SẮC KÝ CỘT

Tách chiết và phân lập hợp chất thiên nhiên Phương pháp sắc ký cột

MỤC LỤCMỞ ĐẦU…………………………………………………………………………… 3

NỘI DUNG …………………………………………………………….…………...4

Chương 1. CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ …………………………………… 4

1. Lịch sử sắc ký …………………………………………………………………. 4

2. Định nghĩa sắc ký……………………………………………………………… 4

3. Các nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật sắc ký …………………………………… 5

4. Phân loại sắc ký………………………………………………………………... 6

4.1. Phân loại theo bản chất của hai pha sử dụng ……………………………… 6

4.2. Phân loại theo bản chất tương tác………………………………………….. 7

4.3. Phân loại theo cấu hình ……………………………………………………. 8

Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ ………………………………………...………….... 10

1. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT …………………………………………………….. 10

1.1. Cột…………………………………………………………………………...10

1.2. Các loại pha tĩnh dùng nhồi cột ……………………………………………. 10

1.2.1. Silica gel ……………………………………………………………... 10

1.2.2. Alumina …………………………………………………………….... 14

1.2.3. Kieselguhr – Celite …………………………………………………... 14

1.2.4. Gel …………………………………………………………………….14

1.3. Dung môi …………………………………………………………………... 15

1.3.1. Các dung môi thường dùng cho sác ký cột ………………………….. 15

1.3.2. Cách chọn dung môi thích hợp……………………………………….. 15

1.4. Mẫu sắc ký …………………………………………………………………. 15

2. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH ……………………………………………………. 16

2.1. Chuẩn bị cột ……………………………………………………………….. 16

2.2. Nạp mẫu cần tách lên cột sắc ký ……………………………………………17

2.2.1. Nạp mẫu dạng dung dịch …………………………………………….. 17

2.2.2. Nạp mẫu dạng bột khô ………………………………………………..18

2.3. Giải ly chất ra khỏi cột …………………………………………………….. 19

2.3.1. Các phương pháp giải ly ……………………………………………... 19

2.3.2. Dung môi giải ly và kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung môi giải

ly …………………………………………………………………………………… 20

1


2.3.3. Vận tốc giải ly ……………………………………………….………. 21

2.3.4. Theo dõi quá trình giải ly cột …………………………………………22

2.3.5. Ghi nhận kết quả sắc ký ………………………………………………23

2.4. Xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất ……………………………… 23

3. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VÀ ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ CỘT HỞ …………… 24

3.1. Ưu điểm ……………………………………………………………………. 24

3.2. Nhược điểm ………………………………………………………………... 24

3.3. Ứng dụng …………………………………………………………………... 24

Chương 3: MỘT VÀI KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT KHÁC ……………………….. 25

1. Sắc ký cột khô ………………………………………………………………… 25

2. Sắc ký cột nhanh ………………………………………………………………. 27

3. Sắc ký nhanh cột khô ………………………………………………………….. 29

KẾT LUẬN …………………………………………………………………………32

TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………………..... 33

2


MỞ ĐẦU Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên, hàng trăm

nghìn các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên cứu để phục vụ cho

nhiều lĩnh vực của cuộc sống. Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu cung cấp

các hoạt chất quí hiếm để tạo ra các biệt dược mà còn cung cấp các chất dẫn đường để

tổng hợp ra các loại thuốc mới. Từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các

nhà khoa học đã chuyển hóa chúng thành những hợp chất có khả năng trị bệnh rất cao.

Vì vậy việc tách chiết, cô lập hợp chất thiên nhiên là công việc thật sự cần thiết.

Có nhiều phương pháp để tách chiêt, cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây cỏ. Một

trong những phương pháp thường hay dùng nhất là phương pháp sắc ký. Phương pháp

sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả và nhanh

chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa học

các hợp chất thiên nhiên. Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho

phép ta ứng dụng nó ở mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện. Ngày nay, phương pháp sắc ký

được sử dụng để tách tất cả mọi hợp chất dù có màu hay không màu, dù trọng lượng

phân tử nhỏ hay lớn.

Do các phân tử sinh học rất thiên hình vạn trạng với trọng lượng phân tử lớn

nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều ít khác nhau nên không thể nào có một kỹ thuật

sắc ký chung cho các loại hợp chất khác nhau. Trong bài báo cáo này, tôi xin giới thiệu

một phương pháp sắc ký thường dùng trong phòng thí nghiệm đó là Phương pháp Sắc

ký cột. Đối với người nghiên cứu về hóa học hợp chất thiên nhiên thì việc tìm hiểu sơ

bộ về sắc ký cột cung như việc ứng dụng kỹ thuật sắc ký cột là một việc vô cùng cần

thiết, có thể sử dụng hiệu quả vào trong công tác nghiên cứu của mình.

3


NỘI DUNGChương 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẮC KÝ

1. Lich sư săc ky

Từ ngữ sắc ký trong tiếng Anh là “chromatography” có xuất xứ từ chữ “chroma”

trong tiếng La Tinh có nghĩa là chất màu. Năm 1903 nhà thực vật học người Nga

Mikhail Semyonovich Tsvett đã dùng cột nhôm oxit (có tài liệu nói cột canxi

cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả tách thành công chlorophyl từ lá

cây. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt

tên phương pháp này là phương pháp sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi

màu vì đã tách được những chất có màu.

Kỹ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20. Các nhà nghiên cứu

nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách

khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau. Đồng thời, kĩ thuật thực hiện

sắc ký cung tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau. Sự phát

triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không còn đúng theo ý nghĩa

ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký đều có những nét chung

nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn hợp chất phân tích qua lớp chất

bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng mang trên chất rắn hoặc giấy và sự

chuyển dịch đó được thực hiện bằng một chất khí hoặc chất lỏng (pha động).

Trong những năm 1930, hàng loạt các nhà hóa học đã được vinh danh bằng giải

thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ vào những thành công trong

việc sử dụng kỹ thuật sắc ký cột hấp phụ:

- 1937, P. KARRER (Thụy Sĩ) về hóa học Carotenoid đặc biệt là vitamin A và

vitamin B.

- 1938 R.KUHN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin.

- 1939 L.RIZICKA (Thụy Sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid.

- 1940 MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp

silica gel và về sau phát triển sang sắc ký giấy. Hai ông được giải thưởng Nobel năm

1952 về sắc ký phân bố.

- 1948 TISLIUS (Thụy Điển) được giải Nobel về kỹ thuật điện di và sắc ký hấp

phụ.

4

http://vi.wikipedia.org/wiki/Th%E1%BA%BF_k%E1%BB%89_20


2. Đinh nghĩa săc ky

- Định nghĩa của Mikhail S. Tsvett (1906): sắc ký là một phương pháp tách trong

đó các cấu tử của một hỗn hợp được tách trên một cột hấp thụ đặt trong một hệ thống

đang chảy.

- Định nghĩa của IUPAC (1993): sắc ký là một phương pháp tách trong đó các cấu

tử được tách được phân bố giữa hai pha, một trong hai pha là pha tĩnh đứng yên còn

pha kia chuyển động theo một hướng xác định. Trong sắc ký cột, pha tĩnh được giữ

trong một cột ngắn và pha động được cho chuyển động qua cột bởi áp suất hoặc do

trọng lực.

