PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA · 2019-10-25 · Marcela e Cadu, que mesmo não...

PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS

DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTIICCAA

Análise da expressão e investigação de mecanismos envolvidos com o controle da

atividade de homólogos do fator de iniciação da tradução eIF4E ao longo do ciclo de vida de

Leishmania amazonensis.

MMAARRIIAANNAA MMAARRQQUUEESS CCOOUUTTEELLOO PPEERREEIIRRAA

Recife, 2008

Pereira, M.M.C. 2008 Análise da expressão e investigação de mecanismos...

1

PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO CCEENNTTRROO DDEE CCIIÊÊNNCCIIAASS BBIIOOLLÓÓGGIICCAASS

DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE GGEENNÉÉTTIICCAA

Análise da expressão e investigação de mecanismos

envolvidos com o controle da atividade de homólogos do fator de iniciação da tradução eIF4E

ao longo do ciclo de vida de Leishmania amazonensis.


Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação

em Genética da

Universidade Federal de

Pernambuco, como parte dos

requisitos necessários para a

obtenção do grau de Mestre

em Genética.

Orientador: Dr. Osvaldo

Pompílio de Melo Neto

Recife - PE 2008


2

UUNNIIVVEERRSSIIDDAADDEE FFEEDDEERRAALL DDEE PPEERRNNAAMMBBUUCCOO PPRROOGGRRAAMMAA DDEE PPÓÓSS--GGRRAADDUUAAÇÇÃÃOO EEMM GGEENNÉÉTTIICCAA

PARECER DA COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE DISSERTAÇÃO DE MESTRADO DE


“Análise da expressão e investigação de mecanismos envolvidos com o controle da atividade de homólogos do fator de iniciação da

tradução eIF4E ao longo do ciclo de vida de Leishmania amazonensis.”

Área de Concentração: BIOLOGIA MOLECULAR

Recife - PE 2008


3

"Não existe triunfo sem perda,

não há vitória sem sofrimento,

não há liberdade sem

sacrifício."

(Senhor dos Anéis - O Retorno do Rei)


4

Ao meu marido, minha família e meus amigos...


5

AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer primeiramente a Deus, por mais uma jornada conquistada, por mais essa vitória em minha vida, por mais um obstáculo vencido.

Ao meu Orientador, Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto, pela confiança depositada e orientação para realização deste trabalho.

Aos meus melhores amigos do laboratório, Danona, Taminha, Christian, Franklin,

Mari Palma, Cariri, Mari Azevedo, Julie, (que também é da Microbiologia!!) e Cássia, pela experiência partilhada no dia a dia, por tornar o ambiente de trabalho tão agradável e pelo companheirismo fora do laboratório!! ADORO VOCÊS!!!! E não esquecendo minha amiga Poprilas, minha “mestra” das culturas, que era pra quem eu recorria quando comecei a manipular com células!!!!!

A todos os companheiros do CPqAM: Ronnie, Éden, Rodrigo, Marília, Rafaela,

Eduardo, Bruna, Ana Paula, Wladimir, Wellington, Marcelinho, Duschinka, Taty, Paloma e a todos os funcionários que proporcionaram a realização deste trabalho.

À Drª Regina Bressan e a Drª Cássia Docena, pela ajuda na microscopia confocal.

Aos Meus amigos da Faculdade Januana Teixeira, Cynthia Maria, Emanuel Borges e Ana Ruth Sampaio. A distância traz saudades, mas nunca o esquecimento... Obrigada pela amizade verdadeira e sincera...

Aos meus “compadres” e “comadres”, eternos amigos, Mariluce e Henrique e Marcela e Cadu, que mesmo não entendendo o meu trabalho, sempre torcem pelo meu sucesso.

Ao pessoal do 14º Batalhão de Infantaria Motorizado, literalmente a minha

segunda casa, pelos momentos maravilhosos no Clube dos Oficiais, onde eu passava fins de semanas relaxando as idéias!!! Em especial a Rose, Dani e Nastassja, por serem tão batalhadoras e por me darem o apoio necessário. Valeu meninas!!!

Em especial:

À minha família. Minha mãe Denise, meu pai José Augusto, meu irmão Daniel e

minha irmã Gabriela, pelo apoio e conforto dado nos momentos difíceis, pelas horas de alegrias e também pela torcida que eu sei que não é pouca. Agradeço também a minha tia Alba, meu tio Zé Carlos, meus primos e meu padrinho Breno, pelos momentos de descontração, afinal, a vida não é só trabalho!!!!!!

À minha outra família, minha sogra Dora, minha cunhada Mariana, meu cunhado

Paulo e minha cunhada Cristiane pelo apoio, confiança e carinho dados a mim. Muito obrigada!!!!!

E principalmente, queria agradecer ao meu marido e melhor amigo Expedito

Júnior, pelo amor, carinho, dedicação, compreensão, companheirismo, pelo interesse de querer entender e aprender o meu trabalho e principalmente pela paciência nestes quase 8 anos juntos. TE AMO MINHA VIDA!!!!!


6

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................08

LISTA DE FIGURAS E TABELA .......................................................11

RESUMO........................................................................................13

1. INTRODUÇÃO............................................................................14

2. OBJETIVOS ...............................................................................17

2.1 Geral ...................................................................................17

2.2 Específicos ...........................................................................17

3. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................18

3.1. Família Trypanosomatidae .....................................................18

3.2 O gênero Leishmania e a leishmaniose .....................................18

3.2.1 Taxonomia e transmissão ..................................................20

3.2.2 Aspectos clínicos da leishmaniose .......................................22

3.2.3 Impacto da doença ...........................................................24

3.2.4 Ciclo evolutivo..................................................................26

3.2.5 Cultivo dos parasitas.........................................................29

3.3 Características da biologia molecular dos tripanossomatídeos ......30

3.3.1 RNAs polimerases, promotores e Transcrição policistrônica ....31

3.3.2 Processamento de mRNAs – “trans-splicing e poliadenilação ..33

3.3.3 Cap4...............................................................................35 3.4 Controle da expressão gênica nos tripanossomatídeos................36

3.5 Biossíntese protéica ...............................................................38

3.5.1 Iniciação da tradução ........................................................38

3.5.1.1 Complexo eIF4F e PABP...............................................39

3.5.1.2 eIF4E: estrutura e função ............................................41

3.5.1.3 Modificações pós-traducionais – fosforilação do eIF4E .....43

3.5.2 Complexo EIF4F e PABP em tripanossomatídeos .................45

3.5.3 Eventos de fosforilação em tripanossomatídeos ..................48


7

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................50

5. MANUSCRITO DO ARTIGO CIENTÍFICO.....................................67

6. CONCLUSÕES ..........................................................................105

7. ABSTRACT...............................................................................106

8. ANEXOS ..................................................................................107

8.1 Instruções para autores......................................................107


8

LISTA DE ABREVIATURAS

EPB’s - Proteínas ligadoras ao 4E (“4E Binding Protein”)

AIDS/SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida

(“Acquired Immunodeficiency Syndrome”)

AUG – Códon de iniciação da tradução

BSA – Albumina sérica bovina

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

ECL – Detecção por quimioluminescência

(“Enhanced Chemioluminescence”)

eIFs – Fatores de iniciação da tradução eucarióticos

(“Eukaryotic Initiation factors”)

EPs - Prociclinas presente na forma procíclica

GEETs - Prociclinas presente na forma procíclica

GMP – Guanosina monofosfato

GP-63 - Glicoproteína de 63KDa

GST – Glutationa S Transferase

GTP – Guanosina Trifosfato

HIV – Vírus da imunodeficiência humana

(“Human Immunodeficiency Virus”)

IL-12 – Interleucina 12

IPTG – Isopropil-tio-β-D-galactopiranosídeo

kDa – Kilodalton

LB – Meio de cultura Luria Bertani

LC– Leishmaniose Cutânea

LCD – Leishmaniose cutâneo difusa

LMC– Leishmaniose Muco-Cutânea

LPG - complexo glicofosforoglicano

LV– Leishmaniose Visceral

m7GTP - cap monometilado


9

Map quinases - Mitogen-activated protein

Mnk1 – Quinase responsável pela fosforilação do eIF4E

Mnk2 – Quinase responsável pela fosforilação do eIF4E

mRNA – ácido ribonucléico mensageiro

mtHsp70 – proteína de choque térmico HSP70 mitocondrial

ORF – Seqüência aberta de leitura (“Open Reading Frame”)

PABP – Proteína de ligação a cauda poli-A (“Poly-A binding protein”)

PBS – Solução salina tamponada com fosfato

(“Phosphate Buffered Saline”)

PCR – Reação em cadeia da polimerase (“Polymerase Chain Reaction”)

PKDL – Leishmaniose dérmica pós Calazart

(“post Kala-azar dermal leishmaniasis”)

PVDF – Membrana de nitrocelulose

RNA – Ácido ribonucléico

RNAP - RNA polimerase

RNAPI - RNA polimerase I

RNAPII - RNA polimerase II

RNAPIII - RNA polimerase III

RRMs – Motivos de reconhecimento de RNA (“RNA recognition motif”)

rRNAs – RNAs ribossomais

SDS-PAGE – Gel de poliacrilamida em condições desnaturantes

(“Sodium Disulfate – Polyacrilamide Gel Eletrophoresis”)

SFB – Soro Fetal Bovino

SL – Seqüência spliced leader ou mini-éxon

snRNAs - RNAs nucleares

TBS – Solução salina tamponada com TRIS (“Tris buffered Saline”)

TCA – Ácido tricloroacético

TGFα - fator de transformação do crescimento

tRNA – Ácido ribonucléico transportador

tRNAi - tRNA iniciador


10

tRNAs - RNAs transportadores

UTR – Região não traduzível (“Untranslated Region”)

VSG – Glicoproteína Variante de Superficie

(“Variant Surface Glycoprotein”)


11

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Figuras da Revisão Bibliográfica

Figura 1. Vetores invertebrados da leishmaniose. ..............................19

Figura 2. Formas evolutivas do gênero Leishmania. ...........................20

Figura 3. Manifestações clínicas da leishmaniose. ...............................24

Figura 4. Mapa da distribuição geográfica dos países com maior

prevalência da leishmaniose. ............................................................25

Figura 5. Mapa da distribuição geográfica da Leishmaniose e da co-

infecção Leishmaniose/HIV. ..............................................................26

Figura 6. Ciclo de vida da Leishmania.. .............................................27

Figura 7. Esquema ilustrando a transcrição e o processamento de mRNAs

.....................................................................................................34

Figura 8. Esquema da iniciação da tradução cap-dependente. ......... ....41

Figuras do Artigo Científico

Figura 1. Padrão de crescimento e diferenciação de L. amazonensis em

cultivo in vitro .................................................................................98


12

Figura 2. Expressão dos quatro homológos do fator de iniciação da

tradução EIF4E e da proteína PABP1 durante as curvas de crescimento e

diferenciação de L. amazonensis........................................................99

Figura 3. Localização subcelular dos fatores EIF4E3 e EIF4E4 ............100

Figura 4. Avaliação do crescimento da L. amazonensis em 24h na

presença de meio novo ou condicionado, com e sem soro fetal bovino

(SFB)....... ...................................................................................101

Figura 5. Expressão dos fatores EIF4E3, EIF4E4 e a PABP1 nas culturas

crescidas por 24 horas na presença de meio novo ou condicionado, com e

sem soro fetal bovino (SFB)............................................................102

Figura 6. Análise do perfil de síntese protéica em células de L.

amazonensis em diferentes estágios de crescimento.. ........................103

Figura 7. Expressão dos fatores EIF4E3 e EIF4E4 em curvas de

crescimento realizadas na presença de inibidores de transcrição

(actinomicina D) ou tradução (cicloheximida)....................................104

Tabelas da Revisão Bibliográfica

Tabela 1. Quantificação dos homólogos eIF4E de Leishmania major na

fase promastigota............................................................................46


13

RESUMO

Os tripanossomatídeos são protozoários que causam manifestações

clínicas de impacto mundial e possuem características bioquímicas

peculiares que os diferem dos demais eucariotos. Sua expressão gênica é

regulada em nível pós-transcricional, provavelmente no estágio de

iniciação da síntese protéica. A tradução cap-dependente é iniciada

através da ligação do fator de iniciação eIF4E, pertencente ao complexo

eIF4F, ao cap presente na extremidade 5’ dos mRNAs. Foram identificados

múltiplos homólogos do fator EIF4E nestes parasitas, que provavelmente

estão associados ao seu complexo ciclo de vida. Neste trabalho, nós

buscamos entender como ocorre a expressão de quatro homólogos deste

fator (EIF4E1-4) durante o ciclo de vida de Leishmania amazonensis. Para

tal, foram realizadas curvas a fim de se obter as três principais formas

evolutivas do parasita. Todos os homólogos estão presentes ao longo da

curva e os EIF4E2-4 apresentam múltiplas isoformas, sugerindo

modificações pós-traducionais por fosforilação. Destes, as isoformas dos

EIF4E3 e 4 apresentaram expressão constrastante que não interferem

com sua localização subcelular, citoplasmática. A ausência de soro fetal

bovino no meio induziu uma desfosforilação prematura do EIF4E4 e uma

“hiperfosforilação” do EIF4E3, associados à falta de crescimento celular.

EIF4E3 “desfosforilado” e EIF4E4 “fosforilado” estão associados a uma

maior atividade de tradução. A presença de um inibidor de transcrição

influenciou no padrão de expressão dos dois homólogos, porém um

inibidor de tradução afetou apenas o EIF4E3. Estes resultados indicam que

os homólogos de eIF4E atuam de forma distinta na célula e que a

fosforilação deve ter um papel significante na regulação destes fatores em

Leishmania e na regulação da síntese de proteínas como um todo.

Palavras-chave: Leishmania amazonensis, EIF4E, fosforilação


14

1. INTRODUÇÃO

Os tripanosomatídeos, pertencentes à ordem Kinetoplastida, são

protozoários eucariotos flagelados cujos gêneros Leishmania e

Trypanosoma são responsáveis por doenças de impacto mundial como a

Doença do Sono (T. brucei), Doença de Chagas (T. cruzi) e várias formas

de leishmaniose (Leishmania sp.) (www.who.int). As formas clínicas da

leishmaniose são particularmente diversas e representam um complexo de

doenças que atingem anualmente 1,5 a 2 milhões de pessoas no mundo

todo, e cerca de 350 milhões de pessoas encontram-se em áreas de risco.

Este quadro é preocupante e desperta o interesse para pesquisas mais

aprofundadas sobre estes parasitas, tanto em nível celular como

molecular.

As espécies patogênicas de tripanosomatídeos possuem um

complicado ciclo de vida, alternando entre o hospedeiro mamífero e o

inseto vetor hematófago. No gênero Leishmania, a forma promastigota,

flagelada extracelular, é a forma predominante no trato digestivo dos

vetores invertebrados, fêmeas de dípteros flebotomíneos. Durante o

repasto sanguíneo, estas formas são transmitidas ao hospedeiro

vertebrado, quando são fagocitados por células do sistema fagocítico

mononuclear, e se transformam em amastigotas, parasitas intracelulares

obrigatórios sem flagelo aparente.

Do ponto de vista da sua biologia, os tripanosomatideos são

eucariotos que possuem características bioquímicas e moleculares

relevantes que os diferenciam dos demais eucariotos. Em especial se

destaca a síntese dos seus mRNAs, realizada de forma policistrônica, onde

dezenas de genes podem ser transcritos em um único e longo mRNA

precursor cuja transcrição é controlada por um único promotor. Estes pré-

mRNAs são processados pelo mecanismo de trans-splicing, que divide este


15

transcrito único em múltiplos mRNAs maduros cada um representando

uma seqüência codificadora individual. A transcrição policistrônica e o

escasso número de promotores nestes parasitas impede uma regulação

individual da síntese de mRNAs, como ocorre em outros eucariotos. Desta

forma, acredita-se que boa parte dos mecanismos de regulação da sua

expressão gênica ocorram em nível pós-transcricional, como durante a

tradução dos mRNAs em proteínas (Clayton, 2002).

A biossíntese protéica ou tradução é um dos processos mais

importantes para a sobrevivência de todos os organismos. Esse processo

nos tripanosomatídeos ainda é pouco conhecido e precisa de mais estudos

para seu total entendimento. A etapa de iniciação é a fase mais crítica

deste processo, sujeita a diferentes mecanismos de regulação, e onde se

define quando e com que intensidade os diferentes mRNAs celulares serão

utilizados na síntese de proteínas. Esta etapa compreende o

reconhecimento do mRNA maduro pela subunidade 40S do ribossomo e a

identificação do códon AUG, que indica o início da seqüência que codifica

para as proteínas propriamente, sendo mediada por proteínas conhecidas

como fatores de iniciação da tradução (eIFs). Entre esses fatores destaca-

se o eIF4E, a proteína que reconhece a estrutura cap na extremidade 5’

do mRNA. Como parte do complexo heterotrimérico eIF4F, junto com o

eIF4A e o eIF4G, esta proteína é a principal responsável pelo

reconhecimento dos mRNAs para a tradução (Gingras et al., 1999).

A iniciação da tradução é bem estudada em leveduras, plantas e

vertebrados, porém pouco se sabe sobre este processo nos

tripanosomatídeos. Vários homólogos de fatores de iniciação da tradução

já foram identificados e suas seqüências se encontram disponíveis em

bancos de dados de acesso público. Para entender a iniciação da tradução

nos tripanosomatídeos, nosso grupo buscou identificar e caracterizar

nestes organismos homólogos para as várias subunidades do eIF4F.

Múltiplos homólogos em potencial foram identificados para as subunidades


16

eIF4E e eIF4G em bancos de seqüências genômicas. Iniciando sua

caracterização funcional, observou-se, no caso dos homólogos de eIF4E,

que estes variam em diferentes aspectos como a afinidade de ligação ao

cap, níveis de expressão e interação com homólogos específicos de eIF4G.

Os resultados obtidos até o momento sugerem um alto grau de

complexidade na iniciação da tradução desses parasitas, o que pode

refletir uma adaptação ao seu complexo ciclo de vida (Dhalia et al., 2005).

Com a identificação de múltiplos homólogos da subunidade eIF4E

em Leishmania, é de se esperar que nem todos atuem diretamente na

iniciação da tradução. Alternativamente, é possível que um ou mais

possam estar atuando em fases específicas do complexo ciclo de vida do

parasita. Neste caso sua expressão seria variável de acordo com estas

diferentes fases. Este trabalho teve como ponto principal, então,

investigar a expressão de quatro homólogos de eIF4E de L. amazonensis

(EIF4E1-4) em formas representativas de diferentes fases do seu ciclo de

vida e também em células submetidas a diferentes condições de estresse.

Os resultados obtidos sugerem um novo elemento de complexidade no

controle da síntese protéica nos tripanosomatídeos que envolve

modificações pós-traducionais em fatores de tradução selecionados.


17

2. OBJETIVOS

GERAL

Analisar e comparar a expressão de quatro homólogos do fator de

iniciação da tradução eIF4E durante o ciclo e vida de Leishmania

amazonensis, bem como investigar mecanismos que estejam envolvidos

com o controle de expressão/atividade destas proteínas.

ESPECÍFICOS

1. Padronizar condições de crescimento e diferenciação de Leishmania

amazonensis em cultura e obtenção de extratos protéicos de diferentes

fases do seu ciclo de vida;

2. Realizar ensaios de “western-blot” para comparar a expressão dos

homólogos EIF4E1-4, utilizando como controle o fator de iniciação EIF4A1

e as proteínas ribossomais P0 e L19 (validando quantidade celular) e a

proteína mtHsp70 (validando a diferenciação celular);

3. Realizar ensaios de imunocitoquímica a fim de observar mudanças de

localização subcelular dos homólogos ao longo do ciclo de vida do

parasita;

4. Avaliar padrões de expressão/modificação dos homólogos em células

submetidas a condições especiais de cultura, como ausência de soro fetal

bovino, induzindo estresse celular.

5. Realizar ensaios de marcação metabólica a fim de comparar mudanças

no padrão de expressão protéica do parasita com alterações no padrão de

expressão/modificação de homólogos específicos;

6. Analisar o efeito de inibidores de transcrição (actinomicina D) e

tradução (cicloheximida) no padrão de expressão/modificação dos

homólogos em estudo;


18

3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Família Trypanosomatidae

A família Tripanosomatidae é formada por organismos unicelulares

que divergiram muito cedo na linhagem evolutiva dos demais eucariotos,

caracterizados por apresentarem corpo alongado dotado de um único

flagelo terminal e um único núcleo, geralmente central (Schmidt e

Roberts, 1996). A presença de uma estrutura em forma de disco achatado

contendo o DNA mitocondrial, conhecida como cinetoplasto, é uma

característica destes protozoários que permite agrupá-los na ordem

Kinetoplastida (Vickerman and Coombs, 1999). Esta família possui nove

gêneros, onde todos os membros são exclusivamente parasitas que

apresentam um complexo ciclo de vida passando por vários estágios

morfológicos e envolvendo mais de um hospedeiro (Singh, 2006).

Os gêneros Trypanosoma e Leishmania merecem destaque devido à

sua importância médica e veterinária, pois são responsáveis por

enfermidades de impacto mundial, como a Doença de Chagas

(Trypanosoma cruzi), Doença do Sono (Trypanosoma brucei) e as várias

formas de Leishmaniose (Leishmania sp.). Em todo o mundo, cerca de

350 milhões de pessoas se encontram em áreas de risco e milhares de

pessoas morrem anualmente devido a essas enfermidades (www.who.int).

3.2 O Gênero Leishmania e a Leishmaniose

O gênero Leishmania é representado por pelo menos 20 agentes

etiológicos causadores de leishmaniose, enfermidade que afeta o mundo

todo, sendo mais frequente na América do Sul, América Central, África

Central, Oriente Médio e no sudoeste da Ásia (www.who.int). A


19

leishmaniose compreende um grupo de doenças que expõe amplas

manifestações clínicas em humanos, cujo tipo não vai depender apenas da

espécie que causou a infecção, mas também da saúde geral e da

maquinaria genética do indivíduo infectado (Alexander et al., 1999).

A leishmaniose é transmitida por cerca de 30 espécies de

flebotomíneos, insetos dípteros pertencentes aos gêneros Phlebotomus e

Lutzomya, encontrados no Velho e Novo Mundo respectivamente (FIGURA

1). As espécies de Leishmania apresentam ciclo digenético com duas

formas vegetativas diferentes: a forma extracelular móvel, promastigota,

que é encontrada no vetor invertebrado e a forma obrigatoriamente

intracelular, amastigota, capaz de se multiplicar em vários hospedeiros

vertebrados, infectando células da linhagem fagocítica. A forma

promastigota é dividida em várias formas de desenvolvimento conhecidas

como promastigotas procíclica, nectomona, leptomona, haptomona,

paramastigota e metacíclica. Porém, as formas observadas em meio de

cultura incluem a forma procíclica, que é a forma não infectiva, mas

apresenta uma alta taxa de multiplicação, e a forma metacíclica, que é a

forma infectiva, mas que não apresenta divisão celular (Shaw, 1994;

Alexander et al., 1999; Gossage et al., 2003; Neves, 2005; Besteiro et al.,

2007) (FIGURA 2).

