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Praktikum “Arzneimittelanalytik, Toxikologie, Drug monitoring und umweltrelevante Untersuchungen“
Quantifizierungvon Arzneistoffen
Praktikum “Arzneimittelanalytik, Toxikologie, Drug monitoring und umweltrelevante Untersuchungen“
Bestimmung eines Einzelstoffs: unproblematisch, weil die Methode nicht selektiv sein muss
Bestimmung im Gemisch:Isolierung erforderlich oder Wahl selektiver Methoden
Einführung
Praktikum “Arzneimittelanalytik, Toxikologie, Drug monitoring und umweltrelevante Untersuchungen“
Trennung über Löslichkeit
� Abtrennung durch Filtration nach selektiver Auflösung
� flüssig/flüssig-Extraktion bei bestimmtem pH-Wert(Stas-Otto-Trennungsgang)
Destillation/Wasserdampfdestillation
� flüchtige/ölige Substanzen
Chromatographische Trennung
Isolierung der Analyten
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1. Gravimetrie
� Quantitatives Ausschütteln des Arzneistoffes
� Bei Mehrstoffgemischen evtl. problematisch
� Quantitative Fällung als schwerlösliche Salze, z.B. Chloride, Sulfate, Pikrate
� Oft Bestimmung von Gegenionen sinnvoll: Cl- mit AgNO3; SO42-: mit BaCl2
� Fällung basischer Arzneistoffe als Pikrate
� z.T. Überführung in Wägeform: Bsp: Al(OH)3 zu Al2O3
� Grundvorraussetzung:
� Schwerlöslichkeit des Stoffes
� Quantitative und spezifische Fällung
� Stöchiometrische Zusammensetzung des Niederschlages
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Gravimetrie
OH
NO2O2N
NO2
Pikrinsäure
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1. Gravimetrie
� Allgemeine Hinweise
� auf vollständige Fällung achten
� bei Filtration auf Porengröße und Partikelgröße achten
� Beachtung der molaren Masse des Fällungsproduktes und der
Analysensubstanz
� Tiegel oder Kolben möglichst konstant wiegen; keine Wägung
heißer Tiegel
� mehrfach mit kleinen Portionen waschen (Nernst‘scher Verteilungssatz)
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Gravimetrie
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1. Gravimetrie
� mögliche Probleme
� Bildung von Kolloiden – keine Kristallisation möglich durch
Oberflächenladungen, Kolloide werden von Filterfritte nicht
zurückgehalten
� Alterung/Reifung – Rekristallisation, Modifikationsänderungen
� Mitfällung anderer Ionen durch Adsorption, Okklusion/Inklusion in
Kristalle
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Gravimetrie
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2. Titrationen
� Titration mit wäßrigen Titrationslösungen: HCl, NaOH, KOH
� organische Lösungsmittel zur Lösungsverbesserung und/oder Steigerung der Acidität (Ethanol, Aceton, THF) [nivellierender Effekt des Wassers]
� wasserfreie Titrationen
� Endpunktsbestimmung mit Indikator oder potentiometrisch
� Maßlösungen sind immer gegen Urtiter eingestellt (Na2CO3 zum Einstellen
von HCl-Maßlösung) das Arzneibuch legt bestimmte Urtitersubstanzen genau fest
Anforderung an Urtiter: gut wägbar, absolut rein, chemisch inert, leicht löslich in H2O
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
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2.1 Säure-Base-Titrationen
2.1.1 Klassische Acidimetrie in wässrigem Milieu
� z.B. Ibuprofen (pKs 4,4): Titration in Ethanol mit NaOH
(Phenolphthalein)
2.1.2 Verdrängungstitration
� Titration von Hydrochloriden als Kationsäuren- Lösung in Ethanol/Wasser, Zugabe von 5 ml HCl- Titration mit NaOH, potentiometrisch, 2 Wendepunkte
� z.B. Bromhexin-HClpKs 9,5 (Salz einer schwachen Base)
N
CH3NH2
Br
BrHCl
COOH
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
