PROTOCOLOS DE EXTRACCION DE

ADN BACTERIANO

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO MEDIANTE EL KIT MINI

QUIAMP ADN DE LA FIRMA QUIAGEN

Las condiciones que se deben tomar en cuenta para el proceso de

extracción son las siguientes:

1. Las centrifugaciones se deben realizar a temperatura ambiente.

2. El baño maría a una temperatura de 56ºC.

3. Equilibrar el Buffer AE a temperatura ambiente para la elución.

4. Verificar que el Buffer AW1 y AW2 estén diluidos.

Seguidamente se empieza con la extracción.

1. Mezclar las 30 muestras obtenidas de un lote convirtiéndolas en una

sola muestra en un tubo falcón, una vez bien mezcladas se retiró un

alícuota de 600 µl de muestra.

2. Añadir 20 µl de proteinasa K y 600 µl de buffer AL a la muestra, se

mezcló en un vortex por 15 segundos. Esto para asegurar una lisis

eficiente.

3. Centrifugar momentáneamente para remover las gotas del interior de la

tapa. Se incubó a 56 ºC por 10 minutos.

4. Añadir 600 µl de etanol (96 – 100%) a la muestra y mezclar en un

vortex. Centrifugar momentáneamente para remover las gotas del

interior de la tapa.

5. Aplicar cuidadosamente 700 µl de la mezcla del paso 4 a la columna

QIAamp Mini spin (en tubo colector de 2ml) sin mojar el borde de la

columna. Cerrar la tapa y centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto. Colocar

la columna QIAamp Mini spin en tubo colector limpio de 2 ml (provisto)

y descartar el tubo que contenía el filtrado.

6. Repetir el paso 5 por aplicación de los 700 µl de la mezcla remanente

del paso 4 a la columna.

7. Cuidadosamente abrir la columna QIAamp Mini spin y añadir 500 µl

del Buffer AW1 sin mojar los bordes, cerrar la tapa y centrifugar a 8000

rpm por 1 minuto. Colocar la columna QIAamp Mini spin en tubo

colector de 2 ml limpio (provisto) descartar el tubo colector que contiene

el filtrado.

8. Cuidadosamente abrir la columna QIAamp Mini spin y añadir 500 µl de

Buffer AW2 sin mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar a 14000 rpm

por 3 minutos.

9. Colocar la columna QIAamp Mini spin en un tubo colector de 2 ml

limpio (no provisto) y descartar el tubo colector anterior con el filtrado.

Centrifugar a 14000 rpm por 1 minuto.

10.Colocar la columna QIAamp Mini spin a un tubo de 1.5 ml nuevo (no

provisto) y descartar el tubo colector. Cuidadosamente abrir la columna

QIAamp Mini spin y añadir 150 µl del Buffer AE (agua destilada)

incubar a temperatura ambiente por 1 minuto y luego centrifugar a 8000

rpm por 1 minuto.

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO POR CHOQUE TÉRMICO

1. Del pool de 30 muestras se retira un alícuota de 1ml de muestra.

2. Después centrifugar a 10000 rpm durante 20 minutos. Desechar el

sobrenadante.

3. Lavar el pellet tres veces con 1 ml de PBS, centrifugar 10 minutos a

10000 rpm.

4. Tras el último lavado resuspender el pellet en 25 µl de PBS.

5. Después someter a un choque térmico durante 10 minutos a 100 ºC y

pasar a hielo durante 10 minutos.

6. Por último centrifugar 5 minutos a 10000 rpm, pasando el sobrenadante

a otro tubo. En este sobrenadante se encuentra el ADN preparado para

su estudio.

PREPARACION DE SOLUCIONES

PBS (solución salina fosfatada)

NaCl 8 g

KCl 0,2 g

Na2PO4 1,44 g

K2HPO4 0,24 g

H2O destilada c.s.p. 1000 ml

Ajustar a pH 7,4. Autoclavar. Conservar entre 4-8°C

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO MEDIANTE CHOQUE

TÉRMICO Y MÉTODO POR COLUMNA CON RESINA

1. Del pul de 30 muestras retirar un alícuota de de 1ml de muestra.

2. Seguidamente centrifugar por 20 minutos a 10000 rpm. Desechar el

sobrenadante.