Na sua forma metacíclica o parasita tem sido descrito como

(A) (B)(A) (B)

Figura 1. Vetores invertebrados da leishmaniose. Em (A) o inseto do gênero Phlebotomus causador da doença no Velho Mundo e em (B) o gênero Luztomya, causador da doença no Novo Mundo. Fonte: http://www.who.int/leishmaniasis/disease_epidemiology/en/index.html


20

pequeno, com um flagelo relativamente grande, aparecendo em maior

número “in vitro” na fase estacionária. Esta forma é tida como a fase

infectante da Leishmania, embora as formas promastigota procíclica e

amastigota também sejam capazes de infectar o hospedeiro (Teixeira et

al., 2002). A forma procíclica é considerada uma célula ovóide, bastante

móvel e que possui atividade replicativa. As formas promastigotas

possuem uma variabilidade muito grande nas suas dimensões, variando

entre 10 µm a 40 µm de comprimento por 1,5 µm a 3,0 µm de diâmetro.

Já a forma amastigota intracelular é aflagelada, arredondada e possui

aproximadamente de 1,5 a 3 µm de comprimento por 3 a 6 µm de

diâmetro (Neves, 2005) (FIGURA 2). Vários genes específicos da

metaciclogênese têm sido mostrados, contudo, os mecanismos

moleculares que levam à iniciação e ao controle deste mecanismo vital

ainda permanecem indefinidos (Cunningham et al., 2001).

3.2.1 Taxonomia e Transmissão

As espécies de Leishmania foram divididas em dois subgêneros

taxonomicamente distintos, Viannia e Leishmania, baseadas em

similaridades moleculares (análise dos fragmentos do DNA do

Figura 2. Formas evolutivas do gênero Leishmania. Em (A e B) se encontra a forma promastigota encontrada no trato digestivo do hospedeiro invertebrado, onde (A) é a forma procíclica e (B) é a forma metacíclica. Em (C) se encontra a forma amastigota presente no hospedeiro vertebrado. Fonte: Besteiro et al., 2007.

(A)

(B) (C)


21

cinetoplasto, cortado por enzimas de restrição e PCR com "primers"

espécie-específicos), bioquímicas (análise isoenzimática) e imunológicas

(separação empregando anticorpos monoclonais) (Pearson et al., 2000).

As espécies foram agrupadas em complexos que recebem o nome da

espécie mais importante e possuem distribuição geográfica, epidemiologia

e tendência a visceralização que lhe são peculiares (Pearson et al., 2000).

O subgênero Viannia compreende o complexo L. brasiliensis, sendo as

principais espécies L. brasiliensis, L. guyanensis, L. panamensis e L.

peruviana. Já o subgênero Leishmania compreende os complexos L.

donovani (L. donovani, L. infantum e L. chagasi), L. mexicana (sendo as

espécies principais L. mexicana, L. amazonensis e L. venezuelensis) e L.

hertigi (este último complexo não parasita o homem). O subgênero

Leishmania ainda possui três espécies de importância clínica, mas que não

foram agrupadas em complexos: L. major, L. tropica e L. aethiopica

(Neves, 2005).

A transmissão mais comum da leishmaniose é através da picada da

fêmea do inseto hematófago, que ao fazer o repasto sanguíneo, passa a

forma promastigota da Leishmania para o hospedeiro mamífero, seja ele o

homem, o cão ou algum animal silvestre. Os hospedeiros vertebrados são

primariamente mamíferos, tais como cães e várias espécies de roedores

(Schmidt e Roberts, 1996). Porém são conhecidas também entre

edentados (tatu, tamanduá, preguiça), marsupiais (gambá), primatas e o

homem (Neves, 2005). Estes, por sua vez, atuam como reservatório de

infecção, contaminando insetos que não carregam o parasita, tornando

cíclico o seu modo de transmissão.

Outros modos de transmissão também podem ocorrer, mas com

menor freqüência, tais como: transfusão sanguínea, compartilhamento de

seringas através do uso de drogas injetáveis, transmissão congênita,

transmissão sexual e acidentes laboratoriais.

(a) Transfusão sanguínea: têm sido reportados casos em muitos


22

países, inclusive no Brasil. O parasita precisa estar no sangue periférico do

doador, sobreviver ao processo de estocagem do banco de sangue e

infectar o receptor (Neves, 2005).

(b) Compartilhamento de seringas: Em 1993, foram detectados

200 casos de HIV associado com leishmaniose na Espanha, e mais de

85% ocorreu com usuários de drogas (Alvar et al., 1997).

(c) Transmissão congênita: pelo menos 10 casos deste tipo de

transmissão foram reportados na literatura, sendo a maior parte dos

casos na Índia. A infecção deve ocorrer durante a troca do sangue

materno no tempo da passagem do feto no momento do nascimento

(Singh, 2006).

(d) Transmissão sexual: pode ser transmitida pela urina e fluidos

prostáticos através de pacientes contaminados (Singh, 2006).

(e) Acidentes laboratoriais: foram reportados casos de

contaminação através da auto-inoculação de materiais perfuro-cortantes

tanto com a forma promastigota como a forma amastigota (Neves, 2005).

3.2.2 Aspectos Clínicos da Leishmaniose

A leishmaniose pode ser uma doença lentamente progressiva e

demorar até sete anos para se tornar clinicamente aparente. Nesse caso,

seus sinais clínicos (tosse, diarréia, icterícia e sangramentos) são

freqüentemente confundidos com outras inúmeras doenças, dificultando o

diagnóstico da leishmaniose e retardando a sua identificação (Slappendel

e Ferrer, 1998; McConkey et al., 2002). Dependendo da espécie de

Leishmania, da localização geográfica e da resposta imune do hospedeiro,

a infecção em humanos pode resultar em várias formas clínicas de

leishmaniose particularmente diversas (www.dpd.cdc.gov).

No Homem a leishmaniose ocorre em pelo menos quatro grandes


23

formas: leishmaniose cutânea, difuso cutânea, mucocutânea e visceral.

(a) Leishmaniose Cutânea ou tegumentar (LC): considerada a

forma mais comum da doença, é caracterizada por lesões múltiplas

localizadas na pele, principalmente na face, braços e pernas, sendo elas

agudas ou crônicas. Embora as lesões possam freqüentemente se curar

espontaneamente, estas podem criar graves incapacidades permanentes e

cicatrizes. É causada pelas espécies L. major, L. tropica, L. mexicana, L.

amazonensis e espécies do subgênero Viannia, principalmente a L.

brasiliensis (Neves, 2005; Singh, 2006) (Figura 3A).

(b) Leishmaniose Mucocutânea (LMC): inicialmente começa como

uma lesão cutânea, que pode então se espalhar causando lesões

mucocutâneas que são frequentemente resistentes ao tratamento ou a

cura. Esta infecção é causada pelas espécies do subgênero Viannia, como

L. brasiliensis, L. panamensis ou L. guyanensis. (Cohen-Freue et al.,

2007). (Figura 3B).

(c) Leishmaniose cutâneo-difusa (LCD): ocorre em indivíduos com

deficiência na resposta imune celular. Severamente, causa lesões

disseminadas que se assemelham a lesões de lepra, nunca se curam

espontaneamente e estão sujeitas a recaídas após o tratamento (Alvar et

al., 1997; Desjeux, 2004) (Figura 3C).

(d) Leishmaniose Visceral (LV): Também conhecida como “Kala

azar” ou febre dumdum. Tem um período de incubação de vários meses a

vários anos, sendo a forma mais severa da leishmaniose, tem uma taxa

de mortalidade de quase 100%, se não tratada, e difere da leishmaniose

cutânea por envolver os órgãos internos. É causada por espécies do

complexo L. donovani, caracterizando-se por febres ondulantes, perda de

peso, esplenomegalia, hepatomegalia e/ou linfoadenopatias e anemia


24

(Figura 3D). Após a recuperação, os pacientes podem desenvolver uma

forma crônica chamada leishmaniose dérmica pós-calazar (PKDL – “post

Kala-azar dermal leishmaniasis”), que normalmente requer um tratamento

longo e caro (Desjeux, 2004; Neves, 2005) (Figura 3E).

(A) (B) (C) (D) (E)

L. infantum é considerado o principal agente associado à

leishmaniose canina, e por isso, as infecções em cães são freqüentemente

consideradas como visceral. Porém, os cães podem adquirir tanto a

leishmaniose visceral quanto a cutânea (Slappendel e Ferrer, 1998).

3.2.3 Impacto da Doença

A leishmaniose é considerada a segunda principal doença causada

por protozoários no mundo, perdendo em incidência apenas para a Malária

(www.vet.uga.edu). Atualmente, a leishmaniose é considerada endêmica

em 88 países, 72 dos quais são países em desenvolvimento, e, dentro

destes, 13 estão entre os países menos desenvolvidos do mundo

(Desjeux, 2004) (Figura 4).

Figura 3. Manifestações clínicas da leishmaniose. (A) Leishmaniose cutânea ou tegumentar; (B) Leishmaniose mucocutânea; (C) Leishmaniose cutânea-difusa; (D) Leishmaniose visceral; (E) Leishmaniose dérmica pós-calazar (PKDL). Fonte: http:// www.who.int/tdr


25

A leishmaniose é uma das infecções oportunistas que atacam os

indivíduos infectados por HIV, e a maioria das co-infecções envolve a

forma de leishmaniose visceral. Ela acelera a manifestação da AIDS

acumulada por imuno-supressão e pelo estímulo à replicação do vírus.

Também pode alterar infecções que são assintomáticas em sintomáticas.

Além disso, a leishmaniose visceral pode ser propagada junto com o vírus

da AIDS por via endovenosa, a partir do uso de agulhas por drogas

intravenosas. Até 1999, 31 países relataram a existência de uma co-

infecção Leishmania/ HIV. (www.who.int) (Figura 05).

(A) (B)

No Brasil, já foram descritas seis espécies de Leishmania causadoras

de leishmaniose cutânea, sendo L. brasiliensis a mais freqüente. No

período de 1970 a 2001, o número de casos variou de 3.000 para 37.000

e a partir da década de 90, os casos apresentaram um pequeno aumento,

com grande variação anual. (FUNASA, 2002a). A Leishmaniose visceral,

Leishmaniose CutâneaPaíses mais endêmicos (90% dos casos)

Países mais endêmicos - Leishmaniose cutânea

Leishmaniose CutâneaPaíses mais endêmicos (90% dos casos)

Países mais endêmicos - Leishmaniose cutânea

Leishmaniose VisceralPaíses mais endêmicos (90% dos casos)

Países mais endêmicos - Leishmaniose visceral

Leishmaniose VisceralPaíses mais endêmicos (90% dos casos)

Países mais endêmicos - Leishmaniose visceral

Figura 4. Mapa da distribuição geográfica dos países com maior prevalência da leishmaniose. (A) ilustra países que possuem maior prevalência da leishmaniose cutânea. Em (B), os países com maior prevalência em leishmaniose visceral. Fonte: http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps/en/index2.html


26

causada pela L. chagasi, atinge 19 estados especialmente da região

Nordeste, onde se concentram mais de 90% dos casos humanos da

doença. Há focos importantes também nas regiões Norte, Sudeste e

Centro-Oeste, sendo que nas duas últimas décadas tem havido um

crescente aumento da incidência, com uma média anual nos últimos cinco

anos de 3500 casos (FUNASA, 2002b).

3.2.4 Ciclo Evolutivo

O ciclo de vida da Leishmania envolve uma alternância entre o

hospedeiro vertebrado e o inseto vetor. E como resultado o parasita

encontra extremas mudanças ambientais e reponde a essas mudanças

através de diferenciação em formas altamente adaptadas que o permite

LeishmanioseCo-infecçãoLeishmanioseCo-infecção

Figura 5. Mapa da distribuição geográfica da Leishmaniose e da co-infecção Leishmaniose/HIV. O azul claro ilustra a distribuição da leishmaniose no mundo, enquanto que o azul escuro mostra os pontos onde ocorre a co-infecção Leishmaniose/HIV. Fonte: http://www.who.int/csr/resources/figure231.gif


27

invadir e proliferar dentro de seus hospedeiros (Barak et al., 2005). As

formas amastigotas de Leishmania são encontradas parasitando células do

sistema mononuclear do hospedeiro vertebrado, principalmente

macrófagos residentes na pele, sobrevivendo e se multiplicando nestas

células. O inseto vetor ao fazer o repasto sanguíneo ingere, junto com o

sangue, macrófagos parasitados por estas formas. Ao chegarem ao

estômago, os macrófagos se rompem e liberam as amastigotas, que

sofrem uma divisão binária e se transformam rapidamente em

promastigotas dentro do sangue que está envolto por uma membrana

peritrófica secretada pelas células do estômago do inseto. Este membrana

se rompe entre o terceiro e quarto dia, liberando as formas promastigotas

(Neves, 2005) (Figura 6).

Um padrão diferente de desenvolvimento de promastigotas é

Figura 6. Ciclo de vida da Leishmania. Foto ilustrando as formas encontradas nos hospedeiros invertebrados (promastigotas) e vertebrados (amastigotas) e como ocorre a transmissão entre os hospedeiros. Fonte: http:// www.who.int/tdr/diseases/leish/lifecycle.html


28

observado nos dois subgêneros, Leishmania e Viannia, onde os membros

do primeiro subgênero desenvolvem-se exclusivamente no intestino médio

e posterior dos vetores (desenvolvimento suprapilário), enquanto que no

segundo desenvolvem-se primeiramente no intestino posterior dos

vetores, e depois migram para o intestino médio e anterior

(desenvolvimento peripilário). (Lainson e Shaw, 1987; Gossage et al.,

2003). Após esta etapa, em ambos os subgêneros, o parasita se

transforma em paramastigotas, e a partir deste ponto ocorre a

metaciclogênese, onde as células migram para a parte anterior do tubo

digestivo do vetor e atingem o estágio infectivo, se transformando em

promastigotas metacíclicas. O tempo necessário para a ocorrência destas

mudanças varia de três a cinco dias, dependendo da espécie de

Leishmania (Neves, 2005).

A transmissão para o hospedeiro vertebrado se dá quando o inseto

infectado realiza o repasto sanguíneo. Ao ingerir o sangue do hospedeiro

vertebrado, as formas metacíclicas são introduzidas no local e em quatro

a oito horas os parasitas são englobados pelos macrófagos teciduais. As

formas amastigotas são encontradas 24 horas após a fagocitose, se

dividem por divisão binária e rompem a membrana do macrófago, sendo

liberadas novas amastigotas que são novamente fagocitadas, iniciando no

local uma reação inflamatória (Neves, 2005) (Figura 6).

As formas promastigotas metacíclicas utilizam mecanismos que

permitem resistir à ação de elementos do soro do vertebrado,

principalmente do sistema complemento, onde proteínas de superfície do

parasita como a GP-63 (Glicoproteína de 63KDa) e a LPG (complexo

lipofosfoglicano) possuem papéis fundamentais (Neves, 2005). Além

disso, eles são injetados no local da picada juntamente com potentes

vasodilatadores que produzem eritremas de longa duração, facilitando a

sua penetração na corrente sanguínea (Singh, 2006). O pH desempenha

um papel central na transformação de promastigotas em amastigotas, e


29

as formas amastigotas apresentam uma maior atividade metabólica

estando em ambiente ácido, embora o citoplasma da amastigota seja

regulado para se manter em um pH próximo do neutro (Burchmore e

Barrett, 2001).

3.2.5 Cultivo dos Parasitas

A maior parte das informações metabólicas, bioquímicas e biológicas

da Leishmania é devido a inúmeros estudos na forma promastigota, pois

suas culturas são de fácil manutenção in vitro e esta pode ser obtida

facilmente em grande quantidade. Contudo, a forma amastigota é

responsável pelas manifestações clínicas nos hospedeiros vertebrados e os

quimioterápicos e vacinas precisam ser desenvolvidos contra esse estágio

do ciclo de vida do parasita. A forma amastigota, entretanto, tem seu

estudo restrito devido a limitações no seu cultivo in vitro e a dificuldades

na obtenção de grandes quantidades de células viáveis, e livres de

contaminação, a partir de hospedeiros de laboratório. Além disso,

amastigotas isoladas a partir de tecidos infectados representam

populações heterogêneas e, durante o processo de infecção,

presumivelmente, diferem em relação ao seu estágio de desenvolvimento

(Joshi et al., 1993; Debrabant et al., 2004).

A diferenciação de promastigotas em amastigotas em cultura

(axênicas) tem sido reportada utilizando apenas uma temperatura mais

elevada (32-37ºC) ou em combinação com uma diminuição do pH do meio

(Bates, 1993; Zilberstein e Shapira, 1994). Em um estudo com curvas de

crescimento em promastigotas para observação do processo de

diferenciação celular, foi visto que quanto maior o número de células

metacíclicas presentes no meio, maior a percentagem de diferenciação

das células em amastigotas axênicas. Neste mesmo estudo foi observado


30

também que o número de repiques realizado está diretamente ligado com

a diminuição do aparecimento de células infecivas metacíclicas. Numa

cultura com 73% de células metacíclicas, a diferenciação em amastigotas

axênicas conseguida foi de 100% (Cysne-Finkelstein et al., 1998). Outros

estudos mostraram que amastigotas axênicas podem ser virulentas “in

vitro” e “in vivo” e infectar células de hamsters, camundongos e

macrófagos, porém, a diferenciação em meio de cultura diminui a

virulência a longo prazo e produz células atenuadas (Gupta et al., 2001;

Debrabant et al., 2004). Alguns estudos abordam vários critérios no

intuito de mostrar similaridades entre a amastigota in vitro e in vivo,

porém, ainda restam controvérsias sobre a reprodutibilidade e/ou o tempo

certo da transformação do parasita (Gupta et al., 2001; Teixeira et al.,

2002, Debrabant et al., 2004; Cohen-Freue et al., 2007).

3.3 Características da biologia molecular dos Tripanosomatídeos

Os tripanossomatídeos são organismos bastante atípicos que

divergiram precocemente na evolução dos eucariotos e apresentam

características moleculares únicas nos mecanismos de síntese e

processamento de seus mRNAs. Nestes organismos os genes codificadores

de proteínas são organizados em blocos numa mesma fita de DNA, não

possuem íntrons (com exceção do gene da poli-A polimerase) e são

transcritos de forma policistrônica a partir de sequencias promotoras não

definidas. Esses policístrons formam mRNAs monocistrônicos maduros

através do mecanismo de processamento em “trans” (“trans-splicing”),

que difere do processamento em “cis” (“cis-splicing”), típico da maioria

dos eucariotos (Myler e Stuart, 2000; Clayton, 2002; Campbell et al.,

2003; Liang et al., 2003).

O processamento em “trans” do pré-mRNA policistrônico acrescenta,


31

na região 5’, uma sequência denominada spliced leader (SL), de 39

nucleotídeos, que é característica apenas de mRNAs dos

tripanosomatídeos tratando-se de um substrato comum utilizado em todas

as reações desse processamento (Liang et al., 2003). Na extremidade 5’

do spliced leader é encontrada uma estrutura cap modificada, denominado

de cap4. Em outros organismos, foi observado que esta estrutura possui

um importante papel na estabilidade e transporte dos mRNAs e na

iniciação da tradução (Liang et al., 2003; Gu e Lima, 2005).

Os tripanossomatídeos possuem escassez de promotores para a RNA

polimerase II (RNAPII), e, com isso, não há nenhuma regulação

quantitativa ao nível de transcrição para a maioria dos genes que

codificam proteínas (Campbell et al., 2003). A conseqüência principal

destes mecanismos atípicos de síntese e processamento dos mRNAs nos

tripanosomatídeos é que a regulação da expressão de genes é

predominantemente pós transcricional, ou seja, ao nível de controle da

estabilidade dos mRNAs e controle da sua utilização na síntese de

proteínas (Clayton, 2002).

3.3.1 RNA Polimerases, Promotores e Transcrição Policistrônica

Os tripanosomatídeos possuem cópias das três RNA polimerases

(RNAP) eucarióticas, altamente conservadas. Foi observado que a RNAPI

atua caracteristicamente transcrevendo os genes dos pré-RNAs

ribossomais (pré-rRNAs) 18S, 5,8S e 28S. Em T. brucei, porém, esta

enzima também transcreve dois tipos de mRNAs que são estágio

específicos e codificam proteínas de superfíce: a variante protéica da

glicoproteína, VSG, da forma sanguínea; e as prociclinas EPs e GEETs da

forma procíclica (Gunzl et al., 2003). Portanto, T. brucei é o único

organismo reportado até agora que utiliza a RNAPI para transcrever genes


32

que codificam proteínas (Devaux et al., 2006).

A RNAPII atua na transcrição dos mRNAs, como em outros

eucariotos, e também na transcrição do mRNA precursor que codifica a

seqüência SL, também chamada de mini-éxon (Gilinger e Bellofatto,

2001). Já a RNAPIII transcreve RNAs transportadores (tRNAs), o rRNA 5S

e pequenos RNAs nucleares (snRNAs) ricos em uridina (Palenchar e

Bellofatto, 2006). Ainda não foram caracterizados promotores para a

RNAPII, com exceção do promotor da SL. Com isso, o conhecimento sobre

a transcrição de proteínas dependentes da RNAPII em tripanossomatídeos

se dá através da comparação com o que ocorre na transcrição do gene da

SL (Clayton, 2002). Mais recentemente, contudo, estudos realizados no

cromossomo 1 de Leishmania major mostram uma transcrição

policistrônica bidirecional de 79 genes, onde ocorre a transcrição de 50

ORFs (Open Reading Frame) em uma fita do DNA e de 29 ORFs restantes

na fita oposta. Ao que parece, a transcrição pela RNAP II se inicia em um

elemento promotor, próximo ao centro, e procede ininterruptamente em

direção às extremidades, transcrevendo as múltiplas ORFs (Myler et al.,

1999; Martinez-Calvillo et al., 2003).

Na transcrição policistrônica, então, os pré-mRNAs são sintetizados,

a partir de um único promotor, ao longo de centenas de kilobases,

gerando transcritos independentes através de reações acopladas de

processamento em “trans” e poliadenilação (Liang et al., 2003). Todavia,

diferentemente dos operons bacterianos, estas diferentes seqüências

codificadoras não estão relacionados em termos de funcionalidade ou

expressão temporal das proteínas codificadas (Campbell et al., 2003).


33

3.3.2 Processamento de mRNAs – “Trans-splicing” e

Poliadenilação

O processamento do mRNA é um mecanismo chave para a

transformação de precursores em mRNAs maduros prontos para serem

utilizados na síntese protéica. Este processo pode exercer um papel crítico

na regulação da expressão gênica em uma variedade de eucariotos. Duas

formas de processamento têm sido reportadas em eucariotos. A maioria

dos eucariotos utiliza o processamento em “cis”, processo que remove os

íntrons de mRNAs precursores, gerando mRNAs maduros (FIGURA 7A). O

processamento em “trans” é um processo menos conhecido e aparece

mais comumente no grupo de protozoários pertencentes a ordem

Kinetoplastida, o que inclui os tripanossomatídeos (Hastings, 2005)

(FIGURA 7B).

