1/18/2010

1

PROTEINI

Prof dr Ivan Stanković

PROTEINI� proteos - prvi, najvažniji� prisutni u svim živim organizmima od virusa do biljaka i

životinja� ulaze u sastav svake ćelije: protoplazama, jedro

(nukleoproteini) uloga u organizmu:� gradivna (primarna funkcija)� kontraktilna (miogen)� katalitička (enzimi)� regulatorna (hormoni)� transportna (hemoglobin)� imunološka (antitela)� energetska (17.2 kJ/g)

1/18/2010

2

elementarni sasatav:

� C, O, H, N, S, (P)

hemijska definicija:

� Proteini su makromolekulska jedinjenja izgrađena odpolipeptidnih lanaca koji se sastoje iz αααα-L-aminokiselinapovezanih peptidnom vezom.

� Proteini omogućavaju rast i regeneraciju organizma, kao i pravilan tok metaboličkih procesa.

� Ljudski organizam može da izgrađuje sopstvene proteine iz proteina hrane, odnosno aminokiselina.

Telesni sastav muškarca (25 god., 70kg) i žene (25 god., 58kg)

pol muškarac žena

telesni sastav kg % kg %

proteini 11.90 17.0 4.93 8.5

masti 9.45 13.5 12.76 22.0

ugljeni hidrati 1.05 1.5 0.87 1.5

voda 43.4 62.0 35.96 62

mineralne mat. 4.20 6.0 3.48 6.0

ukupno 70.0 100 58 100

1/18/2010

3

Distribucija proteina u organizmu (% ukupnih telesnih proteona)

tkivo %

krv 10

masno tkivo 3-4

koža 9-9.5

kosti 18-19

mišići 46-47

Preporučen dnevni unos (RDA) proteina za različite starosne grupe i posebna stanja

starost (godine)ili stanje

RDA(g proteina/dan)

0.0-0.5 telesna masa (kg) x 2.2

0.5-1 telesna masa (kg) x 2.0

1-3 23

4-6 30

7-10 34

11-14, muškarci 45

15-51+, muškarci (70kg) 56

11-18, žene 46

19-51+, žene (55 kg) 44

graviditet +30

laktacija +20

1/18/2010

4

individualni faktori:

1. veličina tela

� višlje i krupnije osobe imaju veće potrebe2. starost

� za vreme rasta potrebe su 2-3 puta veće po jedinici telesne mase3. pol

� muškarci imaju veće potrebe po jedinici mase jer imaju razvijeniju muskulaturu

4. nutricioni status

� pothranjene osobe i osobe na dijeti sa niskim sadržajem ugljenih hidrata imaju veće potebe

5. Graviditet i laktacija

� veće potrebe za razvoj fetusa i sintezu proteina mleka6. klima

� pri niskim temperaturama nije potreban povećan unos proteina ukoliko se energija obezbeđuje iz ugljenih hidrata.

� pri visokim temperaturama potrebno je malo povećati unos proteina zbog povećanog gubitka azota tanspiracijom

7. fizička aktivnost

� osobe koje treniraju ili se oporavlju posle mirovanja imaju veće potrebe

8. dijetarne komponente ishrane

� osobe koje unose proteine niske biološke vrednosti moraju da ih unose u većoj količini

� važan je i odnos ugljenih hidrata i proteina u hrani jer ugljeni hidrati “štede” proteine

9. emocionalna stabilnost

� pokazano je da stresna stanja dovode do izlučivanja veće količine azota i promena u hormonskom profilu

10. bolesti

� uglavnom povećavaju potrebu za proteinima zbog regeneracije tkiva, povećanog bazalnog metabolizma kod hipertermije, povećane siteze antitela, perspiracije

1/18/2010

5

Sadržaj proteina u namirnicama

namirnica sadržaj (%)

meso 18-20

ribe 18-20

jaja 12.5

mleko 3.5

žitarice 10-12

suve leguminoze 25-37

sveže povrće 1-3

sveže voće oko 1

masno voće (lešnik, orah, badem i dr.) 15-50

KLASIFIKACIJA PROTEINA (po Osborn-u):A. Prosti proteini (homoproteini) sastoje se isključivo od

aminokiselina:

1. albumini

� rastvorljivi u vodi i razblaženim rastvorima soli � talože se u zasićenom rastvoru amonijumsulfata� koagulišu na toploti� siromašni su u glikokolu� rasprostranjeni su u biljnom i životinjskom svetu.

2. globulini

� nerastvorljivi u vodi, rastvorljivi u razblaženim rastvorima soli� koagulišu na toploti� talože se dodatkom zasićenog rastvora amonijumsulfata

(poluzasićenje), kao i uklanjanjem soli iz rastvora (dijaliza)� nalaze se u krvi, belancu jajeta, mleku i dr.

1/18/2010

6

3. prolamini

� rastvorljivi u 70-80% etanolu, nerastvorljivi u vodi, razblaženimrastvorima soli, neutralnim rastvaračima i apsolutnom etanolu.

� imaju visok sadržaj glutaminske kiseline i prolina, a siromašni su ulizinu - spadaju u delimično nepotpune proteine

� nalaze se u zrnu žitarica gde sa glutelinima čine gluten koji savodom gradi lepak koji omogućava tehnološku obradu testa ipecivost: glijadin (pšenica), sekalin (raž), hordein (ječam), avenin(ovas), zein (kukuruz) i rizin (pirinač)

4. glutelini

� nerastvorljivi u vodi i razblaženim rastvorima soli, rastvorljivi urazblaženim rastvorima kiselina i alkalija

� nalaze se u žitaricama: glutenin (pšenica). Sa prolaminima čineglutensku proteinsku frakciju koja sa vodom gradi lepak

5. globini� prosti proteini koji se jedine sa pigmentima (hem) i daju

hromoproteine (hemoglobin, mioglobin i dr.)� sadrže histidin u većoj količini� pH oko 7

6. skleroproteini (albuminoidi)� nerastvorljivi, životinjskog porekla� po fizičkim i hemijskim osobinama dele se u tri grupe:

a) keratini� rastvorni u koncentrovanim rastvorima kiselina i baza uz zagrevanje,

ali i uz razlaganje i u sulfidima alkalnih i zemnoalkalnih metala.� svi čvrsti keratini imaju aminokiseline histidin, lizin i arginin u

odnosu: 1:4:12� glavni sastojci egzoskeletnih struktura: koža, kosa, nokti, rogovi,

perje

1/18/2010

7

b) kolageni

� imaju oblik dugačkih, delimično kristalnih vlakana� sastojci vezivnog tkiva, kostiju, žila, hrskavice� kuvanjem se rastvaraju, pri čemu se hidrolizom oslobađa jedan deo

aminokiselina i nastaje želatin koji hlađenjem rastvora prelazi u gelkoji se lako vari i dobro iskorišćava

� želatin spada u nepotpune proteine� Karakteristične aminokiseline: hidroksiprolin i hidroksilizin

c) elastini

� razlikuju se od kolagena po tome što kuvanjem ne daju želatin� sastojci žutih elastičnih vlakana vezivnog tkiva

