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APR 2017
CO-inoculation d’un champignon MYCorhizien à arbuscules (Funneliformis mosseae) avec une BACtérie bénéfique PGPR (Paraburkholderia phytofirmans PsJN)
dans la protection du blé contre l’agent responsable de l’oïdium (Blumeria graminis f.sp. tritici)
UCEIV –ULCO : Maryline MAGNIN-ROBERTRIBP –URCA : Lisa SANCHEZStagiaire Master 2 : Nour El-Houda RAOUANI
1
Master 2 Biologie Intégrative des Interactions Plante Microbe Environnement
2
2Production
Céréalière
mondiale
9.1 milliards d’habitants
2050
Alimentation :3 milliards de tonnes
Union Européenne = 1er producteur mondial
FRANCE= 1er producteur européen (27%)
2
2Production
Céréalière
mondiale
Union Européenne = 1er producteur mondial
= 1er producteur européen (27%)FRANCE
9.1 milliards d’habitants
2050
Alimentation :3 milliards de tonnes
Agent responsable
Champignon biotrophe :Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt)
Production rapide de spores par reproduction asexuée
Dissémination par le vent
Pustules blanchâtresobservées sur feuilles, tiges,épis
Oïdium du blé
Pertes de rendement 10 à 20%
SOLUTIONS ACTUELLES EFFICACES
Lutte chimique
Lutte génétique
3
Problèmes de durabilité Problèmes de pollution de l’environnement
Plan National Ecophyto II
-25% en 20201
-25% en 20252
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Funneliformis mosseaeCMA : champignon mycorhizien à arbuscules
cultivar de blé phosphore du sol
NM
SZE
Fm
M
Ri
espèces CMA
Mustafa et al. 2016
Taux de mycorhization MHB
MycorhizzaHelper Bacteria Frey-Klett et al. 2007
PseudomonasParaburkholderiaBacillusPaenibacillus...
Paraburkholderia phytofirmans PsJNbactérie rhizosphérique et endophytique
Plant Growth Promoting Rhizobacteria
PGPR
Stimulation de la
croissance de la plante
Protection des plantes par résistance
induite (ISR)
Sessitsch et al. 2005
F. mosseae
0
20
40
60
80
100
*
Nom
bre
de
colo
nie
s
/feu
ille
NM M
Protection contre Bgt
Induction réactions de défense du blé
Mustafa et al. 2017
> 70%
Sharma et Nowak, 1998, Ait Barka et al. 2002, Miotto-Vilano et al. 2016
Protectionla tomatela pomme de terrela vigne
champignons pathogènes
SYMBIOSE BENEFIQUE
Meilleure nutrition de
la plante (eau et éléments
minéraux)
Protection des plantes
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Funneliformis mosseaeCMA : champignon mycorhizien à arbuscules
Paraburkholderia phytofirmans PsJNbactérie rhizosphérique et endophytique
Meilleure protection du blé contre Bgtavec une double inoculation?Interactions entre 3 organismes
Meilleure compréhension...
(i) influence du CMA sur la capacité de P. phytofirmans PSJN à coloniser les tissus de la plante et à s’y établir
(ii) influence de la bactérisation du blé sur l’efficacité de la colonisation des racines de blé par le CMA
(iii) impacts de la bactérisation du blé associée à une inoculation mycorhizienne chez le blé après 6 semaines de co-culture :
- les paramètres de croissance chez le blé (taille de la plante, nombre de feuilles, longueur...) et les teneurs en pigments photosynthétiques
- sur la protection du blé contre Bgt et induction des gènes de défense (3 gènes cibles) chez la plante en conditions infectieuses
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P. phytofirmans gfp 2xArrosage du sol
109 CFU/ml
4 semaines 6 semaines5 semaines
Test de colonisationP. phytofirmans PsJN GFP- Culture pasteurienne- Biologie moléculaire
Colonisation par F. mosseae
Mélange (2:1:1)Sable
VermiculitePerlite
+ PGPR
P. phytofirmans gfp 2xTrempage grain
109 CFU/mlCFU: colony forming unit
+ CMAF. mosseae
Blé tendreTriticum aestivum L.
