类囊体膜脂与植物低温敏感性关系的研究进展

南通大学生命科学学院

朱 素 琴

Advances in research of the relationships between Thylakoid Membrane Lipids and chilling sensitivity in plants

温度是植物赖以生长和繁衍的重要环境因子，也是决定植物在地球上分布的关键因素之一。按照对低温的敏感性，陆生植物可以分为抗冷性植物如菠菜(Spinacia oleracea) 、拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 等，和冷敏感性植物如南瓜 (Cucurbita moschata) 、水稻 (Oryza sativa L)等。

低温对植物生理代谢的影响已有长期的研究，自Lyons(1973)提出低温膜伤害假说以来，国内外学者已从不同的角度探讨低温膜伤害的机理。

引言

就环境因素讲，低温、强光、干旱等外部环境的变化，引起细胞内过氧化氢酶 ( 陈贻竹 , 1988)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶 (POD) ( 林植芳等 , 1984；王以柔等 ,

1986)活性等内部环境的变化，从而导致植物体内超氧阴离子、 H2O2 等积累，最终引起膜脂过氧化 ( 伤害 ) 和丙二醛 (MDA)含量增加，而这些都与生物膜膜脂中脂肪酸的不饱和水平 ( 王洪春等 ,1980)密切相关。 就研究的部位讲，整个生物膜系统包括膜结合蛋白质、脂类、多糖等均与低温膜伤害有关，而位于叶肉细胞中的类囊体膜及膜结合蛋白质、脂类、多糖等在低温膜伤害中的变化更引人关注。

类囊体膜脂主要含有 :

●单半乳糖二酰基甘油 (monogalactosyldiglyceride,

MGDG)、

●双半乳糖二酰基甘油 (digalactosyldiglyceride,

DGDG)、

●硫代异鼠李糖甘油二脂(sulfoquinovosyldiglyceride, SQDG)、

●磷脂酰甘油 (Phosphatidylglycerol, PG)

% of total acyl lipid content

Glycerolipids

Chloroplast

thylakoid

inner

mitochondrial

membrane

plasma

membrane

MGDG 51% 0 0DGDG 26 0 0SQDG 7 0 0PC 3 27 32PS 0 25 0PG 9 0 0PE 0 29 46PI 1 0 19CL 0 20 0

Cardiolipin, CL 双磷脂酰甘油

Lipid composition varies between Lipid composition varies between organellesorganelles

研究类囊体膜脂与植物抗冷性关系倍受重视，概括起来主要进行了以下四方面的研究。

第一、通过改变类囊体膜脂组成来研究其功能。用生物化学手段重组试验研究 PG对菠菜光系统Ⅱ放氧活性的影响 ( 阳振乐等 , 2000),

或在控制的条件下用磷脂酶处理类囊体膜中的 PG，从而创造出脂类含量或组成不同的光合膜，研究脂类组成变化对类囊体膜光合功能的影响 (Siegenthaler, 1998),

通过膜蛋白与膜脂体外重组的方法，研究 PG在 LHC-Ⅱ三聚体形成中的作用 (Dubertret , 1994)。

采用遗传学和现代分子生物学方法，通过抑制或过量表达脂肪酸或脂类合成酶基因，从而改变某个特定脂或脂肪酸在类囊体膜中的组成。如以乙基甲烷磺酸盐为诱变剂，获得拟南芥类囊体膜脂脂肪酸去饱和酶基因的系列突变体 (Browse,

1994), 或用 RNA干扰技术 (RNAi)特异地阻断拟南芥体内特定脂肪酸去饱和酶基因 FAD2 (Stoutjesdijk et

al， 2002)、或棉花体内特定脂肪酸去饱和酶基因 FSD2和SAD-1的表达 (Liu 2002)，研究膜脂功能的变化。

第二，叶绿体类囊体膜膜脂不饱和度相关基因的研究

CC

CC

O

HOC

CC

CC

CC

CC

CC

CH3

16:0 16:0 palmitic acid palmitic acid 棕榈酸棕榈酸 , , 十六酸十六酸 , , 软脂酸软脂酸

18:118:1△△99,, oleic acid oleic acid 油酸油酸 , , 十八烯酸十八烯酸

CC

CC

O

HOC

CC

CC

CC C

C CC C

C CH

3

O

HOH

OH H

CH2OH

H

H

HO

CH2 － O － CO － R1|

| HC － O － CO － R2

O － CH2

CC

CC

O

HOC

CC

CC

C

CC

CC

CC C

CH3

亚油酸亚油酸 , , 罂酸罂酸 , , 十八碳二烯酸 十八碳二烯酸 18:2 18:2 △△9, 129, 12,, linoleic acid linoleic acid

