Rezumat (Lb. Romana) Pintea (Ardelean) Simona Alexandrina
-
Upload
mihaela-alexandra-ionita -
Category
Documents
-
view
61 -
download
1
Transcript of Rezumat (Lb. Romana) Pintea (Ardelean) Simona Alexandrina
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
GR.T.POPA IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
SIMONA ALEXANDRINA PINTEA (ARDELEAN)
TEZĂ DE DOCTORAT
Conducător ştiinţific
Prof. Univ. Dr. NĂSTASE VICTOR
2011
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE
GR.T.POPA IAŞI
FACULTATEA DE FARMACIE
SIMONA ALEXANDRINA PINTEA (ARDELEAN)
SSTTUUDDIIII EEXXPPEERRIIMMEENNTTAALLEE AALLEE UUNNOORR NNOOII
SSUUBBSSTTAANNŢŢEE TTEENNSSIIOOAACCTTIIVVEE UUTTIILLIIZZAATTEE
ÎÎNN UUNNEELLEE PPRREEPPAARRAATTEE FFAARRMMAACCEEUUTTIICCEE TEZĂ DE DOCTORAT
Conducător ştiinţific
Prof. Univ. Dr. NĂSTASE VICTOR
IAŞI
2011
CUPRINS
I. DATE DE LITERATURĂ 1. GENERALITĂŢI REFERITOARE LASUBSTANŢELE TENSIOACTIVE ……………… .. 6 1.1. Introducere şi definiţii ......................... .. 6 1.2. Proprietăţile agenţilor de suprafaţă înfuncţie de structura lor .............................................. .. 8 2. MECANISME DE ACŢIUNE ŞICLASIFICAREA TENSIOACTIVILOR ............... 12 2.1. Aspecte generale ...................................... 12 2.2. Tensioactivi din produsele farmaceutice 14
2.3. Clasificarea tensioactivilor ....................... 15
3. DETERMINAREA CALITATIVĂ ŞICANTITATIVĂ A SUBSTANŢELORTENSIOACTIVE ............................................... 18 3.1. Metode analitice calitative ....................... 18
3.2. Metode analitice cantitativ........................
19
4. METODE DE EVALUARE A TOXICITĂŢII TENSIOACTIVILOR. LEGISLAŢIE ......................
22
4.1. Aspecte generale ...................................... 224.2. Consideraţii privind legislaţia
referitoare la produse cosmetice şi tensioactivi / surfactanţi ....................................................................
28
II. CERCETĂRI PERSONALE Motivarea şi obiectivele cercetării ............................ 335. METODE MODERNE FOLOSITE PENTRUSTUDIUL TENSIOACTIVILOR ............................. 38
5.1. Principalele protocoale INVITTOXfolosite ca metode alternative pentru testareanocivităţii tensioactivilor ........................................... 38
5.2. Metode non-invazive folosite pentru testarea acţiunii tensioactivilor la nivel cutanat ...... 50
5.3. Baze de date ............................................ 59
6. FOLOSIREA TENSIOACTIVILOR PENTRUOBŢINEREA UNOR FORMULĂRIFARMACEUTICE ŞI TESTAREA ACESTORA ... 67
6.1. Difuzia prin membrană şi folosireacelulelor Franz ............................................................ 67
6.2. Evaluarea practică a cedării unuiprincipiu activ prin celule Franz echipate cumembrane de celuloză şi piele de şobolan ............... 75
6.3. Analiza reologică şi de nocivitate a unorformulări semisolide cu diferite tipuri detensioactivi ............................................................. 77
7. EVALUAREA NOCIVITĂŢIITENSIOACTIVILOR PRIN FOLOSIREA DEMETODE NON-INVAZIVE ..................................... 94
7.1. Aspecte generale ..................................... 947.2. Materiale şi metode ................................. 967.3. Rezultate şi discuţii ................................ 007.4. Concluzii ....................................... 09
8. APLICAREA TESTELOR INVITTOXPENTRU EVALUAREA UNOR TENSIOACTIVICLASICI ŞI MODERNI ............................... 10
8.1. Aspecte introductive ................................ 108.2. Materiale şi metode ................................. 138.3. Rezultate .............................................. 178.4. Concluzii ............................................. 42
9. FOLOSIREA SURFACTANŢILOR ÎNSINTEZA DE NANOCAPSULE POLIETER-URETANICE UTILIZATE ÎN TRANSPORTULTRANSDERMIC ....................................................... 43
9.1. Aspecte introductive ................................ 439.2. Microscopia electronică de scanare
(SEM) ........................................................................... 459.3. Calorimentria de scanare diferenţială
(DSC) ............................................................................ 499.4. Materiale şi metodă ................................. 539.5. Rezultate şi discuţii ................................ 56
10. TESTAREA UNOR NANOCAPSULE CUTENSIOACTIVI PRIN METODE NON-INVAZIVE PE MODEL ANIMAL ..................... 68
10.1. Condiţii de determinare ........................ 6810.2. Determinări tewametrice ....................... 6910.3. Determinări pH-metrice ........................ 7210.4. Determinări sebumetrice ...................... 7510.5. Determinări mexametrice ..................... 7810.6. Determinări corneometrice ................... 8410.7. Concluzii ................................................ 87
CONCLUZII GENERALE .................................. 88BIBLIOGRAFIE ........................................................ 92
6
CERCETĂRI PERSONALE
Motivarea şi obiectivele cercetării Tensioactivii sau surfactanţii sunt cunoscuţi
pentru influenţa asupra multor membrane biologice,
incluisv asupra pielii. Acest aspect va duce la
modificarea calităţilor pielii, a integrităţii acesteia şi
implicit la modificarea activităţii terapeutice locale sau/şi
sistemice. Din grupul de tensioctivi lauril sulfatul de
sodiu (LSS) prezintă o importanţă deosebită prin faptul
că modifică foarte mult calităţile membranelor biologice
şi în special ale pielii. Folosirea surfactanţilor pentru
facilitarea absorbţiei cutanate este utilă mai ales în cazul
soluţiilor, loţiunilor şi gelurilor pentru care rezistenţa la
suprafaţa pielii este redusă şi tensioactivul grăbeşte
penetrarea cutanată. În aceste cazuri se ţine seama şi de
faptul că tensioactivii modifică sau interacţionează cu
unele componente ale stratului cutanat. După un timp
scurt se stabileşte starea de echilibru.
Pielea este un organ intens studiat datorită
expunerii frecevente la factori de mediu, produse
cosmetice etc. Creşterea aspectelor patologice ce se pot
produce la nivelul pielii a accelerat nevoia de studiu pe
modele experimentale [Franz, T.J., 1978; Wester, R.,
7
1992; Michaels, A., 1975]. LSS difuzează între straturile
lipidice ale pielii şi fluidizează acest dublu strat. Pe lîngă
această tulburare a echilibrului şi integrităţii pielii este
cunoscut faptul că acesta produce şi fenomene nocive de
tip iritare cutanată, pierdere de apă transdermică mai ales
ca rezultat al legării de keratina intracelulară. LSS este
considerat „modelul de aur” al iritării cutanate şi un
compus de referinţă pentru studiul nocivităţii cutanate.
Nu în toate cazurile folosirea tensioactivilor ionici
(anionici şi cationici) determină penetrarea cutanată cea
mai intensă. Studii recente aplicate pentru Metotrexat au
arătat că aceştia sunt avansaţi de un al tensioactiv,
Transcutolul. Un aspect important este acela că pe lângă
tensioactivi, ca agenţi de penetrare se folosesc şi acizi
graşi, alcooli graşi şi solvenţi organici.
Surfactanţii reprezintă o categorie de substanţe auxiliare,
care pot fi folosite atât în produsele farmaceutice şi cât şi
în cele cosmetice, impunandu-se clar necesitatea unor
analize de calitate şi siguranţă, inclusiv compuşii
tensioactivi non-ionici [Franz, T.J., 1975]. Deşi
tensioactivii sunt componente auxiliare, acestea au rol
important, contribuind la obţinerea mai multe forme
8
farmaceutice (emulsii, baze de unguent, emulsie etc.)
[Franz, T.J., 1975; Franz, T.J., 1978].
În categoria compuşilor tensioactivi intră şi grupul celor
non-ionici ei fiind foarte importanţi pentru persoanele cu
pielea sensibilă încadrabile în tipul 1 sau 4 de
hipersensibilitate. Din acest grup de compuşi sunt foarte
utilizaţi polisorbaţii sau tweens şi mai exact polisorbaţii
20 şi 80. Este bine cunoscută capacitatea lor iritativă
foarte scăzută, dar pentru o mai bună înţelegere este
necesară observarea lor detaliată. Diverse forme cu
amestecuri de agenţi tensioactivi au fost, de asemenea,
foarte dezvoltate pentru efectele lor anti-iritante [Wester,
R., 1992; Franz, T.J., 1975]. Polisorbaţii 20 şi 80 sunt
utilizaţi în formularea unor produse bioterapice pentru
două caracteristici: prevenirea adsorbţiei de suprafaţă şi
ca stabilizatori faţă de agregarea proteică.
Analiza modernă a formelor cu agenţi tensioactivi
este justificată pe de-o parte prin utilizarea lor extinsă în
produsele cosmetice şi pe de altă parte prin includerea
unei mulţimi de măsurători uşor realizabile [Michaels,
A., 1975; Franz, T.J., 1975]. O comparaţie între compuşi
poate fi, de asemenea, utilă în privinţa aplicaţiilor pe care
le realizează. Deoarece acestea nu intră în categoria
9
substanţelor periculoase testele pe animale nu sunt
justificate din punct de vedere etic în timp ce testarea
umană este chiar dezirabilă.
Folosirea metodelor noninvazive pentru analiza
tensioactivilor şi produselor cu conţinut de tensioactivi
face posibilă detectarea rapidă a nocivităţii acestora.