O “trans-splicing” foi primeiramente descoberto em T. brucei e já foi

confirmado em outros tripanossomatídeos, incluindo membros dos

gêneros Leishmania, Leptomonas, Trypanosoma, Crithidia e Phytomonas.

Este também é muito freqüente em nematóides, alguns trematóides e

Euglena spp. (Nilsen, 1993). O processamento em “trans” ocorre através

de uma transesterificação formando uma estrutura em “Y” em lugar do

laço intermediário que ocorre no processamento em “cis” (Liang et al.,

2003). Essa reação envolve a adição da sequência SL, junto com o cap4,

na extremidade 5’ dos mRNAs (Zick et al., 2005). Acoplado à

poliadenilação dos RNAs na sua região 3´, esse processamento leva à

formação dos mRNAs maduros (Liang et al., 2003).


34

DNA

Transcrição e adição do Cap

Poliadenilaçãoéxon 1 intron 1 éxon 2 intron 2 intron 3 éxon 4

éxon 1 intron 1 éxon 2 intron 2 intron 3 éxon 4éxon 3


AAAAAAAAAAAA

“Cis-splicing”

éxon 1 éxon 2 éxon 3 AAAAAAAAAAAAéxon 4

éxon 3

Transporte núcleo/citoplasma e Tradução

AAAAAAAAAAAAA

Transcrição e “Cis-splicing” em Eucariotos

promotorCap

Regiões intergênicasCauda poli-A

Ribossomo

DNA

Transcrição e adição do Cap

Poliadenilaçãoéxon 1 intron 1 éxon 2 intron 2 intron 3 éxon 4



AAAAAAAAAAAA

“Cis-splicing”

éxon 1 éxon 2 éxon 3 AAAAAAAAAAAAéxon 4

éxon 3


AAAAAAAAAAAAA

Transcrição e “Cis-splicing” em Eucariotos

promotorCap

Regiões intergênicasCauda poli-A

Ribossomo

(A)

RNA policistrônico

Transcrição policistrônica

DNA Gene 1 Gene 2 Gene 3 Gene 4 Gene 5

Trans-splicing, adição do cap e poliadenilaçãoRNAs monocistrônicos


TRADUÇÃO

AAAAAAAA

promotorCapSplicer LeaderRegiões intergênicasCauda poli-ARibossomo

mRNA 1 mRNA 2 mRNA 3 mRNA 4 mRNA 5

Transcrição e “trans-splicing” em tripanosomatídeos

RNA policistrônico

Transcrição policistrônica

DNA Gene 1 Gene 2 Gene 3 Gene 4 Gene 5

Trans-splicing, adição do cap e poliadenilaçãoRNAs monocistrônicos


TRADUÇÃO

AAAAAAAA

promotorCapSplicer LeaderRegiões intergênicasCauda poli-ARibossomo

mRNA 1 mRNA 2 mRNA 3 mRNA 4 mRNA 5

Transcrição e “trans-splicing” em tripanosomatídeos(B)

Figura 07. Esquema ilustrando a transcrição e o processamento de mRNAs. Em (A), a transcrição e o processamento do mRNA em “cis” (“cis-splicing”) que ocorre nos eucariotos em geral e em (B) o processamento em “trans” (“trans-splicing”) do mRNA que ocorre em tripanosomatídeos.


35

O “trans-splicing” e a poliadenilação são processos acoplados que

aparentemente são regulados por sinais hierárquicos que ocorrem em

seqüências de polipirimidina intergênicas (Hug et al., 1994). Nenhuma

região específica clássica, tais como os sinais de poliadenilação (AAUAAA)

em eucariotos superiores, parece estar presente nos RNAs mensageiros

dos tripanossomatídeos. Resíduos de adenosina, quando repetidos

principalmente, parecem ser alvos preferenciais da poliadenilação (Liang

et al., 2003).

3.3.3 Cap4

Todos os mRNAs de células eucarióticas (exceto os das organelas)

possuem uma estrutura conhecida como cap na região 5’ dos mRNAs,

composta por um resíduo de 7-metil-guanosina (m7GTP) ligado ao

nucleosídeo inicial do transcrito por uma ponte trifosfato (Gingras et al.,

1999). A estrutura do cap no mRNA de eucariotos é formado pela ação

seqüencial de três enzimas. Um dos três fosfatos presente na região 5’

dos pré-mRNAs é clivado pela ação da RNA trifosfatase, na presença de

cátions divalentes (Ho e Shuman 2001). Esta reação permite a

transferência do GMP para GTP através da enzima guanililtransferase, na

porção 5’ difosfato para formar o GpppN (Silva et al., 1998). Ocorre então

a metilação na posição N-7 da guanosina pela ação da (guanina N-7)

metiltransferase (Shuman, 2001).

Nos tripanosomatídeos o cap é modificado por sete metilações,

composta de 2’-O-metilações na ribose dos primeiros quatro nucleotídeos

(AACU), com metilações adicionais sobre as bases do primeiro (m6,6A) e

do quarto (m3U) nucleotídeos, formando a estrutura altamente complexa

m7 guanosina (5’) ppp-N6,N6,2’-O-tri-metil-adenosina-p-2’-O-metil-


36

adenosina-p’-2’-O-metil-citosina-p-3,2’-O-di-metil-uridina, que foi

denominada de Cap4 (Bangs et al., 1992; Mair Ullu and Tschudi, 2000).

Ao contrário dos demais eucariotos, a sua adição aos mRNAs ocorre em

uma etapa pós-transcricional, quando da inserção da sequência SL pelo

“trans-splicing” (Mair, Ullu e Tschudi, 2000). Foi sugerido que a enzima

cap metiltransferase poderia ser alvo de promissoras drogas contra

tripanossomatídeos, uma vez que o mecanismo de formação e estrutura

do cap são fundamentalmente diferentes das do hospedeiro (Tschudi e

Ullu 2002), mas apenas as enzimas RNA trifosfatase e guanililtransferase

foram bem caracterizadas bioquimicamente (Silva et al., 1998; Ho e

Shuman, 2001). No entanto, um trabalho recente foi publicado

caracterizando também a (guanina N-7) metiltransferase de T. brucei

(Hall e Ho, 2006). Apesar das evidências mostrarem que há uma

necessidade da presença do cap durante o processamento em “trans”, sua

função ainda não foi totalmente esclarecida. Porém, a presença da

estrutura cap4, juntamente com os elementos da seqüência SL pode ter

uma função importante na tradução dos tripanosomatídeos (Zamudio et

al., 2006).

3.4 Controle da Expressão Gênica nos Tripanossomatídeos

O controle da expressão gênica pode ser realizado em vários níveis

como, por exemplo, na transcrição, no processamento pós-transcricional

do mRNA, na sua degradação, na tradução, via modificações pós-

traducionais e na degradação de proteínas (Meijer e Thomas, 2002). Nos

eucariotos, a regulação da expressão gênica é principalmente regulada ao

nível transcricional, pela modulação da ação da RNA polimerase II. Mais

de trinta genes de regulação estágio-específica foram estudados em

tripanossomatídeos, e nenhuma evidência de regulação de sua


37

transcrição, pela polimerase II, ou de regulação de seu processamento, ao

nível de poliadenilação ou trans-splicing, foi observada. Pelo contrário, a

regulação da expressão de genes estágio-específicos parece ocorrer

principalmente no nível pós-transcricional, mediada por seqüências na

região 3’ UTR dos mRNAs, que determinam a sua abundância, modulando

sua degradação. As mesmas seqüências regulatórias, com freqüência,

também modulam a eficiência da tradução dos mRNAs (Clayton, 2002).

A regulação da tradução desempenha um papel crítico no

crescimento, na proliferação e no desenvolvimento celular. Vantagens no

controle da tradução incluem resposta rápida e um modo de atingir o nível

de um produto gênico na ausência de transcrição. Todos os elementos do

mRNA maduro, no sentido 5’-3’, a estrutura cap, a região 5’ UTR, a ORF, a

região 3’ UTR e a cauda poli-A, contribuem para uma tradução eficiente do

mRNA. Quando a sequência 5’ UTR é analisada, certas características

podem sugerir um controle deste mRNA. Por exemplo, as regiões 5’ UTR

que possuem níveis de tradução eficientes são curtas, possuem baixo teor

das bases GC, são relativamente não estruturadas e não contem códons

AUG (Kochetov et al., 1998). A região 3’ UTR também parece participar da

regulação da expressão gênica. A tradução da proteína amastina de

Leishmania se mostrou mediada por seqüências dentro da região 3’ UTR

do seus diferentes mRNAs que variam em tamanho e composição (Wu et

al., 2000; Boucher et al., 2002). Uma característica da região regulatória

destes mRNAs é a presença de uma seqüência de aproximadamente 450

nucleotídeos que é altamente conservada, não apenas na maioria dos

transcritos da amastina (Rochette et al., 2005), mas também está

presente em vários outros mRNAs de Leishmania, incluindo conhecidos

mRNAs específicos de amastigotas (Boucher et al., 2002). Acredita-se que

esta seqüência atue no nível de regulação da tradução dos respectivos

mRNAs.


38

3.5 Biossíntese Protéica

A síntese protéica, também conhecida como tradução, é um ponto

importante do controle da expressão gênica. Este processo é responsável

pelas estruturas básicas dos seres vivos, sendo um dos mais importantes

para a sobrevivência tanto de organismos procariontes como de

eucariontes. A tradução do mRNA em proteínas se inicia após a montagem

do ribossomo 80S através da interação entre tRNA iniciador (tRNAi),

mRNA e as subunidades 40S e 60S. As taxas de tradução podem ser

controladas em cada um dos seus três estágios: iniciação, elongação e

terminação. Enquanto que as fases de elongação e terminação são

assistidas por um grupo limitado de fatores, a iniciação da tradução é um

evento complexo, sendo auxiliado por mais de 25 polipeptídeos (Gerbauer

e Hentze, 2004). Dentre estes três estágios, a iniciação parece ser o

principal alvo da regulação da tradução, uma vez que é nessa fase que o

ribossomo é recrutado ao RNA mensageiro e posicionado corretamente no

códon AUG de iniciação da tradução (Prevôt, Darlix e Ohlmann, 2003).

3.5.1 Iniciação da Tradução

O complexo processo de iniciação da tradução que leva a montagem

do ribossomo 80S consiste em vários estágios relacionados que são

mediados por proteínas conhecidas como fatores de iniciação da tradução

eucarióticos (eIFs - eukaryotic initiation factors) (Pestova et al., 2001).

Estes estágios incluem:

(1) Seleção do RNA transportador inicial (tRNAi), a partir do

conjunto de tRNAs celulares, pelo fator de iniciação eIF2 e montagem do

complexo ternário (eIF2 / GTP / tRNAi). Ligação deste complexo a outros

eIFs e a subunidade 40S para formar o complexo de pré-iniciação 43S;


39

(2) Ligação do complexo 43S ao mRNA, o que na maioria das vezes

ocorre por um mecanismo que envolve o reconhecimento inicial do cap na

extremidade 5' do mRNA pela subunidade eIF4E (cap-binding-protein) do

complexo eIF4F;

(3) Movimento do complexo ribossomal ligado ao mRNA ao longo da

região 5' não traduzida (5' UTR), a partir do sítio inicial de ligação até o

códon AUG de iniciação da tradução. O complexo inicial 48S é formado e o

códon AUG tem suas bases pareadas com as bases do anticódon do tRNAi;

(4) Dissociação dos fatores de iniciação da tradução do complexo

48S e junção da subunidade 60S para formar o ribossomo 80S, deixando

o tRNAi no sítio P ribossomal (Hershey e Merrick, 2000; He et al., 2003;

Prevôt, Darlix e Ohlmann, 2003; Gerbauer e Hentze, 2004).

3.5.1.1 Complexo eIF4F e PABP

Dentre os inúmeros fatores de iniciação da tradução que participam

do processo de biossíntese protéica, o complexo eIF4F se destaca por ter

papel crucial no recrutamento do ribossomo para interação com o mRNA e

no posicionamento correto no códon AUG. O papel proposto ao complexo

eIF4F é se ligar a extremidade 5’ do mRNA, desfazer quaisquer estruturas

secundárias aí encontradas, e então facilitar a associação do complexo

43S na agora desestruturada extremidade 5’. O complexo eIF4F também

auxilia a subunidade menor ribosomal na sua migração ao longo do mRNA

até encontrar o códon AUG (Kapp e Lorsch, 2004).

O eIF4F é composto de três subunidades conhecidas como eIF4A,

eIF4E e eIF4G. O fator eIF4E, também conhecido por proteína de ligação

ao cap, é responsável pelo reconhecimento do cap presente nos mRNAs

eucarióticos, recrutamento dos outros fatores de iniciação e por último da

subunidade 40S para o mRNA (Prevôt, Darlix e Ohlmann, 2003). O eIF4A


40

é uma RNA helicase, de 46 kDa que age removendo regiões de estrutura

secundária dentro da região 5' não traduzida (5' UTR) do mRNA,

facilitando a ligação da subunidade menor ribossomal e permitindo sua

migração até o códon de iniciação da tradução (Sonenberg e Dever,

2003). O eIF4G é uma proteína de alto peso molecular que interage com

diferentes proteínas celulares e virais, incluindo os fatores de iniciação da

tradução (Gingras et al., 1999). Este fator possui sítios de ligação para o

eIF4E, eIF4A, eIF3 e PABP (Proteína de ligação á cauda poli-A). Sua

interação com o eIF3, associado à subunidade menor ribossomal, e com o

complexo eIF4E/cap-mRNA, promove o reconhecimento do mRNA por esta

subunidade e a formação do complexo 48S (Gross et al., 2003).

O eIF4G possui também na sua região N-terminal um sítio de

ligação com a PABP. A ligação simultânea do eIF4G, com a proteína de

ligação ao cap, eIF4E, e a PABP associada com a cauda poli-A pode trazer

a porção 3’ do RNA para perto da região 5’ e fazer com que o mRNA

circularize (FIGURA 8). Esta circularização seria responsável tanto pela

“reciclagem” dos ribossomos, que após o término da síntese da cadeia

polipeptídica voltariam à região 5´, quanto por estimular a interação entre

o eIF4E e o cap (Wells et al., 1998; Lloyd, 2006).

A PABP de eucariotos possui 70KDa e é a maior proteína

citoplasmática que se liga ao mRNA. É uma proteína conservada

filogeneticamente, interage com a cauda poli-A dos mRNAs eucarióticos e

com várias outras proteínas, incluindo o eIF4G. Por isso, participa da

iniciação da tradução e tem sido reconhecida como um verdadeiro fator de

iniciação da tradução (Sachs e Varani, 2000; Kuhn e Wahle, 2004). A

PABP contém quatro motivos de reconhecimento do RNA (RRM) no seu

domínio N-terminal que estão envolvidos tanto na ligação com o mRNA

quanto com o eIF4G. Além de participar da iniciação da tradução, outros

estudos realizados mostraram que a PABP interage com o fator eRF3,

envolvido na terminação da tradução (Bruzik et al., 1988). Esta proteína


41

também possui um papel na poliadenilação de transcritos nucleares e na

estabilidade e decaimento dos mRNAs (Couttet et al., 1997; Gallie, 1998;

Mangus, Amrani e Jacobson, 1998; Hoshino et al., 1999).

3.5.1.2 eIF4E : Estrutura e Função

A biossíntese protéica em eucariotos é altamente dependente da

presença da estrutura m7GTP-cap, e o reconhecimento desta estrutura na

iniciação da tradução é feito pelo eIF4E. Este fator é uma fosfoproteína de

24 kDa que possui uma estrutura tridimensional filogeneticamente

conservada desde leveduras até vertebrados (Hershey e Merrick, 2000).

Ela possui na sua organização uma superfície côncava, rica em resíduos

hidrofóbicos, constituída de oito fitas β antiparalelas (Sonenberg e Dever,

AAAAAAAAAAAAAAAA

Cap4

eIF4GeIF4G

PABPPABP

40S40S

Met.eIF3eIF3

PABPPABP PABPPABP

eIF4AeIF4A

eIF4EeIF4E AUG

AAU

5’ UTR

3’ UTRmRNA

AAAAAAAAAAAAAAAA

Cap4

eIF4GeIF4G

PABPPABP

40S40S

Met.eIF3eIF3

PABPPABP PABPPABP

eIF4AeIF4A

eIF4EeIF4EeIF4EeIF4E AUG

AAU

5’ UTR

3’ UTRmRNA

Figura 8. Esquema da iniciação da tradução cap-dependente. Esquema ilustrando a associação do complexo de iniciação da tradução EIF4F (formado pelas subunidades eIF4A, eIF4E e eIF4G) com a PAPB, ligada a cauda poli-A na extremidade 3’ do mRNA. Essa associação causa a circularização do mRNA, e facilita o recrutamento do complexo 43S para o local, iniciando a tradução.


42

2003). O reconhecimento do cap é mediado pelo empacotamento entre os

triptofanos W56 e W102, formando 3 pontes de hidrogênio com a cadeia

lateral do ácido glutâmico E103, e interação por forças de van der Waals

com o grupo metil N(7) do triptofano W166 (aminoácidos referentes ao

eIF4E humano). Estes quatro resíduos fazem contato com a 7-metil

guanosina e são conservados entre a maioria dos eIF4Es conhecidos

(Marcotrigiano et al., 1997).

A atividade do eIF4E é regulada em vários níveis: via modulação de

sua transcrição, através de sua interação com a família de proteínas

ligadoras ao 4E (4EPB’s) e por fosforilação (Raught e Gingras, 1999). O

controle transcricional da síntese do eIF4E ainda não está bem

esclarecido, mas sabe-se que o seu promotor contém dois sítios de ligação

myc, sendo ambos necessários para a expressão do gene em sistemas

heterólogos (Jones et al., 1996). A atividade do eIF4E no complexo eIF4F

é limitada por proteínas da família 4EPB (4EPB1, 4EPB2 e 4EPB3) que

funcionam como sequestradores do eIF4E e assim inibem a tradução cap-

dependente (Sonenberg, 1996). O sítio de ligação das 4E-BPs ao eIF4E é

praticamente o mesmo encontrado no eIF4G, portanto, a função destas

proteínas seria mimetizar o fator eIF4G, competindo pela ligação com o

eIF4E (Sachs e Varani, 2000). A ligação destas proteínas aumenta a

afinidade do eIF4E pelo cap, mas impede a formação do complexo eIF4F

por impedir a associação do eIF4E com o eIF4G e, com isso, impede a

iniciação da tradução (Haghighat et al., 1995). O eIF4E também participa

de forma crucial no controle do ciclo celular (Strudwick e Borden, 2002).

Sua superexpressão causa perda do controle do ciclo celular e está

associada a uma série de tumores humanos (De Benedetti e Rhoads,

1990).

O fator eIF4E tem sido estudado numa variedade de organismos, em

muitos casos revelando a existência de múltiplos homólogos. Células de

mamíferos contêm três diferentes isoformas do eIF4E. Todas estas


43

proteínas ligam-se ao m7GTP, mas elas variam na habilidade de interagir

com eIF4G e com membros da família de repressores eIF4E-BP. A exata

função de todas as diferentes isoformas do eIF4E não foi totalmente

esclarecida (von der Haar et al., 2004), porém o eIF4E possui

considerável conservação filogenética, especialmente no sítio de ligação

ao cap (Tomoo et al., 2002) e demonstrou ser capaz de se ligar a

análogos da estrutura cap, principalmente no cap monometilado (m7GTP)

e, em alguns casos, na sua variante tri-metilada em nematóides (Keiper

et al., 2000).

3.5.1.3 Modificações Pós-Traducionais - Fosforilação do eIF4E

As modificações pós-traducionais, como fosforilação, glicosilação,

acetilação, metilação, entre outras, são encontradas com bastante

frequência nas proteínas em geral. Eventos de fosforilação, observados

em fatores de iniciação da tradução, atuam através de mecanismos ainda

pouco conhecidos que ajudam na regulação da biossíntese protéica.

Dentre estes fatores, já vem sendo estudada a fosforilação do fator eIF4E,

principalmente em humanos (Hiremath et al., 1989; Joshi et al., 1995;

Wang et al., 1998; Scheper et al., 2002; Zuberek et al., 2003). Durante o

ciclo celular, a fosforilação do eIF4E é baixa no período G0, aumenta

através das fases G1 e S e é radicalmente reduzida na fase M, em direta

correlação com a atividade de tradução (Bonneau e Sonenberg, 1987). O

eIF4E também começa a desfosforilar depois de choques de temperatura,

juntamente com a diminuição dos níveis de tradução, porém, nem sempre

a fosforilação do eIF4E e o aumento dos níveis de tradução estão

correlacionados. Estudos mostraram que quando a célula recebe algum

tipo de estresse (como, por exemplo, com arsênio ou anisomicina), induz

um aumento na fosforilação do eIF4E, enquanto que os níveis de tradução


44

diminuem drasticamente (Morley e McKendrick, 1997; Wang et al., 1998;

Dolniak et al., 2008). Neste caso, a diminuição da síntese protéica parece

causar um efeito negativo em outros componentes da maquinaria de

tradução. É possível que a fosforilação do eIF4E seja de fato um

mecanismo compensatório na indução do estresse tentando estimular a

biossíntese protéica (Gingras et al., 1999; Dolniak et al., 2008).

O eIF4E de mamíferos é fosforilado em um resíduo único, a serina

209 (S209) (Joshi et al., 1995), pelas quinases Mnk1 e Mnk2, que estão

associadas ao eIF4G, e essa fosforilação ocorre em resposta a vários

estímulos extracelulares (Gingras et al., 1999). Ensaios de fosforilação

com eIF4Es mutantes incapazes de se ligar ao eIF4G mostraram que eles

eram ineficientes para a fosforilação pela Mnk1 “in vivo”, sugerindo que

essa fosforilação só deve ocorrer quando o eIF4E se encontra ligado ao

eIF4G (Dever, 1999). Dados obtidos em 1994 sugerem que essa

fosforilação no eIF4E causa um aumento na afinidade pelo cap (Minich et

al., 1994), porém, dois estudos mostraram contradições a respeito destes

resultados, onde foi observado que a fosforilação causa a diminuição da

afinidade tanto do cap, como de alguns análogos ao cap (Scheper et al.,

2002; Zuberek et al., 2003). Baseado em estudos de cristalografia do

eIF4E de camundongo, acredita-se que a S209 fosforilada forma uma

ponte salina com a K159 e estabiliza a ligação do eIF4E com o cap

(Marcotrigiano et al., 1997). Esse resultado estaria de acordo com os

dados anteriores de que o eIF4E fosforilado possuiria mais afinidade ao

cap.

