Referat Pemeriksaan Dna

2.3 PEMERIKSAAN ANALISA DNA

2.3.A Analisa DNA Mitokondria dengan DNA Profilling

Semenjak pertengahan tahun 1980, Jefrey dengan teknologi DNA berhasil mendemontrasikan

bahwa bagian – bagian DNA yang sangat polimorfisme, (suatu bentuk yang berbeda dari suatu

struktur dasar yang sama) dapat digunakan sebagai sarana identifikasi spesifik (personal) dari

seseorang. Semenjak itu berbagai macam metode mulai diterapkan untuk penyidikan kasus – kasus

forensik. Dibanding cara – cara konvensional yang mengandalkan serologi dan elektroforesis, maka

teknologi DNA memiliki keunggulan yang sangat mencolok, utamanya dalam hal potensi

diskriminasi dan sensitifitasnya.

Saat ini dikenal ada 2 macam polimorfisme, yaitu polimorfisme protein dan polimorfisme

DNA. Polimorfisme protein antara lain ialah sistem golongan darah, golongan protein serum, sistem

golongan enzim eritrosit, dan system HLA (Human Lymphocyte Antigen).

Polimorfisme DNA merupakan suatau polimorfisme pada tingkat yang lebih awal

dibandingkan polimorfisme protein, yaitu tingkat kode genetik atau DNA. Pemeriksaan

polimorfisme DNA meliputi pemeriksaan Sidik DNA (DNA fingerprint), VNTR (Variable Number

of Tandem Repeats) dan RFLP (Restriction Fragmen Length Polymorphisme) secara Southern blot,

maupun dengan PCR (Polymerase Chain Reaction).

Kalau pada teknologi konvensional didasarkan pada polimorfisme ekspresi protein, maka

pada teknologi DNA didasarkan pada polimorfisme pada tingkat DNA. Dibandingkan dengan

pemeriksaan polimorfisme protein, pemeriksaan polimorfisme DNA menunjukkan beberapa

kelebihan. Pertama, polimorfisme DNA menunjukkan tingkat polimorfis yang jauh lebih tinggi,

sehingga tidak diperlukan pemeriksaan terhadap banyak sistem. Kedua, DNA jauh lebih stabil

dibandingkan protein, membuat pemeriksaan DNA masih dimungkinkan pada bahan yang sudah

membusuk, mengalami mumifikasi, atau bahkan pada jenasah yang hanya tinggal kerangka saja,

Ketiga, distribusi DNA sangat luas meliputi seluruh sel tubuh, sehingga berbagai bahan mungkin

untuk digunakan sebagai bahan pemeriksaan. Keempat, dengan ditemukannya metode PCR, bahan

DNA yang kurang segar dan sedikit jumlahnya masih mungkin untuk dianalisis.

Bagian dari DNA akan tersebar dalam sejumlah genom manusia sehingga dinamakan

multilokus. Bagian ini dimiliki oleh semua orang tetapi masing-masing individu mempunyai jumlah

pengulangan yang berbeda – beda satu sama lainnya, sehingga kemungkinan dua individu

mempunyai fragmen DNA yang sama adalah sangat kecil sekali.

Sampel yang dibutuhkan pada cara konvensional cukup besar, dengan teknologi DNA hanya

dibutuhkan sampel yang ekstrim kecil. Kasus – kasus kriminal dimana jumlah sampel yang diambil

di tempat kejadian perkara (TKP) sangat kecil dan kemungkinan juga sudah mengalami degradasi

maka metode yang cocok adalah metode yang sangat sensitif seperti, misalnya PCR.

Dengan diterapkannya metode PCR, kemampuan metode ini untuk memperbanyak DNA

jutaan sampai milyaran kali, yang memungkinkan dianalisisnya sampel forensik yang jumlahnya

amat minim, seperti analisis kerokan kuku (cakaran korban pada pelaku), bercak mani atau darah

yang minim, puntung rokok, dan sebagainya. Kelebihan lain dari pemeriksaan dengan PCR adalah

kemampuannya untuk menganalisis bahan yang sudah berdegradasi sebagian. Hal ini penting karena

banyak dari sampel forensik merupakan sampel postmortem yang tak segar lagi :

Dalam penyidikan forensik, utamanya berkenaan dengan dengan identifikasi barang bukti

dari sampel biologis, prosedur yang lazim diketahui adalah :

a. Bagaimanakah substansi biologis yang akan dianalisis, apakah sampel berasal dari

manusia atau spesies lain

b. Bagaimana kondisi fisiknya : cair/ basah, kering, atau segar

c. Cara pengambilan sampel

2.3.B Tahapan – Tahapan Pemeriksaan DNA profilling

Tahap 1 : Ekstraksi / Isolasi DNA

DNA harus diperoleh dari sel atau jaringan tubuh. Hanya dalam jumlah sedikit jaringan

seperti darah, rambut, atau kulit yang bila perlu dapat dilakukan penggandaan dengan PCR

(Polimerase Chain Reaction). Tetapi biasanya satu helai rambut sudah cukup untuk proses typing.