3. Lavar el pellet tres veces con 1 ml de PBS, luego centrifugar por 10

minutos a 10000 rpm.

4. Tras el último lavado resupender el pellet en 25 µl de guanidina.

5. Someter a un choque térmico, durante 10 minutos a 100 ºC y pasar a

hielo durante 10 minutos.

6. Centrifugar por 5 minutos a 10000 rpm, pasando el sobrenadante a

otro tubo.

7. Al sobrenadante añadir 5,83 µl de SDS. Llevar a baño maría a una

temperatura de 56ºC por 10 minutos.

8. Después agregar 8,9 µl de acetato de potasio, seguidamente incubar

en hielo por 30 minutos. Centrifugar por 3 minutos a 10000 rpm.

9. Retirar un alícuota de 40 µl a otro tubo de 1,5 ml.

10. Agregar 20 µl de Binding matriz de resina a la columna Magic Miniprep

Minicolumnas de promega y hacer pasar por esta los 40 µl de la

solución anterior.

11.Lavar tres veces con solución de lavado y tras el último lavado

centrifugar por 20 segundos a 2000 rpm. Con el fin de eliminar todo el

etanol

12.Eluir con 30 µl de agua. Y el ADN extraído es conservado a -20°C.

PREPARACION DE SOLUCIONES

PBS (solución salina fosfatada)

NaCl 8 g

KCl 0,2 g

Na2PO4 1,44 g

K2HPO4 0,24 g

H2O destilada c.s.p. 1000 ml

Ajustar a pH 7,4. Autoclavar. Conservar entre 4-8°C

Preparación de Binding matrix de resina (25 ml)

Resuspender 5 g de Resina Diatomaceous, en 50 ml de agua bidestilada.

Agitar y dejar decantar por lo menos 30 minutos. Descartar el sobrenadante.

Resuspender lo restante en T.E. Hasta completar 25 ml. Autoclavar y

almacenar a 4 °C.

Solución de guanidina HCl: 7M guanidina – HCl; 50 mM Tris-HCl, pH

8,0; 20 mM EDTA

Mezclar:

66,84 g de Guanidina – HCl

5 ml 1 M Tris HCl, Ph 8,0

4 ml 0,5 M EDTA 4 g para 100ml

Calentar suavemente hasta disolver y completar a 100 ml con agua. Autoclavar

Solución de lavado

10 mM Tris – HCl, pH 8,0 (1ml de 1M stock)

1 mM EDTA, pH 8,0 (0,2 ml de 0,5 M stock)

50% de etanol (50ml de etanol absoluto)

EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO POR EL MÉTODO

CLÁSICO

1. Del pool de 30 muestras sacar un alícuota de 1,5 ml, centrifugar y

resuspender el pellet en 800 µl de Buffer de lisis. Añadir 0.8 µl de RNAsa

e incubar por 15 minutos a temperatura ambiente y 15 minutos en hielo.

2. Añadir 24 µl de Proteinasa K (20 mg/ml) a la solución del paso anterior e

incubar durante 45 minutos a 55°C.

3. Añadir 288 µl de acetato de amonio 7,5 M y 800 µl de cloroformo.

Centrifugar a 10000 rpm durante 10 minutos.

4. A la fase acuosa añadir 800 µl de cloroformo, centrifugar por 10 minutos

a 10000 rpm.

5. Recuperar nuevamente la fase acuosa, a esta agregar 2 volúmenes de

etanol al 95% mezclar suavemente. Centrifugar a 8000 rpm por 10

minutos seguidamente eliminar todo el etanol.

6. Añadir 1000 µl de etanol al 70 % y agitar suavemente. Centrifugar a

10000 rpm por 5 minutos para eliminar todo el etanol.

7. Secar los pellets recuperados con el fin de eliminar todo el etanol.

8. Resuspender el pellet en 30 µl de agua libre de DNAasas. Conservar las

muestras a -20 °C para su posterior estudio.