Dois mecanismos de ativação de quinases em cascata têm sido

caracterizados na regulação por fosforilação da atividade do eIF4E. O

primeiro provém da quinase PI3 e envolve as proteínas Akt e TOR. Esse

mecanismo influencia a fosforilação do ativador traducional rpS6 via

quinase ribossomal S6K1 que se liga e bloqueia a proteína repressora do

eIF4E (4E-BP), liberando a atividade do eIF4E (Kaufman, 2000; Zhang et


45

al., 2002; Wang e Proud, 2007). A proteína TOR integra sinais de fatores

de crescimento, nutrientes, stress e os níveis de energia para o controle

do crescimento celular (Inoki et al., 2005). O segundo mecanismo ocorre

através das quinases Mnk e envolve uma família de MAP quinases (MAPKs

- Mitogen-activated protein kinases), especificamente ERK e p38 que

ativam a quinase Mnk e esta, por sua vez, fosforila o eIF4E (Gingras et

al., 1999). A proteína repressora do eIF4E (4E-BP) também é regulada

por fosforilação através das MAPKs. A fosforilação de serinas e treoninas

específicas nestas proteínas modulam a sua afinidade pelo eIF4E (Averous

e Proud, 2006). A eIF4E-BP hipofosforilada se liga eficientemente ao

eIF4E, mas a fosforilação de um número crítico de resíduos anula esta

ligação (Gingras et al., 1999). Maiores estudos sobre a regulação da

atividade destas proteínas devem ser feitos, porém, já se sabe que a

fosforilação da serina 65 da eIF4E-BP1 provoca uma repulsão eletrostática

entre esta proteína e o eIF4E, impedindo a sua ligação (Marcotrigiano et

al., 1999).

O efeito fisiológico do aumento da fosforilação do eIF4E permanence

um enigma. Alguns estudos têm sugerido que esse aumento é requerido

para estimulação da tradução global por favorecer a forte associação do

eIF4E com a estrutura cap dos mRNAs (Morley e Naegele, 2002).

3.5.2 Complexo eIF4F e PABP em Tripanosomatídeos

Até o momento pouco se sabe a respeito de mecanismos de

tradução em tripanosomatídeos e apenas alguns trabalhos caracterizaram

fatores envolvidos neste processo. Dados mais relevantes foram obtidos

apenas com a PABP, identificada de diferentes espécies de

tripanosomatídeos (Batista et al., 1994; Pitula, Ruyechan e Williams,

1998; Bates et al., 2000). Em L. major foi descrito um gene que codifica


46

para a PABP (PABP1) que demonstrou ter um significativo grau de

homologia com outras PABPs identificadas na literatura, porém baixa

similaridade com PABPs descritas em outros tripanosomatídeos (Bates et

al ,2000). Estudos com a incorporação de fósforo radioativo (32P), mostrou

que uma das isoformas desta proteína se apresenta na forma fosforilada

(Bates et al., 2000). Só a partir do término do sequenciamento dos

genomas de L. major, T. cruzi e T. brucei (Berriman et al., 2005; El Sayed

et al., 2005; Ivens et al., 2005), entretanto, e com as novas ferramentas

de bioinformática e de biologia molecular, é que avanços significativos

começaram a ser feitos no estudo de outros fatores de tradução em

tripanosomatídeos, como descrito a seguir.

O primeiro homólogo de fator de iniciação da tradução identificado

em tripanosomatídeos foi um homólogo de eIF4A de Leishmania (LeIF),

identificado e caracterizado como indutor de IL-12 e resposta Th1 em

BALB/c mediante sua porção N-terminal (Skeiky et al., 1998). Com o

avanço no sequenciamento de genomas, e a partir de uma busca

sistemática por subunidades do complexo eIF4F, dois homólogos distintos

de eIF4A de L. major foram identificados, que diferiam em abundância e

na sua capacidade de interagir com homólogos de eIF4G (Dhalia et al.,

2005). Cinco homólogos de eIF4G e quatro homólogos de eIF4E (ver a

seguir), também foram identificados, conservados em diferentes espécies

de tripanosomatídeos e sugerindo uma elevada complexidade na iniciação

da sua síntese protéica. Em continuidade, com o estudo dos respectivos

ortólogos de eIF4A de T. brucei, foram investigados aspectos como níveis

celulares, localização subcelular e requisitos para viabilidade celular. Os

resultados obtidos indicam que apenas o TbEIF4AI é ortólogo funcional do

eIF4A com função na tradução. Já o TbEIF4AIII parece ser o ortólogo do

eIF4AIII de mamíferos, cuja função é predominantemente nuclear, ao

nível de processamento de mRNAs (Dhalia et al., 2006).

No que diz respeito a homólogos de eIF4E, um primeiro candidato


47

foi inicialmente identificado e caracterizado de L. major (LeishIF4E-1).

Esta proteína possui considerável conservação filogenética, especialmente

no sítio de ligação ao cap, localização citoplasmática e demonstrou ser

capaz de se ligar a análogos da estrutura cap, principalmente o cap

monometilado e o cap4 sintético (Yoffe et al., 2004). A identificação de

quatro homólogos em um trabalho paralelo, mostrou uma maior

complexidade em relação a função dessa proteína do que se esperava

originalmente. Ensaios de afinidade ao cap clássico de 7-metil-guanosina,

com três destas proteínas sintetizadas na presença de metionina marcada

com 35S, mostraram que apenas a LmEIF4E1 foi capaz de se ligar ao cap.

A modelagem molecular do LmEIF4E1 foi então realizada, confirmando

que o mesmo possui características suficientes para a ligação ao cap

(Dhalia et al., 2005). As três proteínas tiveram sua expressão investigada

em extratos de L. major onde se observou que seus níveis variam

significantemente, com LmEIF4E3 sendo muito abundante e ambas

LmEIF4E1 e 2 presentes em níveis muito mais baixos (TABELA 1) (Dhalia

et al., 2005).

Tabela 1. Quantificação dos homólogos eIF4E de Leishmania major na fase promastigota. Homólogos Peso Molecular Nº de moléculas/célula LmEIF4E1 23,8 kDa 3,2 x 103 LmEIF4E2 31,4 kDa 1 x 103

LmEIF4E3 37,8 kDa 7,1 x 104

Fonte : Dhalia et al., 2005.

Os resultados descritos para o LmEIF4E1 estão de acordo com

aqueles descritos para o LeishIF4E-1, a mesma proteína identificada

independentemente por um segundo grupo (Yoffe et al., 2004). Mais

recentemente, ensaios de interação dos quatro homólogos de eIF4E de L.

major com a protéina eIF4E-BP1 de mamíferos também foram realizados,

e foi observado que as proteínas LeishIF4E1 e LeishIF4E4 se ligaram à


48

proteína GST-eIF4E-BP1 imobilizada em resina. Neste mesmo estudo, foi

observada, através de fracionamento subcelular, que a localização das

quatro isoformas do eIF4E é citoplasmática (Yoffe et al., 2006).

3.5.3 Eventos de Fosforilação em Tripanosomatídeos

Em eucariotos, a fosforilação de proteínas é, dentre as modificações

bioquímicas regulatórias, a mais importante, e já foi descrita como

atuando numa série de eventos, tais como o “turnover” de proteínas,

localização, interação e atividade de várias moléculas. Nos

tripanossomatídeos, o número de fosfoproteínas encontradas é

consideravelmente maior do que o observado para outros parasitas

intracelulares que transitam em ambientes distintos (Parsons et al.,

2005). Durante os diferentes estágios do ciclo celular de Leishmania e

Trypanossoma foram observados padrões diferenciados de fosforilação de

proteína, sugerindo que as quinases e fosfatases estejam envolvidas nos

processos de diferenciação (Bengs et al., 2005). Análise das proteínas

quinases nos recém-completos genomas de L. major, T.brucei e T. cruzi

mostram que eles codificam, respectivamente, 179, 156 e 171 proteínas

kinases que são cataliticamente ativas e ainda 17, 20 e 19 genes de

proteínas quinases atípicas (Naula, Parsons e Mottram, 2005). Especula-

se que a modulação de proteínas através dos eventos de

fosforilação/desfoforilação esteja associada ao desenvolvimento do

processo de infecção, no momento da interação parasito-hospedeiro.

Foi observado em T. cruzi que o fator de transformação do

crescimento (TGFα) produzido por macrófagos, induziu fosforilação na

tirosina de duas proteínas de superfície que são específicas de

amastigotas, aumentando assim a síntese de DNA e o crescimento celular

(Alexander et al., 2003). Esse estudo é importante visto que o macrófago


49

tem papel crucial na imunomodulação da infecção com T. cruzi e também

em Leishmania. Recentemente foi determinada a presença de atividade da

proteína tirosina-fosfatase em extratos protéicos da forma promastigota

de L. major (Guirre-Garcia et al., 2006). Essas descobertas são bastante

promissoras e significativas, contudo, muito pouco ainda se sabe sobre os

eventos de fosforilação e sobre as proteínas quinases em

tripanosomatídeos, necessitando de estudos mais aprofundados nesta

área.


50

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alexander J, Satoskar AR, Russell DG. (1999) Leishmania species: models

of intracellular parasitism. J Cell Sci. 112 Pt 18:2993-3002.

Alexander AD, Villalta F and Lima MF (2003) Transforming growth factor a

binds to Tripanosoma cruzi amastigotes to induce signaling ans

cellular proliferation. Infect Immun. 71(7):4201-5.

Alvar J, Canavate C, Gutierrez-Solar B, et al. (1997) Leishmania and

human immunodeficiency virus coinfection: the first 10 years. Clin

Microbiol Rev. 10:298-319.

Averous J, Proud CG. (2006) When translation meets transformation: the

mTOR story. Oncogene. 25 (48): 6423-35.

Bangs JD, Crain PF, Hashizume T, McCloskey JA and Boothroyd JC (1992)

Mass spectrometry of mRNA cap 4 from trypanosomatids reveals

two novel nucleosides. J Biol Chem. 267: 9805-9815.

Barak E, Amin-Spector S, Gerliak E, Goyard S, Holland N, Zilberstein D.

(2005) Differentiation of Leishmania donovani in host-free system:

analysis of signal perception and response. Mol Biochem Parasitol.

141: 99– 108.

Bates EJ, Knuepfer E and Smith DF (2000) Poly(A)-binding protein I of

Leishmania: functional analysis and localisation in trypanosomatid

parasites. Nucleic Acids Res. 28: 1211-1220.

Bates PA. (1993) Axenic culture of Leishmania amastigotes. Parasitol


51

Today. (4): 143-6.

Batista JA, Teixeira SM, Donelson JE, Kirchhoff LV and de Sa CM (1994)

Characterization of a Trypanosoma cruzi poly(A)-binding protein and

its genes. Mol Biochem Parasitol. 67: 301-312.

Bengs F, Scholz A, Kuhn D, Wiese M. (2005) LmxMPK9, a mitogen-

activated protein kinase homologue affects flagellar length in

Leishmania mexicana. Mol Microbiol. 55:1606-15.

Berriman M, Ghedin E, Hertz-Fowler C, Blandin G, Renauld H,

Bartholomeu DC, Lennard NJ, Caler E, Hamlin NE, Haas B, Böhme U,

Hannick L, Aslett MA, Shallom J, Marcello L, et al. (2005) The

genome of the African trypanosome Trypanosoma brucei. 309

(5733): 416-22.

Besteiro S, Williams RAM, Coombs GH, Mottram JC. (2007) Protein

turnover and differentiation in Leishmania. Int J Parasitol.

37(10):1063-75.

Bonneau AM, Sonenberg N. (1987) Involvement of the 24-kDa cap-

binding protein in regulation of protein synthesis in mitosis. J Biol

Chem. 262 (23): 11134-9

Boucher N, Wu Y, Dumas C, Dube M, Sereno D, Breton M, Papadopoulou

B. (2002) A common mechanism of stage-regulated gene expression

in Leishmania mediated by a conserved 3'-untranslated region

element. J Biol Chem. 277 (22): 19511-20.

Bruzik JP, Van DK, Hirsh D and Steitz JA (1988) Trans splicing involves a


52

novel form of small nuclear ribonucleoprotein particles. Nature 335:

559-562.

Burchmore RJ, Barrett MP. (2001) Life in vacuoles – nutrient acquisition

by Leishmania amastigotes. Int J Parasitol. 31(12): 1311-20.

Campbell DA, Thomas S, Sturm NR. (2003) Transcription in kinetoplastid

protozoa: why be normal? Microbes Infect. 5:1231-40.

Clayton CE. (2002) Life without transcriptional control? From fly to man

and back again. EMBO J. 21:1881-8.

Cohen-Freue G, Holzer TR, Forney JD, McMaster WR. (2007) Global gene

expression in Leishmania. Int J Parasitol. 37:1077-86.

Couttet P, Fromont-Racine M, Steel D, Pictet R and Grange T (1997)

Messenger RNA deadenylylation precedes decapping in mammalian

cells. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94: 5628-5633.

Cunningham ML, Titus RG, Turco SJ, Beverley SM. (2001) Regulation of

differentiation to the infective stage of the protozoan parasite

Leishmania major by tetrahydrobiopterin. Science. 13; 292 (5515):

285-7

Cysne-Finkelstein L, Temporal RM, Alves FA, Leon LL. (1998) Long-term

cultivation of axenic amastigotes is associated to metacyclogenesis

of promatigotes. Exp Parasitol. 89 (1): 58-62

De Benedetti A, Rhoads RE (1990) Overexpression of eukaryotic protein

synthesis initiation factor 4E in HeLa cells results in aberrant growth


53

and morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87(21): 8212-6

Debrabant A, Joshi MB, Pimenta PF, Dwyer DM. (2004) Generation of

Leishmania donovani axenic amastigotes: their growth and

biological characteristics. Int J Parasitol. 34 (2): 205-17.

Desjeux P. (2004) Leishmaniasis: current situation and new perspectives.

Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 27:305-18.

Devaux S, Lecordier L, Uzureau P, Walgraffe D, Dierick JF, Poelvoorde P,

Pays E, Vanhamme L. (2006) Characterization of RNA polymerase II

subunits of Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol. 148 (1):

60-8.

Dever TE (1999) Translation initiation: adept at adapting. Trends

Biochem.Sci. 24(10); 398-403

Dhalia R, Marinsek N, Reis CR, Katz R, Muniz JR, Standart N, Carrington M

and de Melo Neto OP (2006) The two eIF4A helicases in

Trypanosoma brucei are functionally distinct. Nucleic Acids Res. 34:

2495-2507.

Dhalia R, Reis CR, Freire ER, et al. (2005) Translation initiation in

Leishmania major: characterisation of multiple eIF4F subunit

homologues. Mol Biochem Parasitol. 140: 23-41.

Dolniak B, Katsoulidis E, Carayol N, Altman JK, Redig AJ, Tallman MS,

Ueda T, Watanabe-Fukunaga R, Fukunaga R, Platanias LC. (2008)

Regulation of arsenic trioxide-induced cellular responses by Mnk1

and Mnk2. J Biol Chem. [In press].


54

El-Sayed NM, Myler PJ, Bartholomeu DC, Nilsson D, Aggarwal G, Tran AN,

Ghedin E, Worthey EA, Delcher AL, Blandin G, Westenberger SJ,

Caler E, Cerqueira GC, Branche C, Haas B, Anupama A, et al. (2005)

The genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of

Chagas disease. 309 (5733): 409-15.

FUNASA, 2002(a). Vigilância e monitoramento da leishmaniose

tegumentar americana em unidades territoriais - Brasil, 1994-2001.

Boletim Eletrônico Epidemiológico. Ano 02, N°05 (13/12/2002).

FUNASA 2002(b). Leishmaniose visceral no Brasil: situação atual,

principais aspectos epidemiológicos, clínicos e medidas de controle.

Boletim Eletrônico Epidemiológico. Ano 02, N°06 (13/12/2002).

Gallie DR (1998) A tale of two termini: A functional interaction between

the termini of an mRNA is a prerequisite for efficient translation

initiation. Gene 216: 1-11.

Gebauer F and Hentze MW (2004) Molecular mechanisms of translational

control. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 5: 827-835.

Gilinger G and Bellofatto V (2001) Trypanosome spliced leader RNA genes

contain the first identified RNA polymerase II gene promoter in

these organisms. Nucleic Acids Res. 29: 1556-1564.

Gingras AC, Raught B and Sonenberg N (1999) eIF4 initiation factors:

effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of

translation. Annu.Rev.Biochem. 68: 913-963.


55

Gossage SM, Rogers ME, Bates PA. (2003) Two separate growth phases

during the development of Leishmania in sand flies: implications for

understanding the life cycle. Int J Parasitol. 33:1027-34.

Gross JD, Moerke NJ, Von der Haar T, Lugovskoy AA, Sachs AB, McCarthy

JEG and Wagner G (2003) Ribosome Loading onto the mRNA Cap is

driven by conformacional coupling between eIF4G and eIF4E. Cell,

115: 739-750.

Gu M., Lima C.D. (2005) Processing the message: structural insights into

capping and decapping mRNA. Curr. Opin, Struct. Biol. 15(1):99-

106.

Guirre-Garcia MM, Escalona-Montano AR, Bakalara N, et al. (2006)

Leishmania major : detection of membrane-bound protein tyrosine

phosphatase. Parasitology;132:641-9.

Gunzl A, Bruderer T, Laufer G, Schimanski B, Tu LC, Chung HM, Lee PT,

Lee MG. (2003) RNA polymerase I transcribes procyclin genes and

variant surface glycoprotein gene expression sites in Trypanosoma

brucei. Eukaryot. Cell. 2(3):542-51.

Gupta N., Goyal N. and Rastogi AK. (2001) In vitro cultivation and

characterization of axenic amastigotes of Leishmania. Trends

Parasitol. 17(3):150-3.

Haghighat A, Mader S, Pause A and Sonenberg N (1995) Repression of

cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with

p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E. EMBO J. 14:

5701-5709.


56

Hall MP, Ho CK. (2006) Functional characterization of a 48 kDa

Trypanosoma brucei cap 2 RNA methyltransferase. Nucleic Acids

Res. 34(19):5594-602.

Hastings K.E. (2005) SL trans-splicing: easy come or easy go? Trends

Genet. 21(4):240-7.

He H, Haar T, Singh C, Ii M, Li B, Hinnebusch A, McCarthy J and Asano KT

(2003) The yeast initiation factor 4G (eIF4G) HEAT domain interacts

with eIF1and eIF5 and is involved in stringent AUG selection. Mol

Cell Biol 23:5431-5445.

Hershey JWB and Merrick WC (2000) The pathway and mechanism of

initiation of protein synthesis. Translational Control of Gene

Expression (Cold Spring Habor Laboratory Press); pp. 33-38.

Hiremath LS, Hiremath ST, Rychlik W, Joshi S, Domier LL, Rhoads RE.

(1989) In vitro synthesis, phosphorylation, and localization on 48 S

initiation complexes of human protein synthesis initiation factor 4E.

J Biol Chem. 264 (2): 1132-8.

Ho, C.K. and Shuman, S. (2001) Trypanosoma brucei RNA triphosphatase.

Antiprotozoal drug target and guide to eukaryotic phylogeny. J. Biol.

Chem. 276: 46182–46186.

Hoshino S., Imai M., Kobayashi T., Uchida N., Natada T. (1999) The

eucariotic polypeptide chain releasing factor (eRF3/GSPT) carryng

translation termination signal to the 3’-poly(A) tailof mRNA. Direct

association of eRF3/GSPT with polyadenilate-binding protein. J. Biol.


57

Chem. 24(24); 16677-80

Hug M., Hotz HR., Hartman C., Clayton C. (1994) Hierarchies f RNA-

processing signals in a trypanosome surface antigen mRNA

precursor. Mol. Cell. Biol. 14(11); 7428-7435.

Inoki K, Ouyang H, Li Y, Guan KL. (2005) Signaling by target of rapamycin

proteins in cell growth control. Microbiol Mol Biol Rev. 69 (1): 79-

100.

Ivens AC, Peacock CS, Worthey EA, et al. (2005) The genome of the

kinetoplastid parasite, Leishmania major. Science. 309: 436-442.

Jones RM, Branda J, Johnston KA, Polymenis M, Gadd M, Rustgi A,

Callanan L, Schmidt EV. (1996). An essential E box in the promoter

of the gene encoding the mRNA cap-binding protein (eukaryotic

initiation factor 4E) is a target for activation by c-myc. Mol Cell Biol.

16(9): 4754-64.

Joshi B, Cai AL, Keiper BD, Minich WB, Mendez R, Beach CM, Stepinski J,

Stolaeski R, Darzynkiewicz E and Rhoads RE (1995) Phosphorilation

of eukaryotic protein synthesis factor 4E at Ser-209. J. Biol Chem

270: 14597-14603.

Joshi M, Dwyer DM, Nakhasi HL. (1993) Cloning and characterization of

differentially expressed genes from in vitro-grown 'amastigotes' of

Leishmania donovani. 58 (2): 345-54.

Kapp LD, Lorsch JR (2004) The molecular mechanics of eukaryotic

translation. Annu.Rev.Biochem. 73: 657-704.


58

Kaufman RJ. (2000) Overview of vector design for mammalian gene

expression. Mol Biotechnol. 16(2):151-60.

Keiper BD, Lamphear BJ, Deshpande AM Jankowska-Anyszka M, Aamodt

EJ, Blumenthal T, Rhoads RE (2000) Functional characterization of

five eIF4E isoforms in Caernorhabditis elegans. J. Biol. Chem; 275;

10590-10596.

Kochetov AV, Ischenko IV, Vorobiev DG, Kel AE, Babenko VN, Kisselev LL,

Kolchanov NA. (1998) Eukaryotic mRNAs encoding abundant and

scarce proteins are statistically dissimilar in many structural

features. 4; 440 (3): 351-5.

Kuhn U. and Wahle E. (2004) Structure and function of poly(A) binding

proteins. 25; 1678 (2-3): 67-84.

Lainson, R, Shaw, JJ, (1987). Evolution, classification and geographical

distribution. In: Peters, W., Killick-Kendrick, R. (Eds.), The

Leishmaniases in Biology and Medicine, Vol. 1. Academic Press,

London, 1–120.

Liang XH, Haritan A, Uliel S and Michaeli S. (2003) trans and cis splicing in

trypanosomatids: mechanism, factors, and regulation. Eukaryot.Cell

2: 830-840.

Lloyd RE (2006) Translational control by viral proteinases. Virus Res. 119

(1): 76-88.

Mair G, Ullu E, Tschudi C. (2000) Cotranscriptional cap 4 formation on the


59

Trypanosoma brucei spliced leader RNA. J Biol Chem. 15; 275(37):

28994-9.

Mangus DA, Amrani N, Jacobson A. 1998 Pbp1p, a factor interacting with

Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein, regulates

polyadenylation. 18 (12): 7383-96.

Marcotrigiano J, Gingras AC, Sonenberg N, Burley SK. (1997) Cocrystal

structure of the messenger RNA 5' cap-binding protein (eIF4E)

bound to 7-methyl-GDP. Cell 13; 89(6): 951-61.

Marcotrigiano J, Gingras AC, Sonenberg N and Burley Sk (1999) Cap-

dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a

molecular mimic of eIF4G. Mol Cell 3(6): 707-16.

Martinez-Calvillo S, Yan S, Nguyen D, Fox M, Stuart K and Myler PJ (2003)

Transcription of Leishmania major Friedlin chromosome 1 initiates in

both directions within a single region. Mol Cell 11: 1291-1299.

McConkey SE, López A, Shaw D, Calder J (2002) Leishmanial polyarthritis

in a dog. Canine Vet J 43(8): 607-609.