Test de colonisationP. phytofirmans PsJN GFP- Culture pasteurienne- Biologie moléculaire
Colonisation par F. mosseae
Mesure de croissanceDosage de pigments photosynthétiques
B. graminis f.sp. tritici5.105 spores/ml
TEST DE PROTECTION
Suivi expression gènes de défense
à 0, 4, 12 et 24 h après infection par Bgt
Influence du CMA sur la capacité de la bactérie à coloniser les tissus du blé et à s’y établir
Après 4 et 6 semaines, détermination de la présence de la bactérie dans les tissus des plantules de blé (racines et feuilles) P. phytofirmans PsJN gfp 2x
Méthode de culture pasteurienne Observation aux UV
Méthode de biologie moléculaire Amplification d’une partie de séquence ciblée du gène gfp
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Echantillon témoinP. phytofirmans
PsJN gfp 2X
Pas de détection de la présence de labactérie dans nos essais, quelque soit lamétholodogie employée.
A OPTIMISER
9
M M+B
4ème sem. 6ème sem. 4ème sem. 6ème sem.
Taux de colonisation totale (%)
35±11 37± 41±16 52±8*
Arbuscule (%) 10±5 14±9 18±9 20±5
Vésicules (%) 12±6 12±7 13±6 19±4
Après 4 et 6 semaines, le taux de mycorhization est évalué par coloration au bleu de trypan. Détermination des taux de mycorhization totale, arbusculaire et vésiculaire.
hyphe
vésicule
hyphe
arbuscule
Taux de mycorhization de racines de blé par F. mosseae après 4 et 6 semaines en présence du CMA seul (M) ou en combinaison avec la bactérie PGPR P. phytofirmans PsJN (M+B)
Amélioration de lacolonisation totalede 40% enprésence de labactérie après 6semaines de co-culture.
Influence de la bactérisation du blé sur l’efficacité de la colonisation des racines de blé par le CMA
Amélioration du taux de mycorhizationdes racines d’orge par le CMA Glomusintraradices de 40, 50 et 60% en présencede Pseudomonas fluorescens, deRhizobium leguminosarum etd’Agrobacterium rhizogenes,respectivement. Fester et al. 1999
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Impacts de la double inoculation du CMA et de la bactérie sur la croissance du blé
Après 6 semaines,aucun effet significatifdes traitements sur lacroissance desplantules de blé paramètres suivis
Gain des teneurs en pigmentsphotosynthétiques pour letraitement combinant le CMA+ la bactérie
Mesure des paramètres de croissance des plantules à – semaines de culture. Les paramètres suivis sont (A) la taille de la plante, (B) le nombre de talles par plante, (C) le nombre de feuilles par plante, (D) la longueur de la feuille 4, (E) la masse fraîche et (F) la masse sèche de la partie aérienne. Conditions testées sont T: Témoin, B: bactérie seule, M: CMA seul, M+B : bactérie + CMA.
T B M M+B T B M M+B T B M M+B
T B M M+BT B M M+BT B M M+B
Teneur en pigments photosynthétiques de la feuille 4 des plantules âgées de 6 semaines. Teneurs en (A) chlorophylles totales, (B) en chorophylle a, (C) en chlorophylle b, (D) en caroténoides. Conditions testées sont T: Témoin, B: bactérie seule, M: CMA seul, M+B : bactérie + CMA.
T B M M+B
T B M M+BT B M M+B
T B M M+B
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Impacts de la double inoculation du CMA et de la bactérie sur la protection du blé contre Bgt et
l’induction des réactions de défense
Protection du blé observée dans nos conditions deculture par les 3 traitements testés.