Unele dintre cele mai cunoscute aparate sunt cele care
determină pierderea de apă transdermică, iritarea cutanată
sau cantitatea de hemoglobină locală, pigmentul melanic,
pH-ul, hidratarea generală a pielii etc. Cele mai
cunoscute aparate în acest sens sunt: TEWA-metrul,
Dermaspectrometrul, Cromametrul, Mexametrul, Skin-
pH metrul, Corneometrul, Sebumetrul etc. Informaţiile
furnizate de astfel de măsurători definesc calitatea
organului cutanat prin prezentarea calităţii stratului
cornos (corneometrie), a pierderii de apă transdermică
(TEWA-metrie) şi a modificării pigmentării şi a
eritemului local (mexametria). Mexametrul este un
spectrofotometru de reflexie de bandă îngustă proiectat să
măsoare şi să cuantifice eritemul (hemoglobina) şi
melanina ca zone pigmentate. Aplicabilitatea sa pe teren
cosmetic se extinde în studiile recente la tulburări la
hiperpigmentare şi este considerat suficient de sensibil
10
pentru a detecta mici diferenţe de culoare a pielii. Un alt
aspect important este faptul că oferă posibilitatea de
reproductibilitate [Shah, V, 1993; Smith, E.W., 1992].
Metodele de testarea la nivel cutanat sunt diverse
cum ar fi testarea in vitro pe diverse linii celulare,
testarea in vivo pe animale de experienţă şi testarea pe
om. Aceste metode la rândul lor trec printr-o permanentă
analiză şi modernizare. Testarea pe animale pentru
produsele cosmetice este limitată. Aceste metode trebuie
să fie fidele şi reproductibile. Expunerea excesivă la
agenţi fizici şi de mediu a pielii favorizează implicit
apariţia fenomenelor de fotoîmbătrânire. Intervenţia
asupra organului cutanat prin intermediul unor factori
agresivi de mediu cum ar fi formulările cu tensioactivi,
expunerea excesivă la radiaţii UV etc sunt aspecte care
preocupă cercetările actuale. Multe evaluări se pot face
pe model uman [Corbo, M., 1993]. Toxicitatea
compuşilor tensioactivi poate genera un răspuns
fiziologic, pot stimula iritaţia şi implică schimbări
obiective (roşeaţă locală şi edem) ori senzaţii subiective
(prurit şi durere). Chiar şi date recente mai ales
referitoare la studii preclinice finale arată că determinări
variate de siguranţă a produselor apelează la testele pe
11
animalul de experienţă datorită similitudinii evaluării. Cu
toate acestea sunt susţinute intens metodele alternative
dintre care utimele teste INVITTOX dezvoltă metode pe
celule sanguine, ou embrionat etc. [Vinardell, M.P.,
2008].
Un număr mare de persoane folosesc o serie de
creme şi unguente mai ales cu scop cosmetic. Cu toate
acestea nu s-a testat impactul folosirii lor după sau în
timpul expunerii la UV cunoscut fiind faptul că în
compoziţie au o serie de factori cu potenţial nociv
(tensioactivi etc). Acest aspect este corelat cu procentul
de cancere cutanate care apar chiar dacă expunerea
intensivă la UV a fost redusă cu un anumit timp înainte.
Cercetarea doreşte să scoată în evidenţă modificarea
calităţii pielii în prezenţa unui compus antioxidant prin
metode de studiu non invazive de tipul: corneometrie,
TEWA-metrie şi mexametrie [Shah, V., 1993; Smith,
E.W., 1992; Gallagher, S.J., 2003].
În acest context modele in vivo pe animale de
tipul şoarecilor sau şobolanilor sunt uşor de obţinut cu
observaţii profunde până la nivel molecular şi pot genera
rezultate bine corelate cu studiul pe om.
12
Prezentul studiu îşi propune să analizeze tocitatea
unor surfactanţi comuni şi utilizarea lor pe modele
experimentale în special de tip non-invaziv. Acestea se
referă la studii de evaluare toxicologică. Datele
prezentate doresc să sublinieze posibilitatea de evaluare a
tensioactivilor în formule aplicate pe piele umană.
Metodele de studiu se referă la tehnici non-invazive ce se
aplică la nivel cutanat şi la noi metode acceptate pentru
studiul nocivităţii ca teste INVITTOX: studiul pe celulele
sanguine (red blood cell test RBC) – INVITTOX
protocol nr. 37 şi cel pe ou embrionat (membrana
corioalantoidiană) – testul INVITTOX protocol nr. 96.
Datele prezentate doresc să sublinieze posibilitatea de
evaluare a tensioctivilor în formule aplicate pe piele
umană. Pentru conturarea mai detaliată a datelor legate
de aplicaţiile tensioctivilor s-a folosit utilizarea acestora
pentru formularea unor nanocapsule observând şi
diferenţierea aspectului lor datorită tipului de surfactant.
13
Principalele obiective fixate în cadrul tezei de
doctorat 1. Analiza unor formulări farmaceutice semisolide cu
tensioactivi. Compararea unor formulări cu tensioactivi
diferiţi.
2. Studiul nocivităţii tensioctivilor la nivelul organului
cutanat prin metode non-invazive. Teste aplicate pe piele
umană şi de animal de experienţă.
3. Interpretarea nocivităţii unor tensioactivi cu ajutorul
ultimelor teste alternative INVITTOX. Aplicaţii pe
hematii şi ou embrionat.
4. Studiul influenţei cedării unui principiu activ în funcţie
de tipul de tensioaciv. Aplicaţii prin folosirea cedării prin
celule Franz şi membrană sintetică şi obţinută din piele
de şobolan.
5. Aplicaţiile tensioactivilor în formularea unor
nanocapsule. Diferenţierea în funcţie de tipul de
tensioactiv.
14
6.3. Analiza reologică şi de nocivitate a unor
formulări semisolide cu diferite tipuri de tensioactivi
6.3.2. Material şi metodă
Citirile reologice s-au făcut cu Rheotestul RV-
MLV la 25 ºC. Indicele de saponificare s-a determinat
conform F.R.X, urmat de o validare statistică a valorilor
(6).
Formulele produsului semisolid care s-a folosit
pentru testarea tensioactivilor 2 % au fost preluate şi
adaptate dintr-un formular cosmetic (7). Procedeul de
preparare a formulărilor semisolide a fost prin încălzirea
celor două faze (apoasă şi uleioasă-faza grasă) la o
temperatură de aproximativ 70 ºC şi mixarea acestora.
Tensioactivul se solubilizează în faza apoasă. Cele două
faze se amestecă până la răcire şi solidificare.
Pentru determinarea capacităţii de întindere s-au
folosit aceleaşi 3 formule conform tabelului. Capacitatea
de întindere s-a determinat cu ajutorul extensometrului
Pozo Ojeda şi Sune Arbusa. Se ia în calcul diametrul
cercului ocupat de 1 g unguent în urma presării cu o
placă de sticlă (diametrul de 11 cm) care cântăreşte 54,5
grame (G0). La intervale de 1 minut se aşează pe placa
15
superioară a extensometrului greutăţi în ordine
crescândă: 50 g (G1), 100 g (G2), 150 g (G3) şi 200 g
(G4). Se citeşte apoi diametrul cercurilor formate prin
întinderea unguentului. Se calculează apoi suprafeţele
(π.r2) care se notează cu S0, S1, S2, S3 şi S4. Pe baza
acestor tipuri de rezultate se trasează curbele
extensometrice.
Tabelul 13. Formulele cosmetice analizate - pentru 100 g
bază
Ingredient Formula 1 Formula 2 Formula 3
Laurilsulfat de sodiu - - 0,5; 1; 1,5; 2
Tween 20 - 0,5; 1; 1,5; 2 -
Laurat de sucroză
D1216
0,5; 1; 1,5; 2 - -
Alcool cetilic 8 8 8
Unt de cacao 7 7 7
Vaselină 20 20 20
Soluţie conservantă 65 65 65
Pentru testarea curbelor de curgere se foloseşte formula:
16
unde τ este tensiunea tangenţială (Pa), z este contanta
cilindrului şi α ete valoarea citită pe cadran (forţa pe care
semisolidul o opune rotaţiei).
Pentru aprecierea vâscozităţii se foloseşte formula:
unde η este vâscozitatea dinamică (Pa .s), τ este tensiunea
tangenţială (Pa), iar D reprezintă gradientul de viteză (1/s
sau s-1).
Curbele de curgere şi reogramele ţin cont de aceşti
parametrii.
Pentru testarea nocivităţii s-a apelat la 3 grupuri de
voluntare a câte 5 persoane cu vârsta cuprinsă între 20-30
de ani care au fost instruite în ceea ce priveşte testul şi nu
au prezentat alte patologii care să interfere cu rezultatul
final. De asemenea nu s-a constatat nici hipersensibilitate
cutanată.
6.3.3. Rezultate şi discuţii
Analize reologice ale formule studiate au relevat
următoarele aspecte prezentate în figurile 25-31.
17
18
19
20
21
22
Aspectul pielii la trei loturi de voluntari după aplicare patch-ului cu formulele de analizat şi concentraţia de tensioactiv maximă de 2 % timp de 24 ore.
23
Tensioactivii sau surfactanţii, sunt compuşi amfifili care
formează monostraturi orientat pe interfeţe şi prezintă
concentraţii mai mari de echilibru la interfeţe decât cele
existente într-o soluţie vrac. Ele prezintă mai multe
caracteristici, inclusiv cele detergente, de spumare, de
udare, de emulsifiere, de solubilizare şi de dispersare.
