Replikacija u Eukariota
-
Upload
kraljjuran -
Category
Documents
-
view
225 -
download
0
Transcript of Replikacija u Eukariota
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
1/17
11/10/201
Replikacija u eukariota
Brzina kretanja replikacijskih rašlji: 50 Nu/s
U eukariota postoji više ishodišta replikacije – 30 000 kod čovjeka (svakih 30-300 kpb)
Replikon – replikacijska jedinica
Osobitosti replikacije kod eukariota
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
2/17
11/10/201
Regulacija staničnog ciklusa U eukariotskom staničnom ciklusureplikacija DNA i stanična dioba sukoordinirane:
mitoza se događa nakon sintezeDNA, a ova dva procesa razdvajaju
faze G1 i G2
VAŽNO: Stanična DNA se morareplicirati samo jednom tijekom
staničnog ciklusa
Za regulaciju su bitni proteini ciklini i
kinaze ovisne o ciklinima (CDK)
Mitotski ciklini A i B se na kraju M
faze ubikvitiniraju i razgrađuju Nestanak ovih ciklina – nastajanjepre-replikacijskog kompleksa na
mjestima inicijacije replikacije
Inicijacija replikacije kod eukariota
ORC (origin recognition complex ) se veže naishodište replikacije, a proteini CDC6 i CDT1omogućuju vezanje replikacijske helikaze MCM2-7 na DNA
(analogija s proteinima DnaA, DnaC, DnaB)
Nastaje pre-replikacijski kompleks (pre-RC)
koji čini stanice kompetentnima za replikaciju (tzv. licencing )(kasna M- ili rana G1-faza)
pre-RC se još mora aktivirati da bi došlo do započinjanja replikacije u S-fazi
Ova aktivacija ovisna je o aktivnosti
protein kinaza CDK (koje su ovisne o ciklinima)
pre-RC
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
3/17
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
4/17
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
5/17
11/10/201
Aktivno mjesto kvaščeve DNA-polimeraze ε
Komentirajte aktivno mjesto.
Zašto je korišten ddC?
Hogg et al NSMB 2014
Potencijalna uloga P domene
P-domena (tamno plavo) okružuje novosintetiziranu dl DNA
Hogg et al NSMB 2014
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
6/17
11/10/201
Pokus produženja početnice u analizi procesivnosti
Određivanje procesivnosti u pokusu produženja početnice u uvjetima sa i bez heparina
(Heparin je glikozaminoglikan s puno negativnih naboja, te kompetira za vezno mjesto za DNA,čime se može razlikovati procesivan od neprocesivnog načina sinteze DNA (i RNA))
Uz heparin:
Pol δ (bez PCNA): procesivnost 2-3 NuPol ε exo- (bez PCNA): procesivnost do 28 NuPol ε-P1 (bez dijela P-domene): procesivnost 0 NuPol ε-P2 (mutacije 3 ak u P domeni koje interagiraju s dlDNA): smanjena procesivnost
Hogg et al NSMB 2014polimerizacijska aktivnost
Struktura i funkcija PCNA
PCNA ( proliferating cell nuclear antigen) – klizni držač DNA – analognafunkcija bakterijskoj β-hvataljcitri podjedinice stvaraju prsten (kod bakterija dimer)
3D struktura izuzetno slična, ali primarna nema nikakve sličnosti s bakterijskom β-hvataljkom
PCNA β-hvataljka
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
7/17
11/10/201
Struktura RFC
RFC (replication factor C ) – postavljač PCNA na DNA odmiče Polα i postavlja PCNA na DNA blizu početnice nakon čega se veže Polδ
Indiani and O'Donnell Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 751 –761
a | Shown on the left is the crystal structure of the Saccharomycescerevisiae RFC (replication factor C) –PCNA (proliferating cell nuclearantigen) complex that was solved in the presence of ATP S (ProteinData Bank (PDB) code 1SXJ; ATP S is not visible in the structureabove). RFCD (also known as RFC2) and RFCE (also known as RFC5)do not contact the closed PCNA clamp. The diagrammaticrepresentation of the RFC –PCNA crystal structure on the right showsthe nomenclature for clamp-loader subunits, and PCNA is shown inbrown. b | Model of RFC –PCNA, which indicates that PCNA might openinto a right-handed spiral, thereby docking onto the spiral of AAA+domains of all five RFC clamp-loader subunits. c | Model of the DNAthat is positioned in the RFC –PCNA –ATP S structure. The AAA+domains of RFC subunits are arranged in a helix with a pitch thattracks the minor groove of B-form DNA. The C-terminal collarfunctions as a screw cap that blocks the continued threading of DNAthrough the structure. The diagram on the r ight illustrates how single-stranded DNA (ssDNA) at a primed site might bend sharply to exit outthe side of RFC. d | Top view of the RFC –PCNA –DNA model. The C-terminal collar is removed. The AAA+ domains of the RFC subunits arecolour coded as in panel a. PCNA is in grey and DNA is green andorange. The -helices of RFC subunits that track DNA are highlighted inyellow. Each subunit contains two of these -helices. Green spheresindicate a possible exit path for template ssDNA from the central
chamber.
