Biotecnología de Proteínas Recombinantes para la Aplicación en ...
Proteínas Recombinantes
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Proteínas RecombinantesHistórico e vantagens
Origem• 1944 - Oswald Avery: transmissão de informações pelo DNA.
• 1961- François Jacob e Jacques Monod: síntese proteica apartir
do DNA.
• 1972- Paul Berg: Ligação de cadeias genéticas de animais
organismos diferentes.
• 1978- Werner Arber, Daniel Nathans e Hamilton Smith:
Enzimas de restrição (Nobel)
Sistemas de Expressão
Sistemas de Expressão
Desvantagem: Produz muitas proteases!!
Sistemas de Expressão
Sistemas de Expressão
Sistemas de Expressão
Impacto das P.Rs no desenvolvimento de vacinas
17 vacinas em 137 anos.
31 vacinas em 40 anos
Objetivo:• Estabelecer uma abordagem eficiente frente a
proteínas de difícil expressão utilizando E.coli.
• Para estabelecer uma estratégia 71 proteínas foram escolhidas e cada uma expressa em 15 formas diferentes: (cepa x temperatura x plasmídeos x estresse)
Cepas de E.coli • BL21-Gold: deficiente em EndA1 nuclease
• BL21-Codon plus: obtida da BL21 Gold, apresenta mais copias de genes que codificam tRNAs.
• BL21-V2R1: Derivadas de cepas BL21 deficientes em lon (deficiente em proteases
dependentes de ATP) de e omT (deficiente em proteases de membrana).
• BL21-V2R1 pRARE2: introdução do plasmídeo pRARE2 que fornece tRNAs.
• BL21-Rosetta: códons raros, deficiente em protease e resistente a cloranfenicol.
• ArcticExpress: contém chaperonas que auxiliam no folding e possibilitam o funcionamento metabólico de 4° a 12°C.
• JM109: mutações em EndA1 e RecA1, indicado para clonagem de plasmídeos.
• W3110: mutação no gene gatA que responsável pela metabolização do C.
Plasmídeos
6 His-tags introduzidas em C-terminal ou N-terminal.
Purificação
• Os lisados e sobrenadantes são incubados com beads NI-NTA.
• A avaliação da expressão é feita por SDS-PAGE.