FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS DE LOS RECURSOS

NATURALES RENOVABLES

PROYECTO DE TESIS

“INFLUENCIA DE LA CRIOCONSERVACIÓN DE SEMILLAS DE Swietenia

macrophylla King “CAOBA” EN ENSAYOS DE VIABILIDAD

EJECUTOR : Allccahuaman Mañuico, Edwin

ASESORES : Ing. Msc Casiano Aguirre Escalante

LUGAR DE EJECUCIÓN : Laboratorio de Semillas de la Facultad de

Recursos Naturales Renovables de la UNAS

DURACIÓN DEL TRABAJO : Octubre del 2010 – Febrero del 2011

Tingo María - Perú

2010

I. INTRODUCCION

Por lo general los programas de conservación son motivados por

amenazas a los recursos naturales, ya sea por una crisis inmediata o por un factor

de riesgo potencial para el futuro. Debido a los múltiples beneficios que aportan,

tanto al hombre como a las zonas silvestres, los árboles en general y la especie

Swietenia macrophylla King. “caoba” se enfrentan a más amenazas que la

mayoría de los organismos por diferentes factores uno de ellos el cambio climático

y la activa deforestación en la amazonia.

Para evitar esta continuada desaparición de especies forestales, son

necesarias políticas de conservación cada vez más eficaces en las que la

incorporación de las nuevas técnicas derivadas del desarrollo de la biotecnología

pueden cumplir un papel esencial.

Entre los métodos alternativos para la conservación de las semillas se

encuentra la crioconservación que consiste en su almacenamiento a muy bajas

temperaturas, inferiores a -100 °C, aunque por razones prácticas se las suele

introducir en nitrógeno líquido, lo que asegura una temperatura constante de -196

°C. En esta situación se logra la detención de los procesos metabólicos y con ello

el bloqueo de los mecanismos fisiológicos responsables del envejecimiento de las

semillas y por tanto la prolongación indefinida del periodo de conservación.

Además las técnicas de crioconservacion ofrecen otras ventajas en relación a

técnicas tradicionales de conservación a largo plazo como son: los bajos costos de

mantenimiento, la fácil manipulación de las muestras y la no dependencia del

suministro eléctrico.

Existen muchos problemas con respecto a la conservación de las

semillas de Swietenia macrophylla King. “caoba”: perdida de viabilidad a través del

tiempo, la tala indiscriminada del árbol de la caoba, la falta de implementar

metodologías de conservación de semillas a largo plazo. Frente a estos problemas

se plantean las siguientes alternativas: la crioconservacion como una tecnología

de conservación de semillas a largo plazo (100- 200 años), reforestación

asegurada de especies de la caoba. Bajo este contexto se plantean los siguientes

objetivos:

Determinar la energía germinativa y poder germinativo de la Swietenia

macrophylla King. antes y después de la crioconservación.

Determinar la significancia de la crioconservación mediante el análisis de

varianza.

Determinar la influencia de los crioprotectores en la viabilidad de las

semillas.

Hipótesis

H0 : la conservación de semillas de Swietenia macrophylla King. “caoba” en

nitrógeno liquido no altera la viabilidad de las semillas a través del

tiempo.

Ha : la conservación de semillas de Swietenia macrophylla King. “caoba” en

nitrógeno liquido altera la viabilidad de las semillas a través del tiempo.

II. REVISION DE LITERATURA

II.1. Descripción taxonómica de la caoba

CRONQUIST (1981), da la siguiente clasificación taxonómica de Swietenia

macrophylla King.:

REINO : Plantae o vegetal

DIVISIÓN : Angiospermae

CLASE : Dicotyledoneae

ORDEN : Rutales

FAMILIA : Meliaceae

GÉNERO : Swietenia

ESPECIE : Macrophylla

NOMBRE CIENTÍFICO: Swietenia macrophylla King.

Nombre común: caoba

II.2. Descripción botánica

Árbol de gran tamaño, de 30 a 60 metros de altura con el fuste limpio

hasta los 25 metros de altura, los arboles adultos miden entre 75 a 350 cm a la

altura del pecho.

Copa con diámetro de 14 m. Presenta ramitas gruesas de color

castaño con muchos puntos levantados ó lenticelas.

Fuste recto, libre de ramas en buena proporción, bastante cilíndrico,

los contrafuertes pueden tener una altura de más de 4 metros.

Corteza externa color café rojizo oscuro con muchas fisuras profundas

a lo largo del fuste, la corteza interna es de un color rosado rojizo hasta

cafesáceo .Sabor amargo.