PREPARACION DE REACTIVOS

Buffer de lisis (100 mM tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 2 M NaCl)

1 M tris-HCl pH 8,0 1,0 ml

0,5 M EDTA 0,2 ml

3M NaCl 6,6 ml

Agua destilada c.s.p. 10 ml

Esterilizar en autoclave

Conservar en congelación

EXTRACCION DE ADN BACTERIANO DE BRUCELLA

1. Medir 500 µl de la muestra (plasma).

2. Añadir 500 µl de tampón o buffer Nº 1

3. Dejar en hielo durante 30 minutos

4. Centrifugar a 10000 rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente

5. Descartar el sobrenadante

6. Añadir 500 µl de SSC 1x

7. Llevar a vortex

8. Centrifugar a 10000 rpm durante 20 minutos

9. Descartar el sobrenadante

10.Añadir 500 µl del tampón Nº 2

11.Mezclar y agitar

12.Añadir 20 µl de proteinasa K (20 mg/ml)

13. Incubar durante 2 horas a 50 ºC

14.Añadir 500 µl de cloroformo

15.Llevar a vortex

16.Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos

17.Transferir el sobrenadante a un tubo limpio

18.Añadir 1/3 de volumen (es decir del sobrenadante) 7.5 M de acetato de

amonio

19.Anadir dos volúmenes de etanol absoluto y mezclar

20.Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos

21.Descartar el sobrenadante

22.Añadir 400 µl de etanol al 70 % para lavar el pellet de ADN

23.Centrifugar a 10000 rpm durante 15 minutos (repetir paso 22 y 23 dos

veces)

24.Secar el pellet a temperatura ambiente

25.Disolver el pellet de ADN en 50 µl de agua libre de RNAasas y DNAasas

26.Almacenar a -20º C.

PREPARACION DE REACTIVOS

Buffer Nº 1 :

20 mM NaCl

20 mM EDTA

20 mM Tris HCl pH =7.5, 0.5 % TRITON

Buffer Nº2

10 mM NaCl

50 mM EDTA

50 mM Tris HCl pH =7.5, 1% TRITON

Buffer Nº 2

10 Mm NaCl 175.3 g.

50 mM EDTA,

50mM Tris HCl pH 7.5 ,

1% SDS

20 X SSC

NaCl 175.3 g

Citrato de sodio 88.2 g

Citrato de sodio 88.2 g.

Disolver en 800 ml de agua, ajustar el Ph A 7,2 mediante la adicion de unas

gotas de HCl concentrado, también ajustar el volumen a 1000 ml. Diluir para

usar en el protocolo a 1X SSC.

PROTOCOLOS DE EXTRACCION DE

ARN VIRAL

EXTRACCIÓN DE ARN VIRAL POR EL KIT COMERCIAL (QIAGEN).

Para iniciar el proceso de extracción se debe preparar el material y

reactivos siguiendo las indicaciones provistas por el kit de manera que estén

listos para ser utilizados.

El Kit utilizado para la extracción de ARN en el presente trabajo fue: Kit

QIAamp Viral ARN (Qiagen).

Spin Protocolo Mini QIAamp

Procedimiento:

1. Con una pipeta se añade 560 μl de tampón AVL preparados en un tubo

de microcentrífuga de 1.5 ml.

2. Añadiendo 140 μl de suero en tubo de microcentrífuga que contiene el

Buffer AVL, se mezcla durante 15 segundos para garantizar la eficacia

de la lisis, es necesario que la muestra este bien mezclada a fondo con

buffer AVL para obtener una solución homogénea.

3. Se incuba a temperatura ambiente (15 –25º C) durante 10 min. Para que

la lisis de partículas virales sea completa después de 10 min a

temperatura ambiente.

4. Se centrifuga brevemente el tubo para eliminar las gotas del interior de la

tapa.

5. Se añade 560 μl de etanol (96-100%) a la muestra y se mezcla por

agitación manual 15 segundos. Después se centrifuga brevemente para

eliminar las gotas del interior de la tapa. Es importante que la muestra

este homogéneamente mezclada.

6. Se añade cuidadosamente 630 μl de la solución desde el paso 5 a la

columna de la Mini QIAamp (en un tubo de 2 ml) sin mojar el borde. Se

Cerró la tapa y centrifugo a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 min. Se coloca

a la columna Mini QIAamp en un tubo de 2ml para recoger y luego

desechar el tubo que contiene el filtrado. Cerrando cada columna con el

fin de evitar la contaminación cruzada durante la centrifugación. Si la

solución no ha pasado completamente a través de la membrana, se

somete a centrifugación de nuevo a una velocidad mayor hasta que toda

la solución haya pasado.