Meijer HA and Thomas AA (2002) Control of eukaryotic protein synthesis

by upstream open reading frames in the 5'-untranslated region of an

mRNA. Biochem J. 367: 1-11.

Minich WB, Balastra ML, Goss DJ, Rhoads RE (1994). Chromatographic

resolution of in vivo phosphorylated and nonphosphorylated

eucariotic translarion initiation factor eIF-4E: increase cap affinity of

the phosphorylated form. Proc Natl Acad Sci USA; 91(16); 7668-


60

7672.

Morley SJ, Naegele S. (2002) Phosphorylation of eukaryotic initiation

factor (eIF) 4E is not required for de novo protein synthesis

following recovery from hypertonic stress in human kidney cells. 277

(36): 32855-9.

Morley SJ, McKendrick L. (1997) Involvement of stress-activated protein

kinase and p38/RK mitogen-activated protein kinase signaling

pathways in the enhanced phosphorylation of initiation factor 4E in

NIH 3T3 cells. 272 (28): 17887-93.

Myler PJ, Audleman L, Devos T, Hixson G, Kiser P, Lemley C, Magness C,

Rickel E, Sisk E et al. (1999) Leishmania major Friedlin chromosome

1 has an unusual distribution of protein-coding genes. Proc. Natl.

Acad. Sci. U.S.A 96: 2902-2906.

Myler PJ, Stuart KD. (2000) Recent developments from the Leishmania

genome project. Curr Opin Microbiol. (4): 412-6.

Naula C, Parsons M, and Mottram JC (2005) Protein kinases as drug

targets in trypanosomes and Leishmania. Biochim. Biophys. Acta

1754(1-2):151-9.

Neves D (2005) Parasitologia Humana. 10ª edição. Ed. Atheneu, São

Paulo, 521p.

Nilsen TW. (1993) Trans-splicing of nematode premessenger RNA. Annu

Rev Microbiol. 47: 413-40.


61

Palenchar JB e Bellofatto V (2006) Gene transcription in trypanosomes.

Mol Biochem Parasitol. 146(2): 135-41.

Parsons M, Worthey EA, Ward PN, Mottram JC (2005). Comparative

analysis of the kinomes of three pathogenic trypanosomatids:

Leishmania major, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi.

BMC Genomics; 15; 6: 127.

Pearson RD, Sousa AQ, Jeronimo SMB. (2000) Leishmania species:

Visceral (Kala-Azar), Cutaneous, and Mucosal Leishmaniasis. In:

Mandell, G.L., Bennett, J.E., Dolin, R.D. Mandell, Douglas and

Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th ed.,

Philadelphia, Churchill-Livingstone.

Pestova TV, Kolupaeva VG, Lomakin IB, et al. (2001) Molecular

mechanisms of translation initiation in eukaryotes. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA. 98: 7029-7036.

Pitula J, Ruyechan WT and Williams N (1998) Trypanosoma brucei:

identification and purification of a poly(A)-binding protein. Exp.Parasitol.

88: 157-160.

Prévôt D, Darlix JL, Ohlmann T (2003) Conducting the initiation of protein

synthesis: the role of eIF4G. Biol Cell 95(3-4):141-56.

Raught B and Gingras AC (1999) eIF4E activity is regulated at multiple

levels. Int J Biochem Cell Biol 31: 43-57.

Rochette A, McNicoll F, Girard J, Breton M, Leblanc E, Bergeron MG,

Papadopoulou B. (2005) Characterization and developmental gene


62

regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins

in Leishmania spp. Mol Biochem Parasitol. 140 (2): 205-20.

Sachs AB and Varani G (2000) Eukaryotic translation initiation: there are

(at least) two sides to every story. Nat. Struct. Biol. 7: 356-361.

Scheper GC, van Kollenburg B, Hu J, Luo Y, Goss DJ, Proud CG (2002)

Phosphorylation of eucariotic initiation factor 4E markedly reduces

its affinity for capped mRNA. J. Biol. Chem. 277(5); 3303-3309.

Schmidt G and Roberts L (1996) Foundations of Parasitology. 5ª edição.

Times Mirror High Education Group, Iowa, USA, 659p.

Shaw JJ (1994) Taxonomy of the genus Leishmania: present and future

trends and their implications. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 89: 471-

478.

Shuman S. (2001) Structure, mechanism, and evolution of the mRNA

capping apparatus. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 66: 1-40.

Silva E, Ullu E, Kobayashi R, Tschudi C. (1998) Trypanosome capping

enzymes display a novel two-domain structure. Mol. Cell. Biol. 18:

4612–4619.

Singh S. (2006) New developments in diagnosis of leishmaniasis. Indian J

Med Res. 123:311-30.

Skeiky YA, Kennedy M, Kaufman D, et al. (1998) LeIF: a recombinant

Leishmania protein that induces an IL-12-mediated Th1 cytokine

profile. J. Immunol. 161: 6171-6179.


63

Slappendel RJ, Ferrer L. (1998) In: Greene CE: Infectious Diseases of the

Dog and Cat. WB Saunders Co, Philadelphia, 450-458.

Sonenberg N (1996). Translational control. In: Stabilization of eukaryotic

initiation factor 4E binding to the mRNA 5’-cap by domains of eIF4G.

Biol. Chem. 39: 30551-30555.

Sonenberg N and Dever TE (2003) Eukaryotic translation initiation factors

and regulators. Curr. Opin. Struct. Biol. 13: 56-63.

Strudwick S, Borden KL. (2002) The emerging roles of translation factor

eIF4E in the nucleus. Differentiation. 70(1): 10-22.

Teixeira MCA, Santos RJ, Sampaio RB, Pontes-de-Carvalho L, dos-Santos

WLC. (2002) A simple and reproducible method to obtain large

numbers of axenic amastigotes of different Leishmania species.

Parasitol Res. 88: 963-968.

Tomoo K, Shen X, Okabe K, Nozoe Y, Fukuhara S, Morino S, Ishida T,

Taniguchi T, Hasegawa H, Terashima A, Sasaki M, Katsuya Y,

Kitamura K, Miyoshi H, Ishikawa M, Miura K. (2002) Crystal

structures of 7-methylguanosine 5'-triphosphate (m(7)GTP)- and

P(1)-7-methylguanosine-P(3)-adenosine-5',5'-triphosphate

(m(7)GpppA)-bound human full-length eukaryotic initiation factor

4E: biological importance of the C-terminal flexible region. Biochem

J. 362 (Pt 3): 539-44.

Tschudi C, Ullu E. (2002) Unconventional rules of small nuclear RNA

transcription and cap modification in trypanosomatids. Gene Expr.


64

10: 3–16.

Vickerman K., Coombs GH. (1999) Protozoan paradigms for cell biology. J

Cell Sci. 112 (Pt 17) 2797-98.

von der Haar T, Gross JD, Wagner G, McCarthy JE (2004) The mRNA cap-

binding protein eIF4E in post-transcriptional gene expression. Nat

Struct Mol Biol. 11(6): 503-11.

Wang X, Flynn A, Waskiewicz AJ, Webb BL, Vries RG, Baines IA, Cooper

JA, Proud CG. (1998) The phosphorylation of eukaryotic initiation

factor eIF4E in response to phorbol esters, cell stresses, and

cytokines is mediated by distinct MAP kinase pathways. J Biol Chem.

273 (16): 9373-7.

Wang X, Proud CG. (2007) Methods for studying signal-dependent

regulation of translation factor activity. Methods Enzymol. 431: 113-

42

Wells SE, Hillner PE, Vale RD and Sachs AB (1998) Circularization of

mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol.Cell 2: 135-

140.

Wu Y, El Fakhry Y, Sereno D, Tamar S, Papadopolou B. (2000) A new

developmentally regulated gene family in Leishmania amastigotes

ecoding a homolog of amastin surface proteins. Mol. Biol. Parasit.

110(2):345-57.

Yoffe Y, Zuberek J, Lerer A, et al. (2006) Binding specificities and potential

roles of isoforms of eukaryotic initiation factor 4E in Leishmania.


65

Eukaryot.Cell. 5: 1969-1979.

Yoffe Y, Zuberek J, Lewdorowicz M, Zeira Z, Keasar C, Orr-Dahan I,

Jankowska-Anyszka M, Stepinski J, Darzynkiewicz E, Shapira M.

(2004) Cap-binding activity of an homolog from Leishmania. RNA.

10(11):1764-75.

Zamudio JR, Mittra B, Zeiner GM, Feder M, Bujnicki JM, Sturm NR and

Campbell DA (2006) Complete cap 4 formation is not required for

viability in Trypanosoma brucei. Eucaryot Cell. 5: 905-915.

Zhang X, Shu L, Hosoi H, Murti KG, Houghton PJ. (2002) Predominant

nuclear localization of mammalian target of rapamycin in normal

and malignant cells in culture. 277 (31): 28127-34.

Zick A, Onn I, Bezalel R, Margalit H, Shlomai J. (2005) Assigning functions

to genes: identification of S-phase expressed genes in Leishmania

major based on post-transcriptional control elements. Nucleic Acids

Res. 33 (13): 4235-42.

Zilberstein D, Shapira M. (1994) The role of pH and temperature in the

development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48: 449-

70.

Zuberek J, Wyslouch-Cieszynska A, Niedzwiecka A, Dadlez M, Stepinski J,

Augustyniak W, Gingras AC, Zhang Z, Burley SK, Sonenberg N,

Stolarski R, Darzynkiewicz E. (2003) Phospholylation of eIF4E

attenuates its interation with mRNA 5’ cap analogs by electrostatic

repulsion: inten-mediated protein ligation strategy to obtain

phosphorylated protein. RNA. 9(1):52-61.


66

Referências Eletrônicas:

CDC - Center for Disease Control and Prevention

http://www.dpd.cdc.gov/DPDx (Dezembro, 2007).

UGA - University of Georgia, College of Veterinary Medicine.

http://www.vet.uga.edu (Dezembro, 2007).

WHO – World Health Organization.

http://www.who.int (Dezembro, 2007).


67

5. MANUSCRITO DE ARTIGO CIENTÍFICO

Análise da expressão e investigação de mecanismos envolvidos com o controle da atividade de homólogos do fator de iniciação da tradução EIF4E ao longo do ciclo de vida de Leishmania amazonensis.

Pereira, M.M.P. 1,2 ; da Costa Lima,T.D.C.1,2 and de Melo Neto,O.P 1,2,*

1 Programa de Pós-Graduação em Genética, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Professor Moraes Rego s/n, Cidade Universitária, 50670-

901, Recife, PE, Brasil. 2 Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Osvaldo Cruz, Av. Professor Moraes

Rego s/n, Cidade Universitária, 50670-420, Recife, PE, Brasil.

*Autor para correspondência: Fax: 00558121012636 E-mail: [email protected]

Artigo a ser enviado para a revista Molecular and Biochemical

Parasitology. ISSN 0166-6851. Fator de impacto (JCR, 2005): 2,733.


68

RESUMO

A iniciação da tradução em eucariotos é um ponto crucial no processo de

biossíntese protéica, onde a estrutura cap dos mRNAs têm papel

fundamental. O cap é reconhecido pelo eIF4E, que participa do complexo

de iniciação da tradução eIF4F e permite a ligação do ribosoma ao mRNA.

Em Leishmania, onde a regulação da expressão gênica é mediada em boa

parte pelo controle da sua tradução, vários homólogos de eIF4E foram

identificados. Nosso trabalho visou comparar o padrão de expressão de

quatro homólogos (EIF4E1-4) desse fator e identificar que mecanismos

poderiam estar agindo no controle da sua expressão e atividade. Curvas

de crescimento e diferenciação foram realizadas no intuito de se obter as

três formas principais de L. amazonensis. Foi observado que todos os

homólogos estão presentes ao longo das curvas e possuem padrões de

expressão distintos. Os EIF4E2-4 apresentaram-se com duas isoformas,

sugerindo modificações pós-traducionais como fosforilação. Destes, os

EIF4E3 e 4 apresentaram variações na expressão destas isoformas

durante o ciclo de vida do parasita e foram investigados mais

detalhadamente. Experimentos de localização subcelular indicaram que as

duas isoformas de ambas as proteínas são encontradas no citoplasma

tendo a ausência de soro fetal bovino no meio induzindo modificações

pós-traducionais associadas à falta de crescimento celular. Por marcação

metabólica observou-se que a isoforma “desfosforilada” do EIF4E3 e a

isoforma “fosforilada” do EIF4E4 estão associadas a uma maior atividade

de tradução. A incubação com inibidores de transcrição e tradução sugeriu

que a desfosforilação do EIF4E3 é dependente da tradução, e que a

fosforilação do EIF4E4 é dependente da transcrição. Estes resultados

indicam uma possível regulação da biossíntese protéica através de

mecanismos pós-traducionais, como a fosforilação, porém maiores

estudos são necessários para o entendimento desse processo.

Palavras-chave: Leishmania, EIF4E, fosforilação.


69

1. INTRODUÇÃO

O gênero Leishmania é um dos nove gêneros pertencentes à família

Trypanosomatidae, formada por um grupo de parasitas que causam uma

variedade de doenças de importância médica e veterinária. A leishmaniose

representa um elevado problema de saúde pública, sendo endêmica em

88 países e afetando cerca de 1,5 a 2 milhões de pessoas atualmente,

com cerca de 400 mil novos casos por ano [1]. Esta doença apresenta

uma importante diversidade clínica e epidemiológica que vai desde lesões

cutâneas localizadas até infecções viscerais que podem ser fatais [2].

A Leishmania é transmitida aos mamíferos pela picada do inseto

hematófago e, por estar presente em dois hospedeiros, possui um

complexo ciclo de vida envolvendo várias formas de desenvolvimento,

apresentando uma rápida adaptação a mudanças de condições ambientais

[3]. Alterna entre duas formas morfológicas significativas, onde a forma

intracelular obrigatória amastigota infecta hospedeiros mamíferos e a

forma flagelada promastigota está presente no inseto vetor.

Nos tripanosomatídeos encontramos algumas particularidades que

os diferem dos demais eucariotos, como a transcrição policistrônica e o

trans-splicing. Além disso, esses protozoários se caracterizam pela

importância da regulação pós-transcricional no controle da sua expressão

gênica, onde a síntese de proteínas parece ser um componente

importante dessa regulação [4]. O processo de biossíntese protéica,

conhecido também como tradução, tem um papel fundamental para a

sobrevivência de todos os organismos. Esse mecanismo nos

tripanosomatídeos ainda é pouco conhecido e precisa de mais estudos

para seu total entendimento. A tradução representa o passo final para a

via de expressão gênica, que media a formação do proteoma a partir da

informação genômica e pode ser dividida em três principais etapas:

iniciação, elongação e terminação [5]. Participam desse processo


70

inúmeros fatores protéicos que auxiliam o ribossomo nestas três etapas.

Enquanto que na elongação e terminação o número destes fatores é

limitado, na iniciação da tradução participam mais de 25 polipeptídeos,

sendo a etapa mais crítica do processo, sujeita a diferentes mecanismos

de regulação. Esta etapa compreende o reconhecimento do mRNA maduro

pela subunidade 40S do ribossomo e a identificação do códon AUG [6].

A iniciação da tradução é mediada por proteínas conhecidas como

fatores de iniciação da tradução (eIFs). Entre esses fatores destaca-se o

complexo eIF4F, composto pelas subunidades: eIF4E, a proteína de

reconhecimento da estrutura cap; o eIF4A, que possui uma atividade de

helicase responsável pela remoção de estruturas secundárias da

extremidade 5’ do mRNA; e o eIF4G, a proteína estruturadora do

complexo que possui sítios de ligação para o eIF4E, eIF4A, eIF3 e PABP

(Proteína de ligação á cauda poli-A) [7]. Para que ocorra a síntese

protéica, o complexo eIF4F se liga a estrutura cap presente na região 5’

dos mRNAs e permite o recrutamento da subunidade menor ribossomal. A

PABP se liga ao fator eIF4G, promovendo uma interação entre as

extremidade 3’ e 5’ do mRNA, causando uma circularização da molécula

do mensageiro e facilitando a sua tradução [8, 9].

O eIF4E é uma fosfoproteína de 24 kDa, responsável pelo

reconhecimento do cap presente nos mRNAs eucarióticos, a primeira

etapa do recrutamento para o mRNA dos outros fatores de iniciação e por

fim da subunidade 40S [6]. É um fator essencial para a estabilidade do

complexo eIF4F na ligação ao cap e assim possui papel crucial na iniciação

da tradução [10]. É uma proteína conservada desde leveduras até o

homem e um número variado de isoformas deste fator tem sido

encontrado em diversos organismos, dentre estes: três em humanos

[11,12]; três em Arabidopsis thaliana [13] e cinco em Caernorhabdtis

elegans [14]. Em mamíferos a atividade do fator eIF4E é limitada

principalmente por proteínas da família eIF4E-BP, que funcionam como


71

seqüestradoras do eIF4E e assim inibem a tradução e controlam as taxas

globais de produção de proteínas [15]. Além disso, o eIF4E é ainda

controlado diretamente por fosforilação pela enzima MnK, aumentando a

sua taxa de tradução [16].

Até o momento, pouco se sabe a respeito do mecanismo de

tradução em tripanosomatídeos e até recentemente apenas alguns poucos

trabalhos tinham enfocado proteínas envolvidas neste processo, dentre

estes alguns fatores de elongação e a proteína PABP [17,18]. Só em 2004

foi identificado e caracterizado um primeiro homólogo do fator eIF4E de

Leishmania major (LeishIF4E-1), que possui conservação no sítio de

ligação ao cap, localização citoplasmática e demonstrou ser capaz de se

ligar tanto ao cap monometilado como ao cap4, característico dos

tripanosomatídeos [19]. Já a partir do término do sequenciamento do

genoma de L. major [20] e outros tripanosomatídeos, foi possível a

identificação e caracterização preliminar de quatro homólogos de fator

eIF4E (LmEIF4E1-4); cinco de eIF4G (LmEIF4G1-5) e dois de EIF4A

(LmEIF4A1-2) [21].

O número elevado de homólogos de eIF4E e eIF4G encontrados em

tripanosomatídeos, organismos unicelulares, levantou a possibilidade de

que nem todos possam estar atuando diretamente como fator de iniciação

da tradução. Alternativamente, como estes parasitas possuem um

complexo ciclo de vida, estas proteínas poderiam estar atuando nas

diferentes fases deste ciclo controlando diferencialmente a síntese de

proteínas. Neste estudo, analisamos a expressão de quatro homólogos do

fator eIF4E (LmEIF4E1-4) em L. amazonensis durante diferentes fases do

seu ciclo de vida, onde observamos a expressão diferenciada entre os

quatro fatores. Duas destas proteínas apresentaram expressão modificada

durante o ciclo de vida, tendo sido detalhadamente avaliadas para um

melhor entendimento das causas das modificações observadas em seu

comportamento.


72

2. METODOLOGIA

2.1. Obtenção e armazenamento dos parasitas.

Formas promastigotas de Leishmania amazonensis

(MHOM/77/LTB0016), foram mantidas em meio Schneider pH 7,2 e

temperatura de 26ºC, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB),

100UI de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina e 1 mM de L-glutamina.

Esta forma foi utilizada para inoculação no coxim plantar de camundongos

Balb/c numa concentração de 1 x 107 células diluída em 25 µl de PBS (137

mM NaCl, 2,7 mM KCl , 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, pH 7.3).

Quatro a oito semanas após o inóculo, a lesão se tornava aparente e

então os camundongos eram sacrificados para obtenção das formas

amastigotas infectivas [22]. Destas, formas amastigotas foram obtidas

tanto para a produção de extratos protéicos quanto para a realização da

diferenciação em forma promastigota infectivas, estocadas através do

congelamento em nitrogênio líquido. As células utilizadas para o

procedimento de congelamento sofreram apenas uma passagem, a fim de

não perderem sua infectividade, sendo congeladas utilizando glicerol 60%

numa diluição de 1:1.

2.2. Curvas de crescimento e diferenciação de L. amazonensis.

Curvas de crescimento da forma promastigota de L. amazonensis

foram estabelecidas a partir do descongelamento de células promastigotas

infectivas em meio Schneider pH 7,2. Estas foram cultivadas até a fase

estacionária, sendo repassadas ao mesmo meio numa diluição de 106

células/ml para dar início à curva padrão de crescimento, propriamente.

Essa curva foi monitorada diariamente e o crescimento dos parasitas


73

quantificado para detecção da fase estacionária. Nesta fase, a partir do

quinto dia, se observava a presença de uma elevada proporção de células

metacíclicas. As células neste ponto eram repassadas, também numa

diluição de 106 células/ml, para meio Schneider pH 5,5, suplementado

com 20% de SFB e colocadas a 32ºC, a fim de induzir sua diferenciação

em nova curva de crescimento. As células foram monitoradas durante

toda a curva, quantificadas e alíquotas padronizadas foram retiradas nos

tempos de 0h, 2h, 6h e a cada 24h até a sua morte. Essas alíquotas foram

centrifugadas e ressuspendidas em tampão de amostra para SDS-PAGE

para análise posterior através de ensaios de Western-blot.

Curvas com quatro condições diferentes no meio Schneider pH 7,2

também foram realizadas, onde foi utilizado um meio condicionado de

uma cultura crescida até o 8º dia. Esse meio condicionado foi

centrifugado, filtrado para ser reutilizado no ensaio e colocado em duas

garrafas de cultura, onde em uma delas foi acrescentado SFB. Também foi

utilizado neste ensaio meio Schneider pH 7,2 novo, em duas condições

distintas, com e sem SFB. Células estacionárias foram repassadas, numa

diluição de 106 células/ml, para as quatro garrafas de cultura. Alíquotas

foram retiradas nos tempos de 0h, 15min, 30min, 1h, 2h, 6h e em 24h,

onde as células foram quantificadas para observação do seu crescimento e

processadas para Western-blot.

2.3. Expressão e purificação das proteínas recombinantes.

A expressão das proteínas recombinantes foi realizada através da

transformação em células BL21 de Escherichia coli, crescida em meio LB,

de construções plasmidiais contendo os vários genes em estudo clonados

em dois vetores de expressão distintos: pGEX4T3, para expressão de

proteínas fusionadas a Glutationa S-transferase (GST); pET21D, para

expressão de proteínas fusionadas a uma cauda de poli-histidinas. As


74

bactérias transformadas foram crescidas até a densidade ótica (OD600) de

0,5, e posteriormente induzidas, por 4 horas a 30ºC, com IPTG numa

concentração final de 0,1 mM. Após a indução, as bactérias foram

centrifugadas (10.000 g / 4ºC / 10 min), ressuspendidas em 20ml de PBS

(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl , 4,3 mM Na2HPO4 ,1,47 mM KH2PO4, pH 7.3),

e lisadas por ultrasonicação. A purificação das proteínas recombinantes foi

realizada de acordo com protocolo previamente estabelecido [23], através

de cromatografia de afinidade tanto para proteínas fusionadas com cauda

de poli-histidina, utilizando a resina Ni-NTA agarose (Qiagen) quanto com

GST, com a resina glutationa-sefarose (GE Biosciences). A purificação das

proteínas foi analisada em gel SDS-PAGE 15%, submetido a uma solução

corante contendo Azul de Comassie R-250, e quantificadas através de

uma curva de diluição de BSA com quantidades pré-definidas.