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2.1 Säure-Base-Titrationen
2.1.3 Argentoacidimetrie
� bei schwach aciden Verbindungen (OH, SH, NH, CH-acide)
� Fällung von Ag-Salzen unter H+-Bildung
� Lösung in Pyridin, Zugabe von AgNO3
� Titration mit NaOH gg. Phenolphthalein
X-H + AgNO3 → X-Ag + Pyr-H+
� z.B. Theobromin, Theophyllin, Phenobarbital, (vgl. Ethinylestradiol)
NH
HN O
O
O
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
NH
HN O
O
O
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N
N
N
NO
O
CH3 CH3
H3C
2.1 Säure-Base-Titrationen
2.1.4 wasserfreie Titration
� bei nicht ausreichender Acidität/Basizität in wässrigem Milieu
� schwache Basen, z.B. Coffein, Atropinsulfat, Hydrochloride� Lösungsmittel: Essigsäure/Acetanhydrid� Titration mit HClO4� Potentiometrie, Thymolblau, Kristallviolett
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
HClO4 + H3C-COOH ClO4- + H3C-COOH2
+
R3N + H3C-COOH R3NH+ + H3C-COO
-
H3C-COO- + H3C-COOH2
+2 H3C-COOH
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2.1.4 wasserfreie Titration
� schwache Säuren, z.B. Sulfamethoxazol� Lösungsmittel: DMF� Titrationsmittel für Säuren:� ethanolische KOH• Lithium- und Natriummethanolat (in MeOH/Toluol)
• Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH)
⇒ vor allem für schwach NH-acide Verbindungen
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
SHN
NO
CH3
H2N
O O
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2.1 Säure-Base-Titrationen
2.1.5 Zweikomponentenbestimmung durch Titration
� Voraussetzung: pKs-Werte der Arzneistoffe müssen ausreichend
weit auseinander liegen
Bsp.: Indometacin (pKs 4,5) und Amitryptilin-HCl (pKs 9,46)
Verdrängungstitrationmit NaOH→ 3 WP
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
überschüssige HCl
Indometacin
Amitryptilin HCl
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3. Fällungstitrationen, v.a. Argentometrie
� Mohr
�Titration mit AgNO3 in Anwesenheit von wenig CrO42- (gelb), am ÄP
rotbrauner Niederschlag (Ag2CrO4) Problem: stark pH abhängig (nur im neutralen; im sauren bildet sich Cr2O7
2- ,im alkalischen AgOH und Ag2O))
� Fajans
� Zugabe eines Adsorptionsindikators, z.B. Eosin, Farbwechsel am ÄP (überschüssige Ag+-Ionen adsorbieren am Niederschlag, Anlagerung des neg. geladenen Indikators → Farbwechsel von gelb nach rosa)
� Volhard
� Ag+ Überschuss, Titration mit SCN- in Gegenwart von Fe(III)-Ionen, Rotfärbung am ÄP; durch Schwerlöslichkeit von AgSCN entsteht erst ab dem ÄP Fe(SCN)3
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
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4 Komplexometrische TitrationenBestimmung von Kationen
5 Redoxtitrationen
� 5.1.Iodometrie� oxidierbare Arzneistoffe mit I2 , meist wird I2 in situ erzeugt (I- + IO3
-); Indikator Stärke (z.B. Vit. C, ACC, Metamizol-Na))
� reduzierbare Arzneistoffe mit I-, Rücktitration des Iods mit S2O32-
(z.B. H2O2-Lsg, NaOCl-Lsg)
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe
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5.2 Bromometrie� Oxidationsreaktionen, z.B. Isoniazid und Dihydralazinsulfat
(Hydrolyse zu Hydrazin, Ox. zu N2 unter Verbrauch von 2 Br2)
� Additionsreaktionen, z.B. Chinin/Chinidin(Addition von Br2 an Doppelbindungen)
�Substitution an aktivierte Aromaten wie Phenole, aromatische Amine
(elektrophile arom. Substitution in ortho- und para-Position)→ Koppeschaar-Titration (Benzocain, Sulfonamide)
Brom-Erzeugung in situ (BrO3- + 5Br- +6H+ � 3 Br2 +3H2O)
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe
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5.3 Cerimetrie� Ox. mit Ce4+, z.B. Paracetamol (nach saurer Hydrolyse),