CC

CC

O

HOC

CC

CC

C

CC

C

CC

C

C

CH3

亚麻酸亚麻酸 , , 十八碳三烯酸 十八碳三烯酸 18:3 18:3 △△9, 12,159, 12,15,, linolenic acid linolenic acid

图 . 拟南芥叶绿体和内质网膜脂中多不饱和脂肪酸的生物合成

图中箭头的宽度代表通过不同步骤的相对流量，途径中的“打断” ( 红色 ) 代表以下突变位点，且已从拟南芥中获得这些位点的突变体。

DAG ：二酰甘油； DGD ：双半乳糖甘油二脂；G3P ：甘油 -3- 磷酸；LPA ：溶血磷脂酸； MGD ：单半乳糖甘油二脂；PA ：磷脂酸；PC ：磷脂酰胆碱； PE ：磷脂酰乙醇胺；PG ：磷脂酰甘油 ;PI ：磷脂酰肌醇； SQD ：硫代异鼠李糖基甘油二脂。

脂肪酸合成途径是首先在质体基质中产生饱和脂肪酸（ 16:0 和 18:0 ）。第一步去饱和反应是由硬脂酸（ 18:0 ）形成油酸，由位于质体基质中的硬脂酰－ ACP 去饱和酶（ stearoyl-ACP desaturase, SAD ）催化完成 (Ohlrogge and Browse, 1995) 。18:1 和 16:0 是植物细胞在质体基质中合成的两种主要脂肪酸，它们形成甘油脂后，参与生物膜的构建。在各种去饱和酶的作用下，内质网或叶绿体被膜中的甘油脂部分脂肪酸被还原，成为含多不饱和脂肪酸的甘油脂 (Ohlrogge and Browse, 1995) 。

类 别 基 因编 码 酶 电 子

供 体亚细胞 定位 作 用 前 体 作用产物 功 能

FAD4 叶绿体 PG 16:0 16:1(3t) 在脂肪酸链中引入第 1 个双

键FAD5 叶绿体 MGD 16:0 16:1Δ7

ω-6 FAD2 内质网 PC 18:1Δ9 18:2Δ9,12

在脂肪酸链中引入第 2 个双

键

细胞 色素 b5

ω-6 FAD6 叶绿体

MGD 16:1Δ7 16:2Δ7,10

铁氧还 蛋白

DGD MGD

SQD PG18:1Δ9 18:2Δ9,12

ω-3 FAD3 内质网 PC 18:2Δ9,12 18:3Δ9,12,15

在脂肪酸链中引入第 3 个双

键

细胞 色素 b5

ω-3 FAD7 叶绿体

MGD 16:2Δ7,10 16:3Δ7,10,13

铁氧还 蛋白

MGD DGD

SQD PG18:2Δ9,12 18:3Δ9,12,15

ω-3 FAD8 叶绿体

MGD 16:2Δ7,10 16:3Δ7,10,13

MGD DGD

SQD PG18:2Δ9,12 18:3Δ9,12,15

ω-3脂肪酸去饱和酶是一种脂酰 - 脂去饱和酶，位于植物内质网膜、质体膜和兰藻类囊体膜上，其空间位置在 sn-1

或 sn-2，作用位置在 ω-3，以与载体结合的不饱和脂肪酸为底物，催化与甘油脂结合的二烯脂肪酸形成第三个双键。

O

HOH

OH H

CH2OH

H

H

HO

CH2 － O － CO － R1|

| HC － O － CO － R2

O － CH2

CC

CC

O

HOC

CC

CC

C

CC

CC

CC C

CH3

Kodama等 (1994)将拟南芥叶绿体 ω-3脂肪酸去饱和酶的基因 fad7 转至烟草，转化株不饱和脂肪酸 C18:3和C16:3含量明显升高 , 抗寒能力也随之增强。

Murakami (2000)等使烟草中 ω-3脂肪酸去饱和酶的编码基因沉默，导致突变植株的三烯脂肪酸比野生型植株明显减少，突变植株能更好的适应高温环境，而相应对低温环境的适应能力减弱。

Wakita等 (2001)将烟草微体 ω-3脂肪酸去饱和酶的基因 (NtFAD3) 通过农杆菌介导转入甘薯中，发现转基因植株中 C18:3的含量明显增加，同时，抗寒能力增强。

冷驯化是与提高植物抗冷性有关的生物化学及生理学过程，主要包括寒驯化 ( 喜温植物在中度低温 10-12℃ 下暴露数天后就能适应更低但非冰冻温度环境， cool acclimation)和冻驯化 ( 在 0℃ 以上处理植物，以提高它们耐受 0℃ 以下环境的能力， freezing acclimation) 两种类型。