2.4. Purificação do anticorpo por Imunoadsorção.

Soros produzidos contra as diferentes proteínas em estudo foram

purificados através da técnica de imunoadsorção, onde as respectivas

proteínas recombinantes foram fracionadas em gel SDS-PAGE 15% e

transferidas para membrana PVDF (Immobilon-P – Millipore®). Após a

transferência, a membrana foi corada com 0,2% Rouge Ponceau / 1% TCA

onde a banda correspondente à proteína de interesse foi excisada da

membrana e cortada em pequenos pedaços colocados em tubo de 1,6 ml.

Após o bloqueio de 30 minutos em solução de PBS com leite 1% e Tween-

20 a 0,05%, o soro foi adicionado numa diluição de 1:1 com PBS e

deixado sob agitação durante aproximadamente 18 horas, a 4ºC. A

eluição dos anticorpos foi conseguida através da utilização de 200µl da

solução de glicina ácida 0,1 M (pH 2,5) com vigorosa agitação do tubo

durante 5 minutos, seguida da neutralização do pH por adição de 20 µl de


75

TRIS 1M pH8,0 e 200 µl de PBS duas vezes concentrado. Os anticorpos

purificados foram então utilizados em ensaios de “Western-Blot” para o

teste de sensibilidade e especificidade, utilizando diluições seriadas das

respectivas proteínas recombinantes quantificadas.

2.5. Ensaios de “Western-Blot”.

Os extratos obtidos através das curvas realizadas com os parasitas

foram fracionados em gel SDS-PAGE 15% e transferidos para membranas

PVDF (Immobilon-P – Millipore®) para a realização dos ensaios de

“Western-blot”. As membranas foram bloqueadas em solução de TBS (20

mM Tris, 500 mM NaCl, pH 7,5), leite desnatado 5% e Tween-20 a 0,05%

em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, a membrana foi

incubada com soro policlonal, na diluição pré-definida, durante uma hora

em solução de TBS, leite 5% e Tween-20 a 0,05%. Após lavagem com

TBS, a membrana foi incubada com o segundo anticorpo (anti-IgG de

coelho conjugado com peroxidase) (Jackson ImmunoResearch

Laboratories), numa diluição de 1:10.000, na mesma solução que a

incubação anterior, seguida de nova lavagem com TBS. O sinal foi

visualizado através de quimioluminescência (técnica ECL – “Enhanced

Chemioluminecency”) em filme Kodak Biomax Light.

2.6. Imunocitoquímica.

A imunocitoquímica foi realizada utilizando aproximadamente 5 x

106 células em cada reação. As células foram centrifugadas (1600 g /

25ºC / 10 min), lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 3%

por 10 minutos a temperatura ambiente. As células foram novamente


76

centrifugadas e colocadas em placa já contendo lamínula fixada com poli-

L-lisina (Sigma). Após 15 minutos, foram feitas as lavagens com PBS-

glicina 20 mM e a permeabilização com 0,1% de Triton 100x (Sigma) por

10 minutos, seguida das lavagens e do bloqueio com PBS-Glicina + BSA

1% por 20 minutos. Posteriormente, foi colocado o primeiro anticorpo

purificado na diluição pré-definida por 1h a 37ºC. Após lavagens, foi

colocada RNAse A 10 mM por 20 minutos, para degradar todo RNA

presente na célula. Foram feitas novas lavagens e colocado o segundo

anticorpo Alexa Fluor 488 conjugado com o segundo anticorpo diluído

1:500. Para a marcação do DNA foi utilizado o TOTO 3 (Molecular Probes)

diluído 1:1000.As células foram deixadas no escuro por 1h a 37ºC. Ainda

no escuro, foram lavadas, secas, as lamínulas fixadas em lâminas com 10

µl de Prolong-gold e guardadas protegidas da luz em freezer. As células

foram visualizadas em microscópio confocal utilizando o programa de

microscopia Leica SPII-AOBS.

2.7. Marcação Metabólica

A marcação metabólica foi realizada utilizando 1 x 107 células para

cada reação. As células foram crescidas como padronizado nas curvas de

crescimento de promastigotas, e no tempo pré-determinado, foram

retiradas e colocadas em tubos de centrífuga de 15ml. Adicionava-se

então metionina marcada com [35S] para uma concentração final de 10

mCi/ml e deixado a 27ºC durante 1 hora sob agitação. Após esse período,

as células foram centrifugadas (14000RPM/25ºC/10 min) e

ressuspendidas em tampão de amostra para SDS-PAGE para análise

através de eletroforese em gel 15% e exposição em filme Kodak Biomax

MR por 5 dias.


77

2.8 Curvas de inibição de transcrição e tradução.

Para realização das curvas de inibição, as células foram repassadas

para meio Schneider pH 7,2, também na diluição de 106 células/ml, onde

foi adicionado cicloheximida, para inibição da tradução, ou actinomicina D,

para inibição da transcrição. Os compostos foram utilizados nas

concentrações finais de 50 µg/ml e 10 µg/ml respectivamente. Alíquotas

foram retiradas nos tempos de 0h, 15min, 30min, 1h, 2h, 6h e em 24h.

3. RESULTADOS

3.1 Curvas de crescimento e diferenciação.

Para analisar a expressão dos homólogos de eIF4E durante o ciclo

de vida da Leishmania amazonensis, foram realizadas diferentes curvas de

crescimento e diferenciação de forma a maximizar a obtenção das três

principais formas de Leishmania (promastigotas procíclica e metacíclica e

amastigota). Nestas curvas, foram utilizadas células recém isoladas de

lesão de camundongos, e/ou derivadas de alíquotas congeladas, de forma

que ao início dos experimentos não tenham sido submetidas a mais do

que 5 repiques contados do seu isolamento do animal. Este procedimento

foi realizado para manter estas células altamente infectivas e com alta

capacidade de diferenciação. De forma a sincronizar, da melhor maneira

possível, a fase de crescimento celular, padronizou-se iniciar as curvas

com alíquotas de culturas já em fase estacionária. Inicialmente, curvas

foram estabelecidas em meio com pH 7,2 e a 26ºC, visando a obtenção de

formas procíclicas (crescimento exponencial e estacionário) e metacíclicas

da Leishmania. Estas foram monitoradas diariamente, onde foram


78

observados diversos fatores como morfologia, motilidade e crescimento

celular. A partir do 5º dia de crescimento celular, as células se

encontravam em fase estacionária, onde eram observadas, em 40 a 50%

das células da cultura, as formas metacíclicas com flagelo alongado. Para

a diferenciação em amastigotas axênicos (em contrapartida às

amastigotas obtidas diretamente de animais), curvas semelhantes foram

estabelecidas no mesmo meio de cultura, porém com o pH acidificado (pH

5,5) e a incubação em temperatura mais elevada (32ºC). A monitoração

das células permitiu a observação, já a partir do primeiro dia da curva, da

presença de formas redondas semelhantes à amastigota.

Todas as curvas realizadas apresentaram o mesmo padrão de

crescimento tanto nas formas promastigotas (FIGURA 1A) como na forma

amastigota “like” (semelhante à amastigota) (FIGURA 1C). A forma

promastigota foi encontrada em fase exponencial até o quarto dia, e no

quinto dia as células se encontravam na fase estacionária. No sexto dia da

curva, as células apresentavam-se na fase de declínio, onde foi observada

pouca motilidade, múltiplas rosetas e várias células deformadas. A cultura

em pH 5,5 e a 32ºC apresentou crescimento até o terceiro dia, a partir do

qual as células começaram a entrar em fase estacionária. A morfologia

arredondada característica de amastigota já foi observada a partir do

primeiro dia da curva, em menor proporção, e passou a ser predominante

no final da curva. A partir destas culturas foram retiradas alíquotas em

intervalos selecionados para a realização dos demais experimentos

descritos neste trabalho.

3.2 Validação das curvas de crescimento e diferenciação.

Uma vez estabelecidas as condições de cultivo, partiu-se para

confirmar a expressão, nas respectivas curvas, de proteínas que


79

participam na tradução e cuja expressão é sabidamente constitutiva.

Assim, alíquotas contendo quantidades equivalentes de células de cada

curva foram inicialmente avaliadas por SDS-PAGE e em seguida em

ensaios de Western-blot com soro contra proteínas selecionadas. Assim, a

proteína ribosomal P0 e o fator de iniciação da tradução eIF4A1 foram

utilizados como controle, para padronizar quantidade celular e confirmar a

qualidade das amostras protéicas, visto que sabidamente apresentam

expressão constitutiva durante todo o ciclo de vida de espécies de

Leishmania [24] (FIGURA 1B e 1D). Uma segunda proteína ribosomal, a

L19, também teve sua expressão investigada e produziu o mesmo padrão

que a proteína P0.

Também foi utilizado um controle a fim de validar a curva de

diferenciação celular em amastigotas axênicos, a proteína HSP70

mitocondrial (mtHSP70), que possui uma expressão diferenciada em

células amastigotas. Em estudos prévios foram identificados dois

homólogos da mtHSP70 em L. chagasi e L. major, denominados de Lc2.1

e Lc2.2. Soros produzidos contra esses dois homólogos reconhecem as

duas proteínas visto que são altamente conservadas. Em extratos de

promastigotas de várias espécies de Leishmania, foi observado que a

proteína predominante é a de maior peso molecular, provavelmente a

Lc2.2. Porém, em amastigotas provenientes de lesão em camundongos

Balb/c apenas uma banda de menor peso molecular é reconhecida

(provavelmente a Lc2.1).

Nas curvas realizadas, três perfis de expressão foram observados de

mtHSP70. O primeiro perfil foi visto em promastigotas crescidos a 26ºC e

no começo da curva de diferenciação a 32ºC. Neste foram detectadas

duas bandas, onde a banda com peso molecular mais alto (Lc2.2) se

mostrou bem mais abundante que a segunda, menor (Lc2.1). Um perfil

intermediário foi visto no meio da curva de diferenciação onde a

expressão da Lc2.1 foi aumentada enquanto a Lc2.2 diminuiu até ficarem


80

aproximadamente com o mesmo nível de expressão. No final da curva de

diferenciação, foi observado que os níveis de expressão de Lc2.2

diminuíram drasticamente, permanecendo a Lc2.1. Como em amastigotas

de lesão foi observada apenas a expressão da banda de menor peso

molecular (Lc2.1), este resultado valida a curva de diferenciação em

amastigotas axênicas, visto que, ao final da curva a 32ºC, quando

praticamente todas as células alteraram sua morfologia e ficaram

arredondadas, o perfil de expressão delas é semelhante ao da amastigota

de lesão (FIGURA 1E) [25].

3.3 Expressão de quatro homólogos do fator eIF4E durante ciclo

de vida de L. amazonensis.

Em seguida, partiu-se para a análise da expressão dos quatro

homólogos de eIF4E de L. amazonensis. Foram realizados ensaios de

“Western-blot” com anticorpos contra os fatores de iniciação da tradução

EIF4E1-4. Foi observado que os fatores EIF4E1 e EIF4E2 estão presentes

durante toda a curva de forma constitutiva. O EIF4E1 só conseguiu ser

detectado no “Western-blot” utilizando uma concentração de células cinco

vezes maior do que a utilizada nos demais ensaios, visto que essa

proteína é pouco abundante. Já o EIF4E2, mesmo estando em menor

quantidade na célula do que o EIF4E1, conseguiu ser detectado na forma

promastigota com 106 células, porém só foi detectado na forma

amastigota com cinco vezes mais células (FIGURA 2A e 2B).

No que concerne aos fatores EIF4E3 e EIF4E4, os resultados foram

mais complexos. Ambos são expressos durante todo o ciclo de vida e

aparecem sob a forma de duas bandas, se comportando de forma

contrastante. Enquanto que no EIF4E3 a banda de maior peso molecular

diminui de intensidade e depois reaparece forte sozinha no final da curva,

no EIF4E4 a banda de maior peso molecular aumenta e depois desaparece


81

(FIGURA 2A). O mesmo acontece no final da curva de diferenciação do

EIF4E2, onde é também observada a presença de duas bandas. Já na

curva de diferenciação em meio Schneider pH 5,5, os fatores EIF4E3 e

EIF4E4 são expressos da mesma forma que na curva de crescimento em

meio Schneider pH 7,2, porém, ocorre uma diminuição brusca da

expressão das duas proteínas no final da curva (FIGURA 2B).

Em estudos prévios, a expressão de um dos homólogos da proteína

de ligação a cauda poli-A (PABP1) em L. amazonensis, mostrou o mesmo

padrão de duas bandas nas primeiras horas após o repique celular [26]

(FIGURA 2C). Já foi comprovado que esta segunda banda reconhecida

representa a forma fosforilada desta proteína [18]. Também já foi

comprovada a regulação de fatores de iniciação da tradução através de

fosforilação em outros organismos e há vários estudos sobre a ocorrência

de regulação por fosforilação do fator eIF4E de humano. Tudo isso nos

leva a supor que a presença de uma segunda banda, de maior peso

molecular, nos fatores EIF4E observados de L. amazonensis, poderia ser o

reconhecimento da proteína na sua forma fosforilada. Outro ponto

interessante observado nestas curvas foi a velocidade com que ocorreu a

modificação no perfil de expressão das isoformas dos fatores EIF4E3,

EIF4E4 e na PABP1, concluída em grande parte nas primeiras duas horas

após o repique e precedendo a fase de crescimento celular acelerado.

3.4 Localização subcelular dos fatores de iniciação da tradução

EIF4E3 e EIF4E4.

Com o intuito de saber se as duas bandas, ou isoformas, observadas

para os EIF4E3 e EIF4E4, estariam exercendo funções em locais diferentes

na célula, realizamos o ensaio de imunocitoquímica utilizando células

coletadas em pontos estratégicos da curva de crescimento. No ponto 6h


82

da curva, encontramos o fator EIF4E3 apenas com a banda de menor peso

molecular, que seria a proteína na sua forma “não fosforilada” e o EIF4E4

apenas com a banda de maior peso molecular, que seria a forma

“fosforilada” da proteína. Já no ponto de 144h, o contrário foi observado.

Portanto, estes dois pontos foram escolhidos para verificar se a

“fosforilação”/“desfosforilação” das proteínas estariam modificando sua

localização dentro da célula. Os resultados da imunocitoquímica mostram

que os dois fatores apresentaram localização citoplasmática tanto no

ponto de 6h como no ponto de 144h, mostrando que não ocorreu

modificação de localização nas isoformas encontradas destes dois fatores

(FIGURA 3).

3.5 Análise do crescimento celular na indução de estresse em

quatro condições de meio Schneider pH 7,2.

A análise dos resultados de expressão dos EIF4E3 e E4 nas curvas

de crescimento chamou a atenção para a rápida mudança no perfil de

modificação destas proteínas induzida pelo repique celular. Em um

primeiro momento especulou-se que estas modificações poderiam estar

ocorrendo devido a três fatores: (1) densidade celular – ocorre uma

diluição no começo da curva e ao final são observadas células em

abundância. Esse efeito “diluição” celular poderia servir de sinal para se

ativar/desativar eventos pós traducionais; (2) utilização de meio novo -

através do repique do meio esgotado de nutrientes para um meio rico as

células poderiam modificar sua expressão; (3) soro fetal bovino (SFB) -

altamente necessário para o crescimento celular e que poderia estar

limitado no final da curva. Para se identificar qual(is) dentre estes fatores

poderiam estar influenciando nestas modificações pós-traducionais,

elaboramos um ensaio onde quatro condições diferentes de meio foram

testadas. A primeira condição, controle (N+, meio novo com SFB),


83

correspondeu ao repique normal para dar início a uma nova curva. Nas

duas condições seguintes foi utilizado um meio previamente condicionado,

ou seja, já utilizado em uma curva de crescimento anterior mantida até o

estágio de morte celular. Este meio, teoricamente esgotado de nutrientes,

foi reciclado e utilizado para se estabelecer duas novas curvas, com e sem

SFB (C+ e C-, meio condicionado com e sem SFB). Na quarta condição o

repique foi realizado em meio novo, mas se evitou adicionar o SFB (N-).

Após 24 horas, as células nas quatro condições testadas foram

observadas e quantificadas (Figura 4A), onde se observou que o meio

novo sem o SFB (N-) obteve o menor crescimento, seis vezes menor que

o controle (N+). Nesta condição as células já estavam bastante

deformadas e com pouca motilidade, característico de células em fase de

declínio. O meio condicionado ainda foi capaz de permitir a multiplicação

dos parasitas, tanto na ausência de SFB (C-), que embora tenha sido o

segundo pior desempenho ainda assim foi melhor que o (N-), quanto com

suplementação pelo soro (C+), quando o crescimento celular foi de 70 a

80% do observado para o controle. Acredita-se que as células

conseguiram crescer mais na condição (C-) em relação a (N-) devido à

presença de resquícios de SFB no meio condicionado. Estes resultados

sugerem que a densidade celular é um ponto importante que leva à

parada de crescimento e sua retomada quando ocorre a diluição no meio

condicionado, mas o ponto mais relevante parece ser a presença de SFB

no meio de cultura, tendo em vista o resultado obtido na condição (N-).

3.6 Expressão dos fatores EIF4E3 e EIF4E4 nas quatro condições

de meio Schneider pH 7,2.

A Figura 5 mostra os resultados obtidos com a análise da expressão

dos EIF4E3 e 4, e também da PABP1, nas quatro condições de


84

crescimento testadas, imediatamente após o repique (tempo 0) e nos

períodos sucessivos de 15 minutos, 30 minutos, 1, 2, 6 e 24 horas. A

proteína PABP1 foi utilizada neste experimento como parâmetro de

comparação, visto que também sofre modificações pós-traducionais,

nesse caso comprovadamente por fosforilação, nas primeiras horas após o

repique celular. Os intervalos mais curtos para a análise foram

selecionados para se permitir uma melhor definição quanto ao período de

início das mudanças observadas após o repique. Foi observado que no

meio novo sem SFB, onde a célula é exposta a maior condição de

estresse, a fosforilação da PABP já começa a partir dos primeiros 15

minutos após o repique, em contraste com o controle, que só apresenta

fosforilação após 2h. No tempo de 24h o padrão de modificação da PABP1

é semelhante em todas as condições (FIGURA 5A). Já com o EIF4E3 a

proteína na condição (N-) de estresse começa a “desfosforilar” a partir de

1h após o repique, diferente da condição do controle, onde foi observado

o começo da “desfosforilação” com 15 minutos (FIGURA 5B). No caso do

EIF4E4 não parece haver diferenças significativas entre as várias

condições testadas nas primeiras 6 horas após o repique. Em termos de

cinética das modificações nas três proteínas, observou-se que estas

estavam presentes após 1h do repique, em qualquer condição, mas seu

efeito maior se dava em até 6h.

Chama a atenção no caso da curva (N-) para o EIF4E3 a presença

de uma terceira banda após 24h de crescimento, que poderia ser uma

“hiperfosforilação” da proteína. Este padrão é totalmente distinto do

observado no controle, ou mesmo em células em fase estacionária de

crescimento, entretanto nas células crescidas em meio condicionado, que

apresentam fenótipos intermediários entre (N-) e (N+), esta terceira

banda aparece em menor intensidade. No caso do homólogo EIF4E4

ocorre uma “desfosforilação” precoce em 24h de crescimento no meio

novo sem SFB (FIGURA 5C), compatível com o fenótipo observado na fase


85

estacionária de crescimento. Tanto no caso do EIF4E3 como do EIF4E4,

então, e ao contrário da PABP1, o fenótipo observado às 24h sem SFB é

compatível com uma entrada precoce na fase estacionária de crescimento,

em especial no caso do EIF4E3, onde este fenótipo é exacerbado com o

aparecimento da banda “hiperfosforilada”.

3.7 Análise de síntese de proteínas através de marcação

metabólica com metionina marcada com [35S].

A fim de se correlacionar níveis qualitativos e quantitativos de

síntese protéica com padrões de modificação dos fatores EIF4E3 e EIF4E4,

foi realizado o ensaio de marcação metabólica com 35S de alíquotas de

células retiradas de pontos representativos das curvas de crescimento em

pH 7,2. Para realizar esta marcação, escolhemos pontos onde se observou

padrões contrastantes de expressão dos EIF4E3 e EIF4E4, como nos

pontos de 6h e 144h da curva padrão, e o ponto 24h da curva gerada na

condição (N-) do item anterior. Os resultados mostraram que houve

diferença no padrão de expressão entre os três pontos citados (FIGURA

6), onde as bandas diferenciais de cada tempo estão marcadas com setas

vermelhas. É claramente observado também que a incorporação da

metionina marcada no ponto de 6h é maior do que nos outros dois

tempos, visto que as células já estão em fase de declínio e a síntese de

proteínas não está mais ocorrendo no mesmo modo. Outro fato

interessante é que apenas nos tempos de 24h e 144h observamos a

presença de uma expressão forte de uma banda de aproximadamente 70

KDa (seta verde). No geral é possível correlacionar níveis mais elevados

de síntese protéica com a presença da banda “defosforilada” do EIF4E3 e

da banda fosforilada do EIF4E4.


86

3.8 Expressão dos fatores EIF4E3 e EIF4E4 na presença de

inibidores de transcrição e tradução.

Curvas de crescimento foram realizadas sob condição de inibição de

transcrição e tradução de forma a verificar se estes inibidores poderiam

afetar os padrões de modificação pós-traducional destas proteínas. Para a

inibição da transcrição, foi utilizada a actinomicina D (derivada de

Streptomyces), que inibe a transcrição por ligar-se fortemente e

especificamente ao DNA dúplex e, assim, impedir que ele seja molde para

a transcrição [27]. Já para a inibição da tradução, foi utilizada a

cicloheximida, que inibe a atividade de peptidil transferase dos ribossomos

de eucariotos (80S) [28]. A curva de inibição da transcrição com

actinomicina D interferiu no padrão de expressão do fator EIF4E3, pois foi

observada uma “desfosforilação” tardia em 24h. Já no ponto 6h são

encontradas as duas isoformas em níveis equivalentes, diferentemente do

controle que no ponto 6h a proteína aparece totalmente “desfosforilada”

(FIGURA 7). Já no fator EIF4E4, o inibidor provocou uma “desfosforilação”

no ponto de 6h, que deveria estar “fosforilado”, e continuou

“desfosforilado” em 24h, onde deveria apresentar as duas isoformas. Já na

curva utilizando cicloheximida, a inibição da tradução não interfere na

resposta do fator EIF4E4. Porém o contrário é observado com o fator

EIF4E3, pois a expressão da proteína não varia e é observado um bloqueio

da sua “desfosforilação”.

