VERSUCHSTIERKUNDLICHER BLOCKKURS

EmbryotransferBlastozystentransferTransgene Tiere

TRANSGENE TIEREDefinitionen

Begriff „transgen“erstmalig im Zusammenhang mit Labormäusen, in deren Genom fremdes genetischesMaterial mittels Vorkerninjektion übertragen wurde(Gordon JW, Ruddle FH; Science, 1981;214:1244-46)

Gentechnisch modifizierter Organismen

1. nach deutschem Gentechnikrecht (§3 GenTG, 1993):ein Organismus, dessen genetisches Material in einer Weise verändert worden ist,wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzen oder natürlicheRekombination nicht vorkommt mittels gentechnischer Verfahren: - Vorkerninjektion

- homologer Rekombination- retroviraler Vektoren

2. Palmiter und Brinster, 1985 (Transgenic Mice. Cell;41:343-345):Organismen, bei denen eine in vitro rekombinierte und experimentell übertrageneDNA-Sequenz stabil ins Genom integriert ist und vererbt wird

Gesetzliche Grundlagen

Gentechnische Arbeiten:Die Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen.

Die Vermehrung, Lagerung, Zerstörung oder Entsorgung sowie der innerbetriebliche Transport gentechnisch veränderter Organismen....

Gentechnikrecht

à Gentechnikgesetz (GenTG):Genehmigung des Betriebes der jeweiligen Anlage

à Gentechniksicherheitsverordnung (GenTSV)Sachkundenachweis für: Projektleiter

Beauftragter für biol. Sicherheit§§ 15, 17 GenTSV

Tierschutzrechtliche Bestimmungen

à Tierschutzgesetz àààà Herstellung und Haltung transgener Tiereà Experimente mit transgenen Tieren

1. Gewinnung von Embryonen:

à Organentnahme nach Töten der Spendertiere (ohne Superovulation!): nicht anzeige- oder genehmigungspflichtig

2. Hormonelle Stimulation/Superovulation:

für TVA als Halter und Züchter: eine biotechnolog. Zuchtmaßnahme

für Wissenschaftler: im Rahmen Erstellung transgener Tiereàààà genehmigungspflichtig!

Der Gentransfer:

- Nutzung in vitro: kein Tierversuch § 7 Abs.1 TSchG

hier aber: Weiterentwicklung zu lebenden Individuen zu Versuchszwecken

alle notwendigen Tätigkeiten wie à Superovulationà Tötender Spendermäuseà Gentransferà Vasektomieà Embryotransferà Charaktersierung

genehmigungspflichtiger Tierversuch !

4. Zucht/Haltung:

Erlaubnis nach §11 TierSchG, Abschnitt1, Nr.1 àààà TVAin Verbindung mit Anhang V der GenTSV

5. Versuche mit transgenen Tieren: genehmigungs- oder anzeigenpflichtig

Techniken

1. Mikroinjektion in den Vorkern (Maus)

Herstellung klassischer Transgene: à Expression zusätzlichen Gens

2. Homologe Kombination in Embryonalen Stammzellen, (Maus)

Herstellung von Knock out Tiere: à Ausschalten Genfunktion

3. Retrovirale Vektoren: à zufällige Änderung im Genom

Herstellung und Entwicklung transgener Tiere:

Eingriffe an Embryonen unterschiedlichen Entwicklungsalters nötig

à Embryonen im 1 –2 Zellstadium

à Blastozysten

Embryonalentwicklung der Maus

Entwicklungsstadien der befruchteten Eizellen

Tag 0.5 p.c. Einzeller Tag 1.5 p.c. Zweizellstadium

Tag 2 p.c. Vierzellstadium Tag 2.5 p.c. Achtzellstadium Tag 3.5 p.c. Blastozyste

Gewinnung und Kultivierung von Embryonen bzw. Blaszozysten

1. Superovulation der Spendertiere- ermöglicht höhere Ausbeute an entwickelten Eizellen- hormonell: PMSG (Pregnant Mare‘s Serum Gonadotropin)

hCG (human chorionic Gonadotropin)

1. 5-10 IU PMSG i.p. nach 48 h2. 5-10 IU hCG i.p.