Hojas alternas grandes, paripinnadas alternas de 20 a 40 cm de largo;

pecioladas, portando de 6 a 12 foliolos delgados oblicuamente lanceolados por lo

regular de 8 a 15 cm de largo y 2.5 a 7 cm de ancho, acuminados en el ápice,

agudos o muy oblicuos en la base. Haz verde oscuro brillante, envés verde pálido.

Flores colocadas sobre panículas de 10 a 20 cm de largo o más,

glabras; cáliz 2 a 2.5 mm de largo, lóbulos cortos, redondeados; 5 pétalos ovados

de color blanco, 5 a 6 mm de largo; 10 estambres formando un tubo cilíndrico con

dientes agudos o acuminados.

Fruto es una cápsula ovoide dehiscente, comúnmente de 6 a 25 cm de

largo y 2 a 12 cm de diámetro, reducido hacia el ápice en punta, color pardo

grisáceo, lisa o diminutamente verrugosa, con 4 y 5 valvas leñosas de 6 a 8 mm

de grueso; cada cápsula contiene entre 45 a 70 semillas, esponjosas y frágiles.

Semillas sámaras, aladas, livianas, de 7.5 a 10.0 cm de largo por 2.0 a

3.0 cm de ancho, de color rojizo cafesáceo, sabor muy amargo (TOLEDO et al,

2008).

II.3. Semillas de caoba

Almacenamiento / Conservación. El mejor registro de almacenamiento

indica el 89 % de viabilidad después de 1,638 días (poco mas de 5 años) a

— 20 ºC y 4 % de contenido de humedad. Cuando la semilla no es

adecuadamente almacenada pierde su viabilidad en 2 meses o antes.

Dispersión. Anemócora (viento).

Germinación. Tipo: hipógea. Se inicia a los 20 días y se completa a los 40

días de sembrada. El tiempo promedio de germinación es de 28 días. Las

semillas germinan dentro de un rango de temperaturas de 26 a 31 ºC.

Porcentaje de germinación: 40 a 70 %. Se obtiene el 95 % si la siembra

se lleva a cabo con semillas recién colectadas. Las semillas grandes

germinan mejor que las pequeñas.

Número de semillas por kilogramo: 1,300 a 2,000 (3,800). Peso por

semilla: 0.470 g.

Recolección / Extracción. La recolección de los frutos se hace

directamente de los árboles antes de que abran; se secan al sol y se

limpian a mano. Los frutos de mayor peso y tamaño contienen las mejores

semillas, por lo que son este tipo de frutos los que tienen que recolectarse y

así garantizar la mayor cantidad de semillas capaces de germinar. Las

semillas más pesadas son de mejor calidad biológica.

Tratamiento pregerminativo. No disponible.

Viabilidad / Latencia / Longevidad. No presenta latencia. Período de

viabilidad: 120 días.

Tipo de semilla. Intermedia (?).

Figura 1. Semillas de caoba

II.4. Crioconservación

La crioconservación es una técnica utilizada para mantener los

microorganismos de importancia en la industria o en un estudio en particular en

condiciones de bajas temperaturas con el fin de reducir su metabolismo normal

hasta llevarlo a basal (manteniendo el microorganismo viable por largo tiempo,

preservando las estructuras celulares) con el fin de evitar el envejecimiento o

evolución de un determinado microorganismo, es decir sin cambios en sus

características (genéticamente estables ); además mantener los cultivos puros,

reduciendo las probabilidades de contaminación (BASKARAN, 2000).

Los procedimientos clásicos de criopreservación comprenden un

tratamiento previo con sustancias crioprotectoras seguido por una congelación

lenta controlada. Tales procedimientos han tenido éxito con sistemas de cultivo

consistentes en pequeñas unidades de morfología uniforme como en el cultivo de

protoplastos, dividiendo activamente el cultivo de células en suspensión y los

cultivos de callos fragmentados. Sin embargo, este método da resultados erráticos

para sistemas de cultivo que consisten en grandes unidades que incluyen una

mezcla de tamaños y tipos de células, como puntas de brotes, embriones zigóticos

o embriones somáticos relativamente maduros. Actualmente, se dispone de

métodos reproducibles y eficaces como la encapsulación, deshidratación,

vitrificación, desecación y desecación previa al crecimiento (TOLEDO et al, 2008).

II.4.1. El Contenedor Criogénico:

Los contenedores criobiológicos deben ser llenados muy lentamente

para evitar las tensiones que resultan de un cambio brusco de temperatura, que se

produce por el llenado rápido de los mismos.

Precauciones:

Tiempo mínimo de llenado: 30 minutos.

Los contenedores deben estar siempre en posición vertical.

