND bejuttatsa fehrjetermk expresszija, vagy

siRNS technika, vagy gncsendests: egyes gnek trdsnak szablyozsa. Sejtvonalak kialaktsa

Transzfekcis technikk

Mechanikai:

- lipid medilt lipofekci

- elektroporci

- mikroinjektls

- kalcium-foszft precipitci: plazmid a kalciumfoszfttal precipitldik, a sejtek endocitzissal internalizljk:

tranziens jelleg transzfekcis mdszer: az idegen DNS gazdaseejt genomjba integrldsa nem biztostott

- DEAE (dimethylaminoethyl)-dextran: kationos polimer, negatvan tlttt DNS lefedse endocitzis

Vrus ltal kzvettett:

- adenovrus infekci

- retrovrus infekci

15

Vrus vektor ltal kzvettett transzfekci

- primer sejtek ltalban ellenllnak a transzfekciknak, kivve a rekombinns vrus transzdukcit - adenoviralis slentiviralis vectorok sejttenyszetek immortalizlsa, sejtvonalak kialaktsa

1) Recombinns adenovrus vektorok

- a leghatsosabb transzfekcis rendszer

- az sszes humn sejttpuson hasznlhat kzel 100%-os hatsfokkal, kivve a vr sejtes elemei, melyeken nem tallhat adenovrus recepor

- az adenoviralis vektorok nem integrldnak a sejt genomjba tranziens expresszi

- a vektor a clsejtben szthullik, vagy sejtosztdskor felszvdik az expresszis szint fgg az expressziidtartamtl, s a sejtosztds mrtktl

2) Recombinns retrovrus vektorok

- csak az aktvan osztd sejteken alkalmazhat, mert sejtosztds sorn a sejtmagmembrn sztesik, gy a vrus DNS kpes a gazdasejt DNS-hez hozzfrni, beplni a genomba permanens, stabil expresszi.

- korltozott a hasznlhatsga, kicsi a hatkonysga, klnsen a ritkbban osztd sejttpusoknl

3) Recombinns lentivrus vektorok

- jabb, mind az osztd, mind a nem osztd sejteken alkalmazhat, mert a lentivrusok aktvan kpesek tjutni a sejtmagmemrnon

- beintegrldik a gazdasejt genomjba, in vivo s in vitro is alkalmazhat

- htrnya: a beinzertlhat gnszakasz mrete limitlt, kicsi: maximum 5.0 kb, de a transzfekci hatkonysga 3.0kb felett signifiknsan cskken

Adenovrus protokoll

- adenovrus amplifikci: gazdasejtben val felszaports

megfelel sejttpus felszaportsa, kb. 60-70% konfluenciig

adenovrus hozzadsa - inkubls: akr 4-6 nap, mg a sejtek felvlnak

tovbbi vrusszaportshoz kt lpcs prhuzamosan indtott sejttenyszethez vrus izolls nlkl az els

tenyszetbl szrmaz vrusokkal val tovbbfertzs

vrus izolls: az sszegyjttt minta ismtelt fagyasztsa-felengedse, centrifugls (2000 g, 10 perc)

fellsz - in vitro transzfekci, vagy trols 4C nhny htig, ill. 70C

Az adenovrus vektorok stabilan eltarthat 4C-on, vagy szobahmrskleten (~25C), a lentivrus s retrovrus vektorok kevsb. letkpessget segti, ha 70C-on trtn trolskor 5% glicerolos mintt ksztnk

- adenovrus transzfekci:

in vitro (sejttenyszet) felszaportott vrus: fellsz, vagy tiszttott adenovrus, in vivo csak tiszttott vektor hasznlhat:

sejt, sejttredk, FBS, tpoldat -mentes

clsejt tenysztse: kb. 70% konfluenciaszint - vektor hozzadsa a tenyszethez, 1 ra inkubls - moss

48-72 ra mlva a transzdukci vizsglhat, pl.: Western blot, qPCR, szines (fluoreszcens) reporter gn alkalmazsval

(fluoreszcens) mikroszkppal

Lentivrus s retrovrus protokoll

- infekcihoz ltalban valamilyen segdanyag hasznlatos, pl.: a sejtmembrn felszni tltseit elfed polikation (pl. Polybrene) nveli a sejtmembrn s a vruskapszid kapcsoldsi lehetsgt nagy koncentrciban s/vagy hosszan alkalmazva toxikus lehet

