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PROPAGAÇÃO CLONAL DO EUCALIPTO Aplicações Biotecnológicas
ALOISIO XAVIER Professor Associado
Departamento de Engenharia Florestal Universidade Federal de Viçosa - BRASIL
Campinas/SP – BrasilAbril - 2011
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Microestaquia
Micropropagação
Estaquia
1970
1980
1990
A
I
PR
OP
AG
AÇ
ÃO
CL
ON
AL
DO
EU
CA
LIP
TO
Fonte: Campinhos 2010
Micropropagação - Rejuvenescimento
Microestaquia
Miniestaquia
Minijardim Clonal
Estruturas de Viveiro
Micropropagação (?)
2000
2011
PR
OP
AG
AÇ
ÃO
CL
ON
AL
DO
EU
CA
LIP
TO
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Principais Aplicações da Micropropagação em Eucalyptus
(1) Rejuvenescimento/revigoramento de clones selecionados na fase adulta;selecionados na fase adulta;
(2) Embriogênese somática;
(3) Limpeza clonal (Ex.: eliminação de patógenos - Ralstonia solanacearum)
(4) Base para outras técnicas biotecnológicas (ex.: transgênicos).
(5) Intercâmbio de material genético (clone)
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ESTRUTURAS
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ESTRUTURAS
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Fase de Isolamento e
Laboratório de Cultura de Tecidos
A
CB D E
REJUVENESCIMENTO DE CLONES DE Eucalyptus Micropropagacão pela Proliferação de Gemas Axilares
Fase de Alongamento
Fase de Multiplicação
Isolamento e Indução
FGHI
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87,5
65,6
93,8
59,4
84,4
90,693
,8
81,2 80
100
78,1
56,3
50
65,668
,8
65,6
80
CLONE CM1 CLONE CM1 CLONE CM2
Enraizamento de MINIESTACAS e MICROESTACASde clones híbridos de Eucalyptus grandis
59,4
37,5
65,6
53,1
81,2
28,1
0
20
40
60
80
Sob
85 (
%)
MN MC MN MC MN MC
0
2000
AIB (ppm)
28,1
18,8
9,4
65,6
28,1
68,8
34,4
65,6
0
0
20
40
60
Sob
85 (
%)
MN MC MN MC MN MC
0
2000
AIB (ppm)
20 dias 25 dias 30 dias
PERMANÊNCIA EM CV
20 dias 25 dias 30 dias
PERMANÊNCIA EM CV
20 dias 25 dias 30 dias
PERMANÊNCIA EM CV
Sobrevivência das mudas aos 85 dias de idade. Fonte : Xavier et al., 2001.
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95,8
89,6
100,
0
100,
0
92,7
66,7
87,5
90,6
94,0
86,7
100,
080
100
SOB
50 (%
)
Enraizamento de MINIESTACAS e MICROESTACASde clones híbridos de Eucalyptus grandis
91,7
81,3
100,
0
97,9
89,7
69,8 91
,7
88,5
93,2
84,4
0
20
40
60
SOB
50 (%
)
CC1 Micro
CC1 Mini
CC8 Micro
CC8 Mini
CC11 Micro
CC11 Mini
CC12 Micro
CC12 Mini
MC M
icroM
C mini
21
28
Clones
Dia
s
Sobrevivência das mudas aos 50 dias de idade. Fonte : Titon, 2001.
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MICROPROPAGAÇÃO DE HÍBRIDOS DE
Eucalyptus globulus
Teses de mestrado: Borges (2009) e Oliveira (2011)
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Dificuldades encontradas na micropropagação dehíbridos de Eucalyptus globulus
Explantereativo
Explantenão reativo
Fonte: Borges (2009)
reativo não reativo
Explantecom bactéria
Explantecom fungo
Explante com oxidação
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Hiper-hidricidade
Dificuldades encontradas na micropropagação dehíbridos de Eucalyptus globulus
Oxidação do meio de cultura
Reduzido vigor vegetativo
Fonte: Oliveira (2011)
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0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Tax
a de
mul
tipl
icaç
ão
C01 C04 C16
8,0T
axa
de m
ulti
plic
ação
C26 C29 C30
Micropropagação de clones híbridos de Eucalyptus globulus
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Tax
a de
mul
tipl
icaç
ão
Número de subcultivos
Número médio de tufos de brotações produzidas por explante em cadasubcultivo (taxa de multiplicação) dos clones de Eucalyptus urophylla x E.
globulus (C01, C04 e C16) (A) e Eucalyptus grandis x E. globulus (C26, C29 eC30) (B), em meio MS na fase de multiplicação in vitro, em 25 subcultivos.
