Prote í na purificada Cristales Difracci ó n de rayos X Obtenci ó n de fases Mapa de densidad...

$: Prote í na purificada Cristales Difracci ó n de rayos X Obtenci ó n de fases Mapa de densidad electr ó nica Construcci ó n de modelo Refinamiento Validaci.$
Proteína purificada

Cristales

Difracción de rayos X

Obtención de fases

Mapa de densidad electrónica

Construcción de modelo

Refinamiento

Validación

Por qué necesitamos cristales para ver Por qué necesitamos cristales para ver difracción?difracción?

•Amplificación de la señal

….(efecto de interferencia a tener en cuenta!)

molécula celda unidad

cristal

Difracción:Difracción:

Cada electrón dispersa

Las ondas emitidas se suman … y se restan!!

El resultado final depende de las fases relativas de las ondas adicionadas en cada dirección

Usar el sitio interactivo

http://www.journey.sunysb.edu/ProjectJava/Bragg/home.html

Ley de Bragg :

n= 2d sin

Difracción: ondas en faseDifracción: ondas en fase

1. Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas?

Cuando recorren la misma trayectoria

… como en el fenómeno de la reflexión de luz


2 Cuándo dispersan en fase dos ó más ondas?

Cuando sus trayectorias difieren por un múltiplo de la longitud de onda

… como en el fenómeno de la difracción de luz

= 2d sin


Cuanto mayor es el ángulo de difracción, más pequeño es el espaciamiento para el que la difracción es sensible

= 2d sin sin / = 1 / d

Cambiando la dirección del haz entrante Mirando diferentes planos en el cristal

Qué clase de información obtenemos de esto? ~posición relativa de los centros dispersores

(scatterers), esto es, los átomos, en la dirección perpendicular a los planos considerados

En la dirección del ángulo negro va a registrarse baja intensidad difractada

según el rojo, mayor

Por qué?


Cuándo vemos difracción de un cristal?•Un cristal amplifica la difracción en ciertas direcciones, aquéllas para las que la totalidad de las celdas unidad dispersan en fase…• y las elimina en las otras direcciones

•Antes que nada: sólo planos repetitivos pueden dispersar en fase

debido a la simetría del cristal (repetición de la celda), esos planos tienen relaciones enteras con los ejes de la celda!!

a b c : los tres ejes de la celda unidad

Los planos de Bragg conectan divisiones enteras de cada eje

plano 1 0 0

plano 3 0 0

Cuándo vemos difracción de un cristal?

Ahora mirando diferentes orientaciones en 2 dimensiones

plano 1 1 0

plano 2 1 0

plano 1 -1 0

Indices de Miller

h k l

Cuándo vemos difracción de un cristal?

ResoluciónResolución Grado de detalle

detalle distancia entre planos ordenados del cristal

•Si los átomos estuvieran quietos y el orden cristalino fuera perfecto, la resolución estaría limitada sólo por la

•Eía este no es el caso : desorden, alto contenido de solvente (~50%), flexibilidad….

• 4 Å mala

• 3 Å más o menos

• 2-2.5 Å razonable

• 1.5 Å muy buena

• <1 Å excepcional

El límite de resolución en proteínasEl límite de resolución en proteínas

La difracción ocurre en el espacio recíprocoLa difracción ocurre en el espacio recíproco

Si cualquier punto en el cristal puede ser definido como un vector tridimensionalr = xa + yb + zc

entonces, la difracción ocurre en un espacio recíproco de manera que

s = ha* + kb* + lc*

Cada eje de esta celda recíproca queda definido teniendo una dirección perpendicular a los otros dos ejes del espacio real y una longitud igual a la recíproca del espaciamiento entre los planos definidos por dichos ejes

Espacio recíprocoEspacio recíprocoConstrucción de la esfera de Ewald

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Espacio recíprocoEspacio recíprocode un verdadero cristal de proteína…

Teoría de FourierTeoría de Fourier

El patrón de difracción está relacionado al objeto que difractó las ondas, a través de una operación matemática denominada transformada de Fourier

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€

ρxyz=1V

r F hkl

hkl∫

−2πi hx+ky+lz( )[ ]

e

Importante!

Esta integral puede invertirse….

Atención a F, es un vector!

El problema de las fasesEl problema de las fases

Dado que Fhkl es un vector, tiene una magnitud Y una fase (se comporta como una onda!)

€

r F hkl=Fhkl

iαe

Fhkl 2 es directamente proporcional a la intensidad

medida Ihkl

…pero la información sobre se perdió!

Soluciones al problema de las fases :Soluciones al problema de las fases :

•Hipótesis (re)emplazo molecularestructura ≈ conocida

•Perturbar la estructura (y con ella la difracción)

Reemplazo Difracción

isomorfo anómala

FittingFitting y refinamiento y refinamiento

Con la densidad electrónica proyectada en una estación gráfica, uno tiene que construir un modelo atómico que

•encaje bien en la densidad

•tenga sentido químico y físico

Este modelo predice un patrón de difracción (a través de una transformada de Fourier inversa), y uno usa luego programas para minimizar la diferencia entre las amplitudes Fhkl calculadas y observadas

Construyendo el primer modeloConstruyendo el primer modelo

Los mapas de densidad electrónica son el resultado final del experimento de difracción. Su interpretación en términos de un modelo molecular es la primer tarea del cristalográfo

Con lo que el problema de fitear un modelo se asemeja al de 'no perder de vista los árboles en el bosque' esqueletonización


1. Con estos mapas esqueletonizados, lo primero es trazar la cadena principal (ayuda: los C están a ~3.8 Å unos de otros!)