Dejar el contenedor acostado puede ocasionar derrames o daños, como así

también, en posición horizontal, es factible que se encuentre expuesto a

vibraciones fuertes, lo que producirá incidencias negativas en el sistema de

aislamiento al vacío.

Figura 2. Contenedor de nitrógeno liquido

II.5. Ensayos de crioconservación de cedro australiano

Los resultados obtenidos en este experimento muestran que existe

una rápida disminución del poder germinativo de las semillas de Toona ciliata

cuando se conservan a temperatura ambiente (27ºC). La conservación en

refrigerador (4ºC), permite mantener valores altos de poder germinativo durante

más tiempo pero al cabo de 9 meses dichos valores disminuyen

considerablemente. En cambio, la conservación de semillas en un freezer (–18ºC)

hizo posible que el PG se mantuviera en los mismos valores que los de las

semillas recién cosechadas.

Este trabajo muestra que las semillas de Toona ciliata pueden ser

crioconservadas mediante su inmersión directa (±200ºC.min –1) en nitrógeno

líquido sin afectar a su poder germinativo ni a su energía germinativa. En dichas

condiciones, en que virtualmente cesa toda actividad metabólica las semillas de

Toona ciliata podría ser conservadas en los bancos de germoplasma durante un

período indefinido sin los problemas que normalmente se presentan en los

bancos de semillas tradicionales.

Para evitar el rápido deterioro de las semillas de Toona ciliata y

mantener tanto su poder germinativo como su energía germinativa (durante 1

año), las semillas pueden conservarse en un freezer a –18ºC o bien puede

procederse a su inmersión directa en nitrógeno líquido (–196ºC) para

conservarlas durante períodos de tiempo más prolongados (SCOCCHI et al,

2010).

II.6. CRIOPRESERVACIÓN DE SEMILLAS Y PROTOCORMOS DE ONCIDIUM

BIFOLIUM S. (ORCHIDACEAE) POR ENCAPSULACIÓN –

DESHIDRATACIÓN

El objetivo de este trabajo fue desarrollar un sistema que posibilite la

crioconservación de semillas y protocormos estériles de Oncidium bifolium S. en

nitrógeno líquido -NL- (-196 ºC) para luego obtener plantas.

Las semillas colectadas el 22/09/01 fueron mantenidas estériles y

deshidratadas en sílica gel. Para la obtención de protocormos, una fracción de

semillas fueron sembradas el 12/02/02 en el medio conteniendo sales minerales y

vitaminas diluido a la mitad (½ MS) suplementado con 3% de sacarosa e

incubadas en medio líquido a 80 rpm y a 27 ± 2º C, con una intensidad lumínica

de 116 m/seg/m2 y un fotoperíodo de 14 horas.

Las semillas y los protocormos con 40 días de germinados fueron

encapsulados en alginato de sodio al 3%. Para la deshidratación se realizaron

pretratamientos con concentraciones crecientes de sacarosa 0.15M (24 hs);

0.25M (48 hs) y 0.5M (24 hs) y posterior colocación en sílica gel (5 hs). La

criopreservación se efectuó por inmersión en NL durante 1 hora, en forma directa

o mediante la utilización de un Programador Electrónico de descenso de

temperatura (desde 20 ºC a –30 ºC a 1ºC/min.). El descongelado se realizó a

baño María (30 ºC) durante 1 minuto. Luego las cápsulas fueron colocadas en

soluciones decrecientes de sacarosa y lavadas en ½ MS (48 hs) para ser

finalmente cultivadas en ½ MS con 0.7% de agar.

Empleando cápsulas con semillas deshidratadas, el mejor tratamiento

fue el descenso programado con 95% de embriones vivos, alcanzando el testigo

sin criopreservación un 97%. En cambio con NL directo se registró un 23% de

embriones germinados.

Sin embargo para las cápsulas con protocormos, el mayor porcentaje

de embriones se obtuvo con inmersión directa en NL (81%).

De los resultados obtenidos se concluye que, dependiendo del

explante encapsulado, ambas metodologías se pueden emplear para

crioconservar Oncidium bifolium S. (FLACHSLAND et al, 2002)

III. MATERIALES Y MÉTODOS

III.1. Lugar de ejecución

El presente trabajo de investigación se realizará en las instalaciones

del laboratorio de semillas forestales de la facultad de Recursos Naturales

Renovables y el laboratorio de biotecnología ambos pertenecientes a la

Universidad Nacional Agraria de la Selva (UNAS), ubicada en el distrito de Rupa

Rupa, provincia de Leoncio Prado, departamento de Huánuco.