- ismtelt transzfekci, hossz 6-8 rs inkubls lentivrus esetben, 24 rs inkubls retrovrus esetben

-72 ra elteltvel passzls, szelekci (rezisztencia alapjn, pl.: Puromycin)

- a tll sejtekbl klnok

- szelekcit kvet 10-15 nap: az optimlis klnok kivlasztsa - sejtvonalak indtsa

16

Sejttenyszetek felhasznlsa- tmeggyrts

- fehrjetermkek ellltsa biotechnolgia: rekombinns DNS technolgival enzimek, hormonok, monoklonlisantitestek, interleukinok, limfokinek, rkellenes szerek ellltsa

- vannak amelyek elllthatk baktriumtenyszetekben is, de a komplex, glikozillt proteinek eukarita sejtekben valellltst ignyelnek pl: eritropoetin llati sejttenyszetek

Problma: drga egyb utak: gntranszfer rovarsejtekbe, magasabbrend nvnyekbe

- szvettenyszet s szvetmrnksg: humn mesenchimlis ssejtek ellltsa, lefagyasztsa

- vakcink, oltanyagok ellltsa: himl, gyermekparalzis, mumpsz, rubeola, kanyar elleni vdoltsok + influenza

- gygyszerfejleszts

- sejttoxicits vizsglat

- rkkutats

- gnterpia

Fehrjeexpresszis rendszerek1) prokerita expresszis rendszer

- baktrium

2) eukarita expresszis rendszer

- leszt

- rovarsejt-bakulovrus expresszis rendszer

- emls sejtek

tranziens

stabil

induklhat

Baktrium s leszt expresszis rendszerekgyakran bakterilis fehrje fzis fehrjjeknt termeltetik

Elnyei: ipari mretekben is egyszeren s olcsn hasznlhat, ismert genom, egyszer technikk

Htrnyai: poszt-transzlcis mdosts eltrsge miatt nem vagy csak kevss hasznlhatak humnban az ellltott termkek, tisztts, patogn szennyezs

Rovarsejt-bakulovirus rendszer Elnyei

- biztonsgos: a bakulovrusok gazdaszervezet-specifikusak, gerincesekre, nvnyekre veszlytelenek. ltalban csak egy gazdaszervezetet (faj) betegtenek meg ms rovarokra sem jelentenek veszlyt. Mivel a rovaresejtek nmagukban nem veszlyesek, s a transzfektlsuk sorn hasznlt bakulovus sem alacsony biztonsg.

- a baculovrusok genetikailag hordoznak minden szksges informcit nem szksges ms

- knny a fehrjetermelst belltani, ellenrizni: sok, klnfle gntermk nagy mennyisgben val ellltsa. A rekombinns fehrjk nagy rsze vzoldkony knny elklnts, tisztts

- nagy pontossg: emlssejtekhez hasonl poszt-transzlcis mdosts

- a hasznlt sejtek, sejtvonalak knnyen tarthat szuszpenzis tenyszetben: bioreaktorokban trtn termels

Htrnyai: viszonylag drga, specifikusabb krlmnyek

Emls sejttenyszet, transzgnikus llatElny: jobb minsg termk

Htrny: drga, ipari elllts nehzkes, vagy lehetetlen, tisztts, patogenits

17

Transzgn llat- vagy egy msik szervezetbl szmaz a sajt genomjba beplt idegen DNS szakaszt hordoz

- vagy a genom egyes szakaszai delcival, vagy mutcival mdostottak

- azrt lettek ltrehozva, hogy az adott genetikai vltozst szervezet szintjn lehessen vizsglni, illetve az adott gn, vagy gnszakasz egyedfejldsre kifejtett hatsa tanulmnyozhat

-els transzgn egr:1980

- funkci fokozs, illetve cskkens, vagy funkciveszts

- 3 technika:

1) mikroinjektls: DNS bejuttatsa kzvetlenl egy sejt sejtmagjba spec esete: megtermkenytett petesejt pronukleuszba injektls (l)terhes egr oviductusba juttats egyedfejlds. Elny: termszetes kromoszmajavts mechanizmusval tkletesebb bepls, gyakran tbb kpiban egyms mell fej-vg llsban; egy sejtbe bejuttatott DNS szakasz a szervezet sszes testi sejtjben meg fog jelenni, klnsen az ivarsejtekbe. Ha az egyedfejlds ksbbi szakaszban trtnik meg a mikroinjektls mozaikos megjelens nyomon kvethet, hogy mely sejtbl, vagy sejtpulcibl milyen szvetek, sejtek fejldnek