在冷驯化过程中，植物感受低温信号之后，启动防御机制，包括物理结构适应 ( 质膜组成改变和细胞骨架重排 ) 、胞内渗透保护物质含量增加 ( 可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等 ) 、抗氧化剂的合成水平上升 ( 如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸还原酶 ) ，使植物体内重新恢复物质和能量代谢平衡，从而能够在温度更低的环境下存活。

第三，植物冷驯化 (cold acclimation)对叶绿体类囊体膜脂不饱和度和膜脂分子组成的影响

膜脂分子组成陈志强等（ 1994）研究发现：经低温锻炼后，抗寒与不抗寒品种小麦类囊体磷脂酰甘油 (PG) 的反式十六碳一烯酸含量均明显降低；抗寒品种小麦的 MGDG/DGDG比值明显降低 , 而不抗寒品种变化不明显。杨玲 (2001)的研究发现，经冷驯化后黄瓜子叶中 DGDG大量增加， MGDG含量变化不大。

膜脂不饱和度具有耐冻性的野生土豆种经冷驯化后质膜磷脂不饱和度增加 25%，而冷敏感的栽培种冷驯化后质膜磷脂不饱和度无明显变化 (Palta et al,

1993)。低温条件下，喜温植物雀稗草的三烯脂肪酸亚麻酸的含量明显升高，并且抗冷品种膜脂亚麻酸含量的变化大于中等抗冷品种和冷敏感品种(Cyril et al, 2002)。

第四，类囊体膜 PG分子组成与植物的抗冷性 类囊体膜脂磷脂酰甘油 (PG)因具有较多的饱和脂肪酸和一种特殊的脂肪酸 16:1(3t) 而被认为是一种对温度最为敏感、在降温过程中最先发生相变、从而影响膜流动性的分子 (Murata

N 等 ,1983) ，是一种涉及光合作用活动和植物抗寒性的重要磷脂。

CC

CC

O

HOC

CC

CC

CC

CC

CC

CH3

16:1 trans △3, 16:1(3t),

CC

CC

O

HOC

CC

CC

CC

CC

CC

CH316:0 palmitic acid 棕榈酸 , 十六酸 , 软脂酸

CH2 － O － CO － R1|

CH － O － CO － R2|

CH2 － O P CH2 |

| CH2OH

CHOH

－ O －

PG是一种广泛存在于植物细胞膜中的磷脂，但主要分布在叶绿体类囊体膜中，虽只占类囊体膜脂的 3%-10%，却是决定膜脂相变的主要因素 (Murata N, 1983)。 PG分子中高熔点分子 (C16:0/16:0 + C16:0/16:1t)占总分子种的百分比，或饱和脂肪酸 (C16:0 + C16:1t)占总脂肪酸的百分比与植物冷敏感性明显相关 (Murata N, 1983. Tasaka,

1990)。

Phase transition of a lipid bilayer.

heat

cool

拟南芥因含有高比例的顺式不饱和脂肪酸而较抗冷，南瓜则因含低比例不饱和脂肪酸而冷敏感 [19] 。

Murata等 [20] 分别将南瓜、拟南芥 G3PAT基因导入烟草，结果表明转基因植株叶片中 PG脂肪酸饱和度得到了明显的改变，转基因植物的抗寒性也发生了改变，转入冷敏感植物南瓜 G3PAT基因的烟草，类囊体膜 PG分子中饱和脂肪酸含量提高，因而抗冷力下降，对低温更敏感；而导入拟南芥G3PAT基因的烟草， PG分子中不饱和脂肪酸含量增加，抗寒性得到明显的提高。

1 冷敏感植物叶片中 PG分子饱和度比抗冷植物中的高

H2C － OH | HC － OH |H2C － O －P

16:0－

ACP

18:1－

ACP

H2C － O － 18:1 | HC － OH |H2C － O － P

16:0 － ACP18:1 － ACP

G-3-P 与 16:0 － ACP 结合

G-3-P 与 18:1 － ACP

结合

H2C － O － 16:0 | HC － OH |H2C － O － P

G3PAT 酶

叶绿体中存在甘油 -3-磷酸酰基转移酶 (glycerol-3-

phosphate acyl transferase,G3PAT)催化 C16:0或 C18:1( 反应中 C16:0 或 C18:1的载体是酰基载体蛋白 ACP)与甘油 -3-磷酸 (G-3-P)分子中甘油基 sn-1位上的 -OH进行酯化反应。