Figure 5-38a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Nukleosomi i replikacija
Tijekom replikacije nukleosomi disociraju, a poslije se opet brzo reasociraju
Roditeljski histoni se raspodjeljuju nasumično na obje replicirane DNA H3-H4 tetramer je stabilan i jače se veže na DNA od H2A-H2B dimera
http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1sxjhttp://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1sxj
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
8/17
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
9/17
11/10/201
Izrezivanje početnice Okazakijevi fragmenti su duljine 100-200 pb što odgovara duljini
DNA u nukleosomu (150-200 pb)
Nakon replikacije Okazakijevih fragmenata na njima se stvaraju
nukleosomi
S obzirom da su dijelovi DNA na početku i kraju nukleosomaslabije vezani na histone, taj dio DNA se može lakše razmotati ina tom dijelu Polδ istiskuje lanac kćer prethodno sintetiziranogOkazakijevog fragmenta s lanca kalupa, te istovremeno
dovršava “svoj” Okazakijev fragment
Istiskivanje lanca zove se strand displacement , ovu aktivnost
nemaju sve DNA-polimeraze
Istisnutu RNA/DNA početnicu izrezuje FEN1 endonukleaza;RNaza H razgrađuje RNA
Ovim se povećava vjernost replikacije jer je RNA/DNApočetnica nastala djelovanjem Polα/primaze koja nema 3’-5’
egzonukleaznu aktivnost
Pol δ ne može istisnuti lanac kćer s lanca kalupa u dijelunukleosoma gdje je DNA čvrsto vezana na histone (u područjuosi dvostruke simetrije, dyad axis), te ona disocira s kalupa
Nukleosomi zaustavljaju aktivnost Polδ – i zato su Okazakijevifragmenti kratki i odgovaraju duljini DNA koja je omotana u
nukleosomimaKurth i O’Donnell Trends Biochem Sci 2012
Krajevi eukariotskih kromosoma su linearni.
Problem replikacije linearnih kromosoma:
Zbog svojstva polimeraze koja sintetizira u 5’ → 3’ smjeru, 5‘-kraj nakonuklanjanja RNA-početnice bi se smanjivao u svakom ciklusu replikacije.
Telomere su krajevi linearnih kromosoma koji sadrže nekoliko stotina (i više)ponavljanja kratkih G-bogatih sljedova.
Humana telomerna DNA sadrži motiv AGGGTT koji se ponavlja oko 1500 puta.
Jednostanični eukarioti imaju 20-100 ponavljanja
Replikacija krajeva kromosoma
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
10/17
11/10/201
1
Zaštita krajeva kromosoma
Lanac bogat G nu je nešto duži, te se savija u petlju i sparuje s komplemetranimslijedom u drugom lancu telomere
Ova struktura (T-petlja) stabilizirana je proteinima i štiti kraj kromosoma odnukleaza
Telomere replicira telomeraza:
posebna DNA-polimeraza koja
sadrži RNA (150 Nu)
Telomeraza: reverzna transkriptaza
koja nosi vlastiti kalup
RNA služi kao kalup za produženjeG-bogatog lanca, te nosi informaciju
za nastanak telomernog slijeda
Početnica za sintezu telomera je3’-kraj kromosoma
Telomeraza je inaktivna u somatskim
stanicama, stoga se one ne mogu
beskrajno dijeliti, jer nakon
određenog broja dioba nemajufunkcionalne telomere
Skraćivanje telomera povezano je sastarenjem
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
11/17
11/10/201
Geni nekih virusa su izgrađeni od RNA. Retrovirusi prevode RNA genom uDNA djelovanjem reverzne transkriptaze.