2) korai embrionlis szakaszban rekombinns retrovrussal trtn infekci. Elny: 1 kpia, meghatrozott helyre, htrny: nem egyforma a transzfekci az sszes sejten, alacsony hatkonysg, kis DNS fragmentek klnozhatk a retrovirlis vektorba

3) embrionlis ssejtek hasznlatval: izolls, transzformls, korai blasztociszta llapotba val bejuttatsa kimrk ellltsa fenotpusos kivlogats. Hasznlhat: irnytott kromoszma vltoztatsok, pl.: specifikus gn mutcija. Htrny: nehz s kltsges technika

Gn-targetls: gnszakasz mutcija pluripotens embrionlis ssejtbe trtn transzfektls homolg rekombinci blasztocisztba val beltets anyallatban embriogenezis - kimra, pl.: pontmutcik, null (knockout - KO) mutci): gnszakasz s/vagy a gnszakasz expresszija hinyzik. Sokszor a homozigta nem letkpes heterozigtk fenntartsa gyakran ezek nem betegek, fenotpusos jelleg nem jelenik meg, valsznleg egyb aktivld gnek, kls hatsok kompenzlnak

Az integrci helye is fontos

- csendes, heterokromatikus rgiba beplt gnszakasz expresszija alacsony.

Problma kikszblse: tbb egrvonalbl kivlogatva a legjobbat

- az endogn fehrjk expresszija ne srljn, vagy cskkenjen fenotpus! Problma kikszblse: tbb egrvonal sszehasonltsa fenotpusosan

Egrvonalak tovbbszaportsa

Problma: hibrid egrtrzsnl az egyes egyedek nem lesznek identikusak genetikai variabilits. Megolds: beltenysztett egrtrzsek kialaktsa hatkonysg alacsony

Leggyakrabban hasznlt beltenysztett egrtrzsek: C57BL/6, DBA/2, CBA/Ca, BALB/c

Egyb transzgn llatok

- patkny

18

Hasznlatuk:

transzgn llatok nvnyek ltrehozsa: GMO, illetve betegsgek tanulmnyozsa, biofarmakonok (inzulin, nvekedsi hormon) ellltsa alacsony hatkonysg (haszonllatoknl: kecske, birka, szarvasmarha, kevesebb, mint 5%) transzgn llatok kifejlesztse hosszadalmas, drga, de mg gy is olcsbb s

veszlytelenebb, mint sejtekben ellltani. Farmakon ltalban tejben

Veszly: j zoonzisok, prionok

Klnozs Somatic cell nuclear transfer

Tll szelet technika- elssorban idegsejtek, idegelemek vizsglatra: projekcik megtartsa

- ltalban embriban, pre- vagy posztnatal llatbl: knnyebb preparls (jgen)

- agarz glbe gyazs

- vibratmmal vkony szeletek (jgen): 200-300 m

- megfelel szelet kivlasztsa, tenysztednybe, polikarbont membrn felszn, szrumtartalm tpoldatban tarts inkubtorban 1-2 rt, agarz eltvoltsa, majd szrummentes tpoldatban tovbbtarts 3-4 napig

Hibridma technikaA monoklonlis antitesteket leggyakrabban hibridmk segtsgvek lltjk el.

A mdszer lnyege, hogy a megfelel antitestet termel plazmasejtet fzionljk egy mielma (limfoid tumor) sejttel, s a keletkez sejt optimlis esetben egyesti a plazmasejt antitest termel tulajdonsgt a daganatsejt korltlanszaporodkpessgvel.

Az egyests (fzi) vegyszerekkel vagy elektromos trben trtnik.

A hibridma ellltsa sorn a plazmasejtek forrst kpez llatot immunizljk az antignnel, s a lpbl kinyertsejteket fzionljk mielma sejtekkel. gy rengeteg hibridma vonalat nyernek, melyek kzl az antignhez megfelelhelyen s nagy affinitssal ktd antitestet termelt ki kell vlasztani s tovbb szaportani.

