QuantiFERON®-Gold In Tube T-SPOT.TB Test KlinFor Workshop B16 Die neuen Tuberkulose Tests Detlev...
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QuantiFERON®-Gold In Tube T-SPOT.TB Test
KlinFor Workshop B16 ‚Die neuen Tuberkulose Tests‘
Detlev Schultze
Dr. med. Dipl Biol. Leitender Arzt
Institut für Klinische Mikrobiologie und Immunologie, St. Gallen
Lungen-Tuberkulose versus latente Infektion, CDC 2005
Latente Infektion
• TST oder y-Interferon positiv
• Röntgen Lunge negativ
• Keine Symptome einer Tuberkulose
• Proben ohne Erregernachweis
Lungentuberkulose
• TST oder y-Interferon positiv
• Röntgen Lunge positiv
• Husten +/- Blut im Sputum +/- B-Symptomatik
• PositivMikroskopie +/- PCR +/- Kultur aus respiratorischen Proben
Diagnostik der Lungen Tuberkulose
Identifizierung mit PCR und Gensonden
Reistenztestung
- Ethambutaol
- Pyrazinamid
- Isoniazid
- Rifampicin
Adaptiert nach Handbuch Tuberkulose, Lungenliga
CH 2007
Diagnostik der latenten Tuberkulose
Tuberculosis-Skin-Test (TST )
Interferon-Gamma Release
Assay (IGRA)
QuantiFERON-Gold In Tube
[Cellestis]
T-SPOT.TB[Oxford Immunotec])
Vergleich IGRA - TST
Interferon-Gamma Release Assay (IGRA)
In vitro Spezifische Antigene Keine Boosterung 1 Patienten Visite +
Laborkosten Minimale Test-Variabilität Resultate in 2 Tagen
Tuberculosis-Skin-Test (TST )
In vivo Weniger spezifische Antigene Boosterung 2 Patienten Visiten
höhere Test-Variabilität Resultate in 2 - 3 Tagen
ESAT 6 und CFP10 im Interferon-Gamma Release Assay (IGRA)
Mycobacterium-Genom: Region of Difference 1 (RD1)
codiert für ESX-1 Sekretionssystem zur Ausschleusung von Early Secretory Antigenic Target (ESAT-6) und Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10) aus Mycobacterium-Zelle
vorhanden in Mycobacterium tuberculosis
→ Fähigkeit zur lokalen Ausbreitung und Lyse von Pneumocyten
Deletion aus Mycobacterium bovis Virulenz Minderung
fehlt in attenuiertem M.bovis –Stamm = Bacille Calmette-Guérin
Rekonstitution in transgenem BCG Stamm → Virulenz Erhöhung
Komplex mit CFP-10 und ESAT-6
EMBO Journal 2005 / Champion et al 2007 / Wards et al 2000 / Onyebujoh 2004
ESAT 6 und CFP 10 in ESAT 6 und CFP 10 in MycobacteriaceaeMycobacteriaceae
Environmental strains
Antigene
ESAT-6 CFP-10
M abcessus - -M avium - -M branderi - -M celatum - -M chelonae - -M fortuitum - -M gordonii - -M intracellulare - -M kansasii + +M malmoense - -M marinum + +M oenavense - -M scrofulaceum - -M smegmatis - -M szulgai + +M terrae - -M vaccae - -M xenopi - -
Tuberculosis complex
Antigene
ESAT-6
CFP-10
M tuberculosis + +M africanum + +M bovis + +BCG substrain
gothenburg - - moreau - - tice - - tokyo - - danish - - glaxo - - montreal - - pasteur - -
T-SPOT.T-SPOT.TB TB – – Blutaufbereitung in Vacutainer CPTBlutaufbereitung in Vacutainer CPT™™ Röhrli Röhrli
Röhrli zentrifugierenRöhrli zentrifugieren
Lymphocyten Bande aufnehmenLymphocyten Bande aufnehmen
Lymphozyten zählen und waschenLymphozyten zählen und waschen
Lymphozyten in 96-PlatteLymphozyten in 96-Platte
TB Antigene zugebenTB Antigene zugeben
Übernacht Inkubation Übernacht Inkubation
Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot) Technologie
T-SPOT.T-SPOT.TB TB – – Spot BildungSpot Bildung
Platte waschenPlatte waschen Detektionsreagenz zugeben Detektionsreagenz zugeben 60 min inkubieren60 min inkubieren Platte waschen Platte waschen Farbreagenz (Substrat) Farbreagenz (Substrat)
zugebenzugeben Spots innerhalb 7 minSpots innerhalb 7 min Platte waschen und trocknenPlatte waschen und trocknen
negativ
positiv
T-SPOT.T-SPOT.TB TB – – Spot ZählungSpot Zählung
Mit blossem Auge und VergrösserungsglasMit blossem Auge und Vergrösserungsglas
Alternativ mit automatisiertem ELISPOT imagerAlternativ mit automatisiertem ELISPOT imager
Above: Automated T-SPOT plate reader
Null TB Mitogen
Interferon-y Spiegel vor TB-Stimulation ?