- Hiện nay: sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự

phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh.

3. Các nguyên tăc cơ ban cua ky thuât săc ky

Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách riêng các thành phần trong một hỗn

hợp bằng cách phân chia chúng thành 2 pha: pha động và pha tĩnh.

§

Đối với các chất riêng biệt trong hỗn hợp, tùy theo khả năng hấp phụ và khả

năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để được lấy ra lần lượt trước hoặc sau.

5

Pha động (Mobile phase)

Pha tĩnh (Stationar phase)

Lúc khởi đầu

Các thành phần của hỗn hợp phân bố khác nhau vào hai pha

Trạng thái cân bằng, các thành phần của hỗn hợp đã phân bố giữa hai pha theo một tỉ lệ nhất định

Nhận xét:Hợp chất ( ) có ái lực mạnh hơn đối với pha tĩnh

Hệ số phân chia là sự phân bố thí dụ: của 2 loại hợp chất ( ) và ( ) trong một hệ thống gồm có hai pha: pha động và pha tĩnh


Sắc ký hấp phụ được thực hiện trên một ống trơ về mặt hóa học đối với các chất

trong quá trình sắc ký, cột có thể là: thủy tinh, kim loại, nhựa thẳng đứng gọi là “cột”

với chất hấp phụ đóng vai trò pha tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò pha động chảy

qua chất hấp phụ .

Chất hấp phụ trong sắc ký cột thường dùng là oxid nhôm, silica gel, CaCO3, than

hoạt tính, polyamid, các loại có gắn nhóm ion,… Các chất này phải được tiêu chuẩn

hóa.

Dung môi dùng có thể là một hoặc hỗn hợp nhiều loại dung môi có tỉ lệ thích

hợp. Quy trình rửa giải nói chung là sử dụng dung môi có tính chất hướng về một phía

hoặc tăng hoặc giảm về tính chất. Với các chất hấp phụ pha thuận cổ điển, dung môi

sử dụng có độ phân cực tăng dần.

Việc tách hai hợp chất nào đó ra riêng có đạt kết quả tốt hay không là tùy thuộc

vào hệ số phân chia (partition coeffiicient). Bất kỳ một hợp chất nào khi được đặt vào

một hệ thống gồm có 2 pha (thí dụ: hai pha lỏng-lỏng hoặc rắn-lỏng), lúc đạt đến trạng

thái cân bằng, hợp chất đó sẽ phân bố vào mỗi pha với một tỉ lệ nồng độ cố định, tỉ lệ

này thay đổi tùy vào các tính chất động học của các hợp chất và của cả hai pha

Hệ số phân chia K được biểu diễn như sau:

Mỗi hợp chất sẽ có ái lực riêng của nó đối với hai pha, vì thế sẽ có tương tác

mạnh/yếu khác nhau đối với pha tĩnh. Hệ quả là mỗi hợp chất sẽ di chuyển ngang qua

pha tĩnh với một vân tốc khác nhau, nhờ vậy kỹ thuật sắc ký có thể tách riêng các loại

hợp chất.

4. Phân loai săc ky

4.1. Phân loai theo ban chất hai pha sư dung

Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh và pha động, người ta phân biệt một số kỹ

thuật sắc ký khác nhau.

- Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng. Pha tĩnh tách riêng các hợp chất

trong một hỗn hợp nào đó là nhờ vào tính chất hấp phụ của nó.

+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumina hoặc silica gel đã được xử lý, có thể

được nạp nén vào trong một cột hoặc được tráng thành một lớp mỏng, phủ lên trên bề

mặt một tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm nhựa.

6


+ Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất

mang rắn hoặc một chuỗi dây cacbon dài được gắn lên trên chất mang rắn.

- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha động là chất khí: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký khí

+ Pha động là chất lỏng: ví dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc

ký cột.

4.2. Phân loai theo ban chất tương tác

Sắc ký phân chia:

* Pha động: chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)

* Pha tĩnh là chất lỏng, đó là một lớp chất lỏng với chiều dài thật mỏng, chất

lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn mịn, có trơ.

Sắc ký hấp phụ:

* Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.

* Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi

trong một cái ống. Những hạt rắn trơ này cung giống như những hạt rắn trong sắc ký

phân chia, nhưng không có phủ chất lỏng bên ngoài, bản thân hạt rắn là pha tĩnh.

Tiêu biểu của sắc ký hấp phụ. Pha tĩnh rắn là những hạt rắn, nhuyễn, trơ

7


Sắc ký trao đổi ion:

Tiêu biểu của sắc ký trao đổi ion

* Pha động là chỉ có thể là chất lỏng

* Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học gọi là

polyme, nên được gọi là các hạt nhựa. Bề mặt của các hạt mang nhóm chức ở dạng

ion.

Sắc ký lọc gel:

* Pha động chỉ có thể là chất lỏng

* Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polyme, trên bề mặt của các

hạt có nhiều lỗ rỗng. Mỗi loại nhựa có một kích cỡ nhất định, biết trước.

Tiêu biểu của sắc ký lọc gel

8


4.3. Phân loai theo cấu hinh

Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng:

Phương pháp sắc kí lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng các chất hấp

phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt

phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một

dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí

nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.

Chế phân tách của sắc ký giấy chủ yếu là phân bố, trong đó pha tĩnh (thường là

nước) được thấm trên một tờ giấy thấm đặc biệt gọi là giấy sắc ký. Nhờ các xoang

rỗng trong sợi cellulose của tờ giấy sắc ký khác nhau, phân biệt theo độ thấm dung

môi và mức độ dày mỏng của giấy, với các mã hiệu tùy thuộc vào hãng sản xuất. Khi

tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp.

Sắc ký cột

Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ,

được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa, dụng cụ này giống

như cái buret định phân trong phòng thí nghiệm.

Có thể nói sắc ký cột là một dạng của sắc ký giấy hoặc sắc ký lớp mỏng nhưng

ở đây pha tĩnh được nhồi vào cột, nhờ vậy có thể triển khai một cách liên tục với nhiều

hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.

Trong sắc ký cột pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột. Tùy theo tính chất

của chất dùng làm cột mà sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột

hấp phụ) hoặc theo cơ chế phân bố (cột phân bố).

Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất

khí quyển. Pha tĩnh thường là những hạt có kích thước

tương đối lớn (50-150μm), được nạp trong một cột

bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt phía

trên đầu pha tĩnh, có một lớp bông thủy tinh đặt lên trên

bề mặt để không bị xáo trộn lớp mặt. Dung môi giải ly

được đưa ra và hứng trong những lọ nhỏ ở phía dưới

cột, rồi đem cô quay đuổi dung môi, dùng sắc lý lớp

mỏng để theo dõi quá trình giải ly.

Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường thì hợp chất không hoặc

kém phân cực được giải ly ra khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly ra sau.