Confirmation de la capacité du CMA (F. mosseae) àprotéger le blé contre Bgt autre cultivarsensible Mustafa et al. 2017
heures après infection par Bgt
4 12 24
Expression relative / témoin infecté Bgt
heures après infection par Bgt
Chi1
LOX
POX
4 12 24
Expression relative / témoin infecté Bgt
heures après infection par Bgt
4 12 24
Expression relative / témoin infecté Bgt
B+MB Mheures après
infection par Bgt
Chi1
LOX
POX
4 12 24
Expression relative / témoin non
infecté par Bgt
0.01 1 80
Chi1 induction plus importante à 4h : M et B seuls
LOX induction légèrement plus marquée après 12h
3 gène ciblés : expression induite suite à l’infection par Bgt
POX induction transitoire à 4h : M et B seuls+ répression forte après 12h : M+B
I+B en non-infect.
Niveau expression POX induit (6X)
A
B
T B M B+M
T B M B+M
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Méthode détection et évaluation despopulations bactériennes dans les tissus de laplante dans nos conditions d’expérimentations
Optimisation
Répétitions des expériences en ajoutant 1 ou 2 cultivars de blé (sensibles à Bgt) protection « généralisable » sur d’autres cultivars dans nos conditions
d’expérimentations ?
Reconduction des expériences
Protection contre d’autres maladies impactantes chez le blé ?+
Septoriose du blé
Fusariose du blé
Modification des métabolismes de la plante suite à l’ajoutdu CMA ± bactérie évaluée par méthodes plus globalestranscriptomique (RNAseq) et de métabolomique
Compréhension
Qualification de « MHB »concernant la soucheParaburkholderia phytofirmans
Approfondir
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Présentation des premiers résultats obtenus sous forme d’affiche
- Journées Jean Chevaugeon 2018, 12èmes rencontres de Phytopathologie et de Mycologie,Aussois, 15-19 janvier 2018
- Journées Jeunes Chercheurs Condorcet J2C2 2018, Amiens, 18-19 janvier 2018- PHLOEME, 1ères biennales de l’innovation céréalière, Cité des Sciences et de l’Industrie, Paris,
24-25 janvier 2018
Journées / Congrès nationaux
- 5èmes Journées Francophones des Mycorhizes (JFM5), Dunkerque, 27-29 juin 2018
Congrès internationaux
Merci de votre attention
Références
Ait Barka et al. 2002. Inhibitory effect of endophyte bacteria on Botrytis cinerea and its influence to promote the grapevine growth. Biol. Control 24 : 135-142.Fester et al. 1999. Accumulation of secondary compounds in barley and wheat roots in response to inoculation with a arbuscular mycorrhizal fungus and co-inoculation with rhizosphere bacteria. Mycorhizza 8, 241-254.Frey-Klett et al. 2007. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176:22-36Miotto-Vilano et al. 2016. Burkholderia phytofirmans PsJN confers grapevine resistance against Botrytis cinerea via a direct antimicrobial effect combinedwith a better resource mobilization. Front. Plant Sci. 7: 1236.Mustafa et al. 2016. Phosphorus supply, arbuscular mycorrhizal fungal species, and plant genotype impact on the protective efficacy of mycorrhizalinoculation against wheat powdery mildew. Mycorrhiza 26: 685-697.Mustafa et al. 2017. Defense mechanisms associated with mycorrhiza-induced resistance in wheat against powdery mildew. Func. Plant Biol. 44: 443-454.Sharma et Nowak 1998. Enhancement of Verticillium wilt resistance in tomato transplants by in vitro co-culture of seedlings with a plant growth-promotingrhizobacterium (Pseudomonas sp. strain PsJN). Can. J. Microbiol. 44: 528-536.Sessistch et al. 2005. Burkholderia phytofirmans sp. nov., a novel plant-associated bacterium with plant-beneficial properties. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55:1187-1192.
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Anissa HADJ-LOUNES SAHRAOUIBenoît TISSERANTMélodie SAWICKIPhilippe REIGNAULTBéatrice RANDOUXNour El-Houda RAOUANI
Lisa SANCHEZEssaïd AIT BARKAChristophe CLEMENT