Ada 3 senyawa penting dalam isolasi DNA :

- Lysis buffer

- Digestion buffer

- Proteinase K

Proses penghancuran sel (lysis) secara kimia dilakukan dengan pemanfaatan senyawa kimia

seperti EDTA (Ethil Endiamin Tetra Asetat) dan SDS (Sodium Dodesil Sulfat). EDTA sebagai

perusak atau penghancur sel dengan cara mengikat ion magnesium. Ion magnesium ini berfungsi

mempertahankan integritas sel dan meningkatkan aktivitas enzim nuklease yang merusak asam

nukleat. Sedangkan SDS yang merupakan sejenis deterjen dapat digunakan untuk merusak membran

sel.

Kotoran (debris) sel yang ditimbulkan akibat proses penghancuran sel dapat dibersihkan

dengan cara centrifuge, sehingga yang tertinggal di dasar tabung hanya molekul nukleotida (DNA

dan RNA serta protein). Protein dapat dihilangkan dengan bantuan enzim proteinase, sedangkan

RNA juga dibersihkan dari larutan dengan RNAase, maka DNA dapat diisolasi seutuhnya.

Contoh metode isolasi DNA, adalah metode Phenol, Chalating, Chelex, TRIZOL, DNAzol,

dan Salting out. Disini yang paling sering digunakan adalah metode TRIZOL.

Tahap 2 : Proses Pemurnian (Purifikasi) dan mengukur kemurnian DNA

Banyak metode yang digunakan dalam pemurnian DNA, misalnya :

- Ammonium Sulfat

- Diethylamino Ethyl sephacel

- Sepadex G 25 Column

- Spin Column

Sedangkan mengukur kemurniannya dengan menggunakan metode UV Spektrofotometer

yang didasarkan pada prinsip radiasi sinar UV yang diserap oleh nukleotida dan protein dalam

larutan. Penyerapan maksimal oleh DNA pada λ-260 nm sedangkan protein λ-280 nm. Pada DNA

bila kepadatan optik (Optical Density) OD260 sama dengan satu, maka konsentrasi molekul DNA

setara 50 μg/ml (dsDNA) atau 40 μg/ml (oligonukleotida untai tunggal). Kemurnian DNA diukur

dengan membandingkan nilai OD260 dan OD280. Bila nilai rasio perbandingannya adalah 1,8 – 2,

maka DNAnya dikatakan “murni”.

Tahap 3 : Amplifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR)

Seperti halnya proses fotokopi, beberapa bagian DNA dapat dikopi dan digandakan.

Polymerase adalah enzim yang ada secara normal dalam tubuh makhluk hidup. Peran enzim tersebut

dalam proses ini adalah mengkopi materi genetik, meneliti dan mengkoreksi kopian dari DNA.

Setelah enzim melekat pada DNA, DNA dobel helix tersebut terbentuk dua single strand DNA

(ssDNA). Salah satu molekul DNA polimerase mengikat salah satu strand DNA, kemudian ikatan

tersebut bergerak sepanjang strand dan kemudian mensintesis strand nukleotida dan setelah strand

dikopi, dobel helix kemudian menutup kembali.

Diperlukan DNA original untuk dikopi, dua molekul primer yang berbeda untuk mengurung

DNA yang utuh. Nukleotida diperlukan untuk kerangkanya, larutan buffer dan taq DNA polymerase.

Dua primer diperlukan untuk mengkomplemen, satu strand DNA pada awal daerah target dan primer

kedua untuk mengkomplemen strand lainnya pada akhir daerah target.