9

http://vi.wikipedia.org/wiki/Ph%C3%A2n_c%E1%BB%B1c

http://vi.wikipedia.org/wiki/Mao_d%E1%BA%ABn

http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose

http://vi.wikipedia.org/w/index.php?title=Aluminium_oxide&action=edit&redlink=1

http://vi.wikipedia.org/wiki/Silica_gel


Còn trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel pha đảo thì những hợp chất phân cực sẽ

giải ly ra khỏi trước và những chất phân cực kém sẽ giải ly sau.

10


Chương 2: SẮC KÝ CỘT HỞ

1. DỤNG CỤ - HÓA CHẤT

1.1. Cột

Cột là những ống hình trụ bằng thủy tinh dài

30-70 cm, đường kính 1-5 cm, đầu dưới có một

vòi thủy tinh và 1 khóa để điều chỉnh tốc độ

chảy.

Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lượng mẫu

chất cần phân tách

- Trọng lượng chất hấp phụ phải lớn hơn 25-

50 lần trọng lượng mẫu cần sắc ký. Tuy nhiên

với những hỗn hợp các hợp chất khó tách riêng

thì cần sử dụng số lượng chất hấp phụ nhiều hơn

(lớn hơn 100-200 lần), còn với các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp

phụ ít hơn.

- Tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp phụ và đường kính trong của cột vào khoảng

10:1

Muốn biết lượng chất hấp phụ có phù hợp với cột thì cho chất hấp phụ khô vào

cột để quan sát.

1.2. Các loai pha tĩnh dùng nhồi cột

1.2.1. Silica gel

* Silica gel pha thường: được chế tạo bằng cách thủy giải silicat natri (cho tác

dụng với acid sulfuric) để thành polysilisic, tiếp theo là ngưng tụ và polyme hóa để đạt

các chỉ tiêu vật lý cần thiết như có các hạt với kích cỡ, thể tích lỗ rỗng trên bề mặt,

diện tích bề mặt, … như yêu cầu.

11


Silica gel

Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cổ điển có đường kính hạt trung bình khoảng

40-200µm, các lỗ rỗng có đường kính trung bình khoảng 40-300A, diện tích bề mặt

khoảng 100-800 m2/g.

Các vị trí hoạt động trên bề mặt của hạt silica gel là các nhóm silanol, mỗi nhóm

cách nhau 5A. Đây là những tâm rất hoạt động có thể tạo nối hydrogen mạnh với

những hợp chất được sắc ký. Vì thế, khi sắc ký cột với cột nhồi bằng silica gel, những

hợp chất phân cực (có mang nhóm chức -OH, -NH2, -COOH...) có khả năng tạo nối

hydro mạnh, bị silica gel giữ chặt lại trong cột và bị giải ly ra chậm hơn so với những

chất khác có tính kém phân cực như alkan, terpen (là những hợp chất không chứa

những nhóm chức có thể tạo nên nối hydrogen) ít bị silica gel giữ lại, sẽ ra khỏi cột

sớm.

- Muốn điều chỉnh hoạt tính bề mặt của silica gel chỉ cần thêm hoặc loại bỏ

nước. Khi silica gel hấp phụ nước, các phân tử nước sẽ che khuất những vị trí hoạt

động trên bề mặt của hạt silica gel làm hạt bị giảm hoạt tính; muốn silica gel hoạt tính

trở lại, chỉ cần đun nóng để loại bỏ nước. Đây là quá trình thuận nghịch, muốn làm

giảm hoạt tính silica gel thì chỉ cần cho thêm nước vào. Tuy nhiên, khi đun nóng

khoảng 400-500C, quá trình thuận nghịch biến mất, silica gel bị mất vĩnh viễn hoạt

tính bề mặt, do hai nhóm silanol kề bên mất một phân tử nước, tạo thành nối eter,

không còn tính sắc ký.

Mô tả bề mặt hạt silica gel

- Hoạt tính của silica gel là khả năng hấp phụ nước, được đo bởi số Brockmann.

Silica gel có số Brockmann càng lớn thì bề mặt càng kém hoạt tính.

- Có thể hiệu chỉnh tính của silica gel bằng cách cho silica gel kết hợp với

12


những hợp chất khác như base, các dung dịch đệm ở mức pH xác định. Cung có thể

thêm nitrat bạc để làm gia tăng khả năng tách các hợp chất, nhất là alken.

Tuy nhiên cung cần nhớ là với một hợp chất nào đó đang bị silica gel giữ lại

trong cột, giải ly chất đó ra khỏi cột được hay không cung còn tùy vào việc sử dụng

dung môi giải ly có độ phân cực mạnh hay yếu. Dung môi nào có thể tạo nối hydrogen

mạnh sẽ là dung môi thích hợp để giải ly các hợp chất phân cực mạnh ra khỏi cột silica

gel. Hơn nữa, muốn đuổi hết các hợp chất phân cực thí dụ các flavonoid, triterpen

glycosid nên dùng 1-2% acid axetic trong metanol.

* Silica gel chế hóa: được điều chế bằng cách cho các nhóm chức silanol của

silica tác dụng với nhiều loại clorur silil khác nhau để tạo thành những loại chất hấp

phụ mới, với các đặc tính vật lý đổi khác, được gọi là silica gel-tạo nối. Có thể chế hóa

thành silica gel-tạo nối dùng cho pha thường hoặc pha đảo.

- Silica gel tạo nối dùng cho pha đảo: Cho silica gel tác dụng với

clorodimetylalkylsilan R-Si(CH3)2-Cl để tạo silica gel mới có tính không phân cực.

Dây alkyl R thường là C-1, C-2, C-4, C-6, C-8, và C-18. Tuy nhiên, thường hay chế

tạo dây C-8 và C-18. Silica gel pha đảo có ái lực mạnh với các hợp chất kém phân cực

và giữ chặt các hợp chất này lại trong cột. Pha động thường là nước, sau đó thêm vào

các dung môi hữu cơ để làm giảm độ phân cực của dung môi giải ly, như thế chất phân

cực sẽ giải ly ra khỏi cột trước, và những chất kém phân cực sẽ ra sau.

Cấu trúc bề mặt silica gel pha đảo

13


- Silica gel tạo nối dùng cho pha thường: Điều chế tương tự như silica gel tạo

nối dùng cho pha đảo với R thường là: phenyl, cyano, amino, diol,…Ưu điểm của nó

là bền đối với tất cả các loại dung môi kể cả các dung môi có tính phân cực mạnh nên

có thể sử dụng dung môi phân cực mạnh để giải ly ra khỏi cột tất cả các hợp chất có

tính phân cực mạnh, trong khi đó silica gel thường sẽ giữ rất mạnh các hợp chất có

tính phân cực, nhiều khi hợp chất bị dính luôn trong cột, không thể giải ly ra khỏi cột.

Cấu trúc và tên gọi một số loại silica gel-tạo nối dùng cho pha thường

- Silica gel tạo nối dùng cho sắc ký thủ tính:

Hoạt tính sinh học của những hợp chất thủ tính đặc trưng tùy theo hóa học lập

thể của chúng. Có đối phân có hoạt tính chữa bệnh trong khi đối phân còn lại không có

được tính đó, mà lại có khi còn độc hại, vì thế nhất thiết phải tách riêng chúng. Nhưng

hai đối phân có đặc tính vật lý giống nhau, cùng độ hòa tan vào cùng một loại dung

môi nào đó, nên không thể sử dụng sắc ký để tách chúng được, cho dù sử dụng silica

gel pha thường hay pha đảo, cột thường hay cột hiệu năng cao HPLC.

