PROTEÔMICA Ferramentas para identificação de antígenos e imunógenos 10/06/2008.
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PROTEÔMICA
Ferramentas para identificação de antígenos e
imunógenos
10/06/2008
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O que é Proteômica?
“Identificação, caracterização e quantificação de todas as proteínas envolvidas em uma cadeia particular, organela, célula, tecido, órgão ou
organismo que pode ser estudado com o objetivo de fornecer dados confiáveis para o
entendimento de determinado sistema.”
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Genômica DNA (Gene)
GenômicaFuncional
Transcriptômica RNA
Proteômica PROTEÍNA
Metabolômica METABÓLITOS
Transcrição
Tradução
Reação enzimática
A nomenclatura ômica…
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Lições sobre os Projetos genômicos A complexidade evolucionária não é primariamente determinada
pelo maior número de genes, mas sIm pela variação do número de proteínas sintetizadas.
Isso é alcançado pela geração de múltiplas proteínas a partir de um único gene, como por exemplo: Diferentes combinações de exons por splicing alternativo
Processamento pós-traducional (ex, clivagem de pró-peptídeos)
Modificações pós-traducionais (ex acetilação, glicosilação)
Modificações no dogma central: DNA --> RNA --> proteína(s)
É importante então realisar análises a partir dos PRODUTOS do gene, e não tanto dele mesmo.
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Por que estudar a expressão de proteínas?
DNA
Transcritode RNAPrimário
mRNA mRNA
proteína Proteína
ControleTranscricional
Controledo ProcesDe RNA
ControleTransport
RNA
mRNA inativoControle
DegradaçãoRNA
Controle de Tradução
ControlePós-Transducional
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Vantagens centrais da proteômica:
Pesquisadores trabalham no nível de produtos gênicos, que são realmente expressos e levam a um produto real, não somente sendo expresso e tendo mRNA.
Limitações centrais da proteômica:
Geralmente, somente uma fração das proteínas sintetizadas pode ser detectada num experimento, enquanto a expressão de todos os genes pode ser monitorada num experimento de array.
Pré-requisito básico da proteômica:
O genoma sequenciado do organismo investigado ou pelo menos uma coleção de cDNAs.
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Background experimental
Eletroforese 2D Método para separação e visualização de
proteínas Separação por carga e massa
Espectometria de Massa Análise de alta confiabilidade e identificação de
proteínas. Fragmentação de proteínas Análise de peptídeos
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A primeira dimensão (separação por ponto isoelétrico)- Gel com um gradiente de pH imobilizado-Corrente elétrica leva proteínas carregadas a se mover até alcançar o ponto isoelétrico
2D-SDS PAGE gel
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Ponto Isoelétrico (pI)
Separação por carga:
4
5
6
7
8
9
10
Gra
die
nte
de p
H
está
vel
Alto pH:
Proteína carregada
-
Baixo pH:ProteínaCarregada+
No ponto isoelétrico, a proteína não tem carga e portanto não migra mais no campo elétrico.
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A segunda dimensão (separação por massa)-pH gel strip e colocado em um gel SDS-SDS desnatura a proteína (movimento somente devido a massa) e elimina carga.
2D-SDS PAGE gel
A primeira dimensão (separação por ponto isoelétrico)- Gel com um gradiente de pH imobilizado- Corrente elétrica leva aproteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico
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2D-SDS PAGE gel
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Exemplo de técnica de 2D-gel
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Vantagens vs Desvantagens Boa resolução
para proteínas Detecção de
modificações pós-transcricionais
Não funciona bem para proteínas altamente hidrofóbicas
Limitado pelo range de pH
Difícil detecção de proteínas pouco abundantes
Análise e quantificação sáo difíceis
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Exemplo de experimento 2-D gel
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Exemplo de experimento 2-D gel
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Exemplo de experimento 2-D gel
Gautam et al, 2007
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Exemplo de experimento 2-D gel
Gautam et al, 2007
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Exemplo de experimento 2-D gel
Gautam et al, 2007
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Exemplo de experimento 2-D gel
Thomas et al, 2005
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O que é Mass Spec? Ferramenta analítica para determinar a composição
molecular de uma amostra ou os pesos moleculares
Somente picomolares de concentrações são requeridas
Acurácia de 0.01%, com somente 5 ppm de pequenas moléculas orgânicas
Para 40 kDa, erro de 4 Da
Pode-se identificar substituições de aminoácidos ou modificações pós-traducionais
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Que tipo de informação é gerada?
