Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych · (de!nicja niedoskonała, trudno jednoznacznie...
Transcript of Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych · (de!nicja niedoskonała, trudno jednoznacznie...
Regulacja transkrypcji genów eukariotycznych
De!nicja genu
Region DNA, który określa dziedziczoną cechę organizmu; zwykle koduje pojedyncze białko lub RNA. Zawiera całą funkcjonalną podjednostkę wraz z sekwencją kodującą, niekodującymi sekwencjami regulatorowymi DNA oraz z intronami. (de!nicja niedoskonała, trudno jednoznacznie zde!niować gen)
Molecular Biology of the Cell Forth Edition
Współczesne de!nicje odnoszą się do produktu, jakim jest transkrypt, i nie biorą pod uwagę białka
• Jak zawsze w biologii, istnieją wyjątki. Oto lista genów, które nie pasują do ‘de!nicji odnoszącej się do transkryptu’.
Geny kodujący rybosomowe RNA ( 18S; 5,8 S, 28S ) jest transkrybowany w postaci pre-rRNA 45S, następnie zachodzi rozcinanie cząsteczki RNA na fragmenty odpowiadające poszczególnym rodzajom rRNA. Czy jest więc sens w tej sytuacji odnosić się do ko-transkrybowanych genów, jako do ‘pojedynczego genu’? Zamiast tego, ‘genami’ możemy nazwać odcinki DNA odpowiadające pojedynczym jednostkom funkcjonalnym
• Trans-splicing: Istnieją geny ‘ w kawałkach’. Transkrypt pochodzący z jednego fragmentu jest łączony z transkryptem z innego fragmentu, aby mógł powstać funkcjonalny RNA.
• Geny nakładające się: Niektóre ‘geny’ nakładają się. Oznacza to, że pojedynczy fragment DNA może być częścią dwóch lub nawet trzech genów.
• Redagowanie RNA: Niekiedy pierwotny transkrypt ulega intensywnemu redagowaniu zanim stanie się transkryptem funkcjonalnym. W najbardziej skrajnych przypadkach dochodzi do wstawiania lub usuwania nukleotydów. Oznacza to, że zawartość informacyjna ‘genu’ jest niepełna dla zapewnienia jego funkcjonalności i musi być uzupełniona z udziałem innych ‘genów’
Klasyczne wyobrażenie genu – fragment DNA, który koduje funkcjonalny mRNA
Wszystkie transkrypty mRNA mają niekodujące fragmenty 5’ i 3’ końcowe
Etapy ekspresji/poziomy regulacji
• struktura chromatyny
• transkrypcja
• obróbka i kontrola jakości RNA
• transport RNA
• degradacja RNA
• translacja
• mody!kacje post-translacyjne
• degradacja białka
Transkrypcja
• Przetwarzanie informacji z zapisanej w DNA na zapisaną w RNA
• Katalizowana przez zależne od DNA RNA-polimerazy
• Podlega ścisłej regulacji
Regulacja transkrypcji
• Regulacja z reguły na poziomie inicjacji transkrypcji
• Czynniki cis – sekwencje regulatorowe w obrębie promotorów i enhancerów (wzmacniaczy)
• Czynniki trans – białka wiążące się z sekwencjami regulatorowymi (elementami cis)
Czynniki cis
Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.
• Enhancery stymulują transkrypcję, silencery hamują transkrypcję . • Jedne i drugie działają niezależnie od orientacji, tj odwrócenie ich sekwencji nie wpływa na efekt. • Jedne i drugie działają niezależnie od miejsca położenia w genomie.
– Mogą działać na odległość w stosunku do promotora – Enhancery wykrywa się nieomal wszędzie
• Jedne i drugie stanowią miejsce wiązania dla specy!cznych czynników transkrypcyjnych.
Czynniki trans
Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.
3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota
• Polimeraza mitochondrialna
polimeraza produkty wrażliwość na α-amanitynę
Polimeraza I geny rRNA (18S; 28S; 5,8S)
nie wrażliwa
Polimeraza II hn/mRNA, większość snRNA (U1, U2, U4, U5), miRNA
bardzo wrażliwa
Polimeraza III małe RNA: tRNA, snoRNA, 5S rRNA, U6 snRNA
umiarkowanie wrażliwa
CTD- C końcowa domena Pol II, o krytycznym znaczeniu dla transkrypcji
Skład podjednostkowy 3 głównych polimeraz RNA Eukaryota
Polimeraza RNA E.coli Eukariotyczne polimerazy RNA
Podjednostki typu β i β’
Podjednostki typu α
Podjednostki wspólne
Podjednostki specy!czne dla danej polimerazy
Polimeraza II
Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.