Aceşti agenţi sunt o parte integrantă a sistemelor de
formulare disperse pentru medicamente şi produse
cosmetice şi pot întegra caracteristicile de stabilitate
fizică pentru aceste sisteme. În general, aceştia sunt
responsabili pentru proprietăţile reologice ale unei noi
formule de uz dermatocosmetologic [Rieger, M.M.,
1988; Garg, A., 2002]. Caracterizările reologice pentru
produsele semisolide farmaceutice şi cosmetice
furnizează informaţii importante pentru a facilita
producţia şi prelucrarea acestora. Astăzi, cei mai mulţi
producători, pot conta pe rezultatele reologice pentru a
dezvolta produse favorizate pentru client. Prin urmare, o
aparatură având un reometru fiabil şi şi date reologice
pertinente şi bine interpretate, devin absolut necesare
pentru producătorii actuali din domeniul farmaceutic şi
cosmetic. Rezultatele obţinute indică faptul că
formulările semisolide oferă avantaje potenţiale şi reale,
24
reprezentând un vehicul performant pentru dezvoltarea şi
pregătirea preparatelor dermofarmaceutice şi cosmetice
meritând investigaţii suplimentare şi în perioadele
viitoare.
Într-un alt studiu care trebuie amintit primele observaţii
cu privire la potenţialul iritativ al unor formulări
semisolide au fost evaluări vizuale. Acestea sunt
prezentate în figura 40. Primele imagini au arătat
rezultatele patch testelor principale, iar al doilea analiza
Proderm. Aşa cum este prezentat în figurile 39 şi 40,
agentul cel mai nociv este Tween 80, dar textura pielii şi
aspectul vizual nu sunt foarte importante ca şi efectele
secundare negative observabile. Probele au fost aplicate
concentraţiile maxime de tensioactiv (respectiv 10 %).
25
6.3.4. Concluzii
Lauril sulfatul de sodiu este tensioactivul care
determină cele mai bune proprietăţi reologice (curgere,
vâscozitate) comparativ cu ceilalţi doi însă şi lauratul de
sucroză duce la formulări calitative reologic. În schimb
laurilsulfatul de sodiu va determina o nocivitate extrem
de severă comparativ cu ceilalţi tensioactivi.
7. EVALUAREA NOCIVITĂŢII
TENSIOACTIVILOR PRIN FOLOSIREA
DE METODE NON-INVAZIVE
Tensioactivii sunt printre cele mai frecvente şi
versatile elemente constitutive care se regăsesc în
numeroase medicamente topice, produse cosmetice,
26
agenţi pentru curăţat, săpunuri şi şampoane. Surfactanţii
sunt aplicaţi în diverse produse ca şi aditivi din cauza
suprafeţei lor şi a activităţilor de interfaţă. Astfel,
concentraţiile utilizate în preparatele comerciale ar trebui
să evite reacţiile adverse cum ar fi iritarea tegumentară
sau oculară precum şi ale tipuri de patologii secundare
uzului lor. Din acest motiv, căutarea de noi tensioactivi
non-iritanţi este de mare interes şi necesită dezvoltarea
unor studiile de pre-formulare. Pentru a exista asigurarea
că preparatele / formulările sunt inofensive din punct de
vedere dermic şi ocular, este necesar să se studieze
potenţialul iritativ al tensioactivilor prin determinarea
toxicităţii lor.
7.2. Materiale şi metode
S-au utilizat bandaje ocluzive, materiale de fixare
şi siringi. Conform Declaraţiei de la Helsinki studiile au
păstrat toate datele de confidenţialitate. De asemenea
obiectivele studiului au ţintit aspecte esenţiale de ordin
ştiinţific. Înaintea începerii studiului toţi subiecţii au fost
detaliat informaţi despre ceea ce urmează să aibă loc în
cadrul studiului în cel mai mic detaliu. Pentru studiul de
faţă s-au selectat voluntari Caucazieni, care au acceptat în
27
mod liber să participe la cercetare, clinic sănătoşi.
Criteriile de excludere s-au referit la boli dermatologice
care pot interfera cu evaluarea finală, starea de
graviditate, participarea la alte studii simultan, tatuaje,
arsuri şi escare în zonele de studiu. Numărul total de
voluntari a fost 25 de sex feminin subdivizate în grupuri
de 5. De asemenea participanţii vor fi excluşi din grup
dacă:
- nu urmează îndeaproape instrucţiunile;
- se îmbolnăvesc sau suferă traumatisme pe
parcursul studiului;
- nu mai doresc să continue studiul în mod
deliberat.
Descrierea testului
Metodologia de testare constă în următoarele
etape: o anumită cantitate de produs (2 ml) se aplică cu o
seringă de 2 ml pe un bandaj ocluziv; bandajul ocluziv
impregnat cu produsul cosmetic este aplicat pe pielea
umană (umăr sau partea superioară a spatelui); simultan,
patch-urile placebo (niciun fel de substanţe active) şi cele
ce realizează controlul pozitiv (lauril sulfat de sodiu),
sunt aplicate pe piele; cele trei tipuri de probe sunt
28
codificate şi aplicate aleatoriu de către investigator, într-
un trial tip „single blind”; bandajul ocluziv este menţinut
24 de ore fără nici o umiditate, observându-se orice
eventuale efecte secundare; după 24 de ore bandajul
ocluziv este detaşat de pe piele şi produsul este spălat
fără nicio manevră de frecare; toate efectele adverse
tegumentare (eritem, uscăciune, edem), sunt evaluate cu
ajutorul scorurilor COLIPA, menţionate anterior; orice
reacţie este observată imediat şi după 30 de minute, o
oră, 24 şi 48 de ore de la îndepărtarea bandajului ocluziv;
evaluarea a fost realizată de către personal specializat şi
în aceleaşi condiţii luminozitate. Pentru patch-uri au fost
folosite: bandaje ocluzive, materiale adezive pentru
fixarea bandajelor, seringi şi hârtie. Studiile au fost
realizate respectându-se principiile etice ale Declaraţiei
de la Helsinki cu privire la testarea pe subiecţi umani,
incluzând confidenţialitatea cu privire la toate
înregistrările şi documentele.
Aspectul pielii a fost analizat cu ajutorul patch-
testelor şi confirmat de analiza 41 Proderm cu un
dispozitiv Proderm (figura 5).
29
Evaluarea potenţialului toxic / iritativ pentru produsele
cosmetice testate este efectuat vizual - roşeaţa şi / sau
uscăciunea a pielii este evaluată pe o scală în
conformitate cu scorurile COLIPA (tabelul 14).
Transportul transepidermic constă în traversarea
stratului cornos intact (SC). Există două posibilităţi de
trecere: intracelulară şi intercelulară (prin şi printre
30
corneocite). Modul de trecere depinde coeficientul de
partiţie k al substanţei active: substanţele hidrofile
preferă modul intracelular de traversare în timp ce
substanţele lipofile aleg calea intercelulară, în acelaşi
timp, existând molecule care pot utiliza ambele căi.
Această metodă reprezintă o evaluare indirectă a
integrităţii stratului hidrofilic responsabil pentru funcţia
de barieră a pielii. Există o difuzie continuă a apei din
corpul uman spre stratul cornos şi de acolo la mediul
inconjurator. Nivele mici de apă transepidermică
evaporată înseamnă o funcţie mai bună a pielii ca barieră
şi o pierdere mai mică a gradului de umezire naturală.
Funcţia de barieră este uşor perturbată de probleme
mecanice sau chimice. Măsurătorile de tip TEWL vor fi
efectuate numai după utilizarea produselor cu ajutorul
bandajelor ocluzive timp de 24 de ore. Acest tip de
testare au reprezentat o metodă neinvazivă de analiză a
pielii, într-un trial „single blind”. Formula semisolidă
pregătită pentru testele TEWL a fost comparată cu una
similară la care s-a ajuns folosindu-se un extract din
scoarţa uscată de mesteacăn, 1g / 100 g cremă (vezi
tabelul 15). Această formulă s-a dovedit a avea o
31
activitate de protecţie tegumentară [Urşica, L., 2005;
Morell, J.L.P., 1996].
7.3. Rezultate şi discuţii
Primele observaţii cu privire la potenţialul iritativ
al acestor formulări semisolide au fost evaluări vizuale.
Principalele teste au fost: eritemulul, descuamarea şi
edemul. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 17.
32
33
34
35
36
37
38
Observaţia principală în acest studiu preliminar
este că soluţia tensioactivului anionic este formularea cea
mai dăunătoare pentru piele. Aşa cum este prezentat în
literatura de specialitate tensioactivul laurilsulfat de sodiu
este considerat „modelul de aur” pentru testele de iritare.
Deşi acest aspect este clar, ar putea fi important să se
analizeze ce tip de formulare a produs tulburările cele
mai evidente şi care este importanţa diferitelor
39
concentraţii asupra afecţiunilor induse pielii. Datele
referitoare la aceşti compuşi sunt elementare deoarece ei
se aplică cu o frecvenţă considerabilă pe piele. Aspectele
legate de pirderea de apă transdermică subliniază
discuţiile prezentate şi arată că o perioadă scurtă şi
permanentă de aplicare de laurilsufat de sodiu în doze
mici determină o importantă nocivitate pe piele.
Starea de hidratare a pielii este influenţată de factori externi, cum ar fi creme, loţiuni, soluţii şi evaluarea reală arată diferenţele în ceea ce priveşte tipul de agent tensioactiv şi formularea utilizată
Observaţiile cele mai importante în această direcţie sunt legate de nocivitatea laurilsulfatului de sodiu pentru ambele formulări dar mai uşoară pentru crema neionică. Formulările semisolide influenţează starea de hidratare, după o perioadă scurtă de timp de aplicare permanentă. Parametrul cu o influenţă scăzută se referă la valorile melaninei pentru toate tipurile de formulări. Chiar dacă este detectabil prin acelaşi dispozitiv, Mexametrul, eritemul este intens influenţat de agentul tensioactiv anionic. Acest comentariu poate fi corelat cu aspectul vizual al pielii (figura 43) pentru un test cu plasture pe o piele sensibilă indică faptul că la o concentraţie mai mică de agent tensioactiv anionic (5 %) se produc modificări
40
importante externe (scorul eritemului 2). Analizele privind agenţii tensioactivi aplicaţi pe piele sunt justificate mai ales prin utilizarea lor frecventa. Acest lucru poate fi motivul pentru care ştiinţa a dezvoltat noi tendinţe in analiza de toxicitate a tensioactivilor, cum ar fi membrana de ou embrionat-corioalantoidiană (HET-CAM) testul sau testele in vitro (fibroblaşti etc.). Aceste evaluări vor finaliza testele non-invazive de apariţie a hemoragiei, a lizei şi a coagulării. 7.4. Concluzii
Polisorbaţii pot fi consideraţi ingrediente sigure mai evident în formulările semisolide. Polisorbat 20 este un compus foarte protectiv care poate fi aplicat în produsele pentru o piele sensibilă. Aplicaţiile pe termen lung pentru polisorbaţi reprezintă o procedură sigură.