2 G3PAT酶的酰基选择性与类囊体膜脂中 PG分子饱和度的关系

饱和PG分子种

不饱和PG分子种

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

18:1sn-1sn-2

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

18:2sn-1sn-2

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

18:3sn-1sn-2

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

16:0sn-1sn-2

sn-3 P

sn-1sn-2

18:1 16:0

G3PAT 酶的酰基选择性

刚合成的 PG 初产物在sn-1 位是 18:1 或是 16:0 ，在 sn-2 位上是 16:0 或 16:1(3t) 。

H2C － OH|

H C － OH|

H2C － O － P H2C － O － 16:0|

H C － OH|

H2C － O － P

H2C － O － 18:1|

H C － OH|

H2C － O － P18:1/16:0

18:1/16:1(3t)

16:0/16:016:0/16:1(3t)

H2C － O － 18:2|

H C － OH|

H2C － O － P18:2/16:0

18:2/16:1(3t)

H2C － O － 18:3|

H C － OH|

H2C － O － P18:3/16:0

18:3/16:1(3t)

16:0-ACP

18:1-ACP

16:0-A

CP

18:1-A

CP

G3PAT

3 G3PAT酶结构与 G3PAT酶的酰基选择性的关系

G3PAT酶蛋白分子中都有一个保守的“ HX4D”模体 (H,

D 分别为组氨酸和天冬氨酸， X4代表其它 4 种氨基酸 ) 。定点突变证明，“ HX4D”模体中组氨酸 (H)的变化将导致该酶失去酰基转移的功能，推测该模体是该酶的催化中心。

南瓜 G3PAT酶中假定的 3-磷酸 -甘油 (G-3-P)结合位点 (G-3-P分子中碳原子是白色、氧原子红色、磷原子粉红色 ) 。

G-3-P分子中的磷酸部分躺在His139(H139) 、 Lys193(K193) 、 His194(H194) 、 Arg235(R235) 、 Arg237(R237)组成的带正电荷口袋里，甘油基的 C1-OH在口袋中的方向与在丝氨酸蛋白酶中起催化反应的丝氨酸分子中的 -OH方向相同，与来自 H(X)4D 模体中的 His139(H139) 和Asp144(D144)形成一个催化三联体 (catalytic triad), 图中用蓝绿色标明。

该图用 MIDAS PLUS(分子建模软件 , 美国加利福尼亚大学旧金山分校计算机图形实验室开发 ) 软件绘制，引自 Turnbull等(2001)。

南瓜 G3PAT酶中假定的脂酰基底物结合位点，结合位点部分显示了脂肪酸侧链的几种可能的构象。

脂肪酸链中的 9 个碳原子插在由 12个氨基酸残基( 图中用黑色表明 ) 组成的5ǺG 宽的口袋里，脂肪酸链末端的其余碳原子插在由 14个氨基酸残基( 图中用红色表明 ) 组成的10ǺG宽的口袋里。另外，与结合 G-3-P有关的 7 个氨基酸残基用黑色和方括号表示。该图用 MIDAS PLUS(分子建模软件 , 美国加利福尼亚大学旧金山分校计算机图形实验室开发 ) 软件绘制，引自 Turnbull等(2001)

在冷敏感植物如南瓜中， C16:0/C18:1底物通过范德华力结合在由 14个氨基酸残基组成的深的、很窄的疏水性“口袋”里，由于该“口袋”的口很小，酶分子对底物无选择性( 即对 C16:0或 C18:1有同等的选择机会 ) 。若扩大“口袋”的口，酶分子可优先选择底物 C18:1。因为 C16:0脂酰基是直的棒状构象，顺式结构的 C18:1脂酰基是弯的棒状构象，且多两个碳原子。

Slabas 等 (2002) 在南瓜中，将位于“口袋”口的第 261位亮氨酸 (Leu261) 改换成另一个氨基酸，而使“口袋”口张大，改变了该酶的原有特性，变成优先选择底物18:1ACP，最后提高 PG分子的不饱和水平。

在组成 G3PAT酶深的、很窄的疏水性“口袋”的 14个氨基酸残基中，籼粳稻之间有较大差异，这可能是引起籼粳稻 G3PAT酶对18:1ACP/16:0ACP选择比值有差异的主要原因。

已做的工作

饱和PG分子种

不饱和PG分子种

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

18:1sn-1sn-2

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

18:2sn-1sn-2

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

18:3sn-1sn-2

sn-316:0 或 16:1(3t)

P

16:0sn-1sn-2

sn-3 P

sn-1sn-2

18:1 16:0

G3PAT 酶的酰基选择性

研究证明： G3PAT 酶的酰基选择性在籼粳稻间有差异

已做的工作

思路与技术路线

Thank you