3.2 Ubicación geográfica

La ubicación geográfica de la zona de estudio tiene las siguientes

coordenadas geográficas:

Altitud sur : 09° 09 00"

Longitud oeste : 75° 59 00"

Altitud : 660 msnm

3.3 Características climáticas

Lévano (1989), afirma que el clima predominante corresponde a una

zona tropical suave, con una precipitación promedio anual de 1,132 mm, y una

relación evapotranspiración precipitación 0.43.

Rodríguez (2000), menciona que Tingo María tiene una precipitación

promedio anual de 3,079mm. Con una temperatura promedio de 23° C y una

evapotranspiración aproximada de 1 132mm.

3.4. Materiales

3.4.1. Material biológico

Las semillas estudiadas serán de la especie Swietenia macrophylla

King. “caoba” Obtenidas del laboratorio de semillas de la facultad de Recursos

Naturales Renovables de la UNAS

3.4.2. Materiales

Papel filtro.

pipetas

Balón de fondo plano de 250 ml.

Vasos de 600 ml.

Desecador.

Tubos de ensayo.

Cámara digital.

Nitrógeno liquido (10 kg.)

5 viales.

Contenedor de nitrógeno liquido.

3.4.3. Equipos

Un refrigerador.

Termas para nitrógeno liquido.

Balanza analítica.

Estufa.

Germinadores.

Cocina eléctrica

3.4.4. Insumos

Agua destilada.

Sacarosa 15%

Glicerol 15%

3.5. Metodología

3.5.1. Obtención del nitrógeno liquido

Se comprarán 4 litros de nitrógeno liquido y se colocaran en 4 termas

caseras cada terma contendrá 1 litro de nitrógeno liquido.

3.5.2. Obtención de las semillas

Para los ensayos de crioconservación se utilizarán semillas

certificadas de la empresa SEMIFOR SAC.

3.5.3. Siembra de las semillas

Las semillas serán sembradas en bandejas separadas por

tratamientos, expuestas a temperatura y humedad ambiente.

3.5.4. Protocolo de crioconservacion

Figura 3. Protocolo de Crioconservacion.

3.6. Variables a evaluar

3.6.1. Variables independientes

Especie de Swietenia macrophylla King. “caoba”

Material vegetativo utilizado

3.6.2. Variables dependientes

Porcentaje de poder germinativo y energía germinativa

Contenido de humedad

Número de brotes

Porcentaje de mortandad

3.6.2.1. Poder germinativo

Semillas

Control de viabilidad

Control de viabilidad

Aplicación de crioprotectoresAplicación de

crioprotectores

Inmersión en nitrógeno liquido (-196 °C)

Inmersión en nitrógeno liquido (-196 °C)

Recuperación

Control de viabilidad

Para calcular el poder germinativo de las semillas de Swietenia

macrophylla King. se utilizará la siguiente fórmula:

P. G. (%) =

Donde: P.G. = Poder germinativo

3.6.2.2. Energía germinativa

Para el cálculo de la energía germinativa de las semillas de

Swietenia macrophylla King.se utilizará la fórmula siguiente:

E.G. =

Donde:E.G. = Energía germinativa

3.6.2.3. Determinación del contenido de humedad

El contenido en humedad de las semillas se determinará mediante el

método de la estufa; muestras de cada lote semillas se mantendrán a 103 °C

durante 17 h, tal como recomienda la International Seed Testing Association

(ISTA). El contenido de humedad se expresa como porcentaje del peso fresco.

Donde:

C.H. = Contenido de humedad

3.6.2.4. Número de brotes

El numero de brotes, se determinará mediante el conteo

correspondiente a cada semilla germinada.

3.6.2.5. Prendimiento y mortandad de los brotes

Total de semillas germinadas * 100 Total de semillas utilizadas

Total acumulado del % de germinación diaria media al máximo * 100 Total de semillas germinadas

El porcentaje de prendimiento y mortandad de las semillas, se

determinará mediante el conteo, correspondiendo a cada semilla germinada

cuando presentan radículas vivas y semillas muertas cuando no existe

brotamiento de las radículas, y para facilitar los cálculos se utilizará la siguiente

Formula.

Donde:

M: Porcentaje de mortalidad

m: Número de plantas muertas

t: Número total de plantas

3.7. Tratamientos

Cuadro N° 1. Cuadro de tratamientos.

N°N° de días

NLtratamientos Semillas

1 0 T-0 20

2 15 T-1 20

3 30 T-2 20

4 45 T-3 20

5 60 T-4 20

total 60 5 100NL: Nitrógeno Líquido; T0: Testigo

3.8. Diseño experimental

El diseño estadístico que se aplicará será Completos al Azar, con un

número de 20 semillas por cada unidad experimental, cuatro tratamientos y un

testigo.