Polimeraza II RNA rozplata nici DNA, syntetyzuje RNA i łączy ponownie obie nici DNA.
Samodzielnie nie jest w stanie rozpoznać promotora genu i zainicjować transkrypcji.
Do tego celu niezbędna jest obecność OGÓLNYCH CZYNNIKÓW TRANSKRYPCYJNYCH
• U prokariontów geny są ciągłe, tj. kolinearne z ich mRNA. • U wyższych eukariontów geny są nieciągłe, tj. niekolinearne z ich mRNA. • Części genu ulegające ekspresji noszą nazwę eksonów, zaś sekwencje przedzielające
eksony – intronów.
Inicjacja transkrypcji
Podstawowe elementy cis
• Promotor rdzeniowy – wiąże czynniki ogólne (podstawowe) kompleksu polimerazy II – element TATA (wiązanie TBP) – miejsce inicjacji
• Elementy promotora podstawowego – wiążą czynniki wspólne dla wielu różnych promotorów i zapewniające podstawowy poziom transkrypcji
– element CAAT –czynniki NF-1 i NF-Y – element GC – czynnik Sp1 – oktamer – czynnik Oct1
Inicjacja transkrypcji (czynniki cis DNA)
Inicjacja transkrypcji (czynniki trans - białka)
• Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora
TATA binding protein (TBP) w kompleksie z DNA w rejonie ‘TATA-box’ TBP- składnik ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID
Molecular Biology of the Cell Forth Edition
Pierwszy etap inicjacji transkrypcji przyłączenie ogólnego czynnika transkrypcyjnego TFIID
Sekwencyjny model składania Kompleksu Preinicjacyjnego (PIC – preinitiation complex)
Aktywność transkrypcyjna na poziomie podstawowym, jeszcze nie regulatorowym
-30" +1"TATA" Inr"
IIB"
RNA "polimeraza II"
TFIID"}"TBP" TAFs"
IIB"
IIE"Pol IIa"
or TBP"IIA"
IIF"
helicase"protein kinase"IIH"
TATA" Inr"IIA" Pol IIa"IIF"IIE"Kompleks preinicjacyjny"
TATA" Inr"IIA"IIB" Pol IIa"IIF"IIE"ATP - hydroliza"
Kompleks inicjacyjny, DNA na I nukl. stopiony"
IIH"
IIH" PIC
Aktywowany PIC
TFIIA, B, D,E, H, F – Ogólne Czynniki Transkrypcyjne (GTF)
Czynniki TAF – składowe TFIID (ang. TBP Associated Factors)
TATA – TATA box – sekwencja TATAAA rozpoznawana przez białko TBP
Inr – sekwencja inicjatorowa rozpoznawana przez białka TAF
CTD
Polimeryzacja pierwszych kilku nukleozydotrifosforanów i fosforylacja CTD prowadzą do uwolnienia promotora.
Regulacja inicjacji transkrypcji
Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory
• Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora
• Specy!czne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach
Specy!czne elementy cis promotorów i enhancerów
• Moduły odpowiedzi na sygnał – np. moduł CRE – odpowiedź na cAMP (czynnik transkrypcyjny CREB)
• Moduły specy!czne dla komórek i tkanek – np. moduł mioblastowy rozpoznawany przez czynnik MyoD; moduł
limfoblastoidalny – czynnik NF-κB • Moduły rozwojowe
– np. moduły Bicoid i Antennapedia D. melanogaster
Regulacja kombinatoryczna • W sekwencjach regulatorowych występują różne kombinacje elementów
cis wiążących różne czynniki trans, co daje bardzo wiele możliwości regulacji przy udziale stosunkowo niewielkiej liczby regulatorów – kombinatoryka
Promotor ludzkiego genu insuliny
Alternatywny start transkrypcji
• Wiele genów wyższych eukariontów posiada wiele alternatywnych miejsc startu transkrypcji (promotorów), specy!cznych tkankowo
• Dzięki temu z jednego powstają różne transkrypty i białka w różnych komórkach i tkankach
Gen dystrofiny człowieka
móżdżek mięśnie siatkówka kom. Schwanna pozostałe tkanki
kora
Specy!czne czynniki transkrypcyjne
Struktura domenowa aktywatorów transkrypcji
domena wiążąca DNA
domena odpowiedzialna za dimeryzację
domena aktywująca
domena regulatorowa
Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.