Informação estrutural
Tandem mass spectrometers – particularmente, uma sequencia definida
Fragmentação de amostra – análise de produtos
Sequenciamento de peptídeos
Identificação de compostos individuais em misturas complexas
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Como funciona um espectômetro? 3 partes fundamentais: fonte de ionização, o analisador e
o detector
Amostras fáceis de manipular se ionizadas
Separação no analisador de acordo com a razão massa-carga (m/z)
Detecção de íons em separado e abundância relativa
Sinais enviados ao sistema de dados e apresentados em um espectro m/z
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Esquematização
O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para evitar movimento indesejado de íons
A operação está sob completo controle de sistema
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Esquema típico de um TOF-MS
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Introdução da amostra e Ionização
Ionização direta ou via cromatografia para separação de componentes (HPLC, GC, eletroforese capilar)
Ionização pode resultar em íons positivamente
carregados (proteínas) ou negativamente carregados (sacarídeos e oligonucleotídeos)
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Metodologias de Ionização Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) Chemical Ionisation (CI) Electron Impact (EI) Electrospray Ionisation (ESI) Fast Atom Bombardment (FAB) Field Desorption / Field Ionisation (FD/FI) Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
(MALDI) Thermospray Ionisation
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Detecção dos Íons O detector monitora o íon, amplifica seu sinal
e o transmite para o sistema
Detectores comuns: photomultiplier, electron multiplier, micro-channel plate
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Espectometria de massas é uma metodologia poderosa para analisar a estrutura de compostos orgânicos, mas tem algumas limitações:
Nada pode ser caracterizado se não estiver em uma solução DEVIDAMENTE LIMPA
A técnica não tem abilidade de apresentar uma análise seletiva de uma mistura complexa
Para moléculas grandes, resultados são difíceis de interpretar.
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Tandem MS ou MS/MS tem 2 mass spec em série:
O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. Na verdade, MS1 é uma fonte de íons para MS2.
MS2MS1
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Sequenciamento de peptídeos Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados.
Proteínas retiradas de géis 2-D e digeridas
Peptídeos fragmentados nas ligações peptídicas na Tandem mass spectrometry
Alguns peptídeos geram informações para uma sequência completa, enquanto a maioria gera sequencias parciais de 4-5 aa
Geralmente essas “tag” sequences são suficientes para identificação por database
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Identificação de proteínas por MS
Espectro
artificial
Tripsinizado
artificialmente
Database desequências
(ex. SwissProt)
Spot removido do
gel
Fragmentação
com tripsina
Espectro dos
Fragmentos
MATCHLi
bra
ry
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Como funciona o sequenciamento de proteínas Tandem MS: dois analisadores de
massa em série com uma célula de colisão no meio
Célula de colisão: um local aonde os íons colidem com um gás (He, Ne, Ar) resultando em fragmentação do íon
A fragmentação dos petídeos na células de colisão ocorre de maneira predizível, principalmente nas ligações peptídicas
Os íons resultantes tem massas que são consistentes com uma database de pesos moleculares de dipeptídeos, tripeptídeos, tetrapeptídeos...
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp
Célula de colisão
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg
Ser-Glu-Leu
Ser-Glu-Leu-Ile
Etc…
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Bioinformática e Integração de técnicas e conhecimentos
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Exemplo de Experimento com MS
Gautam et al, 2007
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Exemplo de Experimento com MS
Gautam et al, 2007
![Page 41: PROTEÔMICA Ferramentas para identificação de antígenos e imunógenos 10/06/2008.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062623/552fc10c497959413d8c3855/html5/thumbnails/41.jpg)
Vantagens vs. Desvantagens
Determinação de peso molecular e sequencia de aa.
Detecção de modificações pós-transcricionais
Alta confiabilidade
Alto custo Requer sequencia
de peptídeos em databse
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Após a proteômica…..
Genômica funcional
ProteinChipTM.
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Limitações da Proteômica
Limitações experimentais:Análise em larga escala de proteínas pode ser difícil devido a alguns problemas, como:
-Proteínas são frágeis
-Podem existir em múltiplas isoformas
-Não há equivalente para proteína de um PCR para amplificação em larga escala
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Limitações na análise de dados:
-Dados as vezes contêm muito ruído, que podem ser difíceis de separar dos sinais específicos. Pode resultar em gasto de tempo desnecessário analisando espectros não importantes.
-As análises de banco de dados para os espectros de mass spec são somente SCORES, deixando a análise para intervenção manual para eliminação de falsos positivos.
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Limitações biomédicas:
-Na prática é muito difícil de traçar a completa progressão da doença.
-As vezes, usar proteômica para monitorar a bioquímica de uma doença é como usar uma câmera fotográfica para filmar jogo de futebol
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Metodologias de Ionização
1. MALDI beginner:http://www.srsmaldi.com/Maldi/Guide.html
2.MALDI lab user:
http://www.srsmaldi.com/Maldi/Lab.html 3. MALDI tutorial:
http://ms.mc.vanderbilt.edu/tutorials/maldi/maldi-ie_files/frame.htm 4. Ionization Methods 1:http://www.jeol.com/ms/docs/ionize.html
5. Ionization Methods 2:http://www.waters.com/Waters_Website/Applications/lcms/lcms_itq.htm