Concentraţiile mai mari de tensioactivi cum ar fi compuşii neionici sunt sigure pentru piele şi aspectul nociv nu prezintă semnificaţie. Chiar şi compuşii non-ionici introduşi în formulările cosmetice semisolide care nu sunt toxice necesită testări de siguranţă din cauza aplicării lor pe termen lung şi a utilizării acestora în produse pentru pielea sensibilă sau în diverse separări biologice.
41
8. APLICAREA TESTELOR INVITTOX PENTRU EVALUAREA UNOR
TENSIOACTIVI CLASICI ŞI MODERNI
Evaluarea potentialului iritativ al unor
surfactanti prin metode in vitro şi in vivo
Curăţenia / igiena este o veche necesitate iar
surfactanţii au fost folosiţi de către omenire în acest scop
încă din vremuri străvechi.
Tensioactivii sunt molecule amfotere şi conţinând
o jumătate hidrofilă şi una lipofilă care să le permită să
interacţioneze cu atât moleculele polare cât şi cu cele
nepolare. Tensioactivii sunt, în general, clasificate în
funcţie de aceste proprietăţi sau pe baza constituţiei lor
chimice. În funcţie de încărcătura lor, ei sunt clasificaţi
ca tensioactivi anionici, neionici, cationici sau amfoteri.
Datorită proprietăţilor amfotere aceştia pot fi folosiţi ca
agenţi de curaţare, spumare, umectare, emulgatori etc.
Atunci când sunt aplicaţi pe piele, ei pot
interacţiona cu structuri tegumentare, în special cu
componentele lipidice şi proteice. Deşi tensioactivii
utilizaţi în produsele care se îndepărtează sunt în general
bine toleraţi, ei prezintă un risc pentru dezvoltarea
dermatitei iritative de contact.
42
Potenţialul iritativ este extrem de dependent de
concentraţia de substanţă, precum şi de pH-ul
compoziţiei realizat în cadrul formulării [Rhein, L.D.,
1986; Baranda, L., 2002]. Datorită capacităţii de a
emulsiona şi de a reduce tensiunea superficială a apei,
tensioactivii pot elimina lipidele din piele în timpul
procesului de spălare. Prin urmare, efectele dermice
iritante majore se manifestă în special în uscarea şi
asprirea pielii, iar în cazuri rare, pot fi induse chiar
leziuni mai severe.
Există mai multe metode utilizate cu regularitate a
diferenţia detergenţii, în ceea ce priveşte potenţialul lor
de iritaţie şi pentru ai clasifica din punct de vedere al
riscurilor profesionale. Testul Draize de iritare oculară a
fost standardul de aur mulţi ani pentru testarea iritării
ochilor. Având în vedere preocuparea pentru bunăstarea
animalelor şi limitarea utilizării lor în experimentele de
laborator, au fost dezvoltate metode alternative cum ar fi
testul pe celule roşii din sânge, testul pe membrana
corioalantoidiană de ou de găină (test HET-CAM) şi teste
ce folosesc modele de ţesut ocular, toate pentru a evalua
potenţialul iritativ al membranelor mucoase / oculare
indus de tensioactivi şi alte substanţe. Iritaţia dermică
43
este adesea evaluată la om utilizând testarea cu patch-uri
epicutanate (ECT; testul one-time plasture ocluziv), în
timp ce testele tip camera de săpun (SCT) pot fi utilizate
pentru a evalua iritarea secundară expunerii ocluzive
repetate la surfactant.
Scopul acestui studiu a fost de a evalua
comparabilitatea rezultatelor testului prin diferite metode.
Pentru a evita inconsecvenţele dependente de lot,
potenţialul iritativ pentru 18 tensioactivi a fost evaluat
folosind aceeaşi soluţie stoc pentru agenţii tensioactivi în
cadrul fiecărui studiu.
Când etichetarea se face în conformitate cu
clasificarea riscului profesional, substanţele sunt, în
general, testate nediluate şi la pH-ul pe care îl deţin
materiile prime depozitate. Acest lucru nu reflectă
condiţiile incluse în produsele de igienă personală, cum
ar fi şamponul, în care nivelul pH-ului, de obicei, variază
de la pH 5-8. Prin urmare, în acest studiu de
compatibilitate a soluţiilor tensioactive evaluarea s-a
făcut la un pH care este relevant pentru acest tip de
produs de consum. Excepţie au fost cazurile de limitare a
metodei printr-un pH specific, când testarea a fost
efectuată cu produse adaptate la un pH de 6,5.
44
Potenţialul iritativ ocular al tensioactivilor a fost
studiat cu ajutorul a trei sisteme de testare in vitro care în
prezent sunt utilizate ca alternative la studiile pe animale
şi anume testul RBC şi testul HET-CAM.
8.2. Materiale şi metode
Soluţiile de Laurilsulfat de sodiu (SDS), Tween 20
şi Tween 60 au fost în concentraţie de 5 %. Ele au fost
oferite de către departamentul de tehnologie farmaceutică
al UMFT. O soluţie tip vehicul control a fost pregătită
pentru aplicarea pe CAM; reactivul pur a fost diluat cu
apă distilată (1:10, v / v). SDS a fost administrat în CAM
iar ca model de control pozitiv s-a folosit o soluţie de 1
mg / ml în apă distilată.
Testul HETCAM
Această investigaţie biologică este folosită pentru a
evalua potenţialul iritativ ocular pentru orice substanţă de
testat, măsurată prin abilitatea sa de a induce toxicitate la
nivelul vascular pe membrana corioalantoidiană de pui
[Ribatti, D., 2008]. Biotestului HET-CAM a fost realizat
ca urmare a recomandărilor ICCVAM publicate în
noiembrie 2006 în apendicele G şi adaptate la condiţiile
laboratorului nostrum [Kishore, A.S., 2008].
45
Animale şi tratament
Şoareci tip CD1 Nu / Nu au fost achiziţionaţi de la
firma Charles River (Sulzfeld, Germania), 4 şoareci /
grup. Din săptămâna 8 pe zona dorsală a fost aplicată
soluţia testată: grupul A. martorul-doar solvent (apă);
grupul B. soluţie SLS de 5 %; grupul C - Tween 20 5 %
şi grupul D soluţia de Tween 60 5 %, de câte 2 ori / zi
fiecare. Rezultatele finale au fost înregistrate şi
centralizate după 30 de zile. Protocolul de muncă a urmat
toate normele de sănătate animală preconizate NIAH-
National Institute of Animal Health: animalele au fost
menţinute în timpul experimentului în condiţii standard:
12 ore ciclul lumină-întuneric, hrană şi apă libidum,
temperatură de 24 °C, umiditate peste 55 %.
Măsurătorile mexametrice au fost efectuate cu
ajutorul unui dispozitiv de cercetare de la Courage-
Khazaka, un mexametru tip MX18 (Courage-Khazaka
Electronic, Köln, Germania). Pentru măsurători, oarecii
au fost anesteziaţi cu ketamină şi xilazină. Timpul de
măsurare continuă a fost de 20 de secunde.
Protocolul a urmărit observaţiile cu privire la
statusul hemoglobinei (respectiv apariţia eritemului).
Dispozitivul a fost aplicat pe zonele afectate cel mai
46
evident şi a fost menţinut pe piele timp de 20 de secunde.
Datele au fost înregistrate de softul specific al
dispozitivului tip Mexametru MX18 şi apoi exprimate în
unităţi. Toate datele au fost prelucrate ca valori măsurate
iniţiale şi finale pe aceeaşi zonă
Compuşii testaţi şi reactivii
Toate tensioactivii utilizaţi, cu excepţia lauril
sulfatului de sodiu (SDS), au fost obţinuţi de la Cognis
Deutschland GmbH & Co. KG (Germania). O descriere a
acestor tensioactivi poate fi găsită în tabelul 19. Aceleaşi
soluţii stoc au fost utilizate pentru toate testele (12 % AS;
pH 6,5).
47
48
8.3. Rezultate
Soluţii stoc identice (12 % AS; pH 6,5) au fost
utilizate pentru toate testele în scopul evitării variaţiilor
în rezultatele testelor din cauza diferenţelor induse de
proprietăţile intrinseci ale produsului testat.
Atât concentraţia de substanţă activă (AS) cât şi
pH-ul joacă un rol major în provocarea reacţiilor iritante,
pH-ul şi AS % fiind ajustate în conformitate cu tabelul
20, în funcţie de metoda utilizată înainte de testare. Cu
excepţia a ECT, toate testele au fost efectuate în aceeaşi
lună.
49
Unele dintre probe au fost testate în ECT în aceeaşi
lună în timp ce alte probe au fost testate două luni mai
târziu. Testele au fost effectuate „dublu-orb” şi, după caz
randomizat.
Testul RBC
Testul celulelor sanguine roşii este un test pe bază
de celule fotometrice şi a fost dezvoltat pentru a evalua
reacţiile iniţiale celulare care au loc în procesele de
iritaţie oculară determinate de tensioactivi şi de produse
pe bază de surfactanţi. Principiul testului RBC este
evaluarea tulburărilor membranare şi a denaturării
proteinelor cauzate de agenţii tensioactivi. În acest scop,
deteriorarea membranei celulare este evaluată cu ajutorul
cantităţii de hemoglobină care se scurge în supernatant
precum şi de modificările conformaţiei proteinelor care
sunt evaluate prin denaturarea hemoglobinei. Deoarece
pH-ul fiziologic al sângelui este 7,4, toate soluţiile au fost
ajustate la acest pH pentru a evita modificări ale
potenţialului iritativ numai din cauza pH-ului.
