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USO PRÁCTICO EUSO PRÁCTICO EUSO PRÁCTICO E USO PRÁCTICO E INTERPRETACIÓN DE LA INTERPRETACIÓN DE LA
SEROLOGÍA Y PCR EN CAMPOSEROLOGÍA Y PCR EN CAMPO
Roser Dolz Roser Dolz PascualPascual
Joaquín Girón Joaquín Girón SolsonaSolsona
WPSA, WPSA, Valencia, 2014Valencia, 2014
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TIPO ESTUDIO TIPO ESTUDIO LABORATORIALLABORATORIAL
TOMA DE MUESTRASTOMA DE MUESTRASLABORATORIALLABORATORIAL
HISTOPATOLÓGICOÓRGANOS
MICROBIOLÓGICO
SEROLÓGICOTIPO DE MUESTRA
MOLECULAR
PARASITOLÓGICO
MÉTODO CONSERVACIÓN
PATOLOGÍA QUE SE PATOLOGÍA QUE SE SOSPECHASOSPECHA
ETIOLOGÍA
PATOGENIAPATOGENIA
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PCR Y TÉCNICAS DE PCR Y TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓN
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BIOLOGÍA MOLECULARBIOLOGÍA MOLECULAR
BIOLOGÍA MOLECULAR
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¿QUÉ DETECTAN LAS ¿QUÉ DETECTAN LAS TÉCNICAS DE BIOLOGÍA TÉCNICAS DE BIOLOGÍA
MOLECULAR?MOLECULAR?
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ADNADNMaterial hereditarioADN / ARN
Responsable de la identidad y de laidentidad y de la diversidad de los
individuos
Su estudio permite la identificación y clasificación de los agentes infecciososde los agentes infecciosos
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ADNADNNUCLEÓTIDO
TA
CG
ADENINA GUANINA
CG
GC
A G CT AT
A G C T
TIMINA CITOSINA 4 pares de basesT C G A
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¿QUÉ INFORMACIÓN NOS ¿QUÉ INFORMACIÓN NOS PUEDEN DAR?PUEDEN DAR?
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TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULARTÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULARó d d l l é
DETECCIÓN DETECCIÓN CUANTIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN TIPIFICACIÓN TIPIFICACIÓN
Detección y estudio del material genético organismos
MICROORGANISMOMICROORGANISMO
Ausencia o presencia de
MICROORGANISMOMICROORGANISMO MICROORGANISMOMICROORGANISMO
Cantidad de genomas Clasificación en un agente infeccioso (de
su genoma)presentes en una muestra de un
determinado organismo
genotipos
Correlación con fenotipo ( t i id d ti )g (patogenicidad, serotipo)
PCR a tiempo real (cuantitativa)
SecuenciaciónPCR( )
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FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRAMPLIFICACIÓN Específica
EXTRACCCIÓNEXTRACCCIÓN ADN/ARN
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FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRADN/ARN Taq DNA
POLIMERASANUCLEÓTIDOS (dNTPs)G
TG
AT TA
TCCG
GGGA
C CTT A
PRIMERS
AT
CAC T
T CG GA GG
TACGT G
ATT A
PRIMERS
C A T T A C A TG C A C T A T A
C A T T A C A T25 pares de bases
C A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A TG T A A T G T A C C T C C G G A T G T A A T G T A C C T C C G G A T G C A C T A T A
G G A G G C C T A C G T G A T A TC A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A TG T A A T G T A C C T C C G G A T G C A C T A T A
G G A G G C C T A C G T G A T A TC A T T A C A T G G A G G C C T A C G T G A T A T
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FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCRAMPLIFICACIÓN
Específicap
Exponencial
1 PCR 30‐35 CICLOS
X 10 000 000 000X 10.000.000.000
Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3
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FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCR
1 2 3 4 5
225pb
275pb
225pb250pb275pb
70pb
150pb100pb
700pb175pb150pb
100pb70pb
25pb50pb75pb
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FUNDAMENTOS PCRFUNDAMENTOS PCR1000pb800pb700pb600pb500pb
2 3 4 5 6 71 8
500pb400pb300pb
200pb
VENTAJASVENTAJAS INCONVENIENTESINCONVENIENTES
Elevada sensibilidad
Rapidez
Coste
Conservación muestras
Posibilidad tipificar No información de la viabilidad del agente infeccioso
Necesidad información genética del agente infeccioso
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CATTTACATGGAGGCSECUENCIACIÓNSECUENCIACIÓN
CAC
CATA T
CATTTACATGGAGGC
CATTCATTTCATTTA
CAT
CATTTACATGCATTTACAT
CATTTACCATTTACAGC
CATTTACATGGAGCATTTACATGGACATTTACATGGCATTTACATG
A TCATTTACATGGAGGCCATTTACATGGAGGCATTTACATGGAGA T
C A T T T A C A T G G A G G C
GC
160 170
G
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WPSA C A T T T A C A T G G A G G CANÁLISIS DE SECUENCIASANÁLISIS DE SECUENCIASWPSA C A T T T A C A T G G A G G C
STA- CEPA 1 C A T T T A C A T G G A G G CSTA- CEPA 2 C A T T T A C A T G G A G G CSTA- CEPA 3 C A T T T A C A T G G A G A C