Domeny wiążące DNA
• Palce cynkowe • Helisa-skręt-helisa (H-T-H) – np. homeodomena, domena
HMG, domena PAU • Helisa-pętla-helisa (H-L-H) • i wiele innych
Domeny wiążące DNA
Homeodomena zawiera domenę HTH (helisa-skręt-helisa)
Palec cynkowy
atlasgeneticsoncology.org/Deep/Images/TFfig2.jpg
Czynnik transkrypcyjny SP1
Dimeryzacja czynników transkrypcyjnych
Suwak leucynowy • protoonkogeny rodziny c-Fos i c-Jun • rodzina CREB – (cAMP response element binding protein)
Represory
Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.
Regulacja inicjacji transkrypcji Czynniki transkrypcyjne i koaktywatory
• Ogólne czynniki transkrypcyjne (podstawowe) – wspólne dla wielu promotorów, wiązanie w proksymalnej części promotora
• Specy!czne (tkankowo, w odpowiedzi na sygnały regulacyjne, w rozwoju), wiązanie w dystalnej części promotora i w enhancerach
• Koaktywatory –uczestniczą w aktywacji transkrypcji, ale nie wiążą się z DNA. Działają przez oddziaływania z białkami kompleksu transkrypcyjnego – Kompleks mediatora jest ogólnym koaktywatorem polimerazy II
Mediator – kompleks białkowy
Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961
©2007 by National Academy of Sciences
Polimeraza II RNA wraz z Mediatorem
Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961
©2007 by National Academy of Sciences
• niezbędny do regulowanej transkrypcji
• absolutnie wymagany do transkrypcji większości genów eukariotycznych
• oddziałuje bezpośrednio z aktywatorami transkrypcji i polimerazą II RNA
• ważny zarówno dla pozytywnej jak i negatywnej regulacji transkrypcji
Molecular Biology of the Cell Forth Edition
Elongacja transkrypcji genów eukariotycznych jest ściśle związana z obróbką RNA
Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557–567 (August 2006) | doi:10.1038/nrm1981
Domena CTD polimerazy II RNA koordynuje wydarzenia transkrypcyjne
Domena CTD zawiera powtarzającą się sekwencję aminokwasową (YSPTSPS)
Hyperfosforylacja domeny CTD determinuje nowy zestaw regulatorów przyłączających się do pol II i zaznacza przejście od inicjacji do elongacji transkrypcji.
Zatrzymanie w pobliżu promotora i uwolnienie promotora; przejście do fazy produktywnej transkrypcji – jest zależne od fosforylacji CTD
Terminacja i poliadenylacja
CPSF- kompleks białkowy, czynnik specy!czności cięcia i poliadenylacji
Terminacja i poliadenylacja
CstF – czynniki stymulacji cięcia
Poliadenylacja
• Kontroluje (zwiększa) stabilność mRNA • Dotyczy większości mRNA, wyjątkiem są mRNA kodujące histony
Chromatyna - podstawowy element regulacji
transkrypcji genów eukariotycznych
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/nucleosome.html
http://www.us.elsevierhealth.com/SIMON/Pollard/favorite!gs/W_Earnshaw_favorite_!gures.html
Kolejne stopnie kondensacji chromatyny
Heterochromatyna
konstytutywna – jest obecna stale w komórce, DNA wchodzący w jej skład nie zawiera genów, dzięki czemu zachowuje zwartą strukturę (obszary centromerów i telomerów)
fakultatywna – ta forma chromatyny pojawia się w jądrze okresowo i tylko w niektórych komórkach, prawdopodobnie zawiera geny nieaktywne w czasie niektórych faz cyklu komórkowego,
W mitozie cały DNA występuje jako heterochromatyna
Euchromatyna – to luźno upakowana forma chromatyny, zawierająca geny aktywne transkrypcyjnie
Dwa podstawowe stany chromatyny
Domeny funkcjonalne i izolatory
• Izolatory oddzielają domeny funkcjonalne w chromatynie
• Białka wiążące się z izolatorami uniemożliwiają interferencję regulatorów z sąsiedniej domeny (innych genów)
Izolator
Izolator
Obszary kontrolujące loci