Coeficientul H50 / DI este utilizat ca o măsură de
clasificare a iritaţiei oculare în analogie cu testul Draize
de iritaţie oculară.
50
Surfactanţii Dehyton MC, Gluadin WQ, Dehyton
ML, Plantacare 2000, Plantacare 818, Gluadin WK, şi
Plantapon LC7 au fost clasificaţi ca nefiind iritanţi în
timp ce tensioactivii Plantapon LC7, Gluadin WK şi
Plantapon 818 au fost încadraţi cel mai puţin iritanţi.
Tensioactivii PGFAC-S, Plantapon ACG 50, 138
Plantapon LGC, şi Plantacare 1200 au fost clasificaţi ca
fiind uşor iritanţi, tensioactivii Plantapon SB3, Dehyton
DC şi Dehyton PK45 au fost clasificaţi ca fiind moderat
iritanţi şi tensioactivii Texapon S K14, Texapon ALS,
Texapon K12 G şi Texapon N70 au fost clasificaţi ca
iritanţi.
Testul HET-CAM
Testul HET-CAM a fost aplicat conform
protocolului ICCVAM descris anterior de către
Spielemann si Liebsch (INVITTOX 1992). Acesta se
bazează pe observarea membranei corioalantoide după
aplicarea probelor de analizat şi ţine cont de avantajul
ţesutului biologic folosit – reţeaua vasculară sanguină, de
a reacţiona prompt în contact cu compuşii analizaţi.
Membrana corioalantoidă a embrionului de pui de
găină este observată continuu timp de 5 minute după
aplicarea soluţiilor de analizat. Metoda a putut fi folosită
51
în cazul tuturor probelor, acestea fiind transparente.
Momentul apariţiei primului semn de hemoragie, liză
vasculară (vase fantomă) sau coagulabilitate este notat în
secunde şi folosit pentru a calcula indicele de iritabilitate;
severitatea reacţiilor generate a fost de asemenea
evaluată.
Rezultatele sunt prezentate în figura 48 şi în tabelul 20.
52
53
54
55
Analizând rezultatele obţinute se observă diferenţa
existentă între probele control şi cele de analizat. Se
remarcă reacţia severă produsă de către lauril sulfatul de
sodiu (SDS); toxicitatea acestuia este confirmată şi de
efectul produs la aplicarea a 0,3 ml de soluţie 1 % la
nivelul membranei corioalantoide; decesul embrionului a
survenit în decurs de 20 de minute. În afara specimenului
tratat cu SDS toate celelalte au supravieţuit până a doua
zi.
Din seria de compuşi analizaţi se remarcă şi
Cremophor A6; în decursul celor 5 minute de observare a
evoluţiei plexului vascular în contact cu soluţia aplicată
au fost remarcate numeroase zone cu microhemoragii; de
56
asemenea în urma evaluării aspectului macroscopic al
membranei la o zi după aplicarea probelor, Cremophor
A6 este singura probă care determină distrugerea în
totalitate a membranei corioalantoide (figura 51).
Dintre moleculele analizate nici una nu a fost lipsită
în totalitate de potenţial iritativ. Următorii compuşi au
fost evaluaţi ca agenţi surfactanţi cu reacţie iritativă
foarte uşoară: Cremophor A25, Abril EM 90, Isolan GI
34. Sucrose ester, Cremophor RH 40, Cremophor EL şi
Labrasol au indicat un potenţial iritativ uşor. Compusul
cu cel mai ridicat potenţial iritativ încadrat în categoria
efect moderat spre sever a fost Cremophor A6. Acest
efect a fost confirmat şi prin distrucţia structurii
membranei evocată în figura 51.
Rezultatele arată o mare diferenţă între controlul
pozitiv, SDS şi cele două substanţe tensioactive testate
57
Tween 20 şi Tween 60. SDS induce tulburări majore la
nivel vascular pe membrana corioalantoidină; după
aplicarea de 0,3 ml de soluţie (1 mg / ml), o zonă întinsă
a fost afectată de numărul mare de microhemoragii,
moartea modelului fiind înregistrată după 20 de minute
de la contactul cu soluţia de SDS. Celelalte exemplare au
avut o viabilitate mai bună, rezistând până a doua zi.
Cele două soluţii de tensioactivi evaluate nu au
produs reacţii iritative severe pe plexul capilar al CAM
tratate. Ambele au prezentat semne de microcoagulare.
Soluţia de Tween 20 a indus o reacţie generalizată şi mai
severă, care a apărut mai târziu, explicând în acest fel
existenţa celei mai mici valori a scorului iritativ. De
asemenea, nu a existat nici un semn de liza, vasodilataţia
şi hemoragia uşoară au apărut doar la sfârşitul timpului
de observare. În ceea ce priveşte soluţia Tween 60, au
existat câteva domenii de microcoagulare şi de liză
vasculară, dar care au fost înregistrate mai devreme,
inducând un scor iritativ mai mare, chiar dacă severitatea
reacţiei a fost clasificată ca fiind uşoară.
Experimentele in vivo susţin teoria iritativă pentru
aspectele observate pe imaginile macroscopice ale
compuşilor testaţi (figura 52). Cel mai iritativ compus
58
este unul de referinţă SLS, dar, de asemenea, cei
nonionici (Tweens) au dezvoltat reacţii iritante şi de
tegument uscat (figurile 52 şi 53).
59
9. FOLOSIREA SURFACTANŢILOR ÎN SINTEZA DE NANOCAPSULE POLIETER-
URETANICE UTILIZATE ÎN TRANSPORTUL TRANSDERMIC
9.4. Materiale şi metodă
În sinteza nanocapsulelor polieter-uretanice se
utilizează o componentă hidroxilică (diol, poliol sau cel
mai frecvent amestecul lor), o componentă izocianică (un
semiprepolimer izocianic pe bază de lisin-diizocianat),
solvent şi surfactanţi. Componenta hidroxilică este
formată dintr-un amestec de dioli cu mase moleculare
mici ca 1,2-etilenglicol, 1,4-butandiol, respectiv
polietilenglicol cu masa moleculară 200. Componenta
izocianică este un semiprepolimer pe bază de lisin-
diizocianat; se utilizează varianta cu semiprepolimer
pentru a evita problemele de omogenizare datorate
diferenţelor de vâscozitate dintre cele doua componente.
Se foloseşte acetona ca solvent şi diferiţi surfactanţi.
60
61
62
63
9.5. Rezultate şi discuţii
Complecşii de incluziune sunt analizaţi prin
calorimetria de scanare diferenţială în scopul detectării
unei modificări ale proprietăţilor termice comparativ cu
substanţele pure. În cazul încorporării nanocapsulelor,
are loc o deplasare a punctelor lor de topire, fierbere şi
sublimare sau chiar dispariţia acestora.
Analiza prin calorimetrie de scanare diferenţială a
fost realizată cu un aparat Mettler Toledo DSC 821 tip
Star, versiunea 6.0 (Mettler Inc., Schwerzenbach,
Elveţia), cu o viteză de încălzire de 5 ºC / min şi o viteză
de curgere a argonului de 167 ml / min (10 l / h). Masa
probei s-a situat între 2-5 mg iar intervalul de
temperatură a fost între 25-300 ºC.
64
Curbele DSC nu prezintă pic-uri, substanţa având
caracter amorf, iar descompunerea substanţei are loc în
jurul temperaturii de 280 ºC. În cazul produşilor testaţi cu
65
HPBCD se constată dispariţia pic-ului endoterm (220 ºC)
şi apariţia unor pic-uri puternic endoterme în jurul valorii
de 260 ºC, care probabil atestă topirea întregii probe la
această valoare de temperatură. Nu poate fi exclusă şi o
descompunere a probei, însoţită de o eventuală reacţie
între cei doi compuşi.
Morfologia particulelor a fost examinată utilizând
microscopul de scanare electronică Hitachi 2400S
(Hitachi Scientific Ltd, Japonia). S-a utilizat un aparat de
acoperire în strat subţire (Bio-Rad SC 502, VG
Microtech, Anglia) pentru a induce o conductivitate
electrică a suprafeţei eşantionului. Presiunea aerului a
fost de 1,3-13,0 mPa. Forma şi morfologia de suprafaţă
ale unor compuşi formaţi din nanocapsule şi ale
complecşilor lor obţinuţi prin tehnica uscării prin
pulverizare sunt prezentate în figurile urmatoare.
Imaginile microscopice au fost înregistrate cu o mărire de
10.000 x a probei, astfel încât să fie vizibilă atât imaginea
de ansamblu cât şi o imagine cât mai detaliată a
particulelor substanţelor respective.
În cazul produşilor analizaţi se constată existenţa
unor cristale prismatice, de dimensiuni diferite, cu
suprafaţă netedă; nanostructurile se prezintă ca şi cristale
66
de diferite dimensiuni, neregulate. În ceea ce priveşte
cele două formule implicate în obţinerea complecşilor de
incluziune menţionaţi, se constată o diferenţă
semnificativă în morfologia particulelor: unele se
prezintă sub forma unor cristale tridimensionale, de
dimensiuni neregulate iar RAMEB este format din
particule sferice, fisurate, netede. În cazul complecşilor
obţinuţi prin tehnica uscării prin pulverizare se constată o
modificare remarcabilă a morfologiei substanţelor.
Produşii SD au o natură amorfă, cu particule sferice,
unele parţial fisurate, cu o suprafaţă netedă. Se observă
de asemenea agregarea acestor particule sferice.
În consecinţă, morfologia şi dimensiunea particulelor
produşilor SD sunt fundamental diferite de cele ale
substanţelor iniţiale, fiind imposibilă evidenţierea
cristalelor individuale (planurile de clivaj cristalografice)
ale diureticelor sau β-CD. Aceste observaţii conduc la
estimarea existenţei unei singure faze în produşii SD şi
deci la formarea unui complex de incluziune.