Fonte: Oliveira (2011)
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Porcentagem de miniestacas (A) e microestacas (B) enraizadas (PME), em dois clones de Eucalyptusurophylla x E. globulus (C04 e C16) e dois de Eucalyptus urophylla x E. globulus (C26 e C30), em
função do tempo após o estaqueamento. (FONTE: OLIVEIRA, 2011)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 7 14 21 28 35
PM
E (%
)
A
YC04 = 54,1312/(1 - 10477 e -0,9658T) R2 = 0,99YC16 = 65,0310/(1 - 155,52 e -0,2351T) R2 = 0,98YC26 = 51,4620/(1 - 14524 e -0,6224T) R2 = 0,99YC30 = 32,2545/(1 + 91369 e -0,6953T) R2 = 0,99
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 7 14 21 28 35
PM
E (
%)
YC04 = 66,5321/(1 - 43305 e -0,7035T) R2 = 0,99YC16 = 58,6702/(1 - 41321 e -0,4733T) R2 = 0,99YC26 = 60,3818/(1 - 11725 e -0,8916T) R2 = 0,99YC30 = 55,0698/(1 - 24017 e -0,6759T) R2 = 0,99
B
MICROESTACAS MINIESTACAS
Dias após o estaqueamento
C04 C16 C26 C30
Dias após o estaqueamento
C04 C16 C26 C30
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MINIESTAQUIA
MICROESTAQUIA
Tempo Eficiência
Custos Aplicabilidade
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MicropropagaçãoVia EmbriogêneseVia Embriogênese
Somática
Eucalyptus grandis (Fonte: TITON, 2005)
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Calo friável de Eucalyptus grandis X E. urophylla (Fonte: Alves 2007)
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Fig. 1A-K: Somatic embryogenesis and plant regeneration in Eucalyptus globulus. (A) Aspect of the explant three weeks after induction (B) Embryogenic callus with primary somatic embryos produced on a cotyledon of a zygotic embryo explant. (C) Cluster of primary somatic embryos. (D) and (E) Examples of Cotyledon- stage primary somatic embryos. (F) Emblings from primary somatic embryo conversion. (G) Cluster of secondary somatic embryos. (H) Shoot elongation. (I), (J) and (K) Emblings from secondary somatic embryos in different steps of acclimatization.
FONTE: PINTO et al.; 2010.
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ESPÉCIE REFERÊNCIA
Eucalyptus citriodora Muralidharan e Mascarenhas (1987)
Eucalyptus grandis Watt et al., (1991)
Titon (2005)
Alves (2007)
Eucalyptus dunnii Termignoni et al., (1996)
Eucalyptus nitens Ruad et al., (1997)
Embriogênese somática em Eucalyptus
Bandyopadhyay et al., (1999)
Bandyopadhyay e Hamill (2000)
Eucalyptus urophylla Tibok et al., (1995)
Arruda et al., (2000)
Eucalyptus globulus Nugent et al., (2001)
Bandyopadhyay et al., (1999)
Pinto et al., (2008)
Eucalyptus tereticornis Prakash e Gurumurthi (2005)
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MICROPROPAGAÇÃO MICROPROPAGAÇÃO DE CLONES DE DE CLONES DE EucalyptusEucalyptus EMEMBIORREATORES DEBIORREATORES DE IMERSÃO TEMPORÁRIAIMERSÃO TEMPORÁRIA
BIORREATORES: Equipamentospara cultivo sob imersão temporária oupermanente de células, gemas, embriões ouqualquer tipo de propágulo que possa serutilizado na micropropagação.