Có nhiều loại silica gel thương phẩm sử dụng cho sắc ký thủ tính với cơ chế lưu

giữ chất khác nhau, một số những chất đó sử dụng silica gel làm chất nền.

Bang 1: Phân loai một vài pha tĩnh thủ tính

Loai pha thu tính Cơ chế băt giữ chất cua pha tĩnh

Pirkle Tương tác qua ba điểm

Polymer hình xoắn ốc - thủ tính

(polysaccarid)Các nối kỵ nước (hydrophobic bond)

Cyclodextrin và eter vòng

(Crown ether)

Tương tác giữa chủ-khách (tương tác giữa chất

tan đối với lỗ rỗng có tính thủ tính của chủ là

cyclodextrin)

Enzym bị giữ cố định Ái lực thủ tính

14


(Immobilised)

Phức amino acid kim loại Phức xuyên lập thể phân

1.2.2. Alumina

Alumina là oxid aluminium Al2O3, được điều chế qui trình tương tự như silica

gel nhưng trên nguyên liệu là hydroxid aluminium, hơn thế nữa có thể điều chỉnh độ

pH của dung dịch phản ứng để sản xuất ra hạt alumina với bề mặt có tính acid, tính

kiềm hay trung tính.

- Alumina base: chứa khoảng 0,1-0,5% NaOH bám trên mặt alumina ở dạng

natri aluminat, có pH 10.

- Alumina trung tính: pH từ 6,5-7

- Alumina axit: pH 4

Alumina

Nhiệt độ lúc hoạt hóa trong quá trình điều chế là đặc điểm khác nhau giữa

alumina và silica gel. Muốn có alumina hoạt tính mạnh, cần phải đun nóng alumina ở

400-450oC trong 12-16 giờ. Muốn giảm hoạt tính alumina, thêm nước vào.

1.2.3. Kieselguhr-Celite

Kieselguhr và Celite là loại đất sét diatomit. Nguyên liệu này có các lỗ rỗng

lớn, diện tích bề mặt lớn và có tính hấp phụ rất yếu. Khả năng hấp phụ còn có thể giảm

hơn nữa bằng cách cho tác dụng với dung dịch HCl 3%, rửa sạch clor và sấy khô ở

80oC. Với các tính chất trên, nó được sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký phân chia.

1.2.4. Gel

Gel là tên gọi chung cho các loại pha tĩnh được điều chế từ tinh bột, agar

(polysaccarid) hoặc polyacrylamid, trong đó các chuỗi dây dài được nối mạng ngang

để tạo thành mạng không gian 3 chiều.

15


1.3. Dung môi:

1.3.1. Các dung môi thường dùng cho săc ky cột: hexan, benzene, chloroform,

aceton, etanol, methanol, butanol, nước.

Thứ tự độ phân cực tăng dần: Ete dầu hỏa < hexan < xiclohexan < CCl4,<

benzen < toluen < diclometan < CHCl3 < dietyl ete < etyl axetat < axeton < pyridin <

propanol < etanol < nước < axit axetic

1.3.2. Cách chọn dung môi thích hợp

Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò

tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp, với các bước tuần tự như sau:

Bước 1: Mẫu cần sắc kí được hòa tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp, với

nồng độ 10mg/ml gọi là dung dịch mẫu (A).

Bước 2: Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5 x 10 cm. Chấm lên những tấm bản này

mỗi tấm 1 chấm khoảng 2-5µl dung dịch (A).

Bước 3: Mỗi bản mỏng được triển khai với 1 loại dung môi giải ly khác nhau,

kế đó hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc bằng các thuốc thử. Với đơn dung

môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào là phù hợp. Từ kết quả đó, cố gắng tìm một

hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực.

Bước 4:

- Với hỗn hợp mẫu chất là kết quả của phản ứng tổng hợp hữu cơ, ta chọn hệ

dung môi có thể đẩy hợp chất cần quan tâm lên ở vị trí trên bản với Rf = 0,2-0,3.

- Với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ, chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung

môi có thể đẩy vết ít phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bản với Rf = 0,5 và chọn

dung môi chấm dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết

lên vị trí ở bản với Rf = 0,2.

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho

sắc ký cột. Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực

cho dung môi giải ly.

Lưu ý:

- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau.

- Phải chỉnh tỉ lệ dung môi giải ly cột sao cho có tính kém phân cực 1 ít so với

hệ dung môi đã chọn bằng sắc ký lớp mỏng.

1.4. Mẫu săc ky

Mẫu thử trước khi phân tích phải được loại tạp chất bằng phương pháp thích

16


hợp. Mẫu thử có thể ở 2 dạng:

- Dạng dung dịch khá đậm đặc: hòa tan mẫu trong dung môi không quá phân

cực so với hệ dung môi pha động. VD: Pha động là benzen-EtOAc thì tốt nhất là hòa

tan mẫu trong benzene, nếu mẫu không tan trong benzene thì dùng dung môi phân cực

hơn benzene một chút.

- Dạng bột khô: hòa tan mẫu trong dung môi như etyl axetat hoặc methanol,

thêm vào silica gel hạt lớn vừa đủ, cô quay hỗn hợp để đuổi hết dung môi thu được

mẫu ở dạng bột mịn tơi xốp.

Mẫu dạng dung dịch đậm đặc Mẫu dạng bột khô

2. KỸ THUẬT TIẾN HÀNH

2.1. Chuẩn bi cột: Yêu cầu là chất rắn làm cột phải phân tán đồng đều ở mọi điểm

trong cột thành một khối đồng nhất.

- Rửa cột thật sạch, tráng với nước cất và sấy khô.

- Cho bông gòn vào đáy cột (có thể cho thêm một lớp cát mịn sạch). Kẹp cột thẳng

đứng trên giá.

- Cho chất hấp phụ vào cột thường được gọi là nhồi cột. Có 2 cách nhồi cột: nhồi

cột ướt và nhồi cột khô.

+ Nhồi cột ướt: Chất hấp phụ được nạp vào cột ở dạng sệt, được chuẩn bị như

sau:

Trong 1 becher có chứa sẵn dung môi, cho chất hấp phụ

từng lượng nhỏ và đều đặn vào becher, vừa cho vừa khuấy đều.

Đặt lên đầu cột một phễu lọc đuôi dài, rót hỗn hợp sệt vào

cột, mở nhẹ khóa bên dưới cột cho dung môi chảy qua, hứng

dung môi vào một becher trống, dung môi này được sử dụng lại

để rót lên đầu cột.

Rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng 1 thanh cao su

gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp phụ nén đều trong cột.

17


Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy ra và rót trở lại đầu cột vài lần để việc

nạp cột được chặt chẽ cho đến khi thấy chất hấp phụ trong cột có dạng đồng nhất và

mặt thoáng chất hấp phụ ở đầu cột phải nằm ngang. Không được để đầu cột bị khô,

nghĩa là dung môi phải luôn phủ trên phần đầu cột.