Pada kondisi tertentu, bagian DNA akan berlipat ganda menjadi jumlah yang besar dalam

waktu singkat. Proses pencampuran PCR mengikuti 3 tahapan yaitu: denaturasi, annealing primer,

dan replikasi DNA, detailnya adalah sebagai berikut:

a. Satu potong DNA original didenaturasi pada suhu 94 – 96°C, doubel helix strand dipisahkan

menjadi single strand.

b. Primer mengikat masing – masing strand DNA pada suhu sekitar 50 – 65°C.

c. Suhu dinaikkan sampai 72°C untuk replikasi DNA.

Tahap 4 : Elektroforesis dan Staining

Apabila sampel DNA telah cukup dilipatgandakan, maka dilanjutkan dengan proses

elektroforesis. Elektroforesis merupakan monitor hasil analisa DNA, yang nantinya akan tampak

sebagai bentukan pita / band pada gel. Gel merupakan bahan kimia yang terpenting dalam

elektroforesis. Ada 2 tahap dalam proses ini, yaitu :

- Loading DNA Sample

- Running the Gel

Sedikitnya ada 2 gel yang selama ini digunakan yakni gel agarose dan gel polyacrylamid.

DNA yang bermuatan negatif akan bergerak menuju ke kutub positif setelah adanya aliran listrik.

Pergerakan DNA ini dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu :

- Ukuran molekul DNA : semakin kecil ukurannya, maka migrasinya lebih cepat

- Konsentrasi gel : bila konsentrasinya rendah, maka pergerakan DNA lebih cepat

- Konformasi DNA

- Voltase yang digunakan

- Komposisi larutan buffer

Proses elektroforesis selesai langsung dilanjutkan ke pengecatan/ staining. Biasanya menggunakan

silver staining. Sehingga akan nampak pita atau band DNAnya pada gel elektroforesis.

Tahap 5 : Sequencing

Merupakan pengurutan nukleotida – nukleotida dari hasil ampliflkasi PCR. Pada dasarnya

ada 2 metode yang telah dikembangkan, yaitu metode Maxam – Gilbert (cara kimiawi) tahun 1977,

dan metode Sanger (enzimatik) pada tahun yang sama. Karena lebih mudah, praktis dan efisien,

maka metode Sanger lebih banyak digunakan.

Tahap 6 : Analisa Profil DNA Mitokondria

Analisa dilakukan dengan melihat pita – pita DNA yang terlihat pada gel. Pita DNA yang

terdapat pada trace evidence kemudian dibandingkan dengan pita DNA pelaku kejahatan.

2.3.C Penggunaan DNA profiling

Teknik DNA profiling ini banyak digunakan dalam berbagai bidang ilmu baik untuk kesehatan

manusia, penelitian biologi, dunia medis dan untuk pembuktian peristiwa kriminal atau forensik.

1) Untuk mendiagnosis kelainan keturunan

Suatu program penelitian kelainan genetik yang diturunkan dapat dilakukan pada janin yang

belum dilahirkan maupun bayi yang baru dilahirkan, telah dikembangan pada berbagai rumah sakit

didunia. Kelainan tersebut meliputi kejadian Cystic Fibrosis, Haemophilia, Huntington's disease,

Familial Alzheimers, Sickle Cell Anemia, Thalassemia dan lain-lainnya.

Pendeteksian kelainan tersebut lebih awal akan memudahkan dokter atau ahli medis untuk

melakukan pengobatan pada anak yang menderita kelainan tersebut. Suatu program pengobatan

kelainan genetik menggunakan DNA profiling sebagai informasi untuk orang tuanya mengenai

resiko dari kelainan tersebut pada anaknya. Pada program lain informasi pada orang tuanya

mengenai DNA profiling pada bayi yang masih dalam kandungan mengalami kelainan genetik dan

tindakan apa yang akan dilakukan.

2) Pengembangan penelitian mengenai kelainan genetik

Program penelitian difokuskan pada gangguan kelainan yang diturunkan pada kromosom, hal ini

perlu diinformasikan apa yang terdapat pada DNA profiling. Dengan mempelajari DNA profiling

pada orang yang menderita kelainan tertentu atau membandingkan dengan kelompok orang normal

atau penderita kelainan akan dapat diidentifikasi bentuk DNA yang berhubungan dengan kelainan

tersebut.