7. Se destapa cuidadosamente el Mini QIAamp columna, y se repite el paso

6.

8. Luego se añade cuidadosamente 500 μl de Buffer AW1 a la columna. Se

cierra la tapa, y se centrifuga a 6000 x g (8000 rpm) durante 1 min. Se

pone la columna Mini QIAamp en un tubo limpio de 2 ml tubo de

recogida (siempre), y se desecha el tubo que contiene el filtrado.

9. Posteriormente se añade cuidadosamente a la columna, 500 μl de Buffer

AW2. Se centrifuga a toda velocidad (20.000 x g, 14.000 rpm) durante 3

min y se elimina el sobrenadante.

10. Se pone la columna Mini QIAamp en un nuevo tubo de 2 ml de colección

y se desecha el tubo con el filtrado. Se centrifuga a alta velocidad

(14.000 rpm) por 1 min.

11. Se pone la columna Mini QIAamp en un tubo limpio de 1,5 ml de

microcentrífuga. Se desecha el tubo que contiene el filtrado.

Cuidadosamente se abre la columna Mini QIAamp y se añade 60 μl de

Buffer AVE para la elución a temperatura ambiente. Se cierra la tapa, y

se incuba a temperatura ambiente durante 1 min. Centrifugar a 6000 x g

(8000 rpm) durante 1 min.

Las extracciones obtenidas en caso de no ser procesadas

inmediatamente pueden ser conservadas a – 20ºC o – 80ºC hasta que se

procesen.

PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ARN VIRAL

UMSAGEN

Preparación de las muestras

Se prepararon 200µl de las muestras en 300 µl de cloruro de Guanidina y

conservadas a -20 ºC hasta el momento de la extracción del RNA y DNA.

Procedimiento

Trabajar a 4ºC.

Descongelar la muestra y agitar en vortex y agregar: 60 µl Acetato de

Sodio y 200 µl Cloroformo, mezclar enérgicamente en vortex y dejar 10

min a -20ºC.

Centrifugar a 10000 rpm 15 min a 4ºC.

Recuperar cuidadosamente la fase acuosa (sobrenadante) en otro tubo

eppendorf.

Agregar 500 µl de Isopropanol y mezclar suavemente por inversión.

Dejar a - 20 ºC por 60 min

Centrifugar a 10.000 rpm 15 min a 4ºC y decantar el sobrenadante.

Agregar 500 µl de Etanol frío al 70 %, mezclando suavemente por

inversión.

Centrifugar a 10.000 rpm 5 min a 4 oC y decantar totalmente el

sobrenadante.

Resuspender el sedimento con 50 µl de agua DEPC fría a esto añadir 5 µl

de Acetato de Sodio (mantiene el ph estable) y 100 µl de Etanol absoluto

frío Mezclar bien por inversión y dejar a - 20 ºC por una noche.

Centrifugar a 13000 rpm 15 min a 4 oC y decantar totalmente el

sobrenadante.

Secar el sedimento a temperatura ambiente hasta la eliminación total del

sobrenadante.

Resuspender el sedimento con 30 µl de agua DEPC y conservar el RNA

extraído a -20ºC (Chomczynski, and Sacchit, . 1986).