- Nhồi cột khô: Cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều

cao cột.

Cho chất hấp phụ ở dạng bột khô vào thẳng trong cột qua phễu lọc đuôi dài, đều

đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột. Khi lớp chất hấp phụ

đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột thì mở nhẹ khóa cho dung môi chảy ra,

hứng dung môi và 1 becher trống, dung môi được sử dụng lại để rót trở lại lên đầu cột.

Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp phụ vài lần đến khi thấy

chất hấp phụ trong cột có dạng đồng nhất.

Lưu ý: Quá trình nhồi cột phải thực hiện một cách cẩn thận, nếu quan sát thấy

có nhiều bọt khí hoặc có những bất thường trong cột thì phải xả hết cột và nạp lại từ

đầu.

Cột sau khi được nạp silica gel

2.2. Nap mẫu cần tách lên cột săc ky

2.2.1. Nap mẫu dang dung dich

- Mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột để hạ mức dung môi trong cột xuống

sao cho vừa sát với mặt thoáng của chất hấp phụ trong cột.

- Đóng khóa lại, dùng pipette hút dung dịch mẫu chất và nạp vào đầu cột. Muốn

nạp mẫu đặt đầu của pipette gần sát với mặt thoáng của chất hấp phụ trong cột, vừa

bóp vừa rây pipette dọc quanh thành trong của cột, cho dung dịch chất chảy ra dọc

18


theo thành trong của cột chạm xuống bề mặt của chất hấp phụ .

- Mở khóa bên dưới cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm

cho dung dịch mẫu được thấm hết vào chất hấp phụ trên đầu

cột.

- Dùng pipette cho một lượng nhỏ dung môi mới lên đầu

cột, dùng dung môi này để rửa sạch dung dịch mẫu chất đã dính

trên thành cột. Tiếp tục mở khóa cho dung môi chảy qua. Lặp

lại vài lần như thế để dung dịch mẫu thấm sâu vào phần chất

hấp phụ ở phần đầu cột và phần dung môi trên đầu cột trở nên

trong suốt.

- Cho một lớp cát (hoặc bông gòn) dầy khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt

thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ mặt cột.

Sau khi nạp mẫu xong cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.

Cột sau khi đã nạp mẫu

2.2.2. Nap mẫu dang bột khô:

Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá

trình sắc ký cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực thay vì phải hoà tan mẫu trong

dung môi phân cực có thể ảnh hưởng đến quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.

Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc ký (Xg) được hoà tan trong

dung môi như etylaxetat hoặc metanol (50Xg) cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn

(10Xg). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ

mẫu sắc ký đã được tẩm đều lên bề mặt của những hạt silica gel.

19


Đặt mẫu bột khô này lên trên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại chọn để bắt

đầu quá trình sắc ký cột) thấm ướt phần bột silica gel. Cho một lớp cát dầy khoảng 3-6

mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp phụ để bảo vệ bề mặt. Cuối cùng cho

dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.

2.3. Giai ly chất ra khỏi cột

2.3.1. Các phương pháp giai ly

- Giải ly nhờ vào trọng lực: các hạt gel nạp cột phải có kích thước lớn hơn

60µm. Nếu sử dụng những hạt gel có kích thước nhỏ hơn, dung môi ra khỏi cột rất

chậm và cần phải nhờ đến một lực để có thể ra khỏi cột.

- Giải ly sử dụng lực đẩy: dùng máy bơm tạo áp lực để đẩy dung môi đi ngang

qua pha tĩnh. Sử dụng hạt gel có kích thước 40-63 µm và cột sắc ký phải có thành dầy

với lớp bao lưới che chắn bên ngoài để tránh khi sử dụng áp suất cao, cột có thể bị nổ

vỡ.

Hai loại dụng cụ giúp đẩy dung môi vào đầu cột cho sắc ký chớp nhoáng

- Giải ly sử dụng lực hút: dùng máy bơm hút tạo chân không ở đầu ra của cột.

Kỹ thuật này cung cho kết quả tương tự như trên, nhưng việc thu lấy dung môi giải ly

có phần kém thuận tiện vì phải ngưng tạo chân không, tháo thiết bị để rót dung môi ra.

Tuy vậy kỹ thuật này an toàn hơn.

Giải ly sử dụng lực hút

20


Như vậy, các kỹ thuật sắc ký khác nhau là việc sử dụng kích thước khác nhau

của hạt gel làm pha tĩnh và việc sử dụng áp lực để giải ly dung môi ra khỏi cột.

Cột áp suất thấp, sử dụng cột làm bằng thuỷ tinh: thường sử dụng hạt có kích cỡ

40 – 200 µm, sử dụng áp suất bình thường của bầu khí quyển.

Cột áp suất trung bình, sử dụng cột làm bằng thuỷ tinh dầy: thường sử dụng hạt

có kích thước cỡ 25 – 40 µm; thực hiện ở áp suất 75 – 600 psi (tức 5 – 40 bar).

HPLC sử dụng cột bằng thép không rỉ: hạt nạp có kích cỡ 3 – 10 µm; thực hiện ở

áp suất 500 – 3000 psi.

2.3.2. Dung môi giai ly và ky thuât tăng dần tính phân cực cho dung môi giai ly

- Giải ly sử dụng dung môi đơn nồng độ: chỉ sử dụng đơn dung môi hoặc hỗn

hợp dung môi nhưng trong hỗn hợp tỉ lệ giữa các thành phần không thay đổi để giải ly

cho đến khi việc tách chất hoàn tất.

- Giải ly sử dụng dung môi có nồng độ tăng theo kiểu bậc thang: Việc sử dụng

một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định và một số cấu tử

khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Vì thế muốn đuổi chúng ra khỏi cột,

phải dùng một dung môi có ái lực mạnh hơn.

Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nên cho thêm từ từ mỗi

lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cu đã sử

dụng. Không nên tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột.

Ví dụ: Đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang benzen, sẽ pha benzen vào

hexan theo tỉ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50%, 100% benzen.