7. histoni

� rastvorljivi u vodi, razblaženim kiselinama i alkalijama, a nerastvorniu razblaženom rastvoru amonijumhidroksida

� toplota ih ne koaguliše� bogati su u argininu� alkalni proteini, obično se nalaze u obliku soli sa kiselim jedinjenjima

(npr. nukleinskim kiselinama)� ima ih u ikri riba

8. protamini

� slično se rastvaraju kao histoni s tim što se rastvaraju i u amonijumhidroksidu

� male molekulske mase (peptidi)� toplota ih ne koaguliše� bogati su u argininu� alkalni proteini, obično se nalaze u obliku soli (nukleoproteini)� talože druge proteine iz rastvora� ima ih u ikri riba: salmin (ikra lososa)

1/18/2010

8

B. Složeni proteini (heteroproteini) sastoje se, pored aminokiselina i izneproteinskog dela (prostetične grupe):

1. fosfoproteini

� sadrže fosfornu kiselinu najčešće vezanu za aminokiselinu serin

� kazein (mleko), vitelin, vitelenin i fosfitin (žumance jajeta)� kazein se u mleku nalazi kao so Ca-kazeinat. Taloži se

zakišeljavanjem mleka do njegove izoelektrične tačke (pH 4.6)

P

HO

HO

O

O

CH2CH COOH

NH2

fosfoserin

Ca-kazeinat + 2H+ kazein + Ca2+

� Dejstvom enzima renina iz sirila (ekstrakt sluzokože goveđegželudca) na mleko taloži se Ca-parakazeinat, proizvod degradacijeCa-kazeinata:

2. glikoproteini

� satoje se iz proteina i heksoza ili heksozamina� teško hidrolizuju� mukoidi (ovomukoid belanceta) i mukoproteini (hondro-mukoprotein

hrskavice)

3. lipoproteini

� kompleksi proteina sa lipidima� značajni za transport lipida� lipovitelin, lipovitelenin

Ca-kazeinat Ca-parakazeinat + peptidrenin

1/18/2010

9

4. nukleoproteini

� sastoje se iz alkalnih proteina protamina i histona i RNA i DNA� nalaze se u ikri riba, kvascu, klici žitarica

5. hromoproteini

� sastoje se iz prostih proteina npr. globina i neke obojene supstance (prostetična grupa)

� hemoglobin, mioglobin, citohromi, flavoproteini, hlorofil, rodopsin, karotenoproteini

Proteinski sastav nekih namirnica

namirnica proteini Vrsta % u namirnici

meso miogenmioalbumin

miozinaktin

mioglobinostali

albuminalbuminglobulinglobulin

hromoprotein....

ukupno

2.01.2

10.44.20.22.0

20.0

mleko kazeinlaktoalbuminlaktoglobulin

fosfoproteinalbuminglobulinukupno

2.70.20.43.3

jaje ovoalbuminlizozim

ovoglobulinovomukoid

vitelinfosfitinostali

albuminglobulinglobulin

glikoproteinfosfoproteinfosfoproteinlipoproteini

ukupno

6.10.40.40.55.10.40.5

13.4

1/18/2010

10

namirnica proteini vrsta % u namirnici

pasulj fazeolinfazelinostali

globulinglobulin

....ukupno

20.52.01.0

23.5

grašak legumilinleguminvicilin

proteozeostali

albuminglobulinglobulinproteoze

....ukupno

2.010.010.01.01.5

24.5

pšenično brašno glijadingluteninglobulinleukozinproteoze

ostali

prolaminglutelinglobulinalbuminproteoze

....ukupno

3.94.20.60.40.41.1

10.6

kukuruzno brašno zeinzeaninmajsinglobulinproteoze

ostali

prolaminglutelinalbuminglobulinproteoze

.....ukupno

3.03.20.50.60.42.39.0

Podela proteina prema obliku molekule:

1. globularni

� odnos dužina-širina molekule manji od 10

� kompaktno izuvijani polopeptidni lanci

� insulin, albumini, globulini, enzimi

2. fibrilarni

� odnos dužina-širina molekule veći od 10

� dugački polipeptidni lanci uvrnuti u spiralu poprečnopovezani disulfidnim ili vodoničnim vezama

� keratin, kolagen, miozin

1/18/2010

11

AMINOKISELINE� aminokiseline su jedinjenja koja sadrže najmanje jednu amino i

jednu karboksilnu grupu (prolin i hidroksiprolin sadrže imino grupukoja takođe gradi peptidnu vezu)

� sve aminokiseline koje ulaze u satav proteina su αααα-amino-kiseline imogu da se prikažu formulom:

� sve aminokiseline biljnih i životinjskih proteina su L-konfiguracije� kapsule nekih bakterija izgrađene su od D-aminokiselina, pa pošto

digestivni sokovi ne mogu da ih hidrolizuju, one prolaze prekodigestivnog trakta u organizam.

� zbog hiralnog C atoma aminokiseline su optički aktivne i mogu dabudu dekstrogirne (+) ili levogirne (-)

R CH COOH

NH2

αααα-L-AMINOKISELINE PROTEINA

1. a l ifa t i~ne monoamino-monok arbosk e k ise l ine :

gl ikokol i l i gl ic in, G ly αααα -a minos ir} e tna k is e l ina

a la nin, Alaαααα -a minopropionsk a k ise l ina

va l in, V a lαααα -a minoiz ov a le ri ja nsk a k ise l ina

le uc in, Le uαααα -a minoiz ok apronsk a k is e l ina

iz ole uc in, I leαααα -a mino- ββββ -me t il - ββββ -e t ilpropions ka k is e l ina

se rin, S e rαααα -a mino- ββββ -hidrok s ipropions ka k is e l ina

t reonin, T hrαααα -a mino- ββββ -hidrok s ibute rna k ise l ina

CH2

COOH

NH2

CH COOH

NH2

CH3

CH COOH

NH2

CH

CH3

CH3

CH COOH

NH2

CH2

CH

CH3

CH3

CH COOH

NH2

CH2CH

CH3

C2H5

CH COOH

NH2

CH2

OH

CH COOH

NH2

CH

OH

CH3

1/18/2010

12

2. monoamino-dika rbons ke k ise l ine:

as para gins ka k ise l ina , As p αααα - amino} i l ibarna k ise l ina

as para gin, As namid a s pa ra gins ke k ise l ine

gluta minsk a k is e l ina , G luαααα - aminogluta rna k ise l ina

gluta min, G lnamid glutamins k e k is e l ine

3. dia mino-monoka rbons ke k ise l ine

l iz in, Ly sαααα ,,,, εεεε -dia minoka prons ka k ise l ina

arginin, Argαααα - amino- δδδδ -gv anidinov ale ri jans ka k is e l ina

his t idin, H isαααα - amino- ββββ - imidaz ol i lpropionsk a k is e l ina

CH COOH

NH2

CH2

CH2

HOOC

CH COOH

NH2

CH2

CH2

CH2

CH2

NH2

CH COOH

NH2

CH2

CH2

CH2

NH

C NH

NH2

CH COOH

NH2

CH2

HN N

CH COOH

NH2

CH2HOOC

CH COOH

NH2

CH2

H2NOC

CH COOH

NH2

CH2

CH2

H2NOC

4 . a minok is e l ine s a sumporom:

c is te in, Cy s αααα -a mino- ββββ - t iopropionska k ise l ina

c is t indi- ( αααα - amino- ββββ - t iopropionska k ise l ina )

met ionin, M e tαααα -a mino- γγγγ -me t i l t iobute rna k is e l ina

5 . a roma t i~ne a minok is e l ine

f e ni la la nin, P heαααα -a mino- ββββ - f eni lpropionska k ise l ina

t iroz in, T yrαααα -a mino- ββββ -p-hidroks i fe ni lpropions ka k ise l ina

6 . he teroc ik l i~ne aminok ise l ine

t riptofan, T rpαααα -a mino- ββββ - indol i lpropions kak ise l ina

prol in, P ropirol idin-2 -karbonsk a k ise l ina

hidrok s iprol in, Hpr4 -hidrok s ipirol idin-2 -k arbonska k ise l ina

CH COOH

NH2

CH2

CH

S CH3

CH COOH

NH2

CH2

SH

CH COOH

NH2

CH2

SS

CH2

CHHOOC

NH

CH2

CH COOH

NH2

NHCOOH

NHCOOH

HO

CH2

NH2

COOHCH

CH2

NH2

COOHCH

OH

1/18/2010

13

� Osobine aminokiselina ne zavise samo od NH2 i COOH grupe već i od R koji može da bude:

- H (glicin)

- alifatični ugljovodonični niz (alanin, valin, leucin, izoleucin)

- alkohol (serin, treonin)

- tiol (cistein)

- tioetar (metionin)

- fenol (tirozin)

- heterociklus (histidin, triptofan)

- organska kiselina (asparaginska kiselina, gltaminska kiselina)

- amid organske kiseline (asparagin, glutamin)

- alifatični amin (lizin)

- derivat gvanidina (arginin)

- umesto slobodne amino grupe mogu da imaju imino grupu u sastavupirolidinskog prstena: prolin, hidroksiprolin

� Aminokiselina treonin ima dva C* atoma, pa ima četiri stereoizomera:

� Prema mogućnosti sinteze u organizmu aminokiseline se dele na:

1. esencijalne - u organizmu ne mogu da se sintetišu i moraju da se unose hranom

2. poluesencijalne - pod određenim uslovima mogu da zameneesencijalne aminokiseline, neophodne su u dečijem uzrastu

3. neesencijalne - organizam ih sintetiše

CH3

COOH

NH2

OHH

H

CH3

COOH

H

HOH

NH2

CH3

COOH

NH2

HOH

H

CH3

COOH

NH2

HOH

H

L-treonin D-treonin L-alotreonin D-alotreonin

(enantiomeri) (enantiomeri)

1/18/2010

14

esencijalne aminokiseline

poluesencijalne aminokiseline

neesencijalne aminokiseline

metionin arginin alanin

valin histidin asparagin

fenilalanin asparaginska kiselina

treonin cistein

triptofan cistin

izoleucin glutamin

leucin glutaminska kiselina

lizin glicin

prolin

serin

tirozin

FIZIČKE OSOBINE AMINOKISELINA

� jedinjenja male molekulske mase 75-240

� imaju visoku tačku topljenja iznad 200oC, a neke i iznad300oC, pri čemu se zagrevanjem na visokimtemperaturama često i raspadaju

� rastvorljivost u vodi je različita i zavisi od njihoveizoelektrične tačke i polarnosti radikala

� optički aktivne (+) i (-) zbog hiralnog C atoma

� većina aminokiselina je slatkog ukusa, leucin je bezukusa, a arginin i izoleucin su gorki. Glutaminska kiselinai njene soli su prijatnog ukusa i koriste se kao pojačivačiaroma.

1/18/2010

15

HEMIJSKE OSOBINE AMINOKISELINA

I Amfoternost aminokiselina

� kisela (karboksilna) i bazna (amino) grupa u molekuli aminokiselina odgovorne su za njihovo ponašanje kao organskih kiselina i baza

� prema Bronsted-u kiselina je svako jedinjenje koje može da posluži kao donor, a baza je svako jedinjenje koje može da bude akceptor protona.

� aminokiseline sadrže kiselu karboksilnu grupu koja može da otpušta proton i baznu amino grupu koja može da ga primi.

� otpuštanjem protona anjonski oblik aminokiseline stičeodlike baze jer može da primi natrag proton, a isto tako,primanjem protona u amino grupu katjonski oblikaminokiseline stiče odlike kiseline jer taj proton može daotpusti.

H2N-CHR-COOH → H2N-CHR-COO- + H+

kiselina

H2N-CHR-COO- + H+ → H2N-CHR-COOH baza

H2N-CHR-COOH + H+ → +H3N-CHR-COOH baza

+H3N-CHR-COOH → H2N-CHR-COOH + H+

kiselina

1/18/2010

16

� U kristalnom stanju monoamino monokarbonske kiselineimaju oblik dvopolnog, hibridnog jona - zwitter jon

+H3N-CHR-COOH +H3N-CHR-COO- H2N-CHR-COO-

H2N-CHR-COOH(pH < pI) (pH = pI) (pH > pI)

� zwitter jon je oblik koji sadrži isti broj pozitivnog inegativnog naelektrisanja, a dipolnost molekule jeizražena samo unutrašnjim premeštanjem protona

� zwitter jon se ne kreće u električnom polju i taloži se izrastvora. Ima odlike slabe kiseline zbog jače kiselostikarboksilne grupe (Ka = 1.6x10-9)

� nejonizovani oblik se nalazi samo u tragovima, dokjonizacija zavisi od pH rastvora.

� dodatkom kiseline u vodeni rastvor aminokiseline suzbijase disocijacija NH3

+ grupe zwitter jona i pomera seravnoteža u smeru stvaranja katjonskog oblikaaminokiseline:

+H3N-CHR-COO- + HCl → +H3N-CHR-COOH + Cl-

� dodatkom baze oslobađa se H+ jon iz NH3+ grupe i

ravnoteža se pomera u pravcu nastajanja anjonskogoblika aminokiseline:

+H3N-CHR-COO- + NaOH → H2N-CHR-COO- + Na+ + H2O

1/18/2010

17

� ako se aminokiseline rastvore u čistoj vodi vrednosti zaizoelektrični i izojonski pH će se podudarati. Međutim,pošto su aminokiseline slabo rastvorljive naizoelektričnom pH, moraju da se rastvaraju u prisustvurazličitih pufera (soli), gde će usled reakcije sa jonima izpufera da nastane razlika između izojonskog iizoelektričnog pH.