4. DISCUSSÃO

Através deste estudo, foi possível identificar em L. amazonensis que,

entre os quatro homólogos de eIF4E analisados, os EIF4E3 e EIF4E4

apresentaram ao menos duas isoformas claramente identificáveis, com


87

um padrão de expressão que varia durante suas diferentes formas de

vida. Até agora, não foi realizado nenhum estudo sobre a fosforilação do

fator eIF4E em Leishmania. Entretanto, fortes evidências nos levam a

pensar que a isoforma de maior peso molecular nestes homólogos seja

conseqüência desse mecanismo pós-traducional, em especial a ocorrência

de estudos sobre fosforilação do fator eIF4E em outros organismos como

Drosophila [29] e humanos [30, 31, 32, 33, 34]. Em L. major, o evento

de fosforilação foi confirmado na PABP1 através da incorporação “in vivo”

de [32P] [18]. Esta fosforilação também foi observada em L. amazonensis,

nas primeiras horas após o repique na curva de crescimento e

diferenciação [26].

Além de apresentarem variação na expressão e duas isoformas,

observamos também que a “fosforilação/desfosforilação” dos fatores

EIF4E3 e 4 se apresentou invertida, isto é, quando um está “fosforilado” o

outro está “desfosforilado” e vice-versa, sendo que no meio da curva as

duas isoformas estão presentes em ambas as proteínas. Isso nos leva a

supor que estes homólogos poderiam estar atuando na célula e na

iniciação da tradução alternadamente, ou na tradução de mRNAs

específicos que sejam expressos em diferentes fases do complexo ciclo de

vida do parasita. Estas mudanças transientes da expressão gênica durante

a diferenciação, desenvolvimento, ou progressão do ciclo celular também

já foram descritas em outros organismos como Drosophilla [35],

Plasmodium falciparum [36], Saccharomyces cerevisiae [37] e humanos

[38].

Devido ao número elevado de fosfoproteínas encontradas em

tripanossomatídeos, eventos de fosforilação podem ser o mecanismo

chave para a regulação, visto que este número é consideravelmente maior

do que o encontrado para outros parasitas intracelulares que transitam

em ambientes distintos [39]. A quantidade de proteínas quinases

presentes nos tripanosomatídeos é cerca de 33% maior do que em S.


88

cerevisiae e duas vezes maior que em P. falciparum [40, 41]. Um estudo

recente mostra a participação de proteínas da família MAP quinases que

estão envolvidas na regulação do tamanho do flagelo em L. mexicana. A

proteína LmxMKK não é detectada em amastigotas, é altamente regulada

durante a diferenciação para promastigotas com níveis reduzidos durante

o começo desta diferenciação. Além disso, a proteína LmxMPK3 é capaz de

fosforilar LmxMKK, indicando uma possível regulação por “feedback” [42].

A diferenciação de promastigotas para amastigotas em Leishmania é

um processo complexo, porém as mudanças morfológicas que ocorrem no

parasita parecem ser bem coordenadas e reguladas [43]. Um estudo

recente foi realizado investigando mudanças na abundância do RNA

durante a diferenciação promastigota-amastigota de L. donovani em meio

de cultura. Este estudo revelou que vários genes sofrem regulações

transientes e permanentes durante a diferenciação e que a maioria das

mudanças ocorre no final deste processo, quando a diferenciação

morfológica é praticamente completa. Genes que possuem regulação

transiente durante a diferenciação incluem aqueles que codificam

proteínas de choque térmico, proteínas que interagem com o RNA,

proteínas quinases, entre outros [44]. Outro estudo recente com L. major

mostrou, através de PCR em tempo real e da técnica de microarranjos

(“Microarrays”), que a maioria dos mRNAs de L. major são

constitutivamente expressos e a presença de diferentes níveis de mRNA

encontrados nas formas amastigotas e promastigotas ocorre

provavelmente por eventos pós-transcricionais que leva a uma diferença

na estabilidade dos mRNAs [45].

Nossos resultados mostraram uma expressão diferenciada nos

primeiros 15 minutos do repique celular, sugerindo que o perfil de

expressão observado é devido realmente a modificações pós-traducionais,

e não a eventos que dependam de transcrição ou tradução. No caso da

expressão das proteínas nas curvas de inibição, observamos que o padrão


89

de expressão do fator EIF4E4 não é modificado na presença do inibidor de

tradução, o que ocorre também com a proteína PABP1 (dados não

mostrados). No caso do fator EIF4E3 há mudanças no comportamento

pós-traducional da proteína, onde ocorre um bloqueio da “desfosforilação”

em 6h. Já com a presença do inibidor de transcrição, ocorreu mudanças

no perfil de expressão de ambos os homólogos. Ocorre uma

“desfosforilação” tardia do EIF4E3 em 24h, e, no caso do EIF4E4, uma

“desfosforilação” que começa a partir de 6h, ponto onde a proteína

deveria estar apenas na sua forma “fosforilada”. Na PABP1 em L. major, a

actinomicina D modificou tanto seu padrão de expressão, como sua

localização subcelular, sugerindo que a expressão desta proteína poderia

ser regulada ao nível pós-transcricional em resposta a abundância de

mRNA presente na célula [18].

Através do ensaio de marcação metabólica, foi possível observar que

a incorporação da metionina praticamente não ocorreu nos tempos de 24h

sem SFB e 144h, pontos onde a célula está em fase de declínio e, por

isso, a biossíntese protéica é baixa. Devido a isso, podemos sugerir que a

atividade dos fatores EIF4E3 e 4 ocorre quando estão nas isoformas

“desfosforilada” e “fosforilada” respectivamente, visto que no ponto de

elevada biossíntese protéica (6h), os fatores EIF4E3 e 4 encontram-se

nestas isoformas. Além disso, na inibição da tradução, o fator EIF4E3 não

consegue desfosforilar totalmente no ponto de 6h, indicando que se não

está ocorrendo tradução, não precisa haver a modificação da proteína

para a sua forma ativa. Através de uma análise da associação de

proteínas com os poliribossomos, por exemplo, poderíamos observar a

presença de alguma isoforma, que seria um indicativo da participação da

proteína na tradução. Isso confirmaria nossas suposições de que a

“desfoforilação” do EIF4E3 e a “fosforilação” do EIF4E4 estariam ativando

a proteína para participação na biossíntese protéica.

Com todos os dados obtidos neste trabalho, juntamente com os


90

outros dados, seria possível sugerir que os fatores EIF4E3 e EIF4E4

poderiam estar atuando como fatores de iniciação da tradução na

Leishmania. Já os outros fatores poderiam estar envolvidos, através de

funções modulatórias, indiretamente na regulação da tradução. Para

confirmar essas suposições, é necessária a realização de maiores estudos

sobre estes fatores e como ocorre seu mecanismo de regulação pós-

traducional, que parece ser de extrema importância para o mecanismo de

biossíntese protéica e crucial na sobrevida do parasita.

5. Referências

[1] TDR - Special Programme for Research and Training in Tropical

Diseases. http://www.who.int/tdr (Dezembro, 2007).

[2] Handman E. (2001) Leishmania virulence: it's a knock out! Trends

Parasitol. 17 (2): 60.

[3] Besteiro S, Williams RAM, Coombs GH, Mottram JC. (2007) Protein

turnover and differentiation in Leishmania. Int J Parasitol.

37(10):1063-75.

[4] Clayton CE. (2002) Life without transcriptional control? From fly to

man and back again. EMBO J. 21:1881-8.

[5] Gebauer F and Hentze MW (2004) Molecular mechanisms of

translational control. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 5: 827-835.

[6] Prévôt D, Darlix JL, Ohlmann T (2003) Conducting the initiation of

protein synthesis: the role of eIF4G. Biol Cell 95(3-4):141-56.


91

[7] Hershey JWB and Merrick WC (2000) The pathway and mechanism of

initiation of protein synthesis. Translational Control of Gene

Expression (Cold Spring Habor Laboratory Press); pp. 33-38.

[8] Sonenberg N and Dever TE (2003) Eukaryotic translation initiation

factors and regulators. Curr Opin Struct Biol. 13: 56-63.

[9] Lloyd RE (2006) Translational control by viral proteinases. Virus Res.

119 (1): 76-88.

[10] von der Haar T, Ball PD and McCarthy JE (2000) Stabilization of

eukaryotic initiation factor 4E binding to the mRNA 5'-Cap by

domains of eIF4G. J Biol Chem. 275: 30551-30555.

[11] Rom E, Kim HC, Gingras AC, Marcotrigiano J, Favre D, Olsen H,

Burley SK, Sonenberg N. (1998) Cloning and characterization of

4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein. J Biol

Chem. 273 (21): 13104-9.

[12] Goodfellow IG, Roberts LO. (2007) Eukaryotic initiation factor 4E. Int

J Biochem Cell Biol. [in press].

[13] Jankowska-Anyszka M, Lamphear BJ, Aamodt EJ, Harrington T,

Darzynkiewicz E, Stolarski R, Rhoads RE. (1998) Multiple isoforms of

eukaryotic protein synthesis initiation factor 4E in Caenorhabditis

elegans can distinguish between mono- and trimethylated mRNA

cap structures. J Biol Chem. 273 (17): 10538-42.

[14] Keiper BD, Lamphear BJ, Deshpande AM Jankowska-Anyszka M,


92

Aamodt EJ, Blumenthal T, Rhoads RE (2000) Functional

characterization of five eIF4E isoforms in Caernorhabditis elegans. J

Biol Chem. 275; 10590-10596.

[15] Sonenberg N (1996). Translational control. In: Stabilization of

eukaryotic initiation factor 4E binding to the mRNA 5’-cap by

domains of eIF4G. Biol Chem. 39: 30551-30555.

[16] Gingras AC, Raught B and Sonenberg N (1999) eIF4 initiation

factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators

of translation. Annu Rev Biochem. 68: 913-963.

[17] Batista JA, Teixeira SM, Donelson JE, Kirchhoff LV and de Sa CM

(1994) Characterization of a Trypanosoma cruzi poly(A)-binding

protein and its genes. Mol Biochem Parasitol. 67: 301-312.

[18] Bates EJ, Knuepfer E and Smith DF (2000) Poly(A)-binding protein I

of Leishmania: functional analysis and localisation in trypanosomatid

parasites. Nucleic Acids Res. 28: 1211-1220.

[19] Yoffe Y, Zuberek J, Lewdorowicz M, Zeira Z, Keasar C, Orr-Dahan I,

Jankowska-Anyszka M, Stepinski J, Darzynkiewicz E, Shapira M.

(2004) Cap-binding activity of an homolog from Leishmania. RNA.

10 (11): 1764-75.

[20] Ivens AC, Peacock CS, Worthey EA, et al. (2005) The genome of the

kinetoplastid parasite, Leishmania major. Science. 309: 436-442.

[21] Dhalia R, Reis CR, Freire ER, et al. (2005) Translation initiation in

Leishmania major: characterisation of multiple eIF4F subunit


93

homologues. Mol Biochem Parasitol. 140: 23-41.

[22] Uliana SRB, Goyal N, Freymüller E and Smith DF (1999) Leishmania:

overexpression ad comparative structural analysis of the stage-

regulated meta 1 gene. Experimental Parasitology. 92: 183-191.

[23] de Melo Neto OP, Standart N, and Martins de, SC (1995)

Autoregulation of poly(A)-binding protein synthesis in vitro. Nucleic

Acids Res. 23 (12): 2198-2205

[24] Rocha PO (2006) Análise da expressão de fatores envolvidos na

síntese de proteínas durante o ciclo de vida de Leishmania sp.

Dissertação de Mestrado do Programa de Pós Graduação em

Genética da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil.

[25] Campos RM, Nascimento M, Ferraz JC, Pereira MMC, Rocha PO,

Thompson GM, Cysne-Finkelstein L, Figueiredo RCBQ and de Melo Neto

OP (2008) Distinct mitochondrial HSP70 homologues conserved in

various Leishmania species suggest novel biological functions. Artigo

Submetido à revista Molecular and Biochemical Parasitology.

[26] da Costa Lima TDC (2007) Caracterização funcional de homólogos da

proteína de ligação a cauda poli-A (PABP) de Leishmania major.

Dissertação de Mestrado do Programa de Pós Graduação em

Genética da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brasil.

[27] ICB – Intituto de Ciências biológicas

http://www.icb.ufmg.br/prodabi/prodabi3/grupos/grupo1/inibidores.h

tm (Dezembro, 2007).


94

[28] FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/aula_Traducao.pdf

(Dezembro, 2007).

[29] Lachance PE, Miron M, Raught B, Sonenberg N, Lasko P. (2002)

Phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 4E is

critical for growth. Mol Cell Biol. 22 (6): 1656-63.

[30] Hiremath LS, Hiremath ST, Rychlik W, Joshi S, Domier LL, Rhoads

RE. (1989) In vitro synthesis, phosphorylation, and localization on

48 S initiation complexes of human protein synthesis initiation factor

4E. J Biol Chem. 264 (2): 1132-8.

[31] Joshi B, Cai AL, Keiper BD, Minich WB, Mendez R, Beach CM,

Stepinski J, Stolaeski R, Darzynkiewicz E and Rhoads RE (1995)

Phosphorilation of eukaryotic protein synthesis factor 4E at Ser-209.

J Biol Chem 270: 14597-14603.

[32] Wang X, Flynn A, Waskiewicz AJ, Webb BL, Vries RG, Baines IA,

Cooper JA, Proud CG. (1998) The phosphorylation of eukaryotic

initiation factor eIF4E in response to phorbol esters, cell stresses,

and cytokines is mediated by distinct MAP kinase pathways. J Biol

Chem. 273 (16): 9373-7.

[33] Scheper GC, van Kollenburg B, Hu J, Luo Y, Goss DJ, Proud CG

(2002) Phosphorylation of eucariotic initiation factor 4E markedly

reduces its affinity for capped mRNA. J Biol Chem. 277(5); 3303-

3309.


95

[34] Zuberek J, Wyslouch-Cieszynska A, Niedzwiecka A, Dadlez M,

Stepinski J, Augustyniak W, Gingras AC, Zhang Z, Burley SK,

Sonenberg N, Stolarski R, Darzynkiewicz E. (2003) Phospholylation

of eIF4E attenuates its interation with mRNA 5’ cap analogs by

electrostatic repulsion: inten-mediated protein ligation strategy to

obtain phosphorylated protein. RNA. 9 (1): 52-61.

[35] Wagner RA, Tabibiazar R, Liao A, Quertermous T. (2005) Genome-

wide expression dynamics during mouse embryonic development

reveal similarities to Drosophila development. Dev Biol. 288: 595–

611.

[36] Bozdech Z, Llinas M, Pulliam B, Wong E, Zhu J, DeRisi J. (2003) The

transcriptome of the intraerythrocytic developmental cycle of

Plasmodium falciparum. PLOS. 1:E5.

[37] Spellman PT, Sherlock G, Zhang MQ, et al. (1998) Comprehensive

identification of cell cycle-regulated genes of the yeast

Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Mol Biol Cell.

9: 3273–97.

[38] Whitfield ML, Sherlock G, Saldanha AJ, et al. (2002) Identification of

genes periodically expressed in the human cell cycle and their

expression in tumors. Mol Biol Cell. 13: 1977–2000.

[39] Parsons M, Worthey EA, Ward PN, Mottram JC (2005). Comparative

analysis of the kinomes of three pathogenic trypanosomatids:

Leishmania major, Trypanosoma brucei and Trypanosoma cruzi.

BMC Genomics; 15; 6: 127.


96

[40] Ward P, Equinet L, Packer J, Doerig C. (2004) Protein kinases of the

human malaria parasite Plasmodium falciparum: the kinome of a

divergent eukaryote. BMC Genomics. 5 (1): 79.

[41] Naula C, Parsons M, and Mottram JC (2005) Protein kinases as drug

targets in trypanosomes and Leishmania. Biochim Biophys Acta

1754 (1-2): 151-9.

[42] Erdmann M, Scholz A, Melzer IM, Schmetz C, Wiese M. (2006)

Interacting protein kinases involved in the regulation of flagellar

length. Mol Biol Cell. 17 (4): 2035-45.

[43] Barak E, Amin-Spector S, Gerliak E, Goyard S, Holland N, Zilberstein

D. (2005) Differentiation of Leishmania donovani in host-free

system: analysis of signal perception and response. Mol Biochem

Parasitol. 141: 99– 108.

[44] Saxena A, Lahav T, Holland N, Aggarwal G, Anupama A, Huang Y,

Volpin H, Myler PJ, Zilberstein D. (2007) Analysis of the Leishmania

donovani transcriptome reveals an ordered progression of transient

and permanent changes in gene expression during differentiation.

Mol Biochem Parasitol. 152 (1): 53-65.

[45] Leifso K, Cohen-Freue G, Dogra N, Murray A, McMaster WR. (2007)

Genomic and proteomic expression analysis of Leishmania

promastigote and amastigote life stages: the Leishmania genome is

constitutively expressed. Mol Biochem Parasitol. 152 (1): 35-46.


97

(B)Curva de Crescimento em Meio Schneider 7,2

0

10

20

30

40

50

60

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 144h

Tempo (horas)

Nº d

e c

élul

as (

106 )

Fase logestacionária

declínio

Fase lag

Formas metacíclicas

Curva de Crescimento – Meio Schneider pH 7,2 (B)Curva de Crescimento em Meio Schneider 7,2

0

10

20

30

40

50

60

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 144h

Tempo (horas)

Nº d

e c

élul

as (

106 )

Fase logestacionária

declínio

Fase lag

Formas metacíclicas

Curva de Crescimento – Meio Schneider pH 7,2

Amastigota de lesão

26ºC pH 7,2 32ºC pH 5,5

0h 24h 72h 120h 0h 24h 72h 120h 144h

(E)

Amastigota de lesão

26ºC pH 7,2 32ºC pH 5,5

0h 24h 72h 120h 0h 24h 72h 120h 144h

(E)

(A) (B)

pH 7,2 – 26ºC

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 14 4h

EIF4A1

P0

L19

pH 7,2 – 26ºC

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 14 4h

EIF4A1

P0

L19

(C) (D)

Curva de Crescimento em Meio Schneider 5,5

0

3

6

9

12

15

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 144h

Tempo (horas)

Nº

de c

élul

as (

x10

6 ) Fase logestacionária

declínioFase lag

Amastigotas “like”

Curva de Crescimento – Meio Schneider pH 5,5Curva de Crescimento em Meio Schneider 5,5

0

3

6

9

12

15

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 144h

Tempo (horas)

Nº

de c

élul

as (

x10

6 ) Fase logestacionária

declínioFase lag

Amastigotas “like”

Curva de Crescimento – Meio Schneider pH 5,5pH 5,5 – 32ºC

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h

EIF4A1

P0

L19

pH 5,5 – 32ºC

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h

EIF4A1

P0

L19

Figura 1. Padrão de crescimento e diferenciação de L. amazonensis em cultivo in vitro. (A) Curva de crescimento de células promastigotas procíclicas e metacíclicas em meio Schneider pH 7,2, a 26oC. (B) Expressão das proteínas EIF4A1, P0 e L19 utilizadas como controle da curva de crescimento em pH 7,2. (C) Curva de diferenciação de células amastigotas “like” em meio Schneider pH 5,5, a 32oC. (D) Expressão das proteínas EIF4A1, P0 e L19 utilizadas como controle da curva de diferenciação em pH 5,5. (E) Expressão da proteína mtHSP70 em pontos representativos das curva de crescimento e diferenciação e em extrato de amastigotas retiradas de lesão de camundongo Balb/c. (Figura modificada do artigo Campos et al., 2008, submetido a revista Molecular and Biochemical Parasitology). As alíquotas foram fracionadas em SDS-PAGE 15% e analisados por “Western-Blot”. Todas as alíquotas contém 106 células, com exceção da amastigota de lesão que contém 2,5 x 106 células.


98

EIF4E3

EIF4E4

EIF4E1

EIF4E2

(A)

(C)

PABP1

pH 7,2 – 26ºC

(B)pH 7,2 – 26ºC

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 144h0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h 144h

pH 5,5 – 32ºC

0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h0h 2h 6h 24h 48h 72h 96h 120h

0h 2h 6h 24h 48h 72h 120h 144h

Figura 2. Expressão dos quatro homológos do fator de iniciação da tradução EIF4E e da proteína PABP1 durante as curvas de crescimento e diferenciação de L. amazonensis. (A) Expressão dos homólogos EIF4E1-4 na curva de crescimento em pH 7,2 a 26oC. (B) Expressão dos homólogos EIF4E1-4 na curva de diferenciação em pH 5,5, a 32oC. (C) Expressão de pontos representativos da proteína PABP1 na curva de crescimento em pH 7,2 (Resultado da Dissertação de mestrado da aluna Tamara De’Carli da Costa Lima, 2007). As alíquotas foram fracionadas em SDS-PAGE 15% e analisados por “Western-Blot”. Todas as alíquotas contém 106 células, com exceção de ambas as amostras com o EIF4E1 e do EIF4E2 em pH 5,5, que contém 5 x 106 células.


99

144 horas

6 horas

(A)

(B)

EIF4E3 EIF4E4

EIF4E3 EIF4E4

Figura 3. Localização subcelular dos fatores EIF4E3 e EIF4E4. (A) Células com 6h de crescimento em meio com pH 7,2, a 26º C. (B) Células com 144h de crescimento em meio com pH 7,2, a 26º C. Mesmo com o marcador de núcleo e cinetoplasto não estando evidente, nota-se que os dois homólogos apresentaram localização citoplasmática.


100

Figura 4. Avaliação do crescimento da L. amazonensis em 24h na presença de meio novo ou condicionado, com e sem soro fetal bovino (SFB). (A) O gráfico ilustra o crescimento observado após 24h de repique da célula. O meio Schneider novo, pH 7,2, com SFB e crescimento a 26oC (N+) representou o controle do experimento. Foi também avaliado o crescimento celular no mesmo meio na ausência de SFB (N-). Alternativamente foi utilizado o meio condicionado, reutilizado a partir de uma cultura antiga mantida até a fase estacionária de crescimento, na presença (C+) ou ausência (C-) de SFB. (B) Expressão do fator de iniciação da tradução EIF4A1, utilizado para padronizar a quantidade celular nos experimentos. Alíquotas representativas da fase promastigota até o ponto de 24h de crescimento, nas quatro condições de meio, foram fracionadas em SDS-PAGE 15% e analisados por “Western-Blot”. Todas as alíquotas contêm 106 células.

Avaliação do Crescimento da L. amazonensis em 24h

0

1

2

3

4

5

6

7

Número de Células (x106)

C-

C+

N-

N+

(A)

Avaliação do Crescimento da L. amazonensis em 24h

0

1

2

3

4

5

6

7



C-

C+

N-

N+

(A)

(B)

0h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

EIF4A1

N-

N+

C-

C+

(B)

0h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

EIF4A1

N-

N+

C-

C+


101

(A) (B)

EIF4E30h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

N-

N+

C-

C+

N-

N+

C-

C+

PABP10h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

(C)

EIF4E40h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

N-

N+

C-

C+

Figura 5. Expressão dos fatores EIF4E3, EIF4E4 e a PABP1 nas culturas crescidas por 24 horas na presença de meio novo ou condicionado, com e sem soro fetal bovino (SFB). (A) PABP1, (B) EIF4E3, (C) EIF4E4. As culturas foram definidas como descrito na Figura 4. Alíquotas representativas da fase promastigota até o ponto de 24h de crescimento, nas quatro condições de meio, foram fracionadas em SDS-PAGE 15% e analisados por “Western-Blot”. Todas as alíquotas contêm 106 células.