Zeitpunkt abh. vom Hell-Dunkel-Rhythmus des Tierraumes

- nach hCG- Gabe Verpaarung

- Kontrolle der Verpaarung: à Kontrolle Vaginalpfropf

- high ovulators z.B. C57BL/6- low ovulators z.B. BALB/c

1. Spendertiere Embryonen: à ausreichende Anzahl an Embryonen

-Tiere: ♀ Alter 4-6 Wochen-Gewinnung der Embryonen an Tag 0.5 (Einzellstadium für Vorkerninjektion)

an Tag 1.5 (2-Zellstadium für Hygienesanierung)

2. Empfängertiere:Stämme: z.B. B6 x CBA F1 Hybriden, FVB Inzucht, NMRI Auszucht

♀ Tag 0.5 – 1.5 ihrer Pseudogravidität

Anforderungen:à Fellfarbenunterschied zwischen Empfänger- und Spendertier

à Empfängertiere sollten auch kleine Würfe großziehen

3. Technik: Ovidukttransfer

Blastozystengewinnung:

1. Spendertiere:

zu beachten:- Fellfarbenunterschied zwischen ES-Zellen Spenderstamm und Empfängerstamm- Wirtsblastozyste geeigneter Empfänger für ES-Zelllinie- Manipulierbarkeit der Wirtsblastozyst- genügende Anzahl an injizierbaren Blastozysten- Superovulation bei 3 – 4 Wochen alter Tiere- Gewinnung der Blastozysten an Tag 3.5

2. Empfängertiere:

♀ Tag 2.5 ihrer Pseudogravidität

3. TechnikUterustransfer

Isolierung von Ovidukt bzw. Uterus

-Töten der Tiere zum gewünschten Zeitpunkt

à 1- bzw. 2- Zell-Stadium: Tag 0.5-1.5 p.c.

à Blastozysten: Tag 3.5-4.5 p.c.

- Entnahme von Eileiter: Gewinnung von Embryonen im

1-Zell-Stadium à Vorkerninjektion

2-Zell-Stadium à hygienische Sanierung

- Entnahme von Uterus: Blastozystengewinnung Tag 3.5 p.c.

à ES-Zellen à homologe Rekombination

Isolierung von Ovidukt bzw. Uterus

a) Eileiter

b) Uterus

Spülen des Eileiters

-überführen der Embryonen in M2-Medium-Spülen, ev. Zugabe von Hyaluronidase-Überführen in M16 Medium-Kultivieren über Nacht im Brutschrank möglich-Aufnehmen in Transferkapillare und M2-Medium-8-10/Ovidukt

Transferkapillare mit Embryonen

Eileitertransfer

Uterustransfer

Vasektomie: Durchtrennung der SamenleiterSexualverhalten aber noch vorhanden

zur Erzeugung scheinträchtiger Weibchen:

à sexuell intakte Weibchen werden mit vasektomierten Männchen verpaart

1. Mikroinjektion in den Vorkern:

-Vorkerne: sichtbar in befruchteter Eizelle im Einzellstadium

-befruchtete Eizelle: 2 Vorkerne1 Polkörperchen

-Injektion mittels Mikroinjektionsanlage in männlichen Vorkern

-Fixation mittels Haltekapillare

-Injektionskapillare durch Zona pellucida und Cytoplasma in Vorkern

-Zugabe der DNA-Lösung (ca. 1-2 Picoliter)à Anschwillen Vorkern

-Waschen der Embryonen

-Eileitertransfer

Vorkerninjektion:

1. Mikroinjektion in den Vorkern

2. Kultivierung Embryonaler Stammzellen für Blastozysteninjektion:

ES von Mäusen = pluripotente Zellenà gewonnen aus Blastocysten

Vorteil:Möglichkeit der gezielten Änderung eines Gens mit Hilfe homologer Rekombination

Isolierung von ES Zellen:

- aus Blastozysten

- Embryonalstadium:Tag 3,5 Embryonalentwicklung

- Entfernung des embryonalen Teils

- Kultivierung der Zellen:

à auf Gelatine vorbehandelten Petrischalenà enthalten Fibroblasten als Feeder- Schicht

DNA-Integration:

- mittels Elektroporation

à Eintreten der DNA in die Zellen durch elektrischen Puls

Nachweis der homologen Rekombination

-positive Selektion erforderlich

-Verwendung eines Resistenzgens, z.B. Neomycin Resistenzgen

-Selektion mit Geniticin

-nach Selektion Isolierung der resistenten Kolonien

-Injektion diese ES Zellen in Blastozysten à Uterustransfer

-Ergebnis: chimäre Tiere

Blastozysteninjektion/Injektion der ES-Zellen

2. Blastozysteninjektion

3. Retrovirusvektoren

Prinzip: Infektion von Mausembryonen mit Retroviren durch Kontakt zwischenEizelle und Viruspartikel