Menadion, Nifedipin
� Redoxindikatoren wie Ferroin
5.4 Nitritometrie
� primäre aromatische Amine (z.B. Benzocain)
� evtl. erst Hydrolyse oder Reduktion (Zn/HCl) zum prim. arom. Amin
� Titration mit NaNO2 Maßlösung
� Zugabe von Bromid zur Stabilisierung des Nitrosyl-Kations
� Dead-Stop-Titration (Biamperometrie)
� Indikatoren: Potentiometrie, Farbindikatoren
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe - Titrationen
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6. Spektroskopische Verfahren: UV/Vis
A= . c . d
bzw: A= ε.c.d (c in Mol/l)
1%
1cm
A
b
c
A
=⋅
A cm
%1
1
b/d : Schichtdicke [cm]
A : Absorption der Lösung
c : Konz. der Lösung [%]
A cm
%1
1 : spez. Absorption
ist abhängig von Messwellenlänge, Lösungsmittel, pH-Wert, (Gerät)→ Literaturwert oder Bestimmung (mittels Vergleich)
A cm
%1
1
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe – UV/Vis
Grundlage: Lambert-Beersches Gesetz
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6. Spektroskopische Verfahren: UV/Vis
� Bestimmung eines Einzelstoffes
theoretisch: Bestimmung über spez. Absorption
praktisch: Bestimmung über Kalibriergerade; bzw. DreisatzKalibrationskurve
0
0,2
0,4
0,6
0,8
0 1 2 3 4
Konzentration [mg/ml]
Ab
sorp
tion
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe – UV/Vis
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6. Spektroskopische Verfahren: UV/VIS
� Bestimmung des Gehaltes eines Arzneistoffes (I) bei bekanntem
Gehalt eines zweiten Arzneistoffes (II)
• (II) an λ1max bestimmen (mit Lösung bekannter Konz.)
• Messung der Absorption des Gemisches Ages bei λ1max
λ1max
A cm
%1
1
A(I) = Ages – [ (II) · c(II)]A cm
%1
1
c(I) = A(I)
A cm
%1
1 (I)
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe
Ages. = A(I) + A(II)
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6. Spektroskopische Verfahren: UV/Vis
Zweikomponentenbestimmung
Bestimmung zweier Arzneistoffe: Überlagerung der Spektren!
Andere Möglichkeiten:
� Wechsel des Lösungsmittels
� Änderung des pH-Wertes
Bathochromer Shift
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe – UV/Vis
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6. Spektroskopische Verfahren
UV/Vis- Zweikomponentenbestimmung
� gemessen wird die Gesamtabsorption des Gemischesbei 2 Wellenlängen (λ1 und λ2)
� λ1 und λ2 sollten Maxima oder Punkte mit großer Absorption sein: A > 0,2 bzw. A < 0,8
� der spez. Absorptionskoeffizient muß für beide Substanzen bei beiden Wellenlängen bekannt sein (vorher mit Vergleich bestimmen)
Formel zur Berechnung
s. Rücker/Neugebauer/Willems
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe – UV/Vis
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7. Weitere Instrumentelle Verfahren
�Spektroskopische Verfahren
� Fluorimetrie
�Chromatographische Verfahren
� HPLC (Terminanalyse mit DA Detektor)� GC� DC, HPTLC mit UV- oder Fluoreszenzdetektion
�Kapillarelektrophorese (CE)
� UV- oder Fluoreszenzdetektion
Methoden zur Bestimmung der Arzneistoffe
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Vorgehensweise:
immer einen Blindwert bestimmen
Bestimmung einer Vergleichsanalyse mit identischer
qualitativer Zusammensetzung(wozu gibt es schliesslich die Vergleichssubstanzen!?)
wenn möglich, Mehrfachbestimmungen durchführen
Allgemeine Hinweise
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Literatur: DAB, EuAB, USP, BP
Arzneibuchkommentar
Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis
Auterhoff/Kovar:
Identifizierung von ArzneistoffenK. Müller:
Arzneimitteluntersuchungen
Allgemeine Hinweise