3) Bukti biologik

Barang bukti DNA profiling telah sering digunakan pada laboratorium kriminal kepolisian yaitu

darah, rambut, semen dan sebagainya. Seperti misalnya pada peristiwa teror bom Bali dimana

banyak bukti bahan biologik telah diuji DNA profiling-nya untuk menentukan korban dan

identifikasi korban. Selain itu DNA profiling juga dapat untuk identifikasi korban pembunuhan

maupun pelaku pembunuhan ataupun perkosaan

2.3.D Bahan Untuk Pemeriksaan DNA

- Darah dan bercak darah

- Sperma dan bercak sperma

- Jaringan dan sel

- Tulang dan organ

- Rambut dan folikel

- Urin yang mengandung sel berinti

- Saliva dan bercak salivA yang mengandung sel berinti

- Pulpa gigi

- Cairan amnion

2.3.E Cara Pengumpulan / Pengambilan Sampel

A. Darah

1. Sampel Darah Cair

a. Darah dari seseorang

- Diambil oleh semprit oelh petugas yang berpengalaman

- Siapkan 2 tabng dengan EDTA. Dapat dipakai antikoagulan lain, tetapi perlu diingat

bahwa heparin dapat mempengaruhi aktifitas enzim retriksi tertentu

- Isi tiap tabung dengan kuranglebih 5 ml darah

- Tiap tabung ditutp dan diberi label

- Simpan di pendingin

- Dipak dan dikirim ke laboratorium

b. Darah cair di TKP

- Hisap dengan semprit bersih ( steril ) atau pipet disposible

- Pindahkan ke tabung steril

- Darah beku dapat diambil dengan spatel yang bersih

- Dapat dipakai kain katun bersih untuk menyerap darah

- Sampel darah cair diberi antikoagulan

- Diberi label, simpen dipendingin

- Dipak dan dikirim ke laboratorium

c. Darah cair dalam air atau salju, es

- Segera mungkin diambil untuk menghindari pengenceran lanjut

- Dalam jumlah cukup dimasukan dalam tempat bersih

- Hindari kontaminasi

- Simpan dipendingin, bila mungkin dibekukan

- Beri label, dipak dan dikirim ke laboratorium

2. Bercak darah basah

a. Dipakaian

- Pakaian dengan noda darah diletakan pada permukaan bersih, keringkan di udara

- Jangan letakan pada tempat tertutup, kedap udara atau plastik. Akan menyebabkan

bahan pemeriksaan menjadi basah dan timbul bakteri yang dapat merusak barang

bukti

- Setelah kering masukan dalam kantong kertas

- Beri label dan segera kirim ke laboratorium

b. Benda dengan bercak darah basah

- Benda kecil biarkan kering di udara, kumpulkan

- Pada benda besar dan tidak dapat dipindahkan, maka hisap bercak tersebut dengan

kain katun bersih kemudian keringkan di udara

- Masukan dalam kantong kertas

- Beri label dan segera kirim ke laboratorium

3. Bercak darah kering

a. Pada benda yang dapat dipindahkan, misal : senjata, kain, sprei

- Kumpulkan benda tersebut

- Tiap item masukan dalam kantong kertas

- Beri label ,dipak dan kirim ke laboratorium

b. Pada benda padat dengan permukaan tidak menyerap dan tidak dapat dipindahkan, misal :

lantai

- Bercak dikerok dengan alat yang bersih


- Beri label, dipak kemudian kirim ke laoratorium

c. Bercak darah kering pada benda besar yang tidak dapat dipindahkan atau dipotong serta

tidak dapat dikerok

- Bercak dapat dilarutkan dengan kapas bersih yang telah dibasahi dengan cairan salin