Ko-kultra

- idegsejt, (izomsejt) tenyszet

- coating: poly-D-lizin, laminin, zselatin

- tpll(tmaszt) sejtek tenysztse: sejtvonal, vagy izollt fibroblaszt, ill.glia primer tenyszet

- tenyszteni kvnt sejtek preparlsa, szlesztse a tpll sejtrtegre

- tpoldat:ltalban szrum jelenltben, nvekedsi faktorokkal kiegsztve

- ltalban rvid letid, nem passzlhat

3D technika- tmenet a klasszikus in vitro s in vivo technikk kztt

- utnozza a szveti struktrt:

sejtdenzits

polarits

sejt-sejt, sejt-mtrix kapcsolatok

bazlis membrn (sszetevk)

- tumorigenezis vizsglata: egszsges epithl, carcinoma morfogenezis - oncognek, onkoproteinek, nvekedsi faktorok meghatrozsa, proliferci, differencilds, tlls, apiko-bazlis polarits, programmozott sejthall

- real-time imaging, rszletes struktr analzis (konfoklis mikroszkpia)

- bels s kls paramterek hatsvizsglata

19

Organotpis szvettenyszts

- izollt szervbl vkony metszetek, szeletek ksztse porzus anyagon (pl. fmrcs, grid) a leveg-tpoldat hatrfelleten tarts

- sejt gmbcskk spheroid (tbb 100 m tmr) differencilds, szveti struktra

- fggcsepp hanging drop, vagy keverfal rotating-wall tenyszet. A sejtek a gravitci miatt cluster-ekbe

tmrlnek

- polarizlt epitl sejttenyszet porzus membrnon monollayerben

- 3D polarizlt tenyszet: mestersge extracellulris mtrix

- mestersges br: primer fibroblaszt tenyszet biolgiailag leboml hlra szlesztve - nhny ht mlva keratinocitk

- mikrokarrier anyagok: dextrn, zselatin, glikzaminoglikn, vagy ms polimerbl golycskk

- agarz hordoz: a sejt ECM-gl ebbe gyazdik

- vegkapillrisban, egy csepp folykony agarzba gyazott vizsglati objektum skla: 1 mm.

- GFP tagged aktin expresszlt, kollagn I gl 3 napos 3D tenyszet, sejtmag piros, skla: 20 m. ECM: extracellulrismtrix;

MDCK, MadinDarby canine kidney;

SPIM, single plane illumination microscopy.

Immortalizlt sejtvonalak kialaktsa- primer sejttenyszet sejtjei elre meghatrozott, kis szm osztdsra kpesek fgg fajtl, a sejt tpustl, tenyszts krlmnyeitl nem osztd stdiumba kerlnek a sejtek nem osztd, reged tenyszet: jellemz sejtalak (ltalban megnagyobbodott sejtek, tbb sejtmag), gnexpresszis mintzat (tumor szuppresszor proteinek: p53, RB, p16aktivcija), metabolizmus (megnvekedett lizoszma biogenezis, endogn -galaktozidz overexpresszi)

- meghatrozott szm osztds limitlt sejtszm rvid letid j tenyszetek indtsa

- immortalizlt sejtek, vagy sejtvonalak: nagyszm osztds, nagy sejttmeg. Elvrs: primer sejtekhez hasonlgenotpus, fenotpus

- hasznlhat technikk:

vrus gnszakasz beptse a genomba, pl.: simian (majom) virus 40 (SV40) T antign: a legegyszerbb, leghatkonyabb mdja az immortalizcinak

telomerz reverz transzkriptz (TERT) protein expresszi: azokon a sejteken hatsos, amelyekben fontos szerepe van a telomer hossznak (pl. human). A TERT protein a testi sejtekben inaktv llapotban van jelen, a vrus nveli az expresszi szintjt, ami elsegti a megfelel telomerhossz fenntartst megelzi a tenyszet regedst. Elny: ltalban megmarad a primer sejtre jellemz stabil genotpus, jellemz fenotpusos markerek. Nhny sejttpusban azonban ezzel ellenttes folyamat: sejthall pl.: epitlsejtekben. Megolds: hTERT katalitikus alegysgnek s p53, vagy RB siRNS-nek a ko-expresszija:

Ras, vagy Myc overexpresszija egyes sejttpusokban hatsos sejtimmortalizcis mechanizmus

ltalban a vrusgnek inaktivljk a megfertztt sejt tumor szuppresszor gnjeit (p53, Rb, stb) kzvetlen immortalizl hats

20

A primer sejtek osztdsi mintzat alapjn kt f tpusa:

1) 20-50 passzlst megl sejtek: blaszt sejttpusok, pl.: fibroblastok, retinoblasztok

