Proteini - Насловнаbiolozi.bio.bg.ac.rs/attachments/article/1790/3 Proteini.pdf · pH...
Transcript of Proteini - Насловнаbiolozi.bio.bg.ac.rs/attachments/article/1790/3 Proteini.pdf · pH...
Proteini
Molekuli sa hiralnim centrom su optički aktivne supstance - rotiraju ravan polarizovane svetlosti (sve AK sem glicina).
Aminokiseline su amfoterna jedinjenja
U vodenim rastvorima predominantno u jonizovanoj cviterjonskoj formi, zato ih
odlikuje mala rastvorljivost u organskim rastvaračima (hloroform, etar...).
• pH vrednost na kojoj se aminokiseline nalaze u dipolarnoj
formi sa neto naelektrisanjem jednakim nuli se naziva
izoelektrič a tačka pI
Formiranje peptidne veze
Proteini su polimeri ak
• Oko peptidne veze nema rotiranja
Strukturni nivoi organizacije
Vež a . Talože je protei a soli a etala
• FeCl3 i CuSO4 (katjon) metala.
• Bazna sredina proteini negativno
naelektrisani zbog negativno
naelektrisanih karboksilnih grupa.
• Ako nastavimo dodavanje soli dolazi do
adsorpcije pozitivnih jona, protein
postaje naelektrisan i rastvorljiv.
• Pažljivo dodavanje rastvora soli je
neophodno, prestati sa dodavanjem
rastvora či primetite za uće je!!!!
Vež a . Talože je protei a alkaloid i reage si a
• Zasniva se na adsorpciji kompleksnih negativno
naelektrisanih anjona nastalih disocijacijom
alkaloidnih soli.
• Reakcija je efikasna samo u kiseloj sredini kada su
oč e grupe proteina pozitivno naelektrisane.
• Beli talog se dobija u slučaju talože ja
sulfosalicilnom kiselinom.
• Žuti talog se dobija pri talože ju rastvorom limunske
i pikrinske kiseline (Esbach-ov reagens).
Vež a . Ksa toprotei ska reak ija
• Zasniva se na nitrovanju fenolnog
prstena aromatič ih a i okiseli a po oću HNO3
• Nastaje beli talog, koji posle zagrevanja
požuti. • Dodavanjem NaOH rastvor postaje
alkalan i formirana nitro jedinjenja
jo izuju dajući dajući jarko žutu ili ara džastu oju usled jonizacije
fenolne grupe.
• *Obavezno koristiti propipetu pri radu
sa koncentrovanim kiselinama i bazama
!!!!!
Vež a . Test sa erkuri-nitratom
• Zasniva se na
talože ju protei a živo koja reaguje sa tirozinom. Jedinjenje
koje nastaje u reakciji
protei a sa živo postaje crveno posle
tretiranja sa NaNO3
Vež a . Aldehid a reak ija za triptofa
• Zasniva se na kondenzaciji triptofana sa
aldehidima u prisustvu koncentrovane
sumporne kiseline i tragova oksidacione
supstance dajući produkt purpurne (lju ičaste
boje)
Vež a . Cistei ska reak ija
• U reakciji nastaje mrki talog kao posledica
formiranja olovo sulfida PbS po dodatku NaOH
i Pb (CH3COO)2
Vež a . Biuretska reak ija
• Karakteristič a je za jedi je ja sa peptid i veza a, ne daju je slobodne aminokiseline. Daju je jedinjenja
sa najmanje dve peptidne veze.
• Kada se protei i u tretiraju raz laže i rastvoro akar sulfata u alkal oj sredi i for ira se ružičasta
boja.
Vež a . Molish-ova reakcija
• Dokazna reakcija za
glikoproteine, ili
prisustva ugljenih
hidrata u u uzorku
proteina.
Vež a . Kva titativ o određiva je protei a
• Spektrofotometrijska metoda
• Kolorimetrijske metode:
1) Bradford-ova metoda
2) Lowry-eva metoda
Spektrofotometrijska metoda
Lambert-Beer-ov zakon
Lorijeva (Lowry) metoda
• Lorijeva metoda se zasniva na merenju
apsorbancije koja potiče od dva obojena
kompleksa – biuretskog i redukovanog
fosfomolibdenskog-fosfovolframovog
kompleksa.
• Pri prelasku u redukovano stanje menjaju žutu
boju u plavu.
• Intenzitet razvijene plave boje u reakciji se
očitava na 750nm i proporcionalna je
koncentraciji proteina.
Određiva je epoz ate ko e tra ije protei a po oću standardne krive
• Prvi korak je ko struk ija sta dard e krive korišće je Mi rosoft Offi e Ex el progra a a sledeći ači :
U kolonu A unesite koncentracije standardnih
rastvora koje ste koristili 0,
100, 200,300
U kolonu B unesite
odgovarajuće vrednosti apsorbancije. U B1 unosite
vrednost 0, a potom počevši od B2 vrednosti koje ste
izmerili.
* Vrednosti 0 u koloni A i B niste
izmerili, one se unose da bi
stendardna kriva prolazila kroz
koordinatni početak.
Određiva je epoz ate ko e tra ije protei a po oću standardne krive
Potom označite rezultate, izaberite opciju INSERT, zatim SCATTER i prvu opciju iz ovog padajućeg menija. Kada to uradite dobićete grafik .
Izaberite opciju CHART LAYOUT i LAYOUT 9 koji daje jednačinu prave.
Obrišite legende na grafiku sa desne strane i imenujete grafik sa: Standardna kriva
za određivanje koncentracije proteina, i ose X : Koncentracija proteina (μg/ml), a
Y osu sa: Apsorbancija na 750nm (ovo se radi klikom na CHART TITLE i AXIS TITLE)
y = 0,002x - 0,014
R² = 0,994
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0 50 100 150 200 250 300 350
Ap
sorb
an
cija
na
75
0n
m
Koncentracija proteina (μg/ml)
Sta dard a kriva za određiva je ko e tra ije proteina
Dobijeni grafik odštampajte i zalepite u praktikum na strani predviđenoj za
overu. Na grafiku postoji jednačina prave oblika y=ax+b, da bi odredili
nepoznatu koncentraciju proteina, u jednačinu morate uvrstiti za y vrednost
apsorbancije koju ste izmerili u uzorku nepoznate koncentracije (?) Dakle
vrednost koju dobijete za x je nepoznata koncentracija proteina.
Račun prikazati ispod grafika koji ste zalepili u praktikumu na strani za overu.