PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių...
Transcript of PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių...
![Page 1: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/1.jpg)
PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS
Baltymų išskyrimas iš ląstelių kultūrų ir audinių
![Page 2: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/2.jpg)
Ląstelių Subfrakcionavimas
Ląstelių kultivavimas
Ląstelių išskyrimas iš audinių
Baltymų išskyrimas iš audinių ir ląstelių kultūrų
Baltymų išskyrimui naudojami detergentai
![Page 3: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/3.jpg)
Eukariotų ląstelės sandara
• Plazminė membrana ląstelės morfologija, judėjimas, kontaktai su aplinka ir ląstelėmis, medžiagų judėjimas per membraną ir kt.
• Branduolys: chromatinas, ląstelės programos ir valdymo centrasBranduolėliai, nukleoplazma
• Citoplazma koloidinis įvairių molekulių tirpalas
• Organelės:• Mitochondrijos energijos transformacija; karbamido, hemo, steroidinių
hormonų sintezė• Endoplazminis tinklas lipidų ir baltymų sintezė, detoksikacijos reakcijos,
(vidinė branduolio membrana) organoidų fiksacija• Goldžio kompleksas endoplazminiame tinkle pagamintų medžiagų
rūšiavimas ir modifikavimas, paskirstymas ląstelėje• Lizosomos baltymų proteolizė• Peroksisomos medžiagų oksidacija dalyvaujant peroksidui• Pernašos pūslelės (vezikulos) medžiagų pernešimas tarp membraninių ląstelės
struktūrų• Citoskeleto tinklas: ląstelės formos ir judėjimo palaikymas,
Aktino, trapinės gijos organoidų transportasmikrovamzdeliai
• Ribosomos baltymų sintezė
![Page 4: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/4.jpg)
Baltymų kiekis organoiduose
Iš 1 mlj (106) ląstelių – 100 -200 µg baltymų:
tirpūs citoplazmos baltymai - 50%branduolio baltymai - 15%membranų baltymai - 30%
![Page 5: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/5.jpg)
Pavyzdžio pasirinkimas
Visas organizmo lizatas ~100,000Audinio lizatas ~50,000
Ląstelių lizatas (pvz. eritrocitai) ~20,000
Subląstelinis frakcionavimasmitochondrija ~1000branduolys
Išgrynintas baltymų kompleksas 2-50
Baltymų skaičius
![Page 6: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/6.jpg)
Ląstelių tipai
Ląstelių morfoligijų skirtumai.a) BHK-21 ląstelės (baby hamster kidney fibroblasts);
b) FHI (Fetal human intestine) į fibroblastus panašios ląstelės;
c) astrocitai;
d) plato fazė BHK-21 ląstelių;
e) jaučio aortos endotelio ląstelės;
f) 3T3 ląstelės, pelės fibroblastai.
![Page 7: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/7.jpg)
Ląstelių ardymo būdai
Osmotinė lizėLizė šaldymu-šildymuDetergentinė lizėFermentinė lizėArdymas ultragarsu (sonikavimas)Ardymas French presuTrynimasMechaninis homogenizavimasHomogenizavimas rutuliukais
![Page 8: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/8.jpg)
Homogenizacijos trūkumai
– galimas baltymų degradavimas dėl peršilimo,– homogenizavimas nepakankamas,– branduoliai užteršti nesuirusiomis ląstelėmis,– branduoliai užteršti endoplazminio tinklo likučiais
ir organoidais,– nėra bendrų homogenizavimo sąlygų,– citozolis užterštas suirusių branduolių
nukleoplazma.
![Page 9: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/9.jpg)
Detergentai, jų savybės
• Detergentai – amfipatinės (amphipathic) molekulės, turinčios nepoliarinę dalį, kuri turi alifatinių ar aromatinių savybių ir poliarinę dalį;
• Detergentai skirstomi į:– Joninius (turintys krūvį – anijoniniai arba katijoniniai),– Nejoninius (be krūvio),– Zviterjoniniai (turintys tiek teigiamai, tiek neigiamai įkrautas grupes; bendra
krūvio suma - nulinė).
![Page 10: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/10.jpg)
Detergentų Struktūra
Schematinė detergento struktūra (kairėje);
CHAPS struktūra (dešinėje).
Hidrofobinė “uodega”
Hidrofilinė “galvutė”
![Page 11: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/11.jpg)
Detergentų Micelės
Esant didelėms detergentų koncentracijoms, detergentų monomerai agreguoja ir sudaro struktūras – miceles. Micelės yra termodinamiškai stabilus koloidinis detergentų monomerų agregatas.
Ideali detergento micelės struktūra
![Page 12: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/12.jpg)
Kai kurių detergentų savybės• Natrio dodecilsulfatas (SDS)
Anijoninis detergentas. • Triton X-100
Nejoninis detergentas. • Triton X-114
Nejoninis detergentas. • NP-40
Nejoninis detergentas. • CHAPS
Nedenatūruojantis zviterjoninis detergentas. • SB3-10, ASB 14 arba ASB 16
Zviterjoniniai detergentai.
![Page 13: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/13.jpg)
Redukuojantys agentai
• Ditiotreitolis (DTT) ir ditioeritrolis (DTE)
• TBP (Fosfinai)
• TCE (Tris[2-karboksietil]fosfinas)
![Page 14: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/14.jpg)
Detergentų Parinkimas
Disulfidinių tiltelių suardymas• 2-merkaptoetanolis (700 mM, jonizuoja)• Ditiotreitolis (50 mM)• Fosfinai (2 mM, stiprus reduktorius)
Nekovalentinių jungčių suardymasJoniniai detergentai, pvz. SDS,Chaotropiniai ir nejoniniai detergentai, pvz. Urea/Thiourea,
CHAPS
![Page 15: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/15.jpg)
Baltymų išskyrimas
• Viduląstelinių baltymų išskyrimui reikalinga:– ląstelių išskyrimas (pvz., iš audinių);- ląstelių lizavimas;- ląstelių nuosėdų pašalinimas;- DNR, RNR, lipidų pašalinimas.
• Išorinių ląstelių baltymų išskyrimui reikalinga:– Ląstelių išskyrimas.
![Page 16: PROTEOMO NUSTATYMO METODOLOGIJOS Baltymų … 3_Baltymu isskyrimas.pdf · Ląstelių Subfrakcionavimas Ląstelių kultivavimas Ląstelių išskyrimas iš audinių. Baltymų išskyrimas](https://reader037.fdocument.pub/reader037/viewer/2022102704/5a6fab037f8b9a98538b4ae9/html5/thumbnails/16.jpg)
Baltymų išskyrimo metodai
• Bendras ląstelių lizatas• Citoplazmos ir branduolio baltymai• Tirpūs ir netirpūs ląstelių baltymai• Plazminės membranos baltymai• Mitochondrijų baltymai• Citoskeleto baltymai• Ir kt.