� kod peptida i proteina koji sadrže slobodne amino ikarboksilne grupe (iz bočnih nizova i terminalnihaminokiselina) uticaj prisustva soli na razliku izmeđuizojonskog i izoelektričnog pH je daleko izraženiji npr. u0.15 M NaCl izojonska tačka goveđeg albumina je na pH5,37, a izoelektrična tačka je na pH 4,40

� Zbog toga postoje teoretske i eksperimentalne definicijeizojonske i izoelektrične vrednosti pH:

a) teoretske (neoperativne):� izojonski pH je ona vrednost pH pri kojoj je broj protona

koje supstanca (aminokiselina, peptid ili preotein) otpusti uvodeni rastvor jednaka broju protona koje iz rastvoraprima

� izoelektrični pH je ona vrednost pH pri kojoj je ukupanelektrični naboj supstance jednak nuli

b) eksperimentalne (operativne):� izojonska tačka je vrednost pH koju daje rastvor čiste

supstance u čistoj vodi

� izoelektrična tačka je vrednost pH pufera definisanogsasatava pri kojoj supstanca ne migrira u električnom polju

1/18/2010

18

� izoelektrični pH aminokiselina:� neutralne: 4.8-6.3 � kisele: 2.7-3.2� bazne: 7.8-10.8

� poznavanje vrednosti izoelektričnog pH proteina jeznačajno za njihovo odvajanje taloženjem ielektroforetskim tehnikama.

II Reakcije amino grupe

1. građenje soli� bazni karakter amino grupe omogućava građenje soli sa

drugim kiselinama: pikrati lizina i hidroksilizina, flavinatilizina, histidina i arginina i.t.d.

2. alkilovanje� dobijaju se N-mono, -di i -tri alkil (metil, etil) derivati. � eksperimentalno se ove reakcije teško kontrolišu zbog

mogućnosti supstitucije alkil radikalima i vodonikovihatoma van amino grupa

1/18/2010

19

3. arilovanje

� dinitro fenil derivati (DNP) aminokiselina se koriste zaidentifikaciju N-terminalnih aminokiselina peptida u tokuodređivanja sekvence aminokiselina proteina

F

NO2

NO2

+ COOH

CH

R

H2N

NO2

NO2

NH

CHCOOH

R

-HF

� N-aril sulfonil derivati se često koriste za identifikaciju N-terminalnih aminokiselina. Hidrolizom peptidnih veza izdvajaju se aminokiseline od kojih je samo N-terminalna supstituisana

J

SO2Cl

+ CO NH

CH

R

H2N

CH

CO

R'

J

SO2

NH

CH

R

CO NH

CH

R'

CO

-HCl

1/18/2010

20

4. dezaminacija

� dejstvom HNO2 u prisustvu NaNO3 nastaju hidroksiaminokiseline uz oslobađanje azota.

R CH COOH

NH2

+ HONO + N2 + H2ONaNO3 R CH COOH

OH

� reakcija je kvantitativna i predstavlja osnovu Van Slyke-ove metode određivanja azota αααα-amino grupaaminokiselina, peptida i proteina

� oksidativnom dezaminacijom pod dejstvom oksidacionihsredstava kao što su KMnO4, H2O2 ili u tkivimakatalitičkim dejstvom enzima dehidrogenaza nastajuprvo αααα-iminokiseline, a zatim αααα-ketokiseline uzoslobađanje amonijaka

R CH COOH

NH2

R C COOH

NHdehidrogenaza -NH3

R C COOH

O

III reakcije karboksilne grupe

1. Sorensen-ova formol titracija� Aminokiseline ne mogu da se u vodenom rastvoru

direktno titriraju bazom jer zwitter jon sporo reaguje, adodata baza trenutno utiče na promenu boje indikatora.Formaldehid dodat rastvoru aminokiselina u velikomvišku vezuje se za aminogrupu i sprečava vezivanjeprotona iz karboksilne grupe. Tada aminokiselina možeda se titrira bazom uz indikator na uobičajen način.

CH COO-+H3N

R

+ 2HCHO CH COOHN

RHOH

2C

HOH2C

• ova reakcija se primenjuje za određivanje proteina u mleku

1/18/2010

21

2. estri aminokiselina

� dejstvom alkohola na aminokiseline u prisustvu HCl,nastaju estri hidrohlorida amino kiselina iz kojih dejstvomrazblaženih alkalija, nastaju estri aminokiselina:

H2N CH COOH

R

+ HO R' HCl NaOH

ClH3N CH COOR'

R

-H2O -NaCl

-H2O

H2N CH COOR'

R

� estri aminokiselina se koriste za sintezu dipeptida prekodiketo-piperazina.

� Hidrolizom jedne peptidne veze diketopiperazinapomoću HCl nastaje smesa dva izomerna peptida:

H2N CH COOC

2H5

CH3

H2N CH COOC

2H5

CH2OH

HOH

CH CONH

CH3

CH

CH2OH

CONH

H2N CH CONH

CH3

CH2OH

COOHCH H2N CH CONH

CH2OH

CH

CH3

COOH

diketopiperazin

alanilserin serilalanin

1/18/2010

22

3. hloridi aminokiselina

� dobijaju se dejstvom fosfopentahlorida na aminokiselinučija je amino grupa prethodno zaštićena (acetil ilikarbobenzoksi grupom):

CHCH3CONH COOH

R

+ PCl5 CHCH3CONH

R

COCl + POCl3 + HCl

CHCH3CONH

R

COCl + HCl CHClN3H

R

COCl

hlorid hidrohlorida

aminokiseline

� ako se za zaštitu aminogrupe upotrebikarbobenzoksihlorid pri hloriranju sa fosfopentahloridomdobiće se karbobenzoksihlorid aminokiseline koji sekoristi za sintezu polipeptida.

4. dekarboksilacija aminokiselina

� dekarboksilacijom aminokiselina, pri zagrevanjuu prisustvu barijumhidroksida, ili u tkivima uprisustvu enzima karboksilaze aminokiselina,nastaju amini sa jednim C atomom manje:

HN N

CH2-CH(NH2)-COOH -CO2

N N

CH2-CH2-NH2

histidin histamin

H

1/18/2010

23

5. stvaranje helata

� joni metala: Cd2+, Cu2+, Mn2+, Fe2+, Co2+ i dr. saaminokiselinama obrazuju koordinativne komplekse -helate.

� pored karboksilne grupe u stvaranju helata učestvuju idruge grupe (NH2, SH).

� glikokol sa Cu2+ jonom gradi kompleksno jedinjenje kodkoga je Cu2+ jon vezan za karboksilne grupe kovalentnim,a za amino grupe koordinativnim vezama:

CH2

H2N C

O

OH

CH2

H2N C

O

OH

CH2

H2N C

O

O

Cu

O

OCH

2N

CH2

Cu2+

IV reakcije funkcionalnih grupa sa sumporom

� funkcionalne grupe sa sumporom sadrže :� cistein - tiolska (sulfhidrilna) grupa (-SH)� cistin - disulfidna grupa (-S-S-)� metionin - metilovana tiolska grupa (-S-CH3)

1. oksidacija tiola do disulfida

4R-SH → 2R-S-S-R + 2H2O O2

1/18/2010

24

2. formiranje tioestara

3. reakcije disulfida sa tiolima

R-S-S-R + 2R’-SH → 2R-SH + R’-S-S-R’

R C

O

OH + R' SH R C

S

R'

OH

OH R C

O

S R' + H2O

4. reakcije izmene disulfida

R-S-S-R + R’-S-S-R’ → R-S-S-R’ + R’-S-S-R

5. formiranje kompleksa sa metalnim jonima

� Co2+, Cu2+, Mn2+, Cd2+ i dr.