Testigo ( T0 ) Tratamiento 1 ( T1 ) Tratamiento 2 ( T2 )

Tratamiento 3 ( T3 ) Tratamiento 4 ( T4 )

Figura 2. Diseño Experimental.3.8.1. Esquema del diseño

Repeticionestratamientos

TOTAL1 2 . . K

1 Y11 Y21 . . YK12 Y12 Y22 . . YK23 Y13 Y23 . . YK34 Y14 Y24 . . YK4. . . . . .. . . . . .J Y1J Y2J . . YKJ

Total trat. Yi. Y1. Y2. . . YK. Y..

Promedios Y1 Y2 . . YK Y(promd)..

3.8.2. Esquema del análisis de varianza

FV GL SC CM FC

TRATAMIENTOS (t-1) SC trat. CMtrat CMtrat/CMe

EE t(r-1) SCe CMe

TOTAL tr-1 SCtotal

3.8.3. Modelo aditivo

Yij = + t i + ε i j

Donde:

Yij = Es la variable respuesta.

= Efecto de la media poblacional

Ti = Efecto de i-ésimo tratamiento.

eij = Efectos aleatorio ® EE.

3.8.4. Análisis de varianza

FV GL SC CM FC

Tratamientos 4

Error

experimental95

TOTAL 99

ActividadesMeses del 2010-2011

Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero

Elaboración del proyecto de tesis X

Selección de semillas X

Compra de insumos (Nitrógeno) liquido

X X

Ensayos de viabilidad X

Ensayos con crioprotectores X

Sumergido en nitrógeno liquido X

Ensayos de viabilidad X X

Redacción X

Corrección X

Sustentación X

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

V. PRESUPUESTO

DESCRIPCIÓN UNIDAD CANTIDADCOSTO UNITARIO

S/.COSTO TOTAL

S/.

Materiales de escritorio Varios 1   50

papel bond A4 80 gramos     30  lapiceros, lápices, etc.     20  MATERIALES DE LABORATORIO       540

Libreta de campo Unid. 1 4 4

Cinta maskingtape Unid. 2 5 10

Etiquetas Ciento 1 5 5

Tijeras Unid. 1 5 5

Sacarosa (15%)       0

Glicerol (15%)       0

Láminas Cajas 2 12 24

Guantes Par 5 8 40

Papel Kraff Unid. 100 0,5 50

Papel filtro Unid. 30 5 150

Pabilo Rollo 1 20 20

Lápiz Unid. 2 2 4

Corrector Unid. 1 8 8

Plumón indeleble Unid. 2 5 10

Nitrógeno liquido Kg 10 15 150

Alcohol 96º Lts. 5 6 30

Pilas Duracell Pares 5 6 30

EQUIPOS Y BIENES DURADEROS       120

Alquiler de cámara digital Unid. 1 50 50

Alquiler de vernier digital Unid. 1 30 30

Cronometro Unid. 1 40 40SERVICIOS DE TERCEROS Y OTROS       230

Movilidad Pasaje 5 30 150

Fotocopias Unid. 22 10 50

Internet Unid. 10 1 10

Alquiler de equipo de computo Unid. 10 2 20

TOTAL       940.00

Imprevistos 10%       94

TOTAL       1,034.00

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

A. SCOCCHI, E. DIERINGER, E. MROGINSKI, L.A. MROGINSKI,

2010  Conservación de semillas de cedro australiano (Toona ciliata)

Copyright © 2010 Bioversity International - FAO. All rights reserved.

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DANIEL BASKARAN K., 2000 Pruebas de Conservación de Semillas

Recalcitrantes en Malasia, Forest Research Institute Malaysia, Kepong,

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INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRÍCOLAS Y

PECUARIAS, 2004 [en línea] La caoba, Establecimiento y Manejo en la

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(http://www.oeidrus-slp.gob.mx/modulos/tecnologiasdesc.php?idt=108),

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JOSE MANUEL PITA V., CESAR PEREZ RUIZ, 2007 crioconservación de

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TOLEDO M., CHEVALLIER B., VILLARROEL D., MOSTACEDO B., 2008 [en

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FLACHSLAND E., TERADA G., SCOCCHI A. y HEBE R. 2002.

CRIOPRESERVACIÓN DE SEMILLAS Y PROTOCORMOS DE ONCIDIUM

BIFOLIUM S. (ORCHIDACEAE) POR ENCAPSULACIÓN –

DESHIDRATACIÓN, XIII Reunión de Comunicaciones Científicas y Técnicas

2002 Facultad de Ciencias Agrarias – UNNE, septiembre del 2010.