• LCR (locus control regions) – utrzymują domeny funkcjonalne otwarte, czyli aktywne transkrypcyjnie
Chromatyna – preparaty mikroskopowe
• http://cellbio.utmb.edu/cellbio/nucleus2.htm
Struktura chromatyny
DNA + związane białka 1. Histony (małe, zasadowe) 2. Niehistonowe białka regulatorowe
We wszystkich stanach chromatyny białka są związane z DNA, a różnice strukturalne wynikają z różnego stopnia upakowania
PODSTAWOWE BIAŁKA BUDUJĄCE CHROMATYNĘ TO HISTONY najbardziej konserwowane ewolucyjnie białka u Eucariota
Histony H3 i H4 : bogate w argininy, najbardziej konserwowane ewolucyjnie sekwencje białkowe
Histony H2A i H2B : wzbogacone w lizyny, sekwencje konserwowane ewolucyjnie
Histon H1 : bardzo bogaty w lizyny, sekwencja białkowa słabo konserwowana ewolucyjnie, związany z nukleosomem poza jego rdzeniem
Struktura Krystaliczna Nukleosomu
Luger K, Mader AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ. Nature 1997 Sep18;389(6648):251-60
Nukleosom zbudowany jest z rdzenia białkowego, z około 147 bp DNA owiniętego wokół rdzenia oraz z 50 bp DNA łącznikowego
Rdzeń składa się z dwóch kopii każdego z histonów H2A, H2B, H3 i H4
Poza rdzeniem nukleosomu dołączony jest histon H1
DNA
histon H1
histon H2A
histon H2B
histon H3
histon H4
http://fermat-2.cer.jhu.edu/~as410610/lecture_pdf/What_is_the_organization_of_a_eukaryote_.PDF
Kornberg R D PNAS 2007;104:12955-12961
©2007 by National Academy of Sciences
Proces transkrypcji genów eukariotycznych zachodzi w chromatynie.
Regulacja dostępności chromatyny
Hartwell, Hood, Goldberg, Reynolds, Silver, Veres. Genetics. From Genes to Genomes. Copyright © e McGraw-Hill Companies, Inc.
Mody!kacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji
Kowalencyjne mody!kacje histonów rdzeniowych
Nukleosom
Zasadowe N- i C-końce histonowe wystają na zewnątrz nukleosomu, ponad DNA owinięty na oktamerze białkowym. Są miejscem wielu potranslacyjnych mody!kacji
Nature Reviews Molecular Cell Biology 4, 809-814 (October 2003) Timeline: Chromatin history: our view from the bridge Donald E. Olins1 & Ada L. Olins
• Fosforylacja • Acetylacja • Metylacja • ADP-rybozylacja • Ubikwitynylacja • Sumoylacja
Mody!kacje histonów rdzeniowych
Nature Cell Biology Vol, 5 May, 2003
Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:172–183
S/T
P
S/T kinazy
fosfatazy
fosforylacja
K
Ac K acetylacja
Acetylotransferazy histonowe (HAT)
Deacetylazy histonowe (HDAC)
K/R K/R
Me
metylacja metylazy
demetylazy
Enzymy mody!kujące histony rdzeniowe zależnie od ich aktywności mogą być aktywatorami bądź represorami transkrypcji
Po-translacyjne mody!kacje histonów
wg. B.Turner, Cell 2002
Mechanizm działania mody!kacji potranslacyjnych białek histonowych
Acetylacja histonów rdzeniowych rozluźnia strukturę chromatyny
acetylacja
deacetylacja
Chromatyna staje się dostępna dla czynników transkrypcyjnych i polimeraz
Mody!kowane histony rekrutują specy!czne białka rozpoznających określone mody!kacje
Tony Kozaurides, Cell 128 (2007) 693-705
Mody!kowane histony hamują wiązanie białek z danym rejonem chromatyny
Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 557–567 (August 2006) | doi:10.1038/nrm1981
Typowy wzór modyfikacji histonowych na aktywnym transkrypcyjnie genie
Mody!kacje struktury chromatyny wpływające na regulację procesu transkrypcji
Remodeling (przebudowywanie) struktury chromatyny
Regulacja struktury nukleosomowej chromatyny przesuwanie nukleosomów - zwalnianie dostępu do miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych
Aktywność kompleksów przebudowujących chromatynę zależy od ATP, w wyniku ich działania zmienia się sposób oddziaływania pomiędzy histonami, a DNA.