6. reakcije sa sulfitima

� raskidanje disulfidne veze

R-S-S-R + SO32- → R-S- + R-S-SO3

� većina proteina optimalno učestvuje u ovim reakcijama tek posle denaturacije, što se objašnjava na dva načina:

1. aktivne grupe su skrivene usled konformacije nativne molekule

2. aktivne grupe učestvuju u formiranju labilnih hemijskih veza koje se raskidaju denaturacijom

1/18/2010

25

V bojene reakcije

aminokiselina reagensi trivijalni naziv

glicin o-ftalaldehid

arginin α-naftol, hipobromit Sakaguci-jeva reakcija

metionin jodoplatinat

histidin diazosulfanilna kiselina Pauli-jev test

histidin bromfenol plavo, merkuri-hlorid

triptofan p-dimetilaminobenzaldehid Ehrlich-ova reakcija

tirozin Hg soli, azotna kiselina Millon-ova reakcija

tirozin α-nitrozo-β-naftol

prolin izatin

hidroksi kiseline perjodna kis., Nessler-ov reag.

cisteop nitroprusid

sve a.k. ninhidrin

peptidna veza bakar-sulfat, hidroksid biuretska reakcija

Ninhidrinska reakcija� Ninhidrin se redukuje do hidrindantina, aminokiselina preko imino I

keto kiseline dekarboksilacijom prelazi u odgovarajući aldehid.Oslobiđeni amonijak, hindrindantin i višak ninhidrina formiraju plavokondenzaciono jedinjenje

1/18/2010

26

PEPTIDI� Peptidna veza nastaje kondenzacijom karboksilne grupe

jedne i amino grupe druge aminokiseline.

� Karbonilna (C=O) i imino (N-H) grupa leže u istoj ravni jer peptidna veza ima delimično karakter dvogube veze čime je praktično onemogućena rotacija

� Kod većine aminokiselina kondenzacija je linearna� Izuzetak je prolin

1/18/2010

27

� Sinteza peptida nije jednostavna i vrši se prevođenjemkarboksilne grupe u njen hlorid, pri čemu je potrebnopredhodno zaštititi amino grupu npr. acetil grupom ilikarbobenzoksihloridom

� peptіdі dobіjaju oѕnovno іme prema C termіnalnoj amіnokіѕelіnі, aoѕtale amіnokіѕelіne ѕe оznačаvајu kао radіkalі роčеv od Ntermіnalne amіnokіѕelіne npr. trіpeptіd glutatіon je glutamіl-cіѕteіnіl-glіcіn

� рерtidnі nіz моžе da bude гаzlіčіtоg oblіka:1. linеаran2. rаčvаѕt zbog prіѕuѕtva dіamіnomonokarbonѕkіh i monoamіnodіkarbonѕkіh

kіѕelіna3. ѕеmісіklіčаn uѕled ѕtvaranja іntramolekulѕkіh vоdоničnіh veza

4. cikličan usled stvaranja intramolekulskih peptidnih veza

1/18/2010

28

� molekule proteіna ѕaѕtoje ѕe іz jednog іlі vіšе polіpeptіdnіh lаnаса, abroj amіnokіѕeiіnѕkіh ostataka kгеćе ѕe і do nekoiіko deѕetіnahіljada.

� ѕtruktura proteіna моžе da ѕe izučаvа nа čеtігі nіvoa:

1.рrіmаrnа ѕtruktura

� redoѕled (ѕekvenca) amіnokіѕelіnѕkіh oѕtataka u molekulі proteіna

� određіvanje prіmarne ѕtrukture je dugotrajna і ѕloženа procedura

� prvo ѕe vršі raѕkіdanje (hіdrolizа) dіѕuіfіdnіh veza permravіjomkіѕelіnom іlі merkaptoetanolom prі čеmu ѕe odvajaju polіpeptіdnіlancі

� prіmarna ѕtruktura ѕe zatіm određuje hemіjѕkіm і enzіmatѕkіmmetodama koje ѕe zaѕnіvaju na poѕtepanoj hіdrolіzі proteіna ііdentіfіkovanju oѕlobodenіh amіnokіѕelіna.

ЅTRUKTURA PROTEІNA

N termіnalna analіza

a) Ѕangerov poѕtupak (dіnіtrofenіl poѕtupak)

� DNP derivat aminokiseline je žuto obojen i može da se ekstrahuje etrom i identifikuje hromatografski

1/18/2010

29

b) Edman-ova degradacija

� Feniltiohidantoinski derivati aminokiselina se ekstrahuju etilacetatom i određuju hromatografski

C terminalna analiza

a) Enzimska metoda� Enzim karboksipeptidaza katalizuje hidrolizu peptidne

veze kojom je vezana C terminalna aminokiselina

Sekvencioniranje DNK� Sekvencioniranje DNK gena koji kodira ispitivani protein

� Zbog analitičkih problema najbolje je koristiti više tehnika

1/18/2010

30

� Prvi protein čija je primarna struktura bila potpunorasvetljena je hormon insulin� 2 lanca povezana sa 2 -S-S- mosta� lanac A: 21 a.k.,1 -S-S- most, kiseo (2 Glu)� lanac B: 30 a.k., bazan (1 Lys, 1 Arg, 2 His, 2 Glu

Redosled aminokiselina u goveđem insulinu

1/18/2010

31

2. Sekundarna struktura

� prostorni raspored aminokiselina koje su u primarnoj strukturi blizujedna drugoj i periodično ponavljanje strukture.

� ispituje se fizičkim metodama (difrakcija x zraka i dr.)� peptidna veza je uvek u ravni zbog delimičnog karaktera dvogube

veze� teoretski period identičnosti je 7,27 Å, ali svaka peptidna veza može

da nagradi 2 vodonične veze sa drugim polipeptidnim lancem iliunutar samog lanca, pa se period identičnosti skraćuje

1/18/2010

32

� Postoje tri tipa sekundarme strukture: β-plisirani list, α-spirala i slobodni niz

1. β-plisirani list

� Strukturu čine dva lanca povezana vodoničnim vezama� Lanci mogu da budu paralelni i anti-paralelni

� peptidne grupe se nalaze u istoj ravni� α-C atomi pripadaju susednim ravnima koje zaklapaju

određeni ugao� radikali zauzimaju vertikalni položaj� ovu strukturu imaju neki skleroproteini npr. β−keratin

1/18/2010

33

2. α-spirala

� vodonične veze koje se obrazuju unutar lanca dovode donjegovog savijanja u konformaciju spirale

� svaki zavoj spirale se satoji iz 3,7 ostataka aminokiselina� period identičnosti je oko 5,4 Å� peptidne veze su u jednoj ravni, a CO i NH grupe koje

stoje jedna iznad druge obrazuju vodonične veze kojestabilizuju molekulu

� Period identičnisti keratina kose i perja je 5,1 Å a ne 5,4 Å. To jezato što su kod njega 2 ili više polipeptidnih nizova spiralne struktureupleteni u obliku konopca što dovodi do skraćivanja duž osezakedničkog savijanja.