2) kevesebb, mint 10 passzlst tr, illetve nem passzlhat tenyszetek: epithlsejtek

1) 20-50 passzlst megl sejtek: hTERT vagy SV40 T antign

2) SV40 T antign, vagy a Rb, p53 siRNA s hTERT koexpresszija, illetve SV40 T antign s hTERT koexpresszija a nehezen immortalizlhat primer sejteknl hasznlhat, pl.: epitl sejtek cells. Az epitlsejtek esetben az epithelialisnvekedsi faktor (EGF) hasznlhat: 10-20 passzlssal meghosszabbtja a sejttenyszetek letidejt

Elny: nem szksges a szelektls, mivel a technika nmaga kivlogatja az ostd sejteket (tlnvik a nem osztdkat, illetve a nem immortalizlt sejtek elpusztulnak

Citotoxicits assay-kDirekt kontakt mdszer

- csaknem konfluens fibroblaszt tenyszet, friss oldatcsere + vizsgland anyag

- inkubls: 24 ra, 37 C

- moss, fixls, fests el sejtek arnynak megllaptsa

Agar diffzis mdszer

- csaknem konfluens fibroblaszt tenyszet, oldatcsere 2% agar oldatra, vitlis festkkel

- az agar megszilrdulsa utn a vizsgland anyagot az agar felsznre helyezzk

- inkubls: 24 ra, 37 C

- az l sejtek festdnek csak meg

Oldszer mdszer

- csaknem konfluens fibroblaszt tenyszet,

- vizsgland anyag oldsa fiziolgis soldatba, vagy szrummentes tpoldatba

- inkubls: 48 ra, 37 C

- hisztokmia, vagy vitlis fests

21

Sejtek vizsglata- molekulris biolgiai mdszerekkel

PCR, qPCR

Western blot

enzimaktivits

- elektrofiziolgis mdszerekkel

patch clamp

voltage clamp

- kpalkot eljrsok mikroszkpi technikk

fnymikroszkp: tes fny, festsek

polarizcis mikroszkp

fziskontraszt mikroszkp

elektronmikroszkp

fluoreszcens mikroszkp

konfoklis (fluoreszcens) mikroszkp

Upright fnymikroszkp: a kondenzor lencse a vizsglati objektumra fkuszlja a fnyt, az objektv lencse sszegyjti az objektumrl visszaverd fnyt, az okulr lencsje felnagytja a kpet s a szembe, vagy a kamerba vetti a sugarakat.

Inverz fnymikroszkp.

Fluorescens mikroszkp: az objektv lencse kondenzor is egyben, a gerjeszt fnyt a vizsglati objektumra fkuszlja a fluoreszcens festkmolekulkgerjesztdnek emittlt fnyt ugyanaz az objektv lencse gyjti ssze: egy fnytba helyezett dichroikus tkr osztja a fnyt, elklntve a gerjeszt s a kibocstott fnyt, filterek segtsgvel csak egy bizonyos hullmhossz fny jut a detektorhoz.

Elektronmikroszkp: elektromgneses lencsk helyettestik a fnymikroszkpok veglencsit.

Fluoreszcens mikroszkpia

- akr egy fluoreszcens festkmolekult is rzkel

- l s fixlt sejtek, szvetek

- immunfluoreszcencia

- lipid, protein, nukleinsav is jellhet, ion- membrnpotencil-szenzitv festkek

- autofluoreszcencia: GFP

Konfoklis mikroszkpia

- a lzerfny csak egy keskeny rse (pinhole) keresztl, x, y, z dimenzikban pontosan fkuszlva ri el a vizsglati objektumot, majd jut vissza a detektorba

- lekpezs pontrl-pontra

- klnbz (z) skokban trtn lekpezs utn 3D rekonstrukci

22

Elektronmikroszkp

- nagy felbontkpessg: elvileg 0,3 nm alatt, de az elektronnyalb krostja a vizsglt objektumot specilis preparls

Preparl technikk:

- rgen: fixls, manyagba gyazs, mikrotmos szeletels, nehzfm ionokkal val fests felbonts: 3 nm krioelektronmikroszkpia: specilis vizsglati objektumoknl, pl: fehrjeszerkezet vizsglatoknl: gyors fagyaszts, amorf, nem kristlyos jgbe gyazs (bakteriorodopszin, aquaporin, tubulin szerkezet) 2D-ban, szmtgpes mdszerekkel 3D struktra kiszmthat

-fagyasztva trses eljrs: fixls nlkl

Psztz elektronmikroszkp:

vastagabb vizsglati objektumokhoz,

kpalkots pontrl pontra letapogatja a felsznt