Reactivos

Agua DEPC 0.1 %

Dietil Pirocarbonato 1ml

Agua csp 100ml

Tiocianato de guanidina 4 M

Guanidina tiocianato 23.64 g

N- Lauril Sarcrosil 250 mg

Citrato de sodio . 2 H2O 367 mg

Beta Mercaptoetanol 14.3M 350 µl

Agua DEPC csp 50 ml

PROTOCOLO CONVECIONAL PARA LA EXTRACCIÓN DE

ARN VIRAL

PROCEDIMIENTO

1. En un tubo nuevo de 2ml añadir 1,5 ml de Buffer I y 300ul de suero

mezclar la solución y dejar a temperatura ambiente por 1min

2. Centrifugar a 7,312rpm /10 min a temperatura ambiente.

3. Separar el sobrenadante (en el que está el ARN) en un tubo nuevo de

2ml

4. Añadir 0,1 vol. de acetato de sodio 3M pH 5,2, mezclar bien y añadir 0,5

vol. de etanol frio en hielo, mezclar y guardar la solución por más de 2

hrs a 0 ºC

5. Centrifugar a 7,300 rpm /10 min./0ºC, descartar el sobrenadante y secar

el pellet a temperatura ambiente

6. Disolver el pellet en un pequeño volumen de buffer II (1,5ml de buffer II)

es difícil disolver el pellet, y se puede utilizar un homogeneisador

7. Añadir 0,5 vol. de etanol frio en hielo y mezclar inmediatamente,

almacenar la solución por más de 2hrs a – 20ºC

8. Centrifugar a 7,300 rpm /10 min, decantar el sobrenadante y secar el

pellet a temperatura ambiente

9. Repetir el paso 7 y 8 (3V)

10.Disolver el pellet en EDTA 0,02M pH 8 (750ul), como sigue: añadir

aproximadamente la mitad de la solución de EDTA 0,02M pH 8 y llevar a

vortex por 1-2 min. Luego centrifugar por 2 min. a 5.700 rpm. Recuperar

el sobrenadante en un tubo; luego añadir la segunda mitad de la

solución EDTA 0,02M pH 8 al pellet y llevar a vortex 1 o 2 min. hasta

disolver el pellet y finalmente formar un pool de las soluciones de

EDTA .

11.Añadir igual volumen de cloroformo y llevar a vortex

12.Centrifugar a 7,300 rpm /10 min. a temperatura ambiente transferir la

fase acuosa a otro tubo y repetir la extracción con solventes orgánicos

(cloroformo)

13.Transferir la fase acuosa a otro tubo nuevo y añadir 3 vol. de acetato de

sodio 4M pH 7,0 y guardar por más de 1 hora / -20ºC

14.Centrifugar a 7,300 rpm /20 min a 0ºC. Bajo ésta condición los restos de

ADN se encuentran solubles y el ARN es precipitado

15.Retirar el sobrenadante y lavar el pellet con acetato de sodio 3M pH 7,0

a 4ºC Centrifugar a 7,300 rpm /20 min a 0ºC

16.Retirar tanto como sea posible el sobrenadante y disolver el pellet en un

mínimo volumen de 0,2% de SDS, 0,05M EDTA Ph8 1ml/gr

Nota : si el SDS precipita añadir 0.1N de NaOH gota a gota en ajitación

hasta llegar a un pH 7,5

17.Añadir 2vol. de etanol frio y dejar más de 2 hrs a 0ºC y recuperar el

ARN por centrifugación 7,300 rpm /10 min a 4ºC

18.Lavar el pellet con etanol a 70% centrifugar brevemente y el pellet secar

al aire

19.Disolver el pellet de ARN en un vol. pequeño de agua, añadir 3 vol. de

etanol y guardar la solución a -70ºChasta que sea utilizado.

20.Para recuperar el ARN remover una alícuota y añadir acetato de sodio

3M pH 5,2 a una concentración final de 0,3 M mezclar bien y almacenar

a -70ºC

REACTIVOS

Buffer 1

Guanidina HCl 8M (M = 95.6)

0.1 M de acetato de sodio (pH 5.2)

5 mM dithiothereitol

0.5 % sodium lauryl sarcosinate

Añadir 191g de guanidina HCl , 8.35 ml de 3 M de acetato de sodio y 6.25 ml

de 0.2 M dithiothreitol. Anadiri H20 237.5 ml y mezclar bien. Anadir 12.5 ml de

sodium lauryl sarcosinate al 10 % mezclar bien.

Buffer II

Guanidina HCl 8M (M = 95.6)

0.2 M de acetato de sodio (pH 5.2)

1 mM dithiothereitol

20 m M EDTA (pH 8.0)

Añadir 191g de guanidina HCl , 8.35 ml de 3 M de acetato de sodio y 1.25 ml

de 0.2 M dithiothreitol. Añadir 10 ml de y añadir 250 ml de H20 y mezclar bien.

.