steril atau air steril yang digosokan pada area bercak

- Kapas dikeringkan diudara

- Setelah kering masukan dalam kantong kertas

- Beri label, dipak dan kirim ke laboratoium

4. Bercak darah kering di karpet, alat rumah tangga atau pada benda yang dapat dipotong

- Potong bagian dengan bercak dengan alat bersih

- Tiap potongan diberi label dan dipak

- Sertakan bagian kontrol potongan benda yang tidak berbercak

- Kirim ke laboratorium

5. Percikan darah kering

- Seringkali sulit dipisahkan dengan permukaan benda

- Gunakan cellotape. Tempelkan pada percikan sehingga dapat menempel

- Masukan cellotape dalam kantong plastik


B. Sperma dan Bercak Sperma

1. Sperma cair

- Hisap dengan semprit basah (steril) atau pipet disposible

- Pindahkan dalam tabung steril

- Diberi label, simpan di pendingin

- Dapat pula sperma cair diserap dengan kapas bersih, keringkan di udara

- Beri label, dipak dan dikirim ke laboratorium

2. Bercak sperma pada benda yang dapat dipindah. Misal : celana, pakaian, sprei, bantal,

guling, dll

- Bila bercak masih basah, keringkan di udara

- Bila perlu benda yang berbecak dipotong

- Masukan kantong kertas


3. Bercak sperma pada benda besar yang dapat dipotong, misal : karpet, tempat tidur atau

perkakas lain

- Potong daerah berbecak dengan pisau atau gunting bersih

- Masukan potongan dalam kantung kertas

- Hindari kontaminasi


4. Bercak sperma pada benda yang tidak dapat dipindah dan permukaan tidak menyerap,

misal : lantai, logam kayu, dll

- Bercak dikerok dengan alat yang bersih

- Letakan kerokan pada kertas bersih dan lipatlah

- Masukan dakam kantong kertas


5. Barang bukti sperma pada tubuh korban kejahatan seksual

- Korban biasanya diperiksa di RS

- Barang bukti dapat ditemukan di mulut, vagina dan anus korban

- Tiap item ditempatkan pada wadah tersendiri


C. Jaringan , Organ dan Tulang

1. Jaringan, Organ dan Tulang segar

- Ambil tiap jaringan, organ dan tulang segar dengan pinset

- Tiap item ditempatkan pada wadah yang bersih tanpa diberi pengawet

- Beri label

- Simpan di pedingin

- Dipak dan kirim ke laboratoium

2. Jaringan, Organ dan Tulang yang lama (tidak segar)

- Ambil tiap jaringan, organ dan tulang dengan sarung tangan bersih

- Tiap item ditempatkan pada wadah yang bersih tanpa diberi pengawet

- Beri label

- Simpan di suhu kamar

- Dipak dan kirim ke laboratorium

Untuk jaringan otot minimal jumlah 25mg, karena DNA otot sangat sedikit, sedangkan

jaringan lain seperti hati dan ginjal cukup 15mg.

D. Urin, Saliva dan Cairan Tubuh Lain

1. Sampel cair

- Urin atau saliva cair masukan ke tempat steril dari plastik atau kaca sesegera mungkin


- Beri label, dipak dan kirim ke laboratorium

E. Rambut

- Cabut beberapa dengan helai dengan pinset bersih, berikut dengan akarnya

- Usahakan pencabutan tidak merusak folikel

- Rambut yang tercampur darah, jaringan atau cairan tubuh yang lain diperlakukan

dengan hati hati

- Tempatkan pada wadah bersih



F. Pulpa gigi

- Cabut gigi yang masih utuh (tidak rusak)


- Beri label, dipak kemudian kirim ke laoratorium

G. Cairan amnion

- Dilakukan oleh tenaga ahli yang terlatih (dokter spesialis obgyn)

- Dilakukan pada kehamilan > 14 minggu

- Dengan bimbingan USG, tentukan lokasi amniosentesis, setinggi mungkin dalam

uterus, menjahui janin dan placenta

- Lakukan prosedur asepsis dan antisepsis tanpa anaesthesi lokal insersi jarum dengan

dituntun USG sampai mencapai kantong amnion yang bebas.

- Aspirasi cairan amnion 0,5 ml, kemudian buanglah, karena kemungkinan

terkontaminasi dengan sel maternal

- Aspirasi lagi 30 ml (pada prakteknya 10 ml saja sudah dianggap cukup)

- Jarum dicabut, janin dimonitor keadaan jantungnya



2.3.F Cara Pengepakan / Pembungkusan Sampel

Untuk kasus forensik perlu dijaga keaslian bahan dan jangan sampai rusak sehingga

dapat diperiksa dengan baik, maka bahan tersebut harus diperlakukan sebagai berikut :

- Masukan wadah berisi bahan pemeriksaan kedalam kotak kardus

- Tempatkan wadah tersebut sedemikian rupa agar bahan bahan cair tidak tumpah

- Jaga suhu dalam keadaan dingin, dengan pemberian dry ice masukan dalam termos es

- Bungkus kardus tersebut dengan rapi

- Ikat kardus dengan tali tak bersambung

- Pada ikatan tali diberi label dan segel

- Kemudian bungkuslah sekali lagi dengan kertas yang bersih

- Tulis alamat laboratorium yang dituju dan alamat pengirim jelas dan lengkap

Referat Pemeriksaan Dna

Documents

Transcript of Referat Pemeriksaan Dna