67
68
69
70
71
72
73
74
75
10. TESTAREA UNOR NANOCAPSULE CU TENSIOACTIVI PRIN METODE NON-
INVAZIVE PE MODEL ANIMAL
În cadrul experimentului de determinare a
modificărilor apărute la suprafaţa pielii în tratamente cu
medicamente înglobate în nanocapsule de tip polieter-
uretanic s-au avut în vedere următoarele:
- au fost utilizaţi în experiment 30 şoricei C57BL6j
împărţiţi în 10 loturi (3 şoricei / lot);
- şoriceii au fost epilaţi cu o zi înainte de a începe
aplicarea şi determinările, respectiv cu o zi înaintea
aplicării şi determinărilor din săptămânile 4 şi 8;
- a fost aplicată de fiecare dată o cantitate de 200 μL
emulsie de nanocapsule în acetonă (conc = 0.01 % w/w);
- pe martor s-au aplicat câte 200 μL acetonă;
- valorile au fost determinate după 30 minute de la
aplicarea pe piele;
- în tabele şi grafice sunt prelucrate valorile medii
ale fiecărui lot de 3 şoricei;
- loturile au fost notate conform tabelului I in funcţie
de surfactanţii utilizaţi în sinteza nanocapsulelor
poliuretanice.
76
77
78
79
80
81
82
83
10.7. Concluzii
În cazul valorilor determinate pe loturile de şoareci supus
acestui experiment, s-a observat că aplicarea de emulsii care
conţin nanocapsule nu modifică parametrii studiaţi.
84
CONCLUZII GENERALE 1. Surfactanţii sau compuşii cu activitate tensioactivă pot
genera schimbări importante la nivelul organului cutanat.
Studiul lor necesită reevaluare mai ales datorită faptului
că pot fi parte componentă a unor produse cu utilizarea
frecventă şi aceasta impune monitorizarea nocivităţii lor.
În plus noile concepte despre tensioctivi nu se referă la
excluderea lor ci la reevaluarea lor. Calitatea produselor
cu tensioctivi este incontestabilă mai ales în ceea ce
priveşte formulările în care ei au rol de emulgator.
2. Metodele moderne de studiu ale surfactanţilor permit o
investigare direct pe pielea umană pentru a prevedea
nocivitatea lor. Cu toate acestea pentru o detaliere a
acţiunii lor de ansamblu în produse dermatologice sau
alte produse finite se impune studiul complex pe
organisme in vivo (animale de experienţă, embrionii de
pui etc).
3. Studiul tensioactivilor se efectuează în cercetările
actuale prin metode non-invazive. TEWA-metria,
corneometria, Mexametria sunt numai câteva din aceste
metode aplicate pentru testarea organului cutanat.
85
4. Compuşii anionici de tipul laurilsulfatului de sodiu par
a fi extrem de nocivi pentru piele chiar şi la doze reduse.
Acest aspect este uşor observabil mai ales dacă sunt
aplicaţi sub formă de soluţii. Nocivitatea compuşilor
anionici se manifestă în primul rând prin modificarea
aspectului pielii prin iritaţie şi edem (patch test). Un alt
aspect detectabil în urma aplicării compuşilor tensioactivi
îndeosebi anionici este modifcarea statusului hidric al
pielii.
5. Cu toate că despre compuşii anionici se vehiculează în
diverse moduri ideea de nocivitate ei nu pot fi înlocuiţi şi
ignoraţi în produsele şi formulările finite datorită calităţii
conferită acestor formulări. Demonstrarea detaliată în
actualul material a posibilităţilor detaliate, diferite şi
reproductibile de evaluare a
produselor cu tensioactivi ajută la soluţionarea problemei
de testare şi elucidare a nocivităţii versus aplicabilitate.
6. Compuşii neionici nu sunt lipsiţi complet de intervenţii
în ceea ce priveşte modificarea calităţii pielii. Acest
aspect demonstrat prin diversele formulări cu tensioactivi
86
(formulări semisolide, nanocapsule) conduce din nou la
ideea testării pe cât posibil prin tehnici non-invazive a
formulărilor cu aceşti compuşi.
7. Compuşii de tipul surfactanţilor nu modifică sesizabil
melanina, dar cu ajutorul Mexametrului se pote detecta
modificarea hemoglobinei locale (eritemul). În plus
influenţează şi pierderea de apă transdermică şi statusul
hidric al pielii.
8. Parametrii de tipul apei transdermice şi hemoglobinei
locale sunt importanţi în expresia nocivităţii locale a unor
compuşi aplicaţi topic, inclusiv în cazul emulgatorilor.
9. Studiul toxicităţii surfactanţilor prin metode moderne
este de actualitate mai ales în ceea ce priveşte frecvenţa
utilizării lor, îndeosebi în produse cosmetice. Aplicarea
tehnicilor INVITTOX poate fi o soluţie importantă
pentru aprecierea exactă a nocivităţii acestora.
10. Un număr mare de studii au fost efectuate pentru a
găsi teste care să înlocuiască nevoia de animale de
experienţă în testele de siguranţă pentru ochi şi piele.
87
Testul pe piele de şoarece, care este un test fidel pentru
corp în totalitatea lui, poate fi corelat cu testul CAM. O
baterie de teste ar trebui să fie stabilite, pentru că nici un
test unic nu poate îndeplini toate cerinţele de evaluare a
riscurilor; s-ar putea utiliza o metodă in vitro şi o parte
din aceste teste ar putea fi teste simple pe ouă embrionate
sau pe pielea animalelor utilizate ca şi tehnici non-
invazive de măsurare.
11. Tensioactivii pot servi la producerea unor formulări
farmaceutice importante şi moderne. Ei sunt
indispensabili pentru unele formulări semisolide, mai ales
cele de pe piaţa dermocosmetică.
12. Aplicarea tensioactivilor moderni care prezintă
nocivitate scăzută poate fi o soluţie în ceea ce priveşte
reducerea potenţialului nociv ce poate fi exercitat de
acest tip de compuşi.
13. Tensioactivii clasici utilizaţi în formulări individual
sunt iritanţi şi sensibilizanţi pentru piele chiar şi la doze
reduse de 1-2 %. Combinarea acestora cu principii care
88
să protejeze organul cutanat ajută la diminuarea efectelor
nocive locale.
14. Tensioactivii pot influenţa cedarea in vitro a
principiului activ, fie că este vorba de membrană
celulozică fie că membrana de cedare este pielea de
şobolan.
15. Nanocapsulele sunt formulări moderne care în unele
variante de formulare apelează la tensioctivi. Tipul
acestora poate influenţa structura lor şi caracteristicile
formei finite dar nu într-un mod accentuat.
16. Testarea nanocapsulelor cu tensioactivi pe pielea
animalelor de experienţă prin metode rapide non-
invazive arată nocivitatea redusă a acestora.
17. Noile tendinţe în domeniul studiilor compuşilor cu
potenţial nociv se referă la posibilitatea de a-i utiliza în
continuare cu reglementări foarte clare.
89
PROPUNERI ŞI RECOMANDĂRI 1. Folosirea tensioactivilor în formulări farmaceutice
trebuie făcută echilibrat. Aceasta va avea în calcul ideea
de folosire a acestora în doze reduse sau folosirea unor
substanţe asociate care să reducă nocivitatea locală.
2. Aplicaţiile tensioactivilor pot fi extinse pe domenii
variate, inclusiv în ceea ce priveşte formularea de
nanocapsule. Aceste formulări se pot executa cu doze
mici de surfactant şi sunt lipsite de efecte nocive
marcante.
3. Aplicarea testelor INVITTOX este o soluţie facilă şi
detaliată a prezentării nocivităţii unui tensioactiv.
4. Testele INVITTOX se pot corela între ele şi apoi cu
altele de altă natură pentru a aprecia detaliat toxicitatea
tensioactivilor chiar şi la doze reduse.
5. Se recomandă testarea şi monitorizarea atentă a
formulărilor cu tensioactivi mai ales dacă sunt de tip
anionic.
6. Pentru evaluarea tensioactivilor şi formulărilor
acestora este indicată folosirea de metode non-invazive
90
(Mexametrie, TEWAmetrie etc.) care vor reda rapid şi
exact degradarea cutanată.
7. Se recomandă folosirea unor tipuri de tensioctivi care
conferă putere de penetrare similară atunci când se
testează cedarea principiului activ prin membrană
celulozică sau piele de animal.
8. Tensioactivii moderni trebuie luaţi în calcul ca variante
de compuşi cu rol de emulgator sau penetrant lipsiţi de o
nocivitate remarcabilă.
ELEMENTELE DE ORIGINALITATE Prin prezentul material se reliefează elemente de
originalitate care pot fi după cum urmează:
1. Se prezintă studii de toxicitate corelate pe pielea
umană şi studii implementate pe animale de experienţă
care apelează la tehnici moderne de analiză şi investigare.
2. Teza propune abordarea tehnicilor moderne de testare
a compuşilor nocivi şi a tensioactivilor, testele
INVITTOX dintre care s-a selectat testul pe ou embrionat
şi testul pe eritrocite care s-a aplicat pe un număr extins
91
de tensioactivi din categorii diferite. Mulţi dintre aceştia
sunt de ultimă generaţie.
3. Teza subliniază implementarea tehnicilor non-invazive
moderne ca metode de studiu al calităţii organului
cutanat.
4. Formularea de nanocapsule cu diferiţi tensioactivi,
implicit de ultimă generaţie subliniază elementul cel mai
important şi nou al materialului în lucru.
5. Nanocapsulele obţinute prin metode de sinteză actuale
au fost investigate prin metode moderne de analiză pe
animale de experienţă.
6. Studiul are un caracter concluziv în ceea ce priveşte
analiza tensioactivilor între aplicabilitate şi nocivitate.
