RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Ezgi Salmanlı, DVM, PhD Cand.

• Restriksiyon enzimleri kullanılarak DNA’nın farklı büyüklükteki fragmanlara ayrılması

• Bunların jelde görüntülenmesi ve izolatların karşılaştırılmasından ibarettir.

• Viral suşlardaki mutasyonları saptamada, viral epidemileri belirlemede, temelde iki virus suşu arasında farklılıkları genomik düzeyde belirlemede kullanılır.

PCR-RFLP

Normalde RFLP için virus izolatları gerekmektedir fakat daha sonraları geliştirilen PCR-RFLP virus izolatlarını gerektirmediği ve PCR ürünü kullanımına imkan verdiği için geniş kullanım alanı bulmuştur.

• Varyasyonun olduğu fragment amplifiye edilir.• Amplicon uygun bir RE ile kesilir. Restrüksiyon

bölgesinin varlığı veya yokluğuna göre farklı uzunluktaki restrüksiyon fragmentleri meydana gelir.

• İdentifikasyon bunların elektroforezde yürütülmesi ve görüntülenmesine göre yapılır.

• İzolatlar jelde görüntülendikten sonra büyüklüğüne göre ayrışan fragmentlerde polimorfizm olup olmadığına bakılır.

Genetik varyasyonlar

• SNPs

• MNPs

• Indels

Bu genetik varyasyonlar viral genomda Restriction site’ların yok olmasına ya da yeni restriction site’ların meydana gelmesine sebep olabilir.

• ORF30,2254• SNPs• Neuropatojenite

• ORF30 primer• SalI enzimi• EHV-1 pozitif Kontrol Ab4(neuropathogenic)V592(non-neuropath)