2. Luego, se ajustan las cadenas laterales

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Validación de modelosValidación de modelos

Chequear la geometría del modelo construido: parámetros estereoquímicos, distancias y ángulos de enlace, ángulos dihedros permitidos, etc, etc, etc.

Gráfico de Ramachandran de ángulos dihedros y

Lisozima «made in Uruguay» :

1.4Å resolución

Rwork=15.1%

Rfree=18.2%

Fases experimentales!!

(solvent flattened SAD)

Dispersión anómala de los S and Cl-, a la Cu K (1.542Å)

Estructura de un represor transcripcional (FapR) : MAD (1 Se/21kDa)

+ DM

50 mM Tris pH 8.5, 10 mM MgCl2,15% PEG4000P41212, a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å

Protein cleaved during purification/storage!!

Estructura 3D de FapR

Soaking de Mal-CoA

0 min

1 min

5 min50 mM Tris pH 8.5, 10 mM MgCl2,15% PEG4000P41212, a=b=59.1 Å, c=157.8 Å, resol: 3.5 Å

Complejo FapR - malonil-CoA

Schujman et al., EMBO J, 2006

Buenos sitios www para ver :

http://www-structmed.cimr.cam.ac.uk/course.html

http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html

http://www.yorvic.york.ac.uk/~cowtan/index.htmlBuenos libros para leer :T.L. Blundell & L.N. Johnson (1976), "Protein Crystallography", Academic Press: London.

Jan Drenth (2007), "Principles of Protein X-ray Crystallography", 3rd edition. Springer-Verlag: New York.

D. Sherwood (1976), "Crystals, X-rays and Proteins", Longman: London.

Muchas gracias!

Conceptos básicos de difracción: ondas, Conceptos básicos de difracción: ondas, interferencia y espacio recíprocointerferencia y espacio recíproco

Qué son los Rx?

E

Fotones = propagados como una onda

amplitud

longitud de onda

E(t) = A cos(t + )

t

=2

(fase)

Qué son los Rx?

E

Fotones = propagados como una onda

amplitud

longitud de onda

E(x) = A cos(x + )

x

=2

(fase)

OndasOndas

OndasOndas

Si combinamos la variación en el espacio y en el tiempo

A cos[2(t-x/)]

efectos “opuestos” del tiempo y la distancia

Adición de ondas

+

=

Sumando el valor del campo eléctrico para cada punto t…

…da el campo total en t

“interferencia constructiva”: la amplitud aumenta.

La suma de dos ondas con longitud de onda siempre produce una onda resultante de long de onda .

Interferencia destructiva

+

=

Diferencia de fase = 180°

La amplitud disminuye

Sumando ondas como vectoresSumando ondas como vectores

Si queremos sumar todas las ondas dispersadas por el elctron e- de una proteína, usando expresiones de la función de onda obtenemos operaciones trigonométricas MUY feas…

A cos(+1) + B cos(+2) + …

Dado que tenemos dos tipos de información (variables) en cada onda, mplitud y fase, podemos usar la notación de vectores para facilitar las operaciones

Imaginar una rotación const. del vector 1; y graficar el cos o el sin de iempo

Ahora la adición y sustracción se vuelven una operación geométrica simple

Sumando ondas como vectoresSumando ondas como vectores

Algunas disgresiones matemáticas…Algunas disgresiones matemáticas…

Este formalismo usando números complejos en lugar de vectores "simples", es de enorme utilidad!

Las ondas pueden siempre separarse en sus componentes de ondas simples coseno y seno

E(t) = A cos(t + )

A cos(t + ) = A cos cost - A sin sint

amplitud del componente coseno

amplitud del componente seno

Usando la regla de la suma de ángulos:

E(t) = A cos(t + )

A cos(t + ) = A cos cost - A sin sint

amplitud del componente coseno

amplitud del componente seno

Ahora las ondas pueden ser sumadas sumando los dos componentes: real e imaginario.

r

i

A

Usando la regla de la suma de ángulos:


Los números complejos son del tipo

z = a + ib

donde i = √-1

La rotación en el plano complejo es posible por multiplicación de vectores √i = 45°

Diagram de Argand (plano complejo)


Con lo que,

A cos(t + ) = A cos cost - A sin sint,

para t constante

puede escribirse A cos+ i A sin

ó aun,

A e i

= fase

z1z2 = |z1| exp(i1) |z2| exp(i2) = |z1||z2| exp[i(1 + 2)]

Teorema de Euler

La suma del coseno de más i veces el seno de es el número e elevado a i veces .eiα =cosα +isinα


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