PROTOCOLOS DE EXTRACCION DE

ADN VIRAL

PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN VIRAL

La extracción del ADN se realizara según el procedimiento descrito por Deka et

al del 2005 citado por Lata Jain el 2006 que se describe a continuación:

a. Medir aproximadamente 500μl de la muestra que contiene el virus.

b. Tratar con 10μl al 10% de dodecil sulfato de sodio (concentración final

0,2%) y 8μl de proteinasa K (250μg/ml).

c. Incubar la mezcla a 56 ° C durante una hora en un baño maría.

d. Luego mezclar con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol

isoamílico (25:24:1) y centrifugar a 14.000 rpm durante 15 min

e. La fase acuosa se somete a un ciclo más de lavado con fenol:

cloroformo: alcohol-isoamílico.

f. Luego mesclar con un volumen igual de cloroformo: -alcohol isoamílico

(24:1).

g. Dejar el ADN en incubación durante toda la noche a -20 ° C en un

volumen 1/10 de acetato de sodio 3M y volumen igual de isopropanol

h. Precipitar por centrifugación a 14.000 rpm durante 15 min.

i. El pellet de ADN debe ser lavado dos veces con 500μl de etanol al 70%

a -20 ° C y centrifugar a 14.000 rpm durante 15 min.

j. luego secar el pellet al aire y resuspender en 80μl de agua ultra pura

libre de RNAsa y DNAsa para su uso en PCR.

k. Almacenar las muestras extraídas a -20 ° C.

PROTOCOLOS DE AMPLIFICACION – DETECCION DE Micoplasmosis

aviar

PROTOCOLO DE AMPLIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL PARA LA

DETECCIÓN DE Mycoplasma gallisepticum Y Mycoplasma synoviae

1. Preparación de la mezcla

Para la reacción de PCR, se prepara una mezcla con los siguientes

reactivos: Master mix, agua ultra pura y SEQ Mg-Ms-IPC en una placa de

congelación con el fin de evitar la degradación del ADN y reactivos.

MEZCLA REACTIVOS POR MUESTRA

(µl)

PARA 6

MUESTRAS (µl)

MEZCLA

Mg – MS

Master Mix 12,5 75

Agua libre de

DNasas

5,5 33

SEQ Mg-Ms-IPC 2 12

VOLUMEN

TOTAL DE LA

REACCION

20 120

2. El paso siguiente es crear una hoja de Píate para la ejecución de la

PCR. Donde cada cuadro representa el pocillo donde se encuentran las

muestras y controles.

3. Seguidamente realizar el programa de cicláje para la PCR en tiempo

real.

Desnaturalización inicial a 95ºC durante 15 minutos por 1 ciclo

Desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto por 45

Hibridación y extencion a 60 ºC durante 1 minuto y 30 segundos ciclos

4. Agitar la mezcla cuidadosamente, para asegurar una adecuada

homogenización.

5. Añadir 20 µl de la mezcla Multiplex Mvcoplasma aviar a cada uno de

los pocillos de la placa PCR. Posteriormente añadir 5 ul del control

negativo (CN), las muestras a los diferentes pocillos, control positivo

externo (CPE) para Mycoplasma gallisepticum y control positivo externo

(CPE) para Mycoplasma synoviae, (Ver tabla anexada).

Posillo

1

Posillo 2 Posillo 3 Posillo 4 Posillo 5

Mezcla para la reacción

PCR

20 µl 20 µl 20 µl 20 µl 20 µl

Control negativo 5 µl

Muestra 1 5 µl

Muestra 2 5 µl

Control positivo

externo para

Mycoplasma

gallisepticum

5 µl

Control positivo externo

para Mycoplasma

synoviae

5 µl

Total 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl 25 µl

PROTOCOLO DE AMPLIFICACION USANDO EL SISTEMA SYBER GREEN

CON EL KIT DE DIAGNOSTICO MOLECULAR DE MYCOPLASMA

GALLISEPTICUM Y MYCOPLASMA SYNOVIAE ELABORADO POR EL

LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR PROINPA

La amplificación por PCR en tiempo real usando el fluorocromo SYBR Green

se realizo con 5 μl de DNA molde y un volumen final de reacción de 15 μl. Los

diferentes reactivos se prepararon en dos soluciones diferentes Mezcla 1 y

Mezcla 2 con las siguientes concentraciones:

Tabla 1: Mezcla 1 para la reacción PCR

Stock Concentración Final 5 µl

Tampón PCR 10 X 1 µl

dNTPs 5 mM 0,3 µl

Cebadores 10 pmol 0.75 µl

H20 PCR 2,95 µl

Tabla 2: Mezcla 2 para la reacción PCR

Stock Concentración Final 5 µl

Tampón PCR 10 X 0,5 µl

H20 PCR 4,4 µl

Taq Polimerasa 0,1 µl

Estas mezclas fueron preparadas para determinar Mycoplasma gallisepticum y

Mycoplasma synoviae individualmente, es decir detectar un patógeno en un

solo tubo de reacción.

Para la detección simultanea de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma

synoviae se realizaron modificaciones en cuanto al volumen del mezcla 1,

como se observa en la tabla 3.

Tabla 3: Mezcla 1 usada para la detección simultanea de Mycoplasma

gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Stock Concentración Final 5 µl

Tampón PCR 10 X 1 µl

dNTPs 5 mM 0,3 µl

Cebadores para Mg 10 pmol 0,75 µl

Cebadores para Ms 10 pmol 0,75 µl

H20 PCR 2,2 µl

Tabla 4: Mezcla 2 usada para la detección simultanea de Mycoplasma

gallisepticum y Mycoplasma synoviae

Stock Concentración Final 5 µl

Tampón PCR 10 X 0,5 µl

H20 PCR 4,4 µl

Taq Polimerasa 0,1 µl

El volumen de la mezcla 2 no sufrió ninguna modificación.

Para la amplificación se utilizó el siguiente programa de ciclaje:

Desnaturalización inicial a 94ºC durante 5 minutos por 1 ciclo

Desnaturalización a 94 ºC durante 1 minuto

Hibridacion a 60 ºC durante 1 minuto y 30 segundos por 35 ciclos

Elongación a 72 ºC durante 30 segundos

Para el análisis de las curvas de disociación (Tm), se añadió un ciclo en el que

tiene lugar un incremento paulatino de temperatura desde 55 a 90 °C, en 35

min.

PREPARACION DE REACTIVOS

Tampón PCR 10 X (10ml)

Tris H Cl 1M pH 8,3 1ml (100 mM)

MgCl2 (203,30 g/mol) 0,046 g (20mM)

KCl (74,55 g/mol) 0,3728 (500 mM)

Enrasar a 10 ml y autoclavar. Almacenar a -20 ºC

Solución dNTPs 5 Mm (400 µl)

dATP 100 mM 20 µl

dGTP 100 mM 20 µl

dCTP 100 mM 20 µl

dTTP 100 mM 20 µl

PROTOCOLOS DE AMPLIFICACION – DETECCION DE

diarrea viral bovina

DETECCIÓN DEL VIRUS DE DIARREA VIRAL BOVINA (VDVB)

MEDIANTE RT-PCR EN TIEMPO REAL CON EL KIT TAQVET

BVD ( FAST IPI) A PARTIR DE SANGRE ENTERA CON EDTA COMO

ANTICOAGULANTE

El kit utilizado para la detección del vDVB mediante RT-PCR en tiempo

real fue: Kit TaqVet BVD (Fast IPI) que se utiliza para procesar una muestra

por pocillo, apartir de sangre entera con EDTA como anticoagulante.

Protocolo.-

1. Se realiza una pre-dilución de las muestras antes de ser procesadas la

sangre entera con (EDTA), debe realizarse una dilución 1/10 con agua

ultrapura libre de RNasa, Posteriormente se realiza una nueva dilución

1/10 con el reactivo BVD Fast Buffer

2. Se añade 5 ul de la pre-dilución de la muestra y 45 µl de BVD Fast

Buffer.

3. De la dilución obtenida en el paso 2 será analizada 5ul por RT-PCR.

4. Una vez preparado, el tubo que contiene el Fast Mix BVD en una placa

de refrigeración.

5. Se añade 20 μl de Fast Mix BVD y se mezcla la muestra en un tubo de

ensayo de 1,5 ml (para evitar la contaminación de la sonda" BVD Fast

Mix).