BIORREATORES
RITA®
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RECIPIENTE DE IMERSÃO TEMPORÁRIAAUTOMATIZADA RITA®
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PESQUISA COM BIORREATOR PESQUISA COM BIORREATOR –– Clones de Clones de EucalyptusEucalyptus
OLIVEIRA, Mila Liparize de, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de 2009.Micropropagação de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreatores de
imersão temporária. Orientador: Aloisio Xavier. Coorientadores: Ricardo Miguel Penchel Filho, João Batista Teixeira e Wagner Campos Otoni.
PESQUISA EM ANDAMENTO: Micropropagação de clones híbridos de Eucalyptus globulusem biorreatores de imersão temporária. (CORREIA, Anne Caroline Guieiro, M. Sc., Universidade em biorreatores de imersão temporária. (CORREIA, Anne Caroline Guieiro, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, 2011. Propagação clonal de híbridos de Eucalyptus globulus. Orientador: Aloisio Xavier, Coorientadores: Wagner Campos Otoni e Miranda Titon).
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CAPÍTULO 1 - Efeitos do meio de cultura e da relação bap/ana na multiplicação in vitro de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreator de imersão temporária.
CAPÍTULO 2 - Influência da relação N(NO3 -):N(NH4+) na multiplicação in vitro de Eucalyptus
TESE DE MESTRADO – UFVOLIVEIRA, Mila Liparize de, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de 2009.Micropropagação de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreatores de
imersão temporária. Orientador: Aloisio Xavier. Coorientadores: Ricardo Miguel Penchel Filho, João Batista Teixeira e Wagner Campos Otoni.
CAPÍTULO 2 - Influência da relação N(NO3 -):N(NH4+) na multiplicação in vitro de Eucalyptusgrandis x E. urophylla em biorreator de imersão temporária.
CAPÍTULO 3 - Efeito da frequência de imersão e de injeção adicional de ar namultiplicação in vitro de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreator de imersão temporária.
CAPÍTULO 4 - Alongamento in vitro de multibrotações de Eucalyptus grandis x E. urophyllaem meio semissólido e em biorreatores de imersão temporária.
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3:1 2:1 1:1 1:2 1:3
Relações (NO3-/NH4
+)
Influência da relação N(NO3 -):N(NH4+) na multiplicação in vitro de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreator de imersão
temporária (RITA®).
FONTE: OLIVEIRA, 2009.
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0 dias
14 dias
ÁGAR
BiorreatorRITA®
Padrão de brotos produzidos na relação2:1 de N(NO3-):N(NH4+), nos doissistemas de cultivo, ágar e biorreatorRITA®, aos 0,14, 28 e 42 dias de cultivo
28 dias
42 dias
RITA®, aos 0,14, 28 e 42 dias de cultivodo clone de Eucalyptus grandis x E.
urophylla (C1).
FONTE: OLIVEIRA, 2009.
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Explantes alongados aos 28 dias da cultura em biorreator de imersão temporária RITA® (A) e diversidade no padrão de alongamento dos brotos (B) do clone de Eucalyptus
grandis x E. urophylla (C1).
FONTE: OLIVEIRA, 2009.
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OLIVEIRA, Mila Liparize de, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, setembro de 2009.Micropropagação de clones de Eucalyptus grandis x E. urophylla em biorreatores de imersão temporária. Orientador: Aloisio Xavier. Coorientadores: Ricardo Miguel Penchel Filho, João Batista Teixeira e Wagner Campos Otoni.
PRINCIPAIS PRINCIPAIS DESAFIOSDESAFIOS
Hiper-hidricidade
Calo
Estresse dos explantes
Condição de aclimatação e enraizamento
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MICROPROPAGAÇÃO - Tendências
• Automatização dos sistemas de cultura – BIORREATORES;
• Micropropagação em condições fotoautotrópicas.
Acessível;Simplicidade;
Economicamente viável;Operacionalidade em larga escala.
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MICROPROPAGAÇÃO MINIESTAQUIA
PROPAGAÇÃO CLONAL DO EUCALIPTO
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Aloisio [email protected]
Universidade Federal de ViçosaCentro de Ciências Agrárias
Departamento de Engenharia Florestal
Departamento de Engenharia Florestal Viçosa / MG - Brasil