92
BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ
1. Addicks, W.J.; Flynn, G.L.; Weiner, N.
Validation of a flow-through diffusion cell for use
in transdermal research. Pharm. Res. 1987, 4,
337–341.
2. Ai R, Dahl JE, Morisbak E, Polyzois GL.
Irritation and cytotoxic potential of denture
adhesives. Gerondol 2005; 22:177–183.
3. Al-Bawab, A.; Friberg, S.E., Some pertinent
factors in skin care emulsions. Adv. Colloid
Interf. Sci. 2006, 123–126, 313–322.
4. Baranda L. et al.: Correlation between pH and
irritant effect of cleansers marketed for dry skin,
Int. Journ of Dermatol., vol. 41 (8), Aug., p. 494,
2002;
5. Barany E, Lindberg M, Loden M. Biophysical
characterization of skin damage and recovery
after exposure to different surfactants. Contact
Dermat 1999; 40:98–103.
6. Barany, E., 2000. Human in vivo skin irritancy
testing. In: Loden, M., Maibach, H.I. (Eds.), Dry
Skin and Moisturizers. CRC Press LLC, Boca
Raton, pp. 243–250.
93
7. Barry, B.W.; Grace, A.J., Sensory Testing of
Spreadability: Investigation of Rheological
Conditions Operative During Application of
Topical Preparations, J. Pharm. Sci. 1972,61 (3),
335–341.
8. Bellomo, R.; Ronco, C. An Introduction to
continuous renal replacement therapy. In Atlas of
Hemodialysis; Bellomo, R., Baldwin, I., Ronco,
C., Thomas, G., Eds.; Bailliere Tindall: London,
UK, 2001; Volume 1, pp. 1–10.
9. Benassi L, Bertazzoni G, Magnoni C et al.
Decrease in toxic potential of mixed tensides
maintained below the critical micelle
concentration: an in vitro study. Skin Pharmacol.
Appl Skin Physiol 2003; 16: 156–164.
10. Bonferoni, M.C.; Rossi, S.; Ferrari, F.; Caramella,
C. A modified Franz diffusion cell for
simultaneous assessment of drug release and
washability of mucoadhesive gels. Pharm. Dev.
Tech. 1999, 4, 45–53.
11. Breton, P.J., 1999. From microns to nanometers:
early landmarks in the science of scanning
94
electron microscope imaging. Scanning Microsc.
13-1, 1–6.
12. Budai P, Varnagy L, Fejes S et al. Irritative
effects of some pesticides and a technical
component on tissue structure of the
chorioallantoic membrane. Commun Agric Appl
Biol Sci 2004; 69: 807–809.
13. Capitanul, A.; Luzy, A. P. ;Esdaile,D. ; et al.,
Comparison of the human skin grafted onto nude
mouse model with in vivo and in vitro models in
the prediction of percutaneous penetration of
three lipophilic pesticides, Regul. Toxicol. Pharm.
, 2007, 47: 274-287.
14. Caracciolo P.C., de Queiroz A.A.A., Higa O.Z.,
Buffa F., Abraham G.A., 2008, Acta
Biomaterialia, 4, 976-988;
15. Chattaraj, S.C.; Kanfer, I. Release of acyclovir
from semisolid dosage forms: a semi-automated
procedure using a simple plexiglass flow-through
cell. Int. J. Pharm. 1995, 125, 215–222.
16. Chenoweth, D.E.; Cheung, A.K.; Henderson,
L.W. Anaphylatoxin formation during
95
hemodialysis: Effects of different dialyzer
membranes. Kidney Int. 1983, 24, 764–769.
17. Chilcott R, Barai N, Beezer A, Brain S, Brown
M, Bunge A, et al. Inter- and intra-laboratory
variation of in vitro diffusion cell measurements:
an international multi-centre study using
quasistandardised methods and materials. J Pharm
Sci. 2005;94:632–8.
18. Clement, P.; Laugel, C.; Marty, J.-P. Influence of
three synthetic membranes on the release of
caffeine from concentrated w/o emulsions. J.
Controlled Release 2000, 66, 243–254.
19. 1997, (123-124), 169-182.
20. Corbo, M.; Schultz, T.W.; Wong, G.K.; van
Buskirk, G.A. Development and validation of in
vitro release testing methods for semisolid
formulations. Pharm. Tech. 1993, 9, 112–128.
21. Crisante F., Francolini I., Bellusci M., Martinelli
A., D‟Ilario L., Piozzi A., 2009, European
Journal of Pharmaceutical Sciences, 36, 555-564;
22. Cronin, M.T.D.; Dearden, J.C.; Moss, G.P.;
Murray-Dickson, G. Investigation of the
mechanism of flux across human skin in vitro by
96
quantitative structure-permeability relationship.
Eur. J. Pharm. Sci. 1998, 7, 325–330
23. De Fine Olivarius, F.; Agner, T.; Menne, T., Skin
barrier function and dermal inflammation. An
experimental study of transepidermal water loss
after dermal tuberculin injection compared with
SLS patch testing. Br. J. Dermatol. 1993, 129,
554–557.
24. Debbasch C, Ebenhahn C, Dami N et al. Eye
irritation of low-irritant cosmetic formulations:
correlation of in vitro results with clinical data
and product composition. Food Chem Toxicol
2005; 43: 155–165.
25. Diembeck W, Beck H, Benech-Kieffer F,
Courtellemont P, Dupuis J, Lovell W, et al. Test
guidelines for in vitro assessment of dermal
absorption and percutaneous penetration of
cosmetic ingredients. Food Chem Toxicol.
1999;37:191–205.
26. Djabari Z, Bauza E, Dal Farra C et al. The HET-
CAM test combined with histological studies for
better evaluation of active ingredient innocuity.
Int J Tissue React 2002; 24: 117–121
97
27. Duggin, G., Softening Skin with Emollient
Ingredients, Manufacturing Chemist 1996, 67 (6),
27–31.
28. Eccleston, G.M., Functions of mixed emulsifiers
and emulsifying waxes in dermatological lotions
and creams, Colloids and Surfaces A:
Physicochemical and Engineering Aspects
29. Edresi, S.; Baie, S., In-vitro and in-vivo
evaluation of a photo-protective kojic dipalmitate
loaded into nano-creams. Asian Journal of
Pharmaceutical Sciences 2010, 5 (6), 251-265.
30. Eun HC, Suh DH. Comprehensive outlook of in
vitro tests for assessing skin irritancy as
alternative to Draize tests. J Dermatol Sci 2000;
24: 77–91.
31. FDA-SUPAC-SS. Guidance for Industry.
SUPAC-SS Non-sterile Semisolid Dosage Forms.
Scale-up and Postapproval Changes: Chemistry,
Manufacturing and Controls. In vitro
ReleaseTesting and In Vivo Bioequivalence
Documentation 1997; pp. 19–24.
32. Fernandez A.M., Abraham G.A., Valentin J.L.,
San Roman J., 2006, Polymer, 47, 785-798;
98
33. Franz, T.J. Percutaneous absorption. On the
relevance of In vitro data. J. Invest. Dermatol.
1975, 64, 190–195.
34. Franz T. The finite dose technique as a valid in
vitro model for the study of percutaneous
absorption. Curr Probl Dermatol 1978;7:58–68.
35. Friend, D.; Catz, P.; Heller, J.; Okagaki, M.
Transdermal delivery of Levonorgestrel
IV:Evaluation of membranes. J. Pharm. Sci.
1989, 78, 477–481.
36. Fluhr, J.W.; Kuss, O.;Diepgen, T.; Lazzerini, S.;
Pelosi, A.; Gloor,M.; Berardesca, E.,Testing for
irritation with a multifactorial approach:
comparison of eight noninvasive measuring
techniques on five different irritation types, Br. J.
Dermatol. 2001,145, 696–703.
37. Frum Y, Eccleston GM, Meidan VM. Evidence
that drug flux through synthetic membranes is
assocated with normally distributed permeability
coefficients. Eur J Pharm Biopharm.
2007;67:434–9.
38. Gallagher, S.J.; Trottet, L.; Carter, T.P.; Heard,
C.M. Effects of membrane type and liquid/liquid
99
phase boundary on in vitro release of Ketoprofen
from gel formulations. J. Drug target. 2003, 11,
373–379.
39. Garg, A.; Aggarwal, D.; Garg, S.; Singla, A.
K.Spreading of Semisolid Formulations An
Update,Pharmaceutical Technology 2002, 9,84-
105.
40. Gettings SD, Lordo RA, Hintze KL et al. The
CTFA Evaluation of Alternatives Program: An
evaluation of in vitro alternatives to the Draize
primary eye irritation test. (Phase III) surfactant
based formulations. Food Chem Toxicol 1996; 34:
79–117.
41. Gogolewski S., 1996, ‚Biomedical
polyurethanes”. In: Arshady R., editor. „Desk
reference of functional polymers. Syntheses and
applications”, American Chemical Society,
Washington – DC, 657-698;
42. Goldstein, J., et al., 2003. Scanning Electron
Microscopy and X-ray Microanalysis, 3rd ed.
Plenum Press, New York.
43. Guan J., Sacks M.S., Beckman E.J., Wagner
W.R., 2004, Biomaterials, 25, 85-96;
100
44. Hagino S, Itagaki H, Kato S et al. Quantitative
evaluation to predict the eye irritancy of
chemicals: Modification of chorioallantoic
membrane test by using trypan blue. Toxicol In
Vitro 1991; 5: 301–304.
45. Hagino S, Itagaki H, Kato S, Kobayashi T.
Further evaluation of the quantitative
chorioallantoic membrane test using trypan blue
stain to predict the eye irritancy of chemicals.
Toxicol In Vitro 1993; 7: 35–39.
46. Haguenau, F., Hawkes, P.W., Hutchison, J.L.,
Satiat-Jeunemaıˆtre, B., Simon, G.T., Williams,
D.B., 2003. Key events in the history of electron
microscopy. Microsc. Microanal. 9, 96–138.