� Fibrile kolagena se sastoje iz 7 trostrukih spirala upredenih u oblikukonopca

1/18/2010

34

� Nastajanje želatina kuvanjem i hlađenjem kolagena rezultat jeodvrtanja spirale i raskidanja vodoničnih veza pri čemu odvojenipolipeptidni nizovi hidratišu

� Neke aminokiseline remete pravilnost strukture:� imino grupa prolina je deo krutog prstena i nema rotacije oko N-C veze� a.k. sa naelektrisanim ili voluminoznim R grupama elektrostatički ili

fizički remete formiranje heliksa

3. Slobodan niz� Konformacija koju poprima polipeptidna molekula u rastvoru, kada

se raskine najveći broj vodoničnih veza� Peptidne grupe su i dalje u istoj ravni, ali niz rotira oko C atoma za

koje su vezani radikali

3. Tercijerna struktura

� α- i β- strukture, kao i molekule proteina koje nemajusekundarnu strukturu mogu da se savijaju i gradeglobularne, elipsaste ili vretenaste strukture

� savijeni delovi polipeptidnog niza međusobno supovezani disulfidnim, vodoničnim ili jonskim vezamapreko bočnih ostataka aminokiselina

� U održavanju stabilnosti ovih struktura mogu daučestvuju i nepolarni bočni lanci aminokiselinameđusobnim privlačenjem Van-der-Vals-ovim silama

1/18/2010

35

4. Kvaternerna struktura

� Imaju je neki oligomerni proteini koji predstavljaju asocijaciju nekoliko globula povezanih vezama koje nisu kovalentne (peptidne ni disulfidne), npr hemoglobin

� Primer: struktura hemoglobina� Primarna struktura: polipeptidni niz se sastoji iz 574 a.k. u određenom

redosledu� Sekundarna struktura: polipeptidni niz je uvrnut u α-spiralu� Tercijerna struktura: α-spirala je smotana u klupko� Kvaternerna struktura: 4 klupka formiraju tetramer

1/18/2010

36

FIZIČKE I HEMIJSKE OSOBINE PROTEINA� Mm peptida: do 10 000

� Mm proteina: 10 000 - 25 000 000

� prema veličini čestica (1-100 mµ) spadaju u koloide

� predstavljaju smešu više proteinskih frakcija različitihMm (npr. glijadini se nalaze u opsegu Mm 15 – 90 kD)

� za prečišćavanje proteina koristi se dijaliza. Ne prolazekroz polupropustljive membrane creva za dijalizu čiji suprečnici pora manji od njihovih prečnika.

� proteini su koloidni elektroliti i talože se naizoelektričnom pH.

� mogu da se razdvoje elektroforezom. U rastvoru čiji jepH manji od izoelektrične tačke putuju prema katodi, akada je pH viši od izoelektrične tačke prema anodi.

� Određivanje Mt proteina:1. Ultracentrifugiranje (6 000 o/min)2. SDS PAGE3. Gel filtracija

1/18/2010

37

optičke osobine proteina

� interakcije proteina ili njihovih konstituenata (aminokiselina i peptida) i elektromagnetog zračenja deli se na:

1. neapsorptivne interakcije:

• polarizacija• difrakcija x zraka• optička anizotropija• refrakcija i disperzija• skatering

2. apsorptivne interakcije

• apsorpcija u UV oblasti• apsorpcija u IR oblasti

� apsorpciona kriva proteina u UV oblasti ima dva apsortivnapodručja:� 180-250 nm - peptidna veza i funkcionalne grupe aminokiselina sa

sumporom (cistina, cisteina i metionina)

� oko 280 nm - funkcionalne grupe tirozina, triptofana, fenilalanina

� fenilalanin malo utiče na apsorpcioni spektar proteina jerima mali molarni ekstincioni koeficijent i nizak sadržaj uproteinima (odnos Try:Tyr:Phe ~ 27:7:1)

aminokiselina funkcionalna grupa maksimum apsorpcije Em

tirozin fenol 275 1340

triptofan indol 280 5010

fenilalanin fenil 258 206

cistin disulfid 250

cistein tiol 200

metionin alkilsulfid 200

1/18/2010

38

� UV apsorpcija na 280 nm koristi se za određivanje sadržaja proteina

Apsorpcioni spektar glijadina 1 mg/ml u 1% SDS u UV oblasti od 250 do 400 nm

Standardna kriva za glijadin (Sigma) za određivanje sadržaja prolamina apsorpcijom u UV oblasti na 280 nm

1/18/2010

39

Denaturacija proteina

� Denaturacija je promena nativne strukture proteina

� Faktori koji dovode do denaturacije:

� povišena ili snižena temperatura� kiseline ili baze� ultrazvuk� UV svetlost� jonizujuća zračenja� teški metali� enzimi� organski rastvarači i dr.

� denaturisanjem proteini prelaze iz visoko organizovanog u neorganizovano stanje uz promenu konformacije (odmotavanje, ispravljanje molekula)

� denaturisani proteini se lakše hidrolizuju dejstvom enzima

� pokazuju povećanu optičku rotaciju i viskozitet

� povećana reaktivnost aktivnih grupa i smanjena rastvorljivost

� denaturisani enzimi i peptidi gube biološku aktivnost

1/18/2010

40

koagulacija proteina

� pojava kada se čestice proteina talože usled smanjenogBraunovog kretanja

� pri manjim koncentracijama čestice se talože, a pri većimdolazi do očvršćavanja celog sistema – prelazak u gel

� denaturacija je jednaka koagulaciji kada nastane talog

� neki koagulisani proteini su svarljiviji (npr. ovoalbumin)

� koagulacija eliminiše antivitaminsko dejstvo avidina(antivitamin vitamina H)

� koagulisani gluten ne može da veže vodu (sušenjehleba)

AZOTNA RAVNOTEŽA

� proteinske potrebe organizma obično se izražavaju preko azotnog bilansa:

1. pozitivan azotni bilans - količina izlučenog azota je manja od količine unetog. Karakterističan za mlade organizme, jer se uneti proteini koriste ne samo za regeneraciju tkiva, već i za izgradnju novih tkiva -povećanja telesne mase

2. negativan azotni bilans - količina izlučenog azota je veća nego količina unetog. Troše se sopstvena tkiva -dolazi do smanjenja telesne mase

3. azotna ravnoteža - količina izlučenog azota je jednaka količini unetog - telesna masa se ne menja

1/18/2010

41

� biskoristljivost proteina zavisi od njihovog aminokiselinskog sastava

indeks efikasnosti proteina - PER

� pretstavlja sposobnost proteina da u datom momenturegenerišu stara i izgrađuju nova tkiva

povećanje telesne masePER =

masa unetog proteina

biološka vrednost proteina - BV

� pretstavlja deo iskorišćenog proteinskog azota u organizmu

količina zadržanog azotaBV =

količina unetog azota

� za određivanje BV i PER koriste se:

1. biološke metode - zasnivaju se na praćenju azotnog bilansa ipromena telesne mase eksperimentalnih životinja