102

pH 7,2 – 26ºC

97KDa

66KDa

45KDa

30KDa

20KDa

14,4KDa

6h 144h 24h s/ SFB

97KDa

66KDa

45KDa

30KDa

20KDa

14,4KDa

6h 144h 24h s/ SFB

Figura 6. Análise do perfil de síntese protéica em células de L. amazonensis em diferentes estágios de crescimento. Marcação metabólica com metionina marcada com 35S, comparando mudanças no padrão de expressão protéica de células de L. amazonensis derivadas de fases representativas de sua curva padrão de crescimento (6h e 144h) ou de células retiradas da curva (N-, ausência de soro fetal bovino), da Figura 4, no tempo de 24h. As setas vermelhas indicam proteínas presentes apenas na fase exponencial do crescimento do parasita, enquanto que as setas verdes indicam proteínas presentes apenas na estacionárias. Maiores mudanças não puderam ser observadas devido a pouca incorporação de metionina no tempo de 24h sem soro fetal. Todas as alíquotas contém 106 células.


103

Figura 7. Expressão dos fatores EIF4E3 e EIF4E4 em curvas de crescimento realizadas na presença de inibidores de transcrição (actinomicina D) ou tradução (cicloheximida). Alíquotas representativas da fase promastigotas nas primeiras 24h de crescimento em condições padrão (pH7,2 a 26ºC – controle) ou na presença de inibidores de transcrição ou tradução, foram fracionadas em SDS-PAGE 15% e analisados por “Western-Blot”. Todas as alíquotas contém 106 células. Em (A) EIF4E3 e em (B) EIF4E4.

EIF4E3

0h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

Curva Controle

ActinomicinaD

Cicloheximida

EIF4E4

0h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

(A) (B)EIF4E3

0h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

Curva Controle

ActinomicinaD

Cicloheximida

EIF4E4

0h 15’ 30’ 1h 2h 6h 24h

(A) (B)


104

6. CONCLUSÕES •••• Os quatro homólogos do EIF4E estão presentes ao longo da curva de

crescimento de L. amazonensis e possuem padrões de expressão

diferenciados, indicando que os homólogos atuam de forma distinta na

célula durante seu ciclo de vida;

• Os fatores EIF4E2-4 apresentaram um padrão de expressão com duas

isoformas, onde a banda de maior peso molecular deve ser provocada por

modificações pós-traducionais, provavelmente a fosforilação;

•••• Os fatores EIF4E3 e 4 são citoplasmáticos e apresentaram padrões de

expressão contrastante e variáveis de acordo com a fase de crescimento,

indicando uma possível complementaridade funcional destas proteínas na

iniciação da tradução;

• O repique modifica o padrão de expressão das células, que é induzido

pela diluição da célula no meio e pelo soro fetal bovino;

•••• A biossíntese protéica alta no ponto de 6h e baixa no ponto de 144h,

juntamente com o bloqueio da desfosforilação do EIF4E3 na curva de

inibição de tradução é um forte indício de que a atividade do EIF4E3 e 4

ocorre com as proteínas na sua forma "desfosforilada" e fosforilada

respectivamente.


105

7. ABSTRACT The trypanosomatid protozoans cause clinical diseases of global impact

and have peculiar biochemical characteristics that differ from the others

eukaryotes. Gene expression in these parasites is regulated at the post-

transcriptional level, probably at the translation initiation step. The cap-

dependent translation begins with the binding of the translation initiation

factor eIF4E, belonging to the eIF4F complex, to the cap present in the 5'

end of the mRNAs. Multiple homologues to EIF4E were identified in

trypanosomatids, which are probably associated to their complex life

cycle. In this study, our aim was to understand the expression pattern of

four homologues (EIF4E1-4) during the life cycle of Leishmania

amazonensis. Growth curves were performed in order to obtain the three

main growth forms of the parasite. All homologues were expressed

throughout the curve and EIF4E2-4 display multiple isoforms, probably

due to post-translational modifications through phosphorylation. The

EIF4E3 and 4 isoforms display a contrasting pattern of expression which

do not interfere with their subcellular cytoplasmic localization. Lack of fetal

calf serum in the medium induced a premature “dephosphorylation” of

EIF4E4 and a "hyperphosphorylation" of EIF4E3, associated with lack of

cell growth. “Non-phosphorylated” EIF4E3 and “phosphorylated” EIF4E4

were associated with high protein synthesis levels. The presence of a

transcription inhibitor influenced the expression pattern of the two

homologues, but a translation inhibitor affected only EIF4E3. These results

indicate that the eIF4E homologues act in distinct ways in the cell and that

phosphorylation may have a significant role in the regulation of these

factors in Leishmania and in the control of global protein biosynthesis.

Key-Words: Leishmania amazonensis, EIF4E, phospholylation.


106

8. ANEXOS

8.1 Instruções para Autores

RREEVVIISSTTAA:: Molecular and Biochemical Parasitology

Guide for Authors

Submission of a paper to Molecular and Biochemical Parasitology,

including a revised version, implies the transfer of copyright from the

author(s) to the publisher and therefore that the corresponding author has

obtained the approval of all other authors to the text and that it does not

contain information previously published (except as a meeting abstract or

by submission of sequence data to an electronic database) and is not

under consideration for publication elsewhere. Publication in Molecular and

Biochemical Parasitology is taken to imply the authors' willingness to

comply with reasonable requests to supply reagents such as recombinant

clones and monoclonal antibodies, and sequence data in electronic form to

persons lacking access to computer databases.

Manuscripts returned for revision should be returned to the editor within 3

months. Papers accepted for publication should be as concise as possible

and should be no longer than 14 printed pages. In exceptional cases the

editors will consider longer papers (never exceeding 20 printed pages) if

the authors of such complex papers show to the satisfaction of the editors

that the limitation in length would result in subdivision of the material into

several papers and hence in an increase in the total number of pages

necessary for the presentation of the work.

Online Submission Submission to this journal is now totally online. Please


107

use the following guidelines to prepare your article. Via the online

submission page of this journal (http://ees.elsevier.com/molbio/) you will

be guided stepwise through the creation and uploading of the various files.

The system automatically converts source files to a single Adobe Acrobat

PDF version of the article, which is used in the peer review process. Please

note that even though manuscript source files are converted to PDF at

submission for the review process, these source files are needed for

further processing after acceptance. All correspondence, including

notification of the Editor's decision and request for revision, takes place by

email and via the author's homepage, removing the need for a hard-copy

paper trail.

The above represents a brief outline of this form of submission. It can be

advantageous to print this "guide for authors" from the site

(http://authors.elsevier.com/) for reference in the subsequent stages of

article preparation.

Authors' rights

As an author you (or your employer) may do the following:

- make copies (print or electronic of the article for your own personal use,

including for your own classroom teaching use

- make copies and distribute such copies (including through email) of the

article to research colleagues, for the personal use by such colleagues(but

not commercially or systematiccally, e.g., via an email list or list servier)

- post a pre-print version of the article on Internet websites including

electronic pre-print servers, and to retain indefinitely such versions on

such servers or sites


108

- post a revised version of the final text of the article (to reflect changes

made in the peer review and editing process) on your personal or

institutional website or server, with a link to the journal homepage on

www.elsevier.com

- present the article at a meeting or conference and to distribute copies of

the article to delegates attending such a meeting

- for your employer, if the article is a 'work for hire', made within the

scope of your employment, your employer may use all or part of the

information in the article for other intra-company use (e.g., training)

- retain patent and trademark rights and rights to any processes or

procedure described in the article

- include the article in full or in part in a thesis or dissertation (provided

that this is not to be published commercially)

- use the article or any part thereof in a printed compilation of your works,

such as collected writings or lecture notes (subsequent to publication of

your article in the journal)

- prepare other derivative works, to extend the article into book-length

form, or to otherwise re-use portions or excerpts in other works, with full

acknowledgement of its original publication in the journal.

Protein and Nucleic Acid Sequences. Novel nucleotide or protein sequence

data must be deposited in the GenBank™, EMBL or DDBJ databases and

an accession number obtained before the paper can be accepted for


109

publication. Submission to any one of the collaborating databanks is

sufficient to ensure entry in all. The accession number should be included

as a footnote on the title page of the manuscript:

'Note: Nucleotide sequence data reported in this paper are available in the

GenBank™, EMBL and DDBJ databases under the accession number(s)----

'. If requested the database will withhold release of data until publication.

The usual method for submitting sequence data is by World Wide Web to

either GenBank™ (via Banklt: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/),

EMBL (via Webln: http://www.ebi.ac.uk/subs/allsubs.html) or to DDBJ

(via SAKURA: http://sakura.ddbj.nig.ac.jp/). Special types of submissions

such, as genomes, bulk submissions, segmented sets, and

population/phylogenetic/mutation studies, can be more easily prepared

with the Sequin programme (available from the above Web sites). Files

generated by the Sequin programme may be sent via e-mail to GenBank™

(submissions: e-mail: [email protected]; enquiries: e-mail:

[email protected], EMBL (submissions: e-mail: [email protected];

enquiries: e-mail: [email protected]) or DDBJ (submissions: e-mail:

[email protected]; enquiries: e-mail: [email protected]).

Submitters without Web or e-mail access should write to one of the

following addresses to obtain a hard copy submission form (GenBank

Submissions, National Center for Biotechnology Information, National

Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Building 38A, Room 8N-805,

Bethesda, MD 20894, USA. EMBL Nucleotide Sequence Submissions,

European Bioinformatics Institute, Hinxton Hall, Hinxton, Cambridge,

CB10 1SD, UK. DNA Data Bank of Japan, Center for Information Biology,

National Institute of Genetics, Mishima, Shizuoka 411-8540, Japan).

Authors are encouraged by the databases to update their entries as the

need arises.


110

DNA sequences and GenBank Accession numbers

Many Elsevier journals cite "gene accession numbers" in their running text

and footnotes. Gene accession numbers refer to genes or DNA sequences

about which further information can be found in the databases at the

National Center for Biotechnical Information (NCBI) at the National Library

of Medicine. Elsevier authors wishing to enable other scientists to use the

accession numbers cited in their papers via links to these sources, should

type this information in the following manner:

For each and every accession number cited in an article, authors should

type the accession number in bold, underlined text. Letters in the

accession number should always be capitalised. (See Example 1 below).

This combination of letters and format will enable Elsevier's typesetters to

recognize the relevant texts as accession numbers and add the required

link to GenBank's sequences.

Example 1: "Note:GenBank accession nos. AI631510 , AI631511 ,

AI632198 , and BF223228) , a B-cell tumor from a chronic lymphatic

leukemia (GenBank accession no. BE675048 ), and a T-cell lymphoma

(GenBank accession no. AA361117 )".

Authors are encouraged to check accession numbers used very carefully.

An error in a letter or number can result in a dead link.

In the final version of the printed article , the accession number text will

not appear bold or underlined (see Example 2 below).

Example 2: "Note:GenBank accession nos. AI631510, AI631511,

AI632198, and BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic

leukemia (GenBank accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma

(GenBank accession no. AA361117)".


111

In the final version of the electronic copy , the accession number text will

be linked to the appropriate source in the NCBI databases enabling

readers to go directly to that source from the article (see Example 3

below).

Example 3: "GenBank accession nos. AI631510, AI631511, AI632198, and

BF223228), a B-cell tumor from a chronic lymphatic leukemia (GenBank

accession no. BE675048), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no.

AA361117)".

Manuscripts Manuscripts should be in English on numbered pages with

double-spaced typing throughout (including tables, legends and reference

lists) on one side of the paper only with margins of a least 3cm all round.

They should be divided into: (1) title page - include a succinct title (which

should not normally exceed 100 characters and should not contain any

subtitles or abbreviations), the names of all authors, including a given

name for each, the institutions with city, state and country where the

work was performed, the name and complete address (including

telephone, telefax and e-mail) of the corresponding author, a list of

abbreviations and a list of addresses of authors who have moved from the

institutions where the work was performed. (2) abstract - maximum 250

words, (3) keywords (3-6 indexing terms), (4)introduction, (5) materials

and methods, (6) results, (7) discussion, (8) acknowledgements (grant

support and technical support to be listed here), (9) references, (10)

tables and (11) figure legends. A recent issue of the journal should be

consulted for details. In the interests of clarity and brevity, it may

sometimes be advantageous to combine the results and discussion into a

single section. Everyone makes minor modifications to standard methods.

Do not describe standard materials and methods or modifications unless


112

they have significant and demonstrable utility. Do not duplicate

descriptions of methodology in the figure legends. Generic and species

names should be typed out in full the first time mentioned - in the title,

the summary and the text - and thereafter the generic name should be

abbreviated. Words or letters to be printed in italics should either be in

italics or underlined. The metric system should be used throughout.

Short communications These are intended for the publication of brief

definitive reports, primarily to complete DNA sequence data, methods,

biochemical or immunochemical data, that do not merit a full-length

publication. Short communications are no more than four pages long

including everything, with maximally two figures, one table and a

maximum of 20 references . A single page contains about 900 words. Only

the salient points of a long DNA sequence should be published, as the

whole sequence will be available for a computer database. The title,

authorship and affiliations will be in the standard format of the journal.

The text should not be sectioned, except for references. Essential

experimental details may be incorporated into a figure legend. To facilitate

rapid publication, authors will be expected to supply high-quality copy and

expedite any necessary revisions, although decisions will normally be yes

or no, based on the quality and appropriateness of the initial submission.

Minireviews. Minireviews are by invitation only. Potential topics of general

current interest should be submitted to the senior editor for consideration.

Reviews should be short, current, specific and potentially provocative.

They should provide a balanced synthesis from the available data rather

than a comprehensive regurgitation of the literature. If possible, they

should provide new concepts and ideas extending across different parasite

systems. Reviews are restricted to about 4000 words, at most three

display items including figures and tables and a list of references of not


113

more than 50. The text can be divided into simple subsections with a

succinct abstract. Minireviews will undergo the established review process

at MBP, and will be published by an accelerated schedule if accepted.

References In the text, references should be numbered singly in square

brackets in order of their citation, e.g. [2,3,5-7]. In thelist, references

should be numbered in the order of citation in the text, not in alphabetical

order. Unpublished data, personal communications and papers in

preparation or 'submitted' should not be listed in the references (but may

be incorporated at the appropriate place in the text); work 'in press' may

be listed only if it has been accepted for publication. Personal

communications must be accompanied by a letter from the named

person(s) giving permission to quote such information. Abstracts (whether

published or not), theses and similar material are not to be quoted in the

list. If necessary, they can be referred to in the text in parentheses.

Periodicals [1], books [2] and edited books [3] should accord with the

following examples:

[1] Furuya T, Zhong L, Meyer-Fernandes JR, Lu H, Moreno SNJ, Docampo

R. Ecto-protein tyrosine phosphatase activity in Trypanosoma cruzi

infective stages. Mol Biochem Parasitol 1988;92:339-48.

[2] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory

Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press

1989.

[3] Borst P, Bitter W, Blundell PA, et al. The expression sites for variant

surface glycoproteins of Trypanosoma brucei. In: Hide G, Mottram JC,

Coombs GH, Holmes PH, editors. Trypanosomiasis and Leishmaniasis:

Biology and Control. Oxford: CAB International, 1997;7:109-31.


114

Abbreviations of journal titles should conform to those adopted by the List

of Serial Title Word abbreviations, ISDS International Centre, 20, rue

Bachaumont, 75002 Paris, France (ISBN 2-904938-02-8).

Tables Each table should be typed double-spaced on a separate sheet and

have a short descriptive title. A legend may be placed under table.

Footnotes should be identified in the table by a, b, c, etc.

Figures Figures must be in a form and condition suitable for high quality

reproduction. Lettering should be clear and of adequate size to be legible

after reduction. Consider the printed page and column proportions when

preparing figures. If figures are not to be reduced their format should not

exceed 16 x 20 cm. Multiple panels of a single figure must be mounted

together. Each DNA sequence figure must fit on a single sheet of paper.

Place numbering at one end of each line, not on separate lines, and avoid

excessive line spacing. Consider placing nucleotide and protein data in

separate panels, using single-letter amino acid abbreviations for the

protein sequence and grouping nucleotides either continuously or in blocks

of ten separated by one space (90 to 120 nt per line). Over 10 000 bp can

legibly fit on each journal page in this format (see, e.g., Mol. Biochem.

Parasitol. 95:141-146). Preferably use a sans-serif font. Upper case is

standard, except that introns or other features can be usefully

distinguished by lower case. Provide sharp laser-printer or imagesetter

copy. Nucleotide sequences of long coding regions, where the amino acid

sequence is the primary feature, and long DNA sequences, may, at the

editor's discretion, be omitted from the printed paper. They can be

obtained from electronic databases or from the authors. Half-tone

illustrations may be included. They should be submitted as black-and-

white prints on glossy paper and have as much contrast as possible. A


115

scale should appear on photomicrographs. Colour plates will be published

free of charge if colour contributes to the understanding of the

information. In all other cases, the author should be prepared to pay the

extra costs of 635 EUR for the first page and 318 EUR for following pages

of colour. Figures legends should be typed double spaced at the end of the

text, not on the figures. Figures should be checked extremely carefully,

particularly after revisions. No changes to figures will be possible after

acceptance of the manuscript.

Detailed instructions Abbreviations, symbols, chemical and biochemical

nomenclature, etc., should follow the recommendations given in the

Journal of Biological Chemistry (Vol. 272, pp. 28165-28170;

http://www.jbc.org). Avoid abbreviations which are not in common use

across the field of molecular and biochemical parasitology. Those used

should be defined in the text on first usage and listed as a footnote on the

title page. Do not introduce abbreviations unless they are used at least 4

times.

Genetic nomenclature for Trypanosoma and Leishmania should follow the

guidelines proposed by Clayton et al (1998), Mol Biochem Parasitol

1998;97:221-224

(http://www.elsevier.nl/cas/tree/store/molbio/free/1998/97/12/3178.pdf)

Author enquiries For enquiries relating to the submission of articles please

visit Elsevier's Author Gateway at http://authors.elsevier.com . The

Author Gateway also provides the facility to track accepted articles and set

up email alerts to inform you of when an article's status has changed, as

well as detailed artwork guidelines, copyright information, frequently

asked questions and more.


116

Contact details for questions arising after acceptance of an article,

especially those related to proofs, are provided after registration of an

article for publication.

ProofreadingOne set of page proofs in PDF format will be sent by e-mail to

the corresponding Author. (If we do not have an e-mail address then

paper proofs will be sent by post). Elsevier now sends PDF proofs which

can be annotated; for this you will need to download Adobe Reader

version 7 available free from

http://www.adobe.com/products/acrobat/readstep2.html. Instructions on

how to annotate PDF files will accompany the proofs. If you do not wish to

use the PDF annotations function, you may list the corrections (including

replies to the Query Form) and return to Elsevier in an e-mail. Please list

your corrections quoting line number. If, for any reason, this is not

possible, then mark the corrections and any other comments (including

replies to the Query Form) on a printout of your proof and return by fax,

or scan the pages and e-mail, or send by post. Proofs should be read

carefully and returned within 2 days of receipt. Please use this proof only

for checking the typesetting, editing, completeness and correctness of the

text, tables and figures. Significant changes to the article as accepted for

publication will only be considered at this stage with permission from the

Editor. We will do everything possible to get your article published quickly

and accurately. Therefore, it is important to ensure that all of your

corrections are sent back to us in one communication: please check

carefully before replying, as inclusion of any subsequent corrections

cannot be guaranteed. Proofreading is solely your responsibility. Note that

Elsevier may proceed with the publication of your article if no response is

received.

Language Polishing For authors who require information about language

editing and copyediting services pre- and post-submission, please visit


117

http://www.elsevier.com/wps/find/authorshome.authors/languagepolishin

g or contact [email protected] for more information. Please

note that Elsevier neither endorses nor takes responsibility for any

products, gooods or services offered by outside vendors through our

services or in any advertising. For more information, please refer to our

terms and conditions

http://www.elsevier.com/wps/find/termsconditions.cws_home/termscondi

tions.

US National Institutes of Health (NIH) voluntary posting/ "Public Access

Policy"

Elsevier facilitates author posting in connection with the voluntary posting

request of the NIH (referred to as the NIH "Public Access Policy"; see

http://publicaccess.nih.gov/) by submitting the peer-reviewed author's

manuscript directly to PubMed Central on request from the author,

immediately after formal publication. Please e-mail us at

[email protected]) that your work has received NIH funding

(with the NIH grant/project number(s), as well as the name and e-mail

address of the Principal Investigator(s)) and that you intend to respond to

the NIH request. Upon such confirmation, Elsevier will submit to PubMed

Central on your behalf a version of your manuscript that will include peer-

review comments, for public access posting 12 months after the final

publication date. This will ensure that you will have responded fully to the

NIH request policy. There will be no need for you to post your manuscript

directly to PubMed Central, and any such posting is prohibited (although

Elsevier will not request that manuscripts authored and posted by US

government employees should be taken down from PubMed Central).

Individual modifications to this general policy may apply to some Elsevier

journals and its society publishing partners.


118

Editors

C.E. Clayton Zentum für Molekulare Biologie, Universität Heidelberg, Im

Neuerheimer Feld 282, D-69120 Heidelberg, Germany Tel: +49 6221

546876 Fax: +49 6221 545894 E-mail:[email protected]

A.P. Waters Department of Parasitology, L4-Q, Leiden University Medical

Center, Albinusdreef 2, 2333 ZA Leiden, The Netherlands. Tel.: +31 71

5265069; Fax +31 71 52668907; e-mail:[email protected]

P.T. LoVerde, Southwest Foundation for Biomedical Research, PO BOX

760549, USA; e-mail: [email protected]

B. Ullman Department of Biochemistry, Oregon Health Science University,

3181 SW Sam Jackson Park Road, Portland OR 97201, USA Tel: +1 503

494 8437 Fax: +1 503 494 8393 E-mail:[email protected]

Reviews Editor

Alister Craig, Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place,

Liverpool L3 5QA, UK. Tel: +44 151 705 3161; Fax: +44 151 705 3371;

email:[email protected]

Sponsored Articles:

Molecular and Biochemical Parasitology offers authors or their institutions

the option to sponsor non-subscriber access to their articles on Elsevier's

electronic publishing platforms.


119

Pereira, Mariana Marques Coutelo

Análise da expressão e investigação de mecanismos

envolvidos com o controle da atividade de homólogos do

fator de iniciação da tradução eIF4E ao longo do ciclo de

vida de Leismania amazonensis. / Mariana Marques Coutelo

Pereira. – Recife: A Autora, 2008.

118 fls. .: il.

Dissertação (Mestrado em Genética) – UFPE. CCB

1. Leishmania amazonensis 2. Fosforilação 3. Protozoa

I.Título

593.1 CDU (2ª. Ed.) UFPE

561.99 CDD (22ª. Ed.) CCB – 2008 – 124

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA · 2019-10-25 · Marcela e Cadu, que mesmo não...

Documents

Transcript of PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA · 2019-10-25 · Marcela e Cadu, que mesmo não...