REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASAProtocolo de realización

Universidad de Chile

PCR

- Preparación del Primer

- Cálculo de la T° de alineamiento

- PCR

* Determinación del número de ciclos apropiados (específico para cada primer).

* Determinación de la cantidad de control interno 18S según el número de ciclos elegidos.

Preparación del PrimerConcentración final deseada = 500 uM (500 umoles/Lt 500.000

nmoles/Lt)

500.000 nmoles 1.000.000 uL (1 Lt)

N° nmoles x uL

*N° de nmoles depende de cada primer

EJEMPLO:

Primer Haptoglobina (Hp Sense = 17,1 nmoles ; Hp antisense = 16,4 nmoles)

Sense 500.000 nmoles 1.000.000 uL (1 Lt)

17,1 nmoles x uL

Antisense 500.000 nmoles 1.000.000 uL (1 Lt)

16,4 nmoles x uL

x = 34,2 uL

x = 32,8 uL

Para realizar el PCR, es necesario utilizar ambos primer a una concentración de 10uM, por lo tanto se debe preparar la siguiente dilución:

C1 * V1 = C2 * V2

500uM * x = 10uM * 100uL

x = 2 uL de primer a 500 uM

Este cálculo se debe hacer tanto para el primer sense como para el antisense, y en ambos se obtiene una cantidad de 2 uL

Dilución del Primer (10uM)= 2uL de primer sense + 2 uL de primer antisense + 96 uL de NF-water

Cálculo de la T° de alineamiento Para realizar este cálculo es necesario aplicar la siguiente fórmula:

2 (A+T) + 4 (C+G)= T°

* Este cálculo se realiza tanto para el primer sense como para el antisense

Una vez obtenidas ambas temperaturas, se debe calcular el promedio de ambas

Posteriormente se debe restar 5°C al promedio, siendo este ultimo resultado el valor de la T° de alineamiento.

EJEMPLO

Sense: CTACAGACCGAAGGAGATGG

2 (A+T) + 4 (C+G)= T° 2 (7+2) + 4 (4+7) 18 + 44 62° C

Antisense: GGCAGATAGGCATGACTTTC

2 (A+T) + 4 (C+G)= T° 2 (5+5) + 4 (4+6) 20 + 40 60° C

Promedio: 61°C

61°C – 5°C = 56°C

T° de alineamiento = 56°C

Protocolo PCR

Previo a realizar la técnica debemos asegurarnos de:

Limpiar bien el sector (mesón y materiales) donde se va a realizar la técnica con detergente y alcohol

Todos los materiales a utilizar en el PCR deben estar esterilizados (puntas, tubos. etc.)

Protocolo PCR

Componentes 1 Reacción10X PCR Buffer, Minus Mg 2,5 uL

10mM dNTP mixture 0,5 uL

50mM MgCl2 0,75 uL

Primer Mix (10uM de cada uno) 2 uL

cDNA 2 uL *

Taq DNA Polimerasa 0,125 uL **

Control interno (18S) diluído 1:10 ***

H2O destilada esterilizada Llevar a 25uL

Volumen final 25 uL

- Agregar los siguientes componentes a un tubo eppendorf esterilizado, de acuerdo al número de reacciones a realizar.

  - Distribuir el Mix en los tubos eppendorf de 0.2 ml - Agregar el cDNA al tubo que corresponda  

Protocolo PCR

Paso T° Tiempo

1 94°C 4 min

2 94°C 30 seg

3 (Depende del primer) 30 seg

4 72°C 1 min

5 72°C 10 min

6 4°C 000 (pause)

- Programar el Termociclador para las siguientes temperaturas y tiempos:

- Mientras se realiza el PCR, preparar en un matraz esterilizado el gel de agarosa al 1,2% (Se recomienda: 0,36 gr. de agarosa en 30 ml de TAE 1X )

Protocolo PCR Una vez obtenidos los productos PCR, agregar a cada tubo 3

uL de XC Mezclar bien y cargar 10 uL de cada muestra (Producto PCR

+ XC) en los pocillos del gel. En el primer pocillo se debe cargar el marcador de peso

molecular, que se prepara de la siguiente manera:

1 uL de marcador de peso molecular

1 uL de XC

4 uL de H2O DEPC esterilizada

Correr el gel a 70 V por 40 min aprox. Observar en el Transiluminador UV

Determinación del número de ciclos apropiados

Realizar un PCR variando el número de ciclos (Ej: 24 – 28 – 32 – 34 – 36 – 40) y manteniendo las otras condiciones constantes.

Preparar Mix para el número de reacciones a realizar + 1 (Sin considerar el control interno)

Programar el Termociclador para el número máximo de ciclos

• Al comienzo se deben colocar todos los tubos en el termociclador, cuando se vayan cumpliendo los ciclos elegidos, se deben sacar los tubos.

* Una vez terminados los ciclos, se deben volver a colocar todos los tubos en el termociclador para el siguiente paso del PCR (72° por 10 min.)

Determinación del número de ciclos apropiados

Determinación de la cantidad de control interno 18S   Realizar una dilución de 1:10 del Primer 18S con el agua incluida

en el kit (Para preparar 100ul = 10 uL del primer 18S y 90 uL de agua)

Realizar un PCR variando la cantidad del control interno diluido (Ej: 1 – 2 – 3 – 4 – 5uL) y manteniendo las otras condiciones constantes

Preparar Mix para el número de reacciones a realizar + 1 (Sin considerar control interno y H2O)

Agregar Control interno y Agua DEPC esterilizada en la cantidad que corresponda a cada tubo

Programar el Termociclador para el número de ciclos elegidos

Determinación de la cantidad de control interno 18S

FIN