STB- CEPA 1 C A T T T A C A A A G A G G CSTB- CEPA 2 C A T T T A C A A A G A G G C
STC- CEPA 1 C A T C C A C A T G G A G G CSTC- CEPA 2 C A T C C A C A T G G A G G C
STA-CEPA2STA-CEPA3
WPSASEROTIPO A
STA-CEPA1STB-CEPA1STB-CEPA2STC CEPA1
SEROTIPO B
STC-CEPA1STC-CEPA2
0.005
SEROTIPO C
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D78(at)74
ÁRBOL FILOGENÉTICOÁRBOL FILOGENÉTICO
CEPAS ATENUADAS
D78(at)HARBIN
CEF94PBG98(Be-at)
P2(at)
7480
54
20
99 P2(at)AV-14-08-5
HIPRAGUMBORO-CH/80CU-1(at)
HIPRAGUMBORO-GM97
38
54
3345
B G D
VARIANTES
HIPRAGUMBORO-GM97Int/228E(TW)
VARIANT-E(Usvar)DEL-E(USvar)
GLS(USvar)
100
100
72
24 BAJO GRADO ATENUACIÓN
VARIANTES AMERICANAS
CLÁSICAS Y CLÁSICAS
GLS(USvar)GZ29112
VARIANT-A(USvar)STC(UScl)BURSAVAC(vac)
99
99
45
72
CLÁSICAS Y CLÁSICAS DE VIRULENCIA INTERMEDIA
BURSAVAC(vac)52/70(cl)
Cu-1wt(Gcl)BURSINE2(vac)
BURSINEPLUS(vac)100
100
40
40
vvIBDV
BURSINEPLUS(vac)849VB(BEvv)
UK661(UKvv)HK46(HKvv)
D6948(NLvv)66
98
99
D6948(NLvv)OKYM(Jvv)
NETHERLANDSvv3137
66
0.005
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NL-L1449K-04NL-L1449T-04NL-L1449T-04FR-L1450L-05FR-L1450T-05
CASO 364
89
99
100
CASO 3BEAUDETTEM41-M21883Spain/96/334H120-M21970Spain/98/308100
100
56
100
42
64
Spain/98/3084/91-pathogenic4/91attenuatedUK/7/91UK/3/91UK-1233-95
100
100
99
38 UK-1233-95FR-85131-85FR-CR88061-88Spain/00/336IR-3654-VM-Spain/92/3525
10
44
100
Spain/92/35Spain/98/328
Spain/04/221Spain/05/866
Spain/99/316It-497-02-DQ901377
100
73
79
100
QUK-L633-04-DQ901376Italy-02-AJ457137Spain/00/337
ARK99-CU-T2
57
94
79
100
37
E l d di t i éti B1648HOLTEGRAY
JMKD3896D207
100
51
35
51
Escala de distancia genética
Cambios nucleotídicos/posiciónD207D274
D146674
100
0.05
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VENTAJASVENTAJAS
Máxima precisión en la caracterización
Relativa rapidez (comparación con métodos clásicos deRelativa rapidez (comparación con métodos clásicos de tipificación)
ió d d l d d ió dComparación con cepas de todo el mundo y detección de cepas nuevas.
INCONVENIENTESINCONVENIENTES
C tCoste
Análisis de resultados es costosa y complejo
No aplicable de forma sencilla a organismos más complejos (bacterias o virus de genomas complejos)
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¿CUÁNDO SON TÉCNICAS DE ¿CUÁNDO SON TÉCNICAS DE ELECCIÓN?ELECCIÓN?
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Detección y estudio del material genético organismos
N i i l l S d ti á tNo es necesario aislar el microorganismo para su
detección
Se puede estimar un carácter fenotípico (virulencia, serotipo) a partir deldetección serotipo) a partir del
genotipo
Microorganismos de Microorganismos que gaislamiento difícil o lento
Vi
g qrequieran una clasificación
IA – HPAIV/LPAIVVirus
Mycoplasma
IA HPAIV/LPAIVIBV, FAdV, TRT – Serotipo
IBDV – Virulencia
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¿CUÁNDO SE DEBEN TOMAR ¿CUÁNDO SE DEBEN TOMAR LAS MUESTRAS?LAS MUESTRAS?
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Detección y estudio del material genético organismos
E ll f d l f d d l t lEn aquellas fases de la enfermedad en que el agente causal esté presente en las aves/tejidos
INFECCIÓN AGUDAINFECCIÓN AGUDA INFECCIÓN CRÓNICAINFECCIÓN CRÓNICA
Muestreo se puede retrasar en el tiempo, dado que el
l á
Muestreo temprano en la fase aguda de la enfermedad ( d lí ) agente causal estará
durante más tiempo infectando el ave
(presencia de signos clínicos)
infectando el ave
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¿QUÉ MUESTRAS SE DEBEN ¿QUÉ MUESTRAS SE DEBEN TOMAR Y CÓMO SE DEBEN TOMAR Y CÓMO SE DEBEN
CONSERVAR?CONSERVAR?
![Page 25: Roser Dolz Roser Dolz PascualPascual Joaquín Girón Joaquín ... · USO PRÁCTICO E INTERPRETACIÓN DE LA SEROLOGÍA Y PCR EN CAMPO Roser Dolz Roser Dolz PascualPascual Joaquín](https://reader031.fdocument.pub/reader031/viewer/2022013020/5e836ff59a0d78442a4d3e7a/html5/thumbnails/25.jpg)
Se deben tomar muestras de los tejidos u órganos diana donde el agente causal se replique o cree persistenciadonde el agente causal se replique o cree persistencia
1.‐ Tejido diana
2.‐ Hisopo sin medio de transportep p
3.‐ Tarjetas FTA (inactivación del organismo)(inactivación del organismo)
R f i ió /C l ióRefrigeración/Congelación
Selección adecuada de la muestra
Orientar sospecha
Historia clínica (vacunaciones)
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SEROLOGÍASEROLOGÍA
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G R A C I A S G R À C I E S T H A N K Y O UG R A C I A S G R À C I E S