2. hemijske metode - zasnivaju se na određivanju sadržajaamino-kiselina u hidrolizatu ispitivanog proteina

Formule Block-a i Mitchel-a:

PER = 3.77 - 0.0321 · x

BV = 102 - 0.634 · x

• limitirajući faktor (limitirajuća aminokiselina) je onaesencijalna aminokiselina čiji je sadržaj najmanji u odnosu nasadržaj iste aminokiseline u ukupnim proteinima jajeta čiji sesadržaj dogovorno uzima kao 100%

• x - procenat deficita limitirajuće aminokiseline - dobija seoduzimanjem od 100 vrednosti procenta limitirajućeaminokiseline (% od iste amino-kiseline proteina jajeta)

1/18/2010

42

% esencijelnih aminokiselina u proteinima jajeta (FAO)

lizin 6,88

Treonin 5,01

Valin 6,75

Metionin 5,71

Izoleucin 8,70

Leucin 6,20

Tirozin 4,10

fenilalanin 5,65

primer: u proteinima pasulja limitirajuća a.k. je metionin 1.92 % (5.71 % u proteinima jajeta)1.92 · 100 / 5.71 = 33.6 %100 - 33.6 = 66.4 - procenat deficita limitirajuće a.k.

BV = 102 - 0.634 · 66.4 = 59.9

PER = 3.77 - 0.0321 · 66.4 = 1.64

Podela proteina prema biološkoj vrednosti:

1. potpuni proteini (BV > 75)- omogućavaju normalan rast i regeneraciju organizma- proteini: mesa (sem proteina vezivnog tkiva), mleka, jaja

2. delimično nepotpuni proteini (BV = 55-75)- omogućavaju samo održavanje telesne mase- većina biljnih proteina: proteini žitarica su deficitarni ulizinu, a proteini leguminoza u metioninu

3. nepotpuni proteini (BV < 55)- ne omogućavaju ni održavanje telesne mase- proteini vezivnog tkiva: kolagen, elastin. - zein iz kukuruza je veoma deficitaran u lizinu

1/18/2010

43

Poboljšanje biološke vrednosti proteina

� komplementacija kombinovanjem proteina� dodavanje deficitarnih a.k. u dijetetske proizvode� genetske modifikacije – hibridi sa većim sadržajem deficitarnih a.k.

UTICAJ TERMIČKOG TRETMANA NA BIOISKORISTLJIVOST PROTEINA� Denaturacija i koagulacija proteina imaju povoljno dejstvo na

digestivnu iskoristljivost proteina zbog promene konformacijepolipeptidnih lanaca što omogućava lakši pristup enzimima

� Formiranje unutrašnjih peptidnih veza između ε-amino grupelizina i amidne karboksilne grupe glutaminske i asparaginskekiseline pri veoma visokim temperaturama usled sternih smetnjionemogućava pristup digestivnim enzimima.Digestivna iskoristljivost proteina pasterizovanog mleka je većanego UHT sterilizoivanog.

� Racemizacija aminokiselina usled uticaja alkalne sredine prilikomtehnoloških procesa pripremanja proteinskih koncentrata (kazeinata,proteina kvasca, soje) dovodi do smanjenja bioskoristljivosti jer seD-aminokiseline ne metabolišu u organizmu

1/18/2010

44

� Nastajanje lizinoalanina (LAL) tretiranjem proteina alkalijama navisokoj temperaturi smanjuje digestibilnost proteina i iskoristljivostlizina, a kod eksperimentalnih životinja izaziva renalna oštećenja.

• LAL se satoji iz lizina čija je εεεε-amino grupa vezana za metil grupuostataka alanina, nije dipeptid i hidrolizom ne daje dveaminokiseline.

• U alkalnoj sredini lizin se vezuje sa ostatkom dehidroalanina kojinastaje reakcijom ββββ-eliminacije iz cisteina i serina

Cistein

Serin

baza

-H2S

CH2

C

dehidroalaninski

ostatak

+L-lizin

C-H

(CH2)4

NH

CH2

*C-H

LAL

-H2O

� interakcija proteina i ugljenih hidrata

• Pri zagrevanju dolazi do reakcije neenzimskog tamnjenja - Millard-ove reakcije. Lizin najviše učestvuje u ovoj reakciji jer su slobodne i terminalne amino grupe najaktivnije. Zbog toga pri reakciji neenzimskog tamnjenja dolazi do smanjenja iskoristljivosti proteina jer je deo lizina blokiran.

H-C-OH

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

H-C

H2C-OH

O

aldoza aldozamin

R-NH2

H-C-NHR

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

H-C

H2C-OH

O

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

H-C-OH

H2C

H-C=O

HO-C-H

H-C-OH

H-C-OH

H2C-OH

O

1-amino-1-dezoksi-2-ketoza

Amadorijevo

premestanje

CH2-NHR

CH2-NHR•U prvoj fazi kondenzuje se karbonilna grupa šećera i slobodnaamino grupa proteina (lizina ili terminalna) pri čemu se formiraaldozamin ili ketozamin•Druga faza je Amadorijevo premeštanje pri čemu nastaje N-supstituisana-1-amino-1-dezoksi-2-ketoza•U trećoj fazi dolazi do stvaranja više stotina različitih jedinjenjakoja su odgovorna za za brojne arome boju i ukus termičkitretirane hrane, a na kraju nastaju tamni pigmenti melanoidini.

1/18/2010

45

� interakcija proteina i masti

• Oksidativnom razgradnjom nezasićenih masnih kiselina iholesterola nastaju proizvodi koji mogu da reaguju saamino grupama proteina, naročito lizina, čime sesmanjuje njihova iskoristljivost.

DIGESTIBILNOST PROTEINAFaktori koji utiču na digestibilnost proteina:� poreklo (biljni proteini imaju manju digestibilnost zbog manje

digestibilnih ćelijskih memebrana)� fizikohemijski faktori (konformacija molekula, tipovi veza)� prisustvo sastojaka hrane koji modifikuju digestiju (vlakna, tanini)� prisustvo antifizioloških faktora koji utiču na digestiju (tripsin

inhibitori, lektini)� termički tretman (Millard-ova reakcija, stvaranje lizinoalanina,

racemizacija i dr.)Izračunavanje digestibilnosti:

[Ni - (Nf - Ne)] x 100Ni

Ni - uneti azotNf - fekalni azotNe - endogeni fekalni azot (na dijeti bez proteina, oko 14mg/kg za

odrasle, 20 mg/kg za decu)

1/18/2010

46

Namirnica Digestibilnost proteina (%)

Belance jajeta 97

Celo jaje, govedina, živina, riba 95

Pšenično belo brašno 95

Soja protein izolat 94

Polirani pirinač 88

Sojino brašno 86

Integralna pšenica 86

Kukuruzni proizvodi 86

Integralni pirinač 84

pasulj 69

DIJETE Digestibilnost proteina (%)

SAD 96

Kina 94

Kolumbija (viša klasa) 93

Filipini (urbana) 88

Čile (srednja klasa) 82

Meksiko (ruralna) 80

Gvatemala (ruralna) 79

Brazil (ruralna) 78

Indija (vegetarijanska) 78

� Izračunavanje digestibilnosti proteina mešovitog obroka od pirinča pasulja, pšenice i jaja