Bang 2: Các dung môi thường dùng trong sắc ký cột, được sắp xếp theo chỉ số phân

cực tăng dần

Dung môiNhiệt độ

sôi (oC)

Hằng số

điện môi

ở 25oC

Chỉ số

phân cực

Độ nhớt

(mN.S.m-2)

Độ tan

trong

nước

(%w/w)

Pentan 36 1,8 0,0 0,23 0,004

Hexan 69 1,9 0,0 0,33 0,001

Heptan 98 - 0,0 0,39 0,0003

Ciclohexan 81 2,0 0,2 1,00 0,01

Tetraclorur 77 2,2 1,6 0,97 0,08

21


Toluen 111 2,38 2,4 0,59 0,51

Xylen 139 - 2,5 0,61 0,018

Benzen 80 2,3 2,7 0,65 0,18

Diethyl ether 35 4,34 2,8 0,32 6,89

Diclorometan 41 8,9 3,1 0,44 1,6

Isopropanol 82 18,3 3,9 2,3 100

n-Buthanol 118 - 3,9 2,98 7,81

Tetrahydrofuran 65 7,58 4,0 0,55 100

n-Propanol 92 20,1 4,0 2,27 100

Acetate butyl 125 - 4,0 0,73 0,43

Chloroform 61 4,87 4,1 0,57 0,815

Acetate ethyl 77 6,0 4,4 0,45 8,7

Methyl ethyl 80 - 4,7 0,45 24

Dioxan 101 2,2 4,8 1,54 100

Aceton 56 20,7 5,1 0,32 100

Methanol 65 33,6 5,1 0,6 100

Ethanol 78 24,3 5,2 1,2 100

Acetonitryl 82 37,5 5,8 0,37 100

Acid acetic 118 6,2 6,2 1,26 100

Dimethyl 189 4,7 7,2 2,0 100

Nước 100 78,5 9,0 1,0 100- Giải ly sử dụng dung môi với nồng độ tăng dần tuyến tính: Dung môi giải ly

có độ phân cực tăng dần đều.

2.3.3. Vân tốc giai ly

Vận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân

bằng với chất hấp phụ) cung không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời

gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá

trình tách.

Thông thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly khoảng 5-50 giọt/phút hoặc

1-2 cm/phút.

Ví dụ: “Chiết dịch từ lá xanh” Dung môi sử dụng là dung môi nào? Vận tốc chảy

của dung môi?

Lấy 10g lá rau muốn còn tươi (khoảng 30 lá) cắt nhỏ cho vào cối sứ (bỏ gân lá),

22


trộn thêm 2g bột CaCO3 để trung hòa dịch axit của tế bào. Nghiền các lá đến khi thành

một thể đồng nhất. Cho 10 -15ml aceton 80% hoặc cồn etylic 90% vào cối sứ và khuấy

đều, để 5 phút rồi lọc bằng bông và bằng phễu thuỷ tinh, dung dịch thu được trộn với

2ml toluen rồi chiết bằng phễu chiết, lấy phần trên được dịch mẫu. Tiến hành sắc ký

cột.

Sau khi nạp silica gel vào buret đạt chiều cao cột khoảng 10-20cm, bột đường

glucozơ 20-30cm, bột canxi cacbonat nạp khoảng 15-20cm.

Dung môi sử dụng là các hệ: ete dầu hoả-aceton; toluen-aceton; toluen-cồn

etylic; aceton-HCl đặc; NH4NO3 4M - NH3 4M; CH3COOH 1,5M - CH3COONH4

1,5M.

Vận tốc chảy của dung môi giải ly khoảng 15- 20 giọt/phút.

2.3.4. Theo dõi quá trình giai ly cột

- Với mẫu có màu: quan sát bằng mắt thường ta thấy các dãy lớp có màu sắc

khác nhau đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly

khỏi cột.

Các chất có màu sắc khác nhau tách xa nhau trong cột

Sử dụng sắc ký bản mỏng để kiểm tra mỗi dãy màu có một hay nhiều chất

- Với các mẫu không màu: hứng dung dịch giải ly trong những hủ bi có thể tích

như nhau và đánh số thứ tự. Dung dịch trong những hủ bi hứng được sẽ được sắc ký

lớp mỏng trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có sắc ký bản mỏng giống nhau sẽ

23


được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất kém các

phân đoạn này sẽ cho cao của các phân đoạn đó. Chỉ ngưng cột khi thu được lượng cao

các phân đoạn bằng 70-80% trọng lượng mẫu đã nạp vào đầu cột.

2.3.5. Ghi nhân kết qua săc ky

- Phân đoạn thu được là một chất tương đối sạch tuy vẫn có chứa một ít tạp

chất: khi trên bản mỏng có một vết chính chiếm 80%, ngoài ra còn một số vết mờ.

- Phân đoạn thu được là hỗn hợp nhiều chất: khi trên bản mỏng có nhiều vết,

các vết có độ đậm như nhau.

- Để kiểm tra xem một hợp chất có tinh khiết hay không ta sử dụng sắc ký lớp

mỏng lần lượt với 3 hệ dung môi giải ly hoàn toàn khác hẳn nhau (không dùng một hệ

dung môi với 3 tỉ lệ khác nhau). Nếu chất chỉ cho hiện ra một vết duy nhất thì có thể

kết luận là chất tinh khiết. Nếu chất không tinh khiết thì sẽ cho thấy bên cạnh vết chính

có thêm vết khác. Muốn khảo sát rõ hơn thì dùng HPLC.

2.4. Xác đinh cấu trúc hóa học cua một hợp chất

Chỉ nên tìm cách xác định cấu trúc hóa học của một hợp chất tinh khiết sau khi

đã kết tinh nhiều lần trong dung môi phù hợp (độ tinh khiết 95%).

Kết quả khảo sát cấu trúc hóa học của một hợp chất theo các chi tiết sau:

- Mô tả hình dạng, màu sắc và mùi của sản phẩm.

- Sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi gì, thuốc hiện hình gì, giá trị Rf của vết,

hình chụp bản mỏng.

- Điểm nóng chảy.

- Năng lực triền quang.

- Khối phổ.

- Phân tích nguyên tố.

- Phổ hồng ngoại IR.

- Phổ tử ngoại: max (chỉ đo khi hợp chất có chứa nối đôi liên hợp)

- Phổ 1H –NMR.

- Phổ 13C-NMR.

Sau khi biện luận các tín hiệu của các loại phổ, so sánh với các số liệu trong tài

liệu sẽ đề xuất cấu trúc hóa học của hợp chất cô lập được. Cấu trúc này phải đáp ứng

tất cả các chỉ tiêu hóa lý đã nêu trên.

3. ƯU, NHƯỢC ĐIỂM VÀ ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ CỘT HỞ

3.1. Ưu điểm

24


- Có thể sử dụng trong cả hai lĩnh vực phân tích và điều chế.

- Sắc ký cột không những dùng để xác định số lượng các thành phần của hỗn

hợp mà nó còn có thể được dùng để tách và tinh chế những thành phần phân tích.

- Pha tĩnh và các dụng cụ thí nghiệm rẻ tiền, dễ kiếm; có thể triển khai với một

lượng lớn mẫu chất.

3.2. Nhược điểm

- Khi chạy cột sắc ký đòi hỏi sự theo dõi liên tục để duy trì mức dung môi vì

nếu không sẽ dễ gây xuất hiện các bọt khí làm tắc cột, nứt cột, biến dạng đường đi của

dung môi.

- Quá trình chạy cột mất thời gian.

- Quá trình tách chậm và hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp.

3.3. Ứng dụng

- Phân lập các alkaloid, kháng sinh, hormon tăng trưởng steroid, hormon sinh

dục và các hợp chất liên quan.

- Tách các chất lipid, các hợp chất chứa nitro từ các hydrocarbon, các hợp chất

vòng thơm từ hỗn hợp mạch thẳng – vòng thơm.

- Rửa giải và tách các thuốc trừ sâu.

- Làm tinh khiết dược liệu.

- Phân tích các vitamin.