Kompleksy remodelujące zaangażowane są zarówno w aktywację jak i represję transkrypcji (koaktywatory i korepresory transkrypcji)
Kompleksy przebudowujące chromatynę zależne od ATP składają się z wielu białkowych podjednostek
Drożdżowy SWI/SNF
11 białek
potrzebny do ekspresji genów decydujących o typie koniugacyjnym drożdży (switching), oraz ekspresji genów regulujących metabolizm
sacharozy (sucrose non-fermenting) niektóre supresory mutacji swi/snf są mutacjami w genach kodujących histony aby aktywować transkrypcję regulowanych przez siebie genów kompleks SWI/SNF oddziałuje z chromatyną
kompleks jest ATPazą
SWI/SNF – wielo-podjednostkowy kompleks remodelujący chromatynę
ATP - zależna przebudowa chromatyny
Chromatin remodeling: insights and intrigue from single-molecule studies Bradley R Cairns Nature Structural and Molecular Biology 14: 989-996, 2007
Ślizganie lub przesunięcie oktameru histonowego w nowe miejsce, odsłonięcie DNA
Usunięcie oktameru histonowego z obszaru DNA
Chromatin remodeling: insights and intrigue from single-molecule studies Bradley R Cairns Nature Structural and Molecular Biology 14: 989-996, 2007
Usunięcie dimerów H2A-H2B, pozostawienie jedynie centralnej części oktameru – tetrameru l H3-H4, odsłonięcie DNA i destabilizacja nukleosomu
ATP - zależna przebudowa chromatyny
Zastąpienie dimerów– wymiana dimeru H2A-H2B na dimer zawierający histon H2B i wariant H2A.Z (Htz1 in S. cerevisiae)
Metylacja DNA wpływa na strukturę chromatyny i reguluje proces transkrypcji genów eukariotycznych
Mechanizm metylacji DNA
Metylacja DNA przyłączenie grupy metylowej do cytozyny (u ssaków metylacji podlegają sekwencje CpG, do 10% cytozyn jest metylowanych u ssaków ) • powoduje zamknięcie danego obszaru chromatyny • może być podtrzymywana podczas podziałów komórkowych • może powstawać de novo
metylacja DNA a struktura chromatyny podtrzymywanie metylacji DNA
Przykład ewolucyjnego efektu epimutacji (zmiany we wzorze metylacji DNA)
From Cubas et al 1999, Nature 401: 157-161
Lcyc kontroluje symetrię góra-dół kwiatu; u mutanta nieaktywny z powodu silnej, dziedziczonej metylacji
Metylacja DNA odgrywa ważną rolę w regulacji ekspresji genów oraz w dziedziczeniu epigenetycznym
Epigenetyczna regulacja genów to zjawisko polegajace na dziedziczeniu zmian w ekspresji genów, które są niezależne od zmian w sekwencji DNA
Metylacja DNA jest znacznikiem epigenetycznym decydującym o prawidłowym zachodzeniu piętna genomowego (ang. genetic imprinting), znacznik ten powstaje w rozwijającym się oocycie i jest niezbędny do utrzymania mono-allelicznej ekspresji piętnowanego genu (np. gen Igf2 – koduje czynnik wzrostowy, wyłącznie allel od ojca jest aktywny) Proces ten jest niezbędny do właściwego rozwoju.
Metylacja DNA odgrywa podstawową rolę w inaktywacji chromosomu X. Dzięki inaktywacji jednego z chromosomów X, u samic tak jak i u samców aktywna jest tylko jedna kopia genów sprzężonych z płcią.
Metylacja DNA utrzymuje się podczas mitozy, u zwierząt w procesie mejozy jest usuwana
http://www.epigenome.org/
http://www.mecp2.org.uk/
Podstawowe mody!kacje zmieniające strukturę chromatyny
• kowalencyjne mody!kacje histonów, np. acetylacja lub metylacja
• ATP-zależna przebudowa (remodeling) chromatyny- zmiana konformacji nukleosomów lub ich pozycji względem DNA, np. poprzez przesunięcie oktameru histonów wzdłuż nici DNA
• Metylacja DNA