47. Hawkes, P., 2004. Recent advances in electron
optics and electron microscopy. Ann. Fondation
Louis de Broglie 29-1 .
48. Henning A, Schaefer UF, Neumann D. Potential
pitfalls in skin permeation experiments: influence
of experimental factors and subsequent data
evaluation. Eur J Pharm Biopharm. 2009;72:324–
31.
101
49. Herh, P.; Tkachuk, J.; Wu, S.; Bernzen, M.;
Rudolph B.,The rheology of pharmaceutical and
cosmetic semisolids,American Laboratory 1998,
1, 12-14.
50. Herzinger T, Korting HC, Maibach HI.
Assessment of cutaneous and ocular irritancy: a
decade of research on alternatives to animal
experimentation. Fundam Appl Toxicol 1995; 24:
29–41.
51. Hong J.H., Jeon H.J., Yoo J.H., Yu W.-R., Youk
J.H., 2007, Polymer Degradation and Stability,
92, 1186-1192;
52. Imokawa, G., Surfactant-induced depletion of
ceramides and other intercellular lipids:
implication for the mechanism leading to
dehydration of the stratum corneum, Exog.
Dermatol. 2004,3, 81–98.
53. Jiang X., Li J., Ding M., Tan H., Ling Q., Zhong
Y., Fu Q., 2007, European Polymer Journal, 43,
1838-1846;
54. Jones, D.S.; Woolfson, A.D.; Brown, A.F.,
Texture, Viscoelastic, and Mucoadhesive
Properties of Pharmaceutical Gels Composed of
102
Cellulose Polymers, Int. J. Pharm. 1997,151,
223–233.
55. Joy, D.C., 1991. The theory and practice of high-
resolution scanning electron microscopy.
Ultramicroscopy 37, 216–233.
56. Kajs T. M. ,Gartstein V Review of the
instrumental assessment of skin: Effects of
cleansing products J. Soc.Cosmet. Chem.
1991,42, 249-271
57. Khan G, Frum Y, Sarheed O, Eccleston GM,
Meidan VM. Assessment of drug permeability
distribution in two different model skins. Int J
Pharm. 2005;303:81–7.
58. Kishore A S, Surekha P A, Sekhar P V R et al.
Chorioallantoic Membrane Bioassay: An In Vitro
Alternative to Draize Eye Irritation Test for
Pesticide Screening. International Journal of
Toxicology 2008; 27: 449-453.
59. Kobayashi, Y.; Iwai,L.; Akutsu, N.; et al.,
Increased carbonyl protein levels in the stratum
corneum of the face during winter, Int. J.
Cosmetic. Sci., 2008, 30, 35-40.
103
60. Kogan, A.; Garti,N., Microemulsions as
transdermal drug delivery vehicles. Adv. Colloid.
Interfac., 2006, 123-126, 369-385.
61. Kónya, M.; Sorrenti, M.; Ferrari F.; et al., Study
of the microstructure of o/w creams with thermal
and rheological methods, Journal of Thermal
Analysis and Calorimetry 2003, 73, 623-632.
62. Michaels A, Chandrasekaran SK, Francis W,
Meredith M. Drug permeation through human
skin: theory and in vitro experimental
measurement. A I Ch E J. 1975;21:985–96.
63. Morell, J.L.P.; Claramonte, M.D.C.; Vialard, A.P.
Validation of a release diffusion cell for topical
dosage forms. Int. J. Pharm. 1996, 137, 49–55.
64. Oatley, C.W., 1982. The early history of the
scanning electron microscope. J. Appl. Phys. 53
(2).
65. *** OECD, 2008. Guideline for the Testing of
Chemicals, Draft Proposal for a New Guideline:
In vitro Skin Irritation: Human Skin Model Test.
Available at: http://www.oecd.org/ searchResult /
0,3400,en-2649-201185-1-1-1-1-1,00.html.
104
66. Otto, A.; Plessis, J.; Wiechers, J.W., Formulation
effects of topical emulsions on transdermal and
dermal delivery. International Journal of
Cosmetic Science, 2009, 31, 1–19.
67. Park J.-H., Allen M.G., Prausnitz M.R., 2005,
Journal of Controlled Release, 104, 51-66;
68. Pellett, M.A.; Castellano, S.; Hadgraft, J.; Davis,
A.F. The penetration of supersaturated solutions
of piroxicam across silicone membranes and
human skin in vitro. J. Control. Release 1997, 46,
205–214.
69. Prausnitz M.R., Mitragotri S., Langer R., 2004,
Nat. Rev. Drug. Discov., 3, 115-124;
70. Sanchez L, Mitjans M, Infante MR et al.
Determination of interleukin-1_ in human NCTC
2544 keratinocyte cells as a predictor of skin
irritation from lysine-based surfactants. Toxicol
Lett 2006; 167: 40–46.
71. Santerre J.P., Woodhouse K., Laroche G., Labow
R.S., 2005, Biomaterials, 26, 7457-7470;
72. Santoyo, S.; Arrelano, A.; Ygartua, P.; Martin, C.
In vitro percutaneous absorption of piroxicam
105
through synthetic membranes and abdominal rat
skin. Pharm. Acta. Helv. 1996, 71, 141–146.
73. Savic, S.; Weber, C.,; Savic, M.M.; Muller-
Goymann, C., Natural surfactant-based topical
vehicles for two model drugs: Influence of
different lipophilic excipients on in vitro/in vivo
skin performance. International Journal of
Pharmaceutics 2009, 38, 220–230.
74. Sivak, W.N., Zhang J., Petoud S., Beckman E.J.,
2010, Acta Biomaterialia, 6, 144-153;
75. Schaefer H., Redelmeier T.E., 1996, „Skin
Barrier: Principles of Percutaneous Absorption”,
Karger, Basel, 12-18;
76. Shah, V.P.; Elkins, J.S.; Lam, S.Y.; Skelly, J.P.
Determination of in vitro drug release from
hydrocortisone creams. Int. J. Pharm. 1989, 53,
53–39.
77. Shah, V.; Elkins, J.; Hanus, J.; Noorizadeh, C.;
Skelly, J. In vitro release of Hydrocortisone from
topical preparations and automated procedure.
Pharm. Res. 1991, 8, 55–59.
106
78. Tatai L., Moore T.G., Adhikari R., Malherbe F.,
Jayasekara R., Griffiths I., Gunatillake A., 2007,
Biomaterials, 28, 5407-5417;
79. Teichmann, A.;Heuschkel,S.;Jacobi,U.; et al.,
Comparison of stratum corneum penetration and
localization of a lipophilic model drug applied in
an O/W microemulsion and an amphiphilic
cream, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2007, 67, 699-
706.
80. Thakker, K.D.; Chern, H. Development and
validation of in vitro release tests for semisolid
dosage forms - case study. Disso. Tech. 2003, 10,
10–15.
81. Twist, J.; Zatz, J. Membrane - solvent - solute
interaction in a model permeation system. J.
Pharm. Sci. 1988, 77, 538–540.
82. Twist, J.N.; Zatz, J.L. Influence of solvents on
paraben permeation through idealized skin model
membranes. J. Soc. Cosmet. Chem. 1986, 37,
429–444.
83. Uchiyama T., Watanabe J., Ishihara K., 2002,
Journal of Membrane Science, 208, 39;
107
84. Ueda, C.T.; Shah, V.P.; Derdzinski, K.; Ewing,
G.; Flynn, G.; Maibach, H.; Marques, M.;
Rytting, H.; Shaw, S.; Thakker, K.; Yacobi, A.
Topical and Transdermal Drug Products.
Pharmacopeial Forum. 2009, 35, 750–764.
85. Urşica L, C.Dehelean, C. Peev, V.Vlaia,
G.Coneac- Formulation and quality evaluation of
some topical semisolid preparations containing
dried extract of birch tree, Recent Developments
in Pharmaceutical Analysis, Sept.2005 pp.207.
86. Van Ruissen, F.; Carroll, Le, M.; Van der Valk,
J.M.; Schalkwijk, J., Differential effects of
detergents on keratinocyte gene expression. J.
Invest. Dermatol. 1998, 110, 358–363.
87. Vinardell MP, Garcıa L. The quantitive
chlorioallantoic membrane test using trypan blue
stain to predict the eye irritancy of liquid
scintillation cocktails. Toxicol In Vitro 2000; 14:
551–555.
88. Vinardell MP., Mitjans M. Alternative Methods
for Eye and Skin Irritation Tests: An Overview. J
Pharm Sci 2008; 97:46–59.
108
89. Vinardell MP, Rimbau V, Mitjans M. Potential
eye irritation of some „„biodegradable‟‟ liquid
scintillation cocktails determined in vitro. Food
Chem Toxicol 2004; 42:1287–1290.
90. Vinardell MP, Mitjans M. The chorioallantoic
membrane test as a model to predict the potential
human eye irritation induced by commonly used
laboratory solvents. Toxicol In Vitro 2006; 20:
1066–1070.
91. Welin-Berger, K.; Neelissen, J.A.M.;
Bergenstahl, B. The effect of rheological
behaviour of a topical anaesthetic formulations on
the release and permeation rates of the active
compound. Eur. J. Pharm. Sci. 2001, 13, 309–
318.
92. Wester R, Maibach H. Review: percutaneous
absorption of drugs. Clin Pharmacokinet.
1992;23:253–66.
93. Williams, A.C.; Barry, B.B., Penetration
enhancers, Adv. Drug Deliv. Rev. 2004,56, 603–
618
94. Wu, S.T.; Shiu, G.K.; Simmons, J.E.; Bronaugh,
R.L.; Skelly, J.P. In vitro release of nitroglycerin
109
from topical products by use of artificial
membranes. J. Pharm. Sci. 1992, 81, 1153–1156.
95. Zorin, S.; Kuylenstierna, F.; Thulin, H. In vitro
test of Nicotine's permeability through human
skin. Risk evaluation and safety aspects. Am.
Occup. Hyg. 1999, 43, 405–413.
110