- Khử màu dầu, chất béo và sáp bằng phương pháp thấm lọc.

25


Chương 3: MỘT VÀI KỸ THUẬT SẮC KÝ CỘT KHÁC

1. Săc ky cột khô (Dry column chromatography – DCC)

- Chất hấp phu: sử dụng alumina hoặc silica gel loại dùng cho sắc ký lớp

mỏng, có thể trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang. Liều lượng sử dụng: 1g mẫu

chất cần 300g chất hấp phụ khô.

- Mô ta hệ thống: sử dụng một ống Celophan có đường kính 2-5cm được dựng

thẳng đứng. Đáy ống được hàn lại, tạo dáng hình trụ và đầu đáy này có đặt một lớp

bông thủy tinh. Đáy ống được soi thủng nhiều lỗ nhỏ bằng cây kim may.

Chuẩn bị ống sắc ký

- Nap chất hấp phu vào ống: chất hấp phụ được nạp khô vào ống. Đầu tiên cho

chất vào 1/3 cột, gõ nhẹ ống lên mặt ghế hay mặt bàn để nén chất cho chặt chẽ, tiếp tục

nhồi để có 1 ống thẳng cứng có thể cầm trên tay (trong suốt quá trình nhồi, đầu trên

được để hở).

Nạp chất hấp phụ vào ống

- Nap mẫu vào đầu cột:

26


+ Nạp mẫu dạng ướt: mẫu được hòa tan trong một lượng tối thiểu dung môi,

dùng ống nhỏ giọt đặt dung dịch mẫu phủ lên trên đầu cột và để yên một lúc cho dung

môi bay đi.

+ Nạp mẫu dạng khô: hòa tan mẫu trong một dung môi dễ bay hơi như dietyl

ete hoặc diclorometan vào một becher, cho vào một lượng chất hấp phụ loại dùng cho

sắc ký cột với trọng lượng gấp năm lần lượng mẫu, trộn đều rồi cô quay thu hồi dung

môi sẽ có được bột rắn khô. Phủ lớp bột này lên trên đầu cột đã nhồi lúc nãy. Sau cùng

phủ một lớp cát (hoặc bông gòn) lên trên đầu cột để bảo vệ mặt thoáng của cột.

Nạp mẫu vào cột

- Triển khai sắc ký: ống được dựng đứng và dung môi được cho chảy từ trên

đầu ống xuống dưới cuối ống nhờ vào trọng lực. Cho dung môi vào đầu cột, giữ sao

cho có một lớp dung môi dày 3-5cm trên đầu cột.

Triển khai sắc ký

- Hiện hinh sắc ký: Đặt ống trụ nằm ngang trên một tấm kiếng và quan sát

bằng đèn UV, đánh dấu các đoạn. Lấy ống ra ngoài và dùng lưỡi dao lam để cắt ống

thành những khúc thích hợp. Dùng dung môi để trích chất trong mỗi đoạn.

27


Cắt ống trụ để trích chất

Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký cột khô

₪ Ưu điểm:

- Phương pháp sắc ký cột khô là phương pháp bắt cầu giữa phương pháp sắc

ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký cột điều chế cổ điển. Áp lực chi phí về thiết bị ít hơn

so với phương pháp sắc ký lỏng điều chế.

- Cung như các phương pháp sắc ký cột nói chung, DCC dùng được cả trong

phân tích và điều chế.

- DCC nhanh, dễ dàng và hiệu quả cao trong việc tách hoặc tinh chế các chất

với số lượng lớn.

- Giống như TLC, DCC là một phương pháp "không rửa giải" sử dụng ống

nilon như là vật hỗ trợ và có thể dùng UV-254 để nhận biết. Cung như các loại sắc ký

cột, các cột với hầu hết mọi kích cỡ chứa đầy pha tĩnh trong sắc ký cột khô có thể

dùng để tách, hoặc làm sạch một lượng rất lớn các chất.

₪ Nhược điểm:

- Để thiết lập cột đòi hỏi kĩ thuật, sự khéo léo và cần thời gian.

- Đòi hỏi sự chú ý liên tục trong suốt quá trình tiến hành.

Ứng dung: Cung như các phương pháp sắc ký cột nói chung, sắc ký cột khô

dùng được cả trong phân tích và điều chế. Sắc ký cột khô được dùng để xác định số

lượng thành phần chất trong hỗn hợp, phân tách và làm tinh khiết những thành phần

này để dùng cho những phân tích sau đó. Sắc ký cột khô đã áp dụng thành công cho

những chất như thuốc nhuộm, alkaloids, và những hợp chất dị vòng khác, mặc dù có

thể tách bằng các loại cột sắc ký khác nhưng sẽ gặp nhiều khó khăn đáng kể. Lipid

cung có thể được tách bằng sắc ký cột khô.

2. Săc ky cột nhanh (Flash column chromatography-FCC)

- Chất hấp phu: sử dụng silica gel có cỡ hạt 40-63µm cho kết quả tốt nhất.

- Mô ta hệ thống: Hệ thống gồm cột sắc ký bằng thủy tinh như hệ thống sắc ký

28


cổ điển, đầu cột được ráp nối với một hệ thống bơm nén có áp lực trung bình, áp lực

có thể điều chỉnh. Hơi nén từ trên đầu cột đẩy dung môi xuyên xuống lớp chất hấp phụ

nhanh hơn.

Hệ thống sắc ký cột nhanh

- Lượng mẫu và kích thước cột: nên sử dụng cột ngắn, đường kính khoảng 1-

10 cm và chiều dài không quá 40 cm.

Bang 3: Một số thông số cho sắc ký cột nhanh

Đường kính

cột (mm)

Thể tích giai ly

(ml)

Lượng mẫu cho vào (mg) Thể tích

hứng một lọ

(ml)Rf ≥0,2 Rf ≥0,1

10 100 100 40 5

20 200 400 160 10

30 400 900 360 20

40 600 1600 600 30

50 1000 2500 1000 50

- Vận tốc giải ly: mực dung môi hạ xuống trong ống với tốc độ 5 cm/phút.

Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký cột nhanh

₪ Ưu điểm:

- Nhờ khí nén đẩy dung môi giải ly nên thời gian triển khai nhanh hơn sắc ký

cột cổ điển (thời gian triển khai nhỏ hơn 20 phút). Cho phép phân lập mẫu 0.01-10g

29


trong10-15 phút. Có thể tách rất tốt hỗn hợp có khoảng 4 chất.

- Thiết bị đơn giản, rẻ tiền so với HPLC.


- Độ phân giải trung bình (lớn hơn 0.15).

- Không tách được hỗn hợp phức tạp hay tách riêng chất cần phân lập mà chỉ

thu được các phân đoạn chứa chất cần phân lập.

- Để thực hiện cần phải có máy bơm nén khí và mộ tbộ phận gồm những cột và

những nắp vặn kín chuyên dụng, có kích thước từ nhỏ đến lớn. Những bộ phận này

tương đối đắt tiền nếu so với sắc ký cổ điển.

Ứng dung: Sắc ký cột nhanh được sử dụng để tách các phân đoạn đơn giản từ

hỗn hợp phức tạp. Sau đó đưa các phân đoạn này lên sắc ký cột cổ điển để tách thành

các phân đoạn tinh khiết.