T-Zellen durch ESAT-6, CFP-10, TB7.7 stimulierbar ?
T-Zellen durch Phythämagglutinin stimulierbar?
QuantiFERON®-Gold In Tube
3x1ml BlutInkubation 37ºC16-24 Stunden
Zentrifugation 5-15 min
-Interferon stabil im Kühlschrank
(+4°C) 8 Wochen
1 Blut Entnahme und Vorbereitung für Test
NULL TB Mitogen
Option 1: Versand Blutröhrchen innerhalb 16 Stunden an Labor, vor Inkubation.
Option 2: Versand Blutröhrchen innerhalb 3 Tagen an Labor, nach Inkubation
Option 3: Sammlung der Proben nach Zentrifugation, ans labor zur -Interferon Messung
QuantiFERON®-Gold In TubeQuantiFERON®-Gold In Tube
Ergebnis-berechnung
[IE/ml]
Stop Lösung und
Extinktions-Messung
Waschen und Substrat Zugabe
Inkubation 120 min Raum-Temperatur
Plasma und Konjugat
2 γ-Interferon ELISA
Positive Ergebnisse → Wiederholung im Doppel → Befund reproduziert
Durchführung 1-2 x pro Woche
QuantiFERON®-Gold In TubeQuantiFERON®-Gold In Tube
3 Befundung
QuantiFERON®-Gold In TubeQuantiFERON®-Gold In Tube
QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test
QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test
QuantiFERON®-Gold In Tube – Blutentnahme bis Plasmagewinnung
Blutentnahme Massnahme bei Abweichung
Röhrchen-Füllung mit Blut bis Markierung = 1 ml, Test validiert für 0.8-1.2 ml
Neues Röhrchen füllen
Transport Beachten
Lagerungsposition irrelevant vor 37°C Inkubation → erneutes 5 sec- Mischen
37°C Inkubation ? - nein
- ja
- ja + Zentrifugation
16 Stunden 17 - 27°C
72 Stunden 17 - 27°C
8 Wochen 4°C
Inkubation bei 37°C Massnahme bei Abweichung
Röhrchenposition aufrecht – Kappe nach oben Erneute Blutentnahme
Plasmagewinnung Massnahme bei Abweichung
- Zentrifugation (5-15 minutes 1‘500–2‘200 g) - Sedimenation im Röhrchen abwarten und Plasma
vorsichtig ohne Zellen abhebern
Gel hat Blutkuchen nicht vom Plasma getrennt → erneute Zentrifugation >2‘200g
QuantiFERON®-Gold In Tube Interpretation – negative Mitogen Kontrolle
Kollektiv mit unterschiedlichem Immunstatus nicht stimulierbar (%)
gesunde, immunkompetente Personen 0.3
Patienten mit Autoimmun-Erkrankungen (anti-TNF-a) 5.6
Dialyse Patienten 6.8
Präanalytik nicht beachtet → mangelnde Bildung IFN-y durch …
heftiges Schütteln der Röhrchen (5 sec) bis Schaumbildung
… geronnenes Blut
… ungelöste Antigene
Temperatur 17 - 27°C für Lagerung-/Transport
Zeitintervall Blutentnahme bis Inkubation
… Verfall der T-Zellen
Inkubation Röhrchen für 16 - 24 Stunden bei 37°C. … zu kurze Erwärmung
Vorrats-Lagerung unbenutzter Röhrchen 4-27°C für 15 Monate
… Verfall TB Antigene / Mitogen
T-Zellen durch Mitogen (Phythämagglutinin) nicht stimulierbar → IFN--y <0.5 IE/ml
ProblemProblem Beurteilung Leistung der IGRA’s im Vergleich mit TST, ohne Beurteilung Leistung der IGRA’s im Vergleich mit TST, ohne
Gold Standard für die Latente TB Infektion ? Gold Standard für die Latente TB Infektion ?
TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch 100% spezifisch100% spezifisch
Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität und Spezifität der IGRA’s und des TST unmöglichund Spezifität der IGRA’s und des TST unmöglich
HypotheseHypothese Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer
sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten
→ Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis→ Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s
SensitivitätSensitivität in Probanden in Probanden ohne TBohne TB, nach Ausmass Exposition, nach Ausmass Exposition
TST = QFN Gold in tube = TST = QFN Gold in tube = T-SPOT.T-SPOT.TB TB
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s
Sensitivität Sensitivität in Probanden in Probanden mit aktiver TBmit aktiver TB TST < QFN Gold in tube < TST < QFN Gold in tube < T-SPOT.T-SPOT.TBTB
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s
Spezifität Spezifität bei sehr geringem Risiko einer TB Infektionbei sehr geringem Risiko einer TB Infektion
TST < QFN Gold in tube = TST < QFN Gold in tube = T-SPOT.T-SPOT.TB TB
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s
Prädiktiver WertPrädiktiver Wert Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit
IGRA Ergebnissen IGRA Ergebnissen → → unbekanntunbekannt→ → langfristige Kohortenstudien notwendiglangfristige Kohortenstudien notwendig
Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s