Zucht/Zuchtaufbau

1. Allgemeine Zielsetzung bei der Zucht transgener Tiere:

- Keimbahnübertragung - stabile Integration des Transgens

-Ausgangstier: transgenes Foundertier

2. Rückkreuzung

à auf einen anderen genetischen Hintergrund (z.B. von 129 Sv auf C57BL/6)

Problem: - starke Reduktion des Transgens möglich

- Erreichen des gewünschten genetisch. Hintergrunds nach 10 Generationen

Vorteil: Wurfgeschwister als Kontrolltiere nicht mehr notwendig

Vorkerninjektion:

ES-Zellen

Genomische Homogenität und Heterogenität im Verlauf

Generationenverlauf bei einer Rückkreuzung:

Haltung und Transport

Haltung:

- Haltung und/oder Zucht à gentechnisches Arbeiten- nur in behördlich zugelassenen gentechnischen Anlagen- Sicherheitsstufen (S1-S4, i.d.R. S1, S2)

Empfängerlabor:

- personelle und räumliche Vorraussetzungen (nach GenTG, GenTS-VO)

Transport:

- innerbetrieblich, zwischenbetrieblich - geschlossene Behälter, bei Bedarf doppelwandig- Käfig/Box gegen Bruch gesichert- Transportrisiken: à Gefährdung des Personals

à Entfliehen transgener Tiere

Nomenklatur gentechnisch modifizierter Stämme:

Transgene LinienTargeted Mutation (Knock out)Targeted Mutation (Double Knock out)Targeted Mutation (Knock in)

-Symbol für Transgene: 1. Tg für Transgen2. Offizielles Gensymbol der intergrierten DNA3. Laborlinie/Gründerbezeichnung/fortlaufende Nummer4. Registrierter Laborkode des Ursprungslabors

TgX = die angewandte transgene TechnikTgN = nicht homologe Insertion (Vorkernmikroinjektion)TgR = Insertion über retrovirale VektorenTgH = homologe Rekombination (ES-Zellen)

1.Beispiel: Transgene Linien (Mikroinjektion):

C75BL/6J-TgN(CD8Ge)23Jwg:

der CD8 Klon aus dem humanen Genomintegriert in C57BL/6 Mäuse aus dem Jackson Laboratory23. Maus, die im Labor von Jon W. Gordon etabliert wurde

2. Beispiel: Targeted Mutation (Knock out)

B6.129P2-TgHCftrtm1Unc: tm = targeted mutationZiffer = Anzahl der gerichteten MutationLaborcode

erste gerichtete Mutation im cystic fibrosis transmembraneconductance regulator homolog der University of North Carolinaunter Verwendung von 129P2 ES Zellen, rückgekreuzt auf C57BL/6

; à RK noch nicht abgeschlossen, . à RK abgeschlossen

Inzuchtmaus: z.B. C57BL/6 = C57BL/6NCrlAuszuchtmaus: z.B. NMRI = Crl:NMR(Han)

Einflussfaktoren auf den Phänotyp transgener Tiere (nach Rülicke und Mertens, 1999)

genetische Faktoren Interaktion nichtgenetische Faktoren(biotische, abiotische Umwelt)

direkte Wirkung indirekte Wirkung(Mutation) (genet. Hintergrund)

Integrations-stellenAnzahl KopienStruktur des Transgens

PHÄNOTYP

Auswirkung gentechnischer Manipulation

- abhängig vom transgenen Modell- abhängig vom genetische Hintergrund- betroffen können sein: Wohlbefinden, Lebensfähigkeit, Fertilität, Phänotyp

Genetischer Hintergrund: Beispiel: IL2 Knockouts*

Linie genetischer Hintergrund PhänotypB6;129-IL2tm gemischt: 50% Todesrate bei 4-9 Wochen

C57bl/6 Splenomegalie, Anämie129P2/OlaHsd

B6.129-IL2tm C57BL/6 congen Tod im Alter von 3 – 6 Monatenhämolytische Anämie

C3.129P2-IL2tm C3H/HeJ congen Tod im Alter von 7 Wochenhämolytische Anämie

*Linder, 2001

Bedeutung Maus: Transgene Mausmodelle

à idealer Modellorganismus für genetische Analysen bei Säugern durch: - physiologische Ähnlichkeit zum Mensch- hohe Fruchtbarkeit à schnell produzierbar- kurzes Generationsintervall- geringer Platzbedarf

à Bedeutung für Humangenetik durch umfassende genetische Charakterisierungder Maus

Einsatz zur:Aufklärung molekularer Ursachen von Krankheiten-Strategieentwicklung für Therapie-Gentherapie-Testsystem für toxikologische Untersuchungen

(Abbildungen aus:Hogan et al. 1994. Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor (NY)