Namirnica digestibilnost proteina zastupljenost u obroku (%)Poliran pirinač 88 40Crni pasulj 69 35Integralna pšenica 86 15Celo jaje 95 10Digestibilnost: (0,88 x 40) + (0,69 x 35) + (0,86 x 15) + (0,95 x 10) = 82%

1/18/2010

47

DIGESTIJA PROTEINA1. usta

� mehaničko usitnjavanje hrane

2. želudac� pepsin - prekurzor: pepsinogen, aktivator: HCl, pH 1-

2 raskida endogene peptidne veze proteina, naročitoizmeđu aromatičnih i dikarbonskih kiselina pri čemunastaju proteoze i peptoni

� renin - potrebno prisustvo Ca2+, pH 4 dovodi dokoagulacije mleka pri čemu kazein prelazi uparakazein pa se duže zadržava u želudcu. Važan jekod dece dok ga kod odraslih nema. Koristi se uproizvodnji sira.

3. tanko crevoa) enzimi pankreasnog soka:

� tripsin (prekurzor: tripsinogen, aktivator: enterokinaza, pH 7.9) -raskida endogene peptidne veze proteina, proteoza i peptona,naročito između baznih aminokiselina pri čemu nastaju polipeptidi idipeptidi

� himotripsin (prekurzor: himotripsinogen, aktivator: tripsin, pH 8) -raskida endogene peptidne veze proteina, proteoza i peptona,naročito između neutralnih aminokiselina pri čemu nastaju polipeptidii dipeptidi

� elastaza (prekurzor: proeleastaza, aktivator: tripsin, pH 8) - raskidaendogene peptidne veze proteina, proteoza i peptona, naročitoizmeđu malih aminokiselina (glicin, alanin, serin) pri čemu nastajupolipeptidi i dipeptidi

� karboksipeptidaza (prekurzor: prokarboksipeptidaza, aktivator:tripsin, pH 8) - raskida egzogene peptidne veze polipeptida naslobodnom karboksilnom delu lanca pri čemu nastaju aminokiseline ipeptidi

1/18/2010

48

b) enzimi crevnog soka� aminopeptidaza raskida egzogene peptidne veze

polipeptida na slobodnom amino kraju lanca pri čemu nastaju aminokiseline i peptidi

� dipeptidaze raskidaju peptidnu vezu dipeptida pri čemu nastaju aminokiseline

APSORPCIJA PROTEINA� D-aminokiseline se apsorbuju prostom difuzijom� L-aminokiseline (prirodni izomeri) se apsorbuju aktivnim

transportom u kome ima ulogu vitamin B6� u apsorpciji postoji kompeticija između aminokiselina

tako da suviše velika količina jedne aminokiseline može da uspori apsorpciju druge

� apsorbovane aminokiseline putuju portalnim venskim krvotokom do jetre

� moguće je da poneki polipeptidni lanac, koji iz određenih razloga ne može da se digestira, bude apsorbovan. Te molekule ne mogu da se koriste u sintezi proteina, već dovode do razvoja imunosti i preosetljivosti na proteine pojedinih namirnica (nutritivni alergeni)

1/18/2010

49

METABOLIZAM PROTEINA

� biljni i životinjski proteini izgrađeni su od oko 20aminokiselina

� esencijalne aminokiseline: izoleucin, leucin, lizin,metionin, fenilalanin, treonin, triptofan i valin (arginin ihistidin su poluesencijalne) ne mogu da se sintetišu uorganizmu i moraju da se unose hranom

� neesencijalne aminokiseline mogu da se sitetišu izdrugih aminokiselina, Ac-koenzima A ili piruvatareakcijama aminovanja, transaminacije, dezaminacije idefosforilacije koje su enzimski katalizovane

1/18/2010

50

Sinteza proteina

1/18/2010

51

ANALITIKA PROTEINA

1. određivanje ukupnih proteina

- metoda po Kjeldahl-u

� koncentrovana sumporna kiselina vrši razaranjematerijala pri čemu se ugljenik oksidiše do ugljen-dioksida, vodonik do vode, a azot se redukuje doamonijaka koji se destiliše vodenom parom i hvata uodređenu zapreminu kiseline poznatog titra, nakon čegase višak kiseline se retitrira bazom

� U zavisnosti od sadržaja azota u proteinima pojedinihnamirnica (FAO tablice) sadržaj proteina se izračunavamnoženjem dobijenog sadržaja azota faktorom iz tablice(npr. 5.7 za proteine pšenice, 6.25 za proteine drugihžitarica)

- određivanje belančevina mleka formol titracijom

� dodatkom formaldehida blokiraju se amino grupe belančevina, akarboksilne grupe mogu da se titriraju bazom

R CH

NH2

COOH

CH

H

O

R CH

N(CH2OH)

2

COOH

+

2. određivanje određenih frakcija proteina

- taloženje na izoelektričnom pH

� npr. kazein se izdvaja iz mleka taloženjem na pH 4.6 i može da se odredi po Kjeldahl-u

- ekstrakcija određenim rastvaračima (po Osborn-u)� ekstahovani proteini mogu da se odrede po Kjeldahl-u ili metodama

za određivanje proteina u rastvoru: po Lowry-u, BCA, Biuret-skom metodom, merenjem apsorpcije u UV oblasti i dr.

- elektroforezom i gel filtracijom

� izdvojene frakcije mogu da se odrede pomenutim metodama

1/18/2010

52

3. određivanje aminokiselinskog sastava i biološke vrednosti proteina

� Proteini se hidrolizuju do aminokiselina kiselom ili baznomhidrolizom.

� Baznom hidrolizom dolazi do razlaganja većeg broja aminokiselina.

� Kiselom hidrolizom triptofan se potpuno razlaže, a dolazi i dodelimičnog razlaganja aminokiselina sa sumporom, ali, obzirom dase sadržaj aminokiselina određuje u odnosu na kiselo hidrolizovanstandard ovi gubitci se eliminišu.

� Kisela hidroliza se izvodi 6M HCl u zatopljenim ampulama na 110oCu toku 20h. Višak kiseline se ukloni višestrukim ispiranjem iuparavanjem, a hidrolizat se rastvara u citratnom puferu pH 2.2 isadržaj aminokiselina određuje aminoanlizatorom (ninhidrinskareakcija), ili HPLC tehnikom nakon PTC derivatizacije (UV detektor)

� Iz sadržaja esencijelnih aminokiselina izračunavaju se parametrihranljive vrednoeti proteina: BV, PER, EAAI

4. određivanje primarne, sekundarne, tercijarne i kvaternerne strukture proteina

� sekvenciona analiza

� rentgenske metode

5. ispitivanje imunogenosti proteina namirnica

� važno je kod ispitivanja dijetetskih preparata za pojedinegrupe preosetljivih osoba: npr. gluten-free preparati zacelijačne bolesnike

� imunohemijske metode: ELISA, imunobloting tehnike,imunoprecipitacija RIA i dr.