6. Se dispensa 20 μl de la mezcla por pocillo en la microplaca de PCR.

7. Luego se añade 5 μl de muestra diluida en DVB rápido de buffer en los

pozos de la microplaca, que se utilizará para la prueba en sus

respectivos pocillos.

8. Se tapa bien la serie de tubos PCR para iniciar la amplificación.

9. Se programa el equipo para el procesamiento de la muestras

10. De esta manera inicio el proceso de la PCR en tiempo real.

DETECCIÓN DEL VIRUS DE DIARREA VIRAL BOVINA VDVB

MEDIANTE RT-PCR EN TIEMPO REAL CON EL KIT TAQVET

BVD (FAST IPI) MODIFICADO APARTIR DE LA EXTRACCIÓN

DE UN POOL DE 20 MUESTRAS DE SUERO.

El kit utilizado para la detección del vDVB mediante RT-PCR en tiempo

real fue: Kit TaqVet BVD (Fast IPI) que se utiliza para procesar una muestra

por pocillo, apartir de sangre entera con EDTA como anticoagulante, este kit

se utilizó para procesar un pool de 20 muestras por pocillo como se realiza en

otros kits de RT-PCR en tiempo real con algunas modificaciones.

Protocolo.-

1. Las muestras que se obtuvieron del producto de la extracción de ARN

fueron procesadas sin ningún tratamiento previo.

2. Una vez que este todo preparado se puso el tubo "BVD Fast Mix en una

rejilla de refrigeración.

3. Se agito en un vortex suavemente el tubo "BVD Fast Mix

4. Se añadió 20 μl de “Fast BVD” y mezclo la muestra en un tubo de

ensayo de 1,5 ml (para evitar la contaminación de la sonda" BVD Fast

Mix).

5. Se dispenso 20 μl de la mezcla por pocillo en la microplaca de PCR.

6. Luego se añadió 5 μl del producto de la extracción de ARN en los pozos

de la microplaca, que se utilizará para la prueba en sus respectivos

pocillos.

7. Se cubrió la placa con un adhesivo para iniciar la amplificación.

8. Se programo el equipo para el procesamiento de la muestras

9. De esta manera inicio el proceso de la PCR en tiempo real.

Para ambos procedimientos el programa de ciclaje es:

Primera etapa: 48°C – 30 min – repetición: 1

Segunda etapa: 95°C – 10 min – repetición: 1

Tercera etapa: 95°C – 15 seg. - repetición : 45

Cuarta etapa: 60°C – 1 min – repetición : 45

TÉCNICA DE RT-PCR EN TIEMPO REAL CON UN KIT

DISEÑADO PARA LA DETECCIÓN DE LA DIARREA VIRAL

BOVINA (DVB) APARTIR DE LA EXTRACCIÓN DE UN POOL DE

20 MUESTRAS DE SUERO.

1.- Preparación de mesclas de amplificación mix 1 y mix 2

2.- Se trabaja con el producto de la extracción de las muestras procesadas por

RT-PCR en tiempo real.

3.- Al producto de la extracción se realiza una retro-transcripción previa para

convertir de ARN a ADNc y de esta manera poder trabajar con el equipo de RT-

PCR en tiempo real.

4.- Se dispensa 5ul a cada pocillo del mix 1 y 5ul mix 2.

3.- Luego se añade 5ul de las muestras a cada tubo PCR.

4.- Colocar los tubos en el equipo de RT-PCR en tiempo real LSI SLAN (Es

muy importante trabajar en la placa refrigerante para evitar la degradación tanto

de los reactivos como de las muestras durante el proceso).

Reactivo Cantidad 1

muestra

Cantidad 12

muestras

Mix 1

Tampon PCR 10X 1ul 12ul

dNTP 5 milimolar 0.3ul 3.6ul

Primer 10 pmol 0.7ul 9ul

Agua de PCR 2.95ul 35.4ul

Mix 2

Tampon PCR 4.4ul 52.8ul

Agua de PCR 0.1ul 1.2ul

Taq plimerasa 5ul 60ul

Syber green 0.05 0.6

5.- Los tiempos y temperaturas de reacción utilizados se los describe a

continuación.

Etapa Nº de ciclo Temperatura Tiempo

Primera 1 ciclo 95ºC 10 min

Segunda 35 ciclos 94ºC

72ºC

1min

30 seg.