Reverzna transkriptaza: RNA-ovisna DNA-polimeraza
(na temelju RNA-kalupa stvara DNA, obratno transkripciji)
DNA
polimeraza
Popravak DNA
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
12/17
11/10/201
1
• greške u DNA tijekom replikacije
• spontana oštećenja DNA • oštećenja DNA zbog djelovanja kemijskih i fizikalnih agensa, npr. zbog
reaktivnih vrsta kisika, ROS (reactive oxygen species)
mutacije: supstitucije, delecije, insercije
kemijska modifikacija baza
lomovi okosnice
unakrsne kovalentne veze izmeđuoba lanca DNA
Mehanizmi popravka grešaka i oštećenja u DNA
- popravak krivo ugrađenih nukleotida tijekom replikacije pomoću Pol I i Pol III- popravak krivo ugrađenih nukleotida nakon replikacije- direktni popravak
- popravak izrezivanjem baza
- popravak izrezivanjem nukleotida
Greške i oštećenja u DNA
Greške i oštećenja u DNA
Nastaje oksidacijom
Aflatoksin B1, produkt plijesni,
može se aktivirati citokromomP450, pri čemu nastaje reaktivnispoj (epoksid) koji možemodificirati G u DNA na N-7(nastaje alikilirani adukt) štouzorkuje transverzije G-C u A-T
Citokrom P450 sudjeluje u
detoksifikaciji organizma
Ponavljajući tripleti mogu dovesti do alternativnih struktura koji dovode
do povećanja broja ponavljanjatijekom replikacije
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
13/17
11/10/201
1
Spontana oštećenja DNA
Figure 5-44 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Plavo – hidrolitičke reakcije, deaminacija, hidroliza N-glikozidne veze (depurinacija)Crveno – oksidacijaZeleno – nekontrolirana metilacija pomoću S-adenozilmetionina
debljina strelice odgovara učestalosti
Depurinacija: 5000 purinskih baza dnevno u humanoj stanici
Spontanom deaminacijom citozina nastaje uracil (1 u 107 C dnevno, tj.100 puta dnevno
u humanoj stanici)
Deaminacija A i G je 100 x rjeđa
Figure 5-50a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Deaminacija baza
Deaminacija C 100x brža u jlDNA, nego u dl DNA(problem tijekom replikacije i transkripcije)
Hipoksantin se sparuje s C
Mutacija CG u TG, T se ispravlja
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
14/17
11/10/201
1
Geometrija pb s tautomernim oblicima
slična je geometriji WC parovima baza - jedan od uzroka ugradnje krivih
nukleotida tijekom replikacije
Dušične baze se mogu pojaviti urazličitim tautomernim oblicima
Figure 5-8 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Popravak krivo ugrađenog nukleotida tijekom replikacije pomoću pol I i III
http://www.flickr.com/photos/agathman/5428007501/http://www.flickr.com/photos/agathman/5428007491/http://www.flickr.com/photos/agathman/5428608654/
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
15/17
11/10/201
1
Mismatch repair – popravak krivo ugrađenih nukleotida nakon replikacije
Enzimi za mismatch repair prepoznaju novi
lanac jer kratko vrijeme nakon replikacije još nije metiliran na N6 adenina u GATC sljedovima
Nemetilirana DNA – strana DNA
Ovaj popravak je energetski vrlo skup
popravlja greške i do 1000 Nu dalje od mjesta metilacije
Mismatch repair – popravak krivo ugrađenih nukleotida nakon replikacije
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
16/17
11/10/201
1
Direktni popravak
UV svjetlo stvara kovalentne veze između susjednih pirimidina na istom lancu
Takav pirimidinski dimer ne može stati u B-DNA te blokira replikaciju
- fotokemijsko cijepanje pirimidinskih dimera enzimom DNA-fotoliaza
- enzim prepoznaje i cijepa dimer u originalne baze
- kod mnogih organizama, ali ne i kod čovjeka
Popravak izrezivanjem nukleotida
Za uklanjanje lezija koje uzrokuju veće strukturne promjene, npr. izrezivanjepirimidinskog dimera
Mehanizam: dva ureza na istom lancu DNA
-
8/20/2019 Replikacija u Eukariota
17/17
11/10/201
Popravak izrezivanjem baze
1. DNA-glikozilaza: hidrolizira glikozidnu vezu između deoksiriboze i neispravne baze
ako se radi o uracilu: uracil-DNA-glikozilazaako se radi o npr. 3-metiladeninu: glikozilaza AlkA
2. Nastaje AP mjesto bez baze (apurinsko, apirimidinsko mjesto)
AP-endonukleaza urezuje okosnicu
deoksiriboza-fosfodiesteraza uklanja deoksiribozni fosfat
3. DNA-pol I ugrađuje ispravni nukleotid DNA-ligaza povezuje urez (poveže lanac)
Spontanom deaminacijom citozina nastaje uracil
koji se ovom vrstom popravka
uklanja iz DNA (da ne dođe do mutacije GC u AT)
Timin se koristi umjesto uracila u DNA kako bi povećaotočnost genetičke informacije (da se koristi uracil u DNA, ne bi se mogao razlikovati ispravno
ugrađeni uracil od uracila nastalog deaminacijom citozina)
Prepoznavanje krive baze pomoću DNA-glikozilaza
DNA-glikozilaza putuje duž DNA i izvrće baze, te ih “provjerava” na grešku