3. Săc ky nhanh - cột khô (Dry-column flash chromatography; Vacuum liquid

chromatography – VLC)

- Dung cu: Phễu lọc xốp bằng thủy tinh, bình tam giác, hệ thống tạo chân

không nhẹ bằng vòi nước.

Hệ thống sắc ký nhanh cột khô

- Nap chất hấp phu vào cột:

Hệ thống gồm: phễu lọc xốp gắn trên bình tam giác, bình này nối với một máy

bơm hút tạo chân không.

Cho máy bơm chân không hoạt động, cho từng muỗng silica gel khô (loại cỡ

hạt 15-40 µm) vào phễu đến tận đáy. Dùng nút thủy tinh có đáy bằng phẳng để nén

silica gel xuống đáy phễu tạo thành một khối rắn đồng nhất có bề mặt phẳng.

30


Lưu ý: lớp silica gel chỉ dày tối đa 5 cm (gia tăng theo đường kính, không

tăng theo chiều cao).

Bang 4: Mối liên quan giữa lượng mẫu và kích thước phễu trong sắc ký nhanh-cột khô

Lượng mẫuĐường kính trong

cua phễu (cm)

Chiều cao

Lớp hấp phụ (cm)

Phân đoan dung

dich giai ly (ml)

< 100 mg 0,5 – 1,0 4 10 – 15

0,5 – 1,0 g 2,0 – 3,0 4 15 – 20

1,0 – 10,0 g 5 5 30 – 50

10,0 – 20,0 g 10 5 50

- Cân bằng cột sắc ký:

+ Đặt một lớp bông gòn dày lên bề mặt pha tĩnh để bảo vệ lớp mặt.

+ Cho một lượng lớn dung môi (loại dung môi ít phân cực nhất) lên đầu cột,

cho hệ thống tạo áp suất kém hoạt động, dung môi được hút xuống đi qua cột và được

hứng vào bình tam giác. Lượng dung môi này được sử dụng để cho lại lên đầu cột.

Thực hiện vài lần đến khi thấy chất hấp phụ trong cột đồng nhất.

- Nap mẫu lên đầu cột: tháo miếng bông gòn bảo vệ bề mặt

+ Nạp mẫu ướt: cột được hút khô tương đối, tắt máy áp suất kém. Hòa tan

mẫu trong dung môi ít phân cực sau đó phủ đều lên khắp bề mặt silica gel. Gắn máy áp

suất kém.

+ Nạp mẫu khô: cho lượng mẫu khô lên đầu cột, gõ nhẹ và trải đều mẫu thành

một lớp mỏng.

Sau khi nạp mẫu lên đầu cột, lấy lớp bông gòn phủ lại lên trên mặt cột.

- Giai ly: Cho máy bơm tạo áp suất kém hoạt động. Rót một thể tích dung môi

nhất định lên bề mặt phễu (bảng 4), dung môi được hút xuống bình tam giác bên dưới.

Chờ cho phễu khô tương đối, ngắt áp suất, rót phần dung dịch vừa giải ly vào các lọ có

đánh số thứ tự. Tiếp tục cho dung môi giải ly vào phễu và lặp lại các thao tác như trên.

Mỗi lần phải hút khô phễu rồi mới cho dung môi mới. Dung môi giải ly được sử dụng

lần lượt từ không phân cực đến phân cực.

Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký nhanh-cột khô

₪ Ưu điểm:

- Dụng cụ dễ tìm.

- Thời gian sắc ký nhanh nhờ lực hút bên dưới để hút dung môi giải ly.

31


- Thuận tiện cho người thao tác: quá trình thực hiện có thể bị gián đoạn mà

không bị ảnh hưởng.


- Không tách ngay thành chất tinh khiết được (trừ những hỗn hợp đơn giản hay

các vết cách xa nhau).

- Phải có dụng cụ thích hợp (phễu lọc xốp; hệ thống hút).

Ứng dung:

- Tách hỗn hợp thành vài phân đoạn có độ phân cực khác nhau, mỗi phân đoạn

gồm ít chất hơn để dễ dàng phân lập tiếp bằng sắc ký cột cổ điển.

- Hoạt động đơn giản nên được ứng dụng rộng trong lĩnh vực hợp chất thiên

nhiên. Thích hợp đối với dịch chiết dược liệu thô.

- Giúp định hướng trong thử nghiệm sinh học một cách tập trung và ít lãng phí.

32


KẾT LUẬNSắc ký là một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực trên thế

giới. Việt Nam tiếp cận kỹ thuật này vào những năm của thập niên 80. Vì điều kiện

cuộc sống ngày càng cao nên đòi hỏi phải có những công nghệ kỹ thuật hiện đại để

đáp ứng nhu cầu.

Ngày nay, phương pháp sắc ký là phương pháp chủ đạo để phân lập các hợp

chất tự nhiên cung như tổng hợp. Nó đã có những đóng góp to lớn trong quá trình

phân lập các dược chất từ dược liệu. Qua đó chứng minh được dược tính và giúp bào

chế ra các thuốc có hoạt chất từ dược liệu với độ tinh khiết cao góp phần làm tăng

hiệu quả điều trị cung như giảm các tác dụng phụ. Ngoài ra, kỹ thuật sắc ký càng có

vai trò lớn trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng hàng hoá để đáp ứng nhu cầu

cuộc sống như: thực phẩm, dược phẩm, hoá chất…

Vì vậy, với từng mục đích sử dụng mà ta có thể chọn một phương pháp sắc ký

phù hợp để phân tích mẫu tương ứng./.

33


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1986), Phương pháp nghiên cứu hóa học

cây thuốc, Nhà xuất bản Y học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Nguyễn Ngọc Hạnh (2002), Giáo trình tách chiết và cô lập hợp chất hữu cơ, Viện

công nghệ Hóa học Thành phố Hồ Chí Minh.

3. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất

bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

4. http://www.sorbtech.com/chromatography/dry-column-chromatography-dcc/

5. http://www.saiadsorbents.com/dcc.htm

6. http://www.wfu.edu/chem/courses/organic/CC/index.htm

7. http://orgchem.colorado.edu/Technique/Procedures/Columnchrom/Procedure.html

8. http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/column.html

9. http://www.chemistryviews.org/details/education/2040151/Tips_and_Tricks_ for

_ the_Lab_ Column_Packing.html

34

http://www.chemistryviews.org/details/education/2040151/Tips_and_Tricks_%20for%20_%20the_Lab_%20Column_Packing.html

http://www.chemistryviews.org/details/education/2040151/Tips_and_Tricks_%20for%20_%20the_Lab_%20Column_Packing.html

http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/column.html

http://orgchem.colorado.edu/Technique/Procedures/Columnchrom/Procedure.html

http://www.wfu.edu/chem/courses/organic/CC/index.htm

http://www.saiadsorbents.com/dcc.htm

http://www.sorbtech.com/chromatography/dry-column-chromatography-dcc/

SẮC KÝ CỘT

Documents

Transcript of SẮC KÝ CỘT