Rol de los metabolitos secundarios del alga Chondracanthus ...
Producción de metabolitos secundarios en biorreactores 5... · • Los metabolitos secundarios se...
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Producción de metabolitos secundarios
en biorreactores
Alejandro Mentaberry
Departamento de Fisiología, Biología Celular y Molecular
FCEN-UBA
Conceptos y Técnicas de BiotecnologíaCurso 2010
Sumario
Potencial económico de los metabolitos secundarios
Referencias
Estrategias para incrementar la producciónde metabolitos secundarios.
- Selección de especies vegetales apropiadas- Selección de líneas celulares mejoradas- Optimización de las condiciones de cultivo- Agregado de precursores- Suspensiones, órganos y células inmovilizadas- Uso de elicitores microbianos y de estreses abióticos- Permeabilización y remoción in situ
Diseño de procesos. Ejemplos
Ingeniería metabólica y biotransformación
El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante
Concepto general
• La producción de metabolitos secundarios está estrechamente relacionada con el proceso de desarrollo de la planta.
- Generalmente no está asociada al crecimiento.- Depende de condiciones determinadas de control hormonal. - Es paralela al desarrollo de tejidos especializados y órganos
(raíces, tallos, hojas y glándulas).- La biosíntesis y acumulación suele estar fuertemente compartimentalizada a nivel intracelular, celular, de tejidosy de órganos.
• Los metabolitos secundarios se producen ante situacionesde estrés o enfermedad.
- Factores bióticos- Factores abióticos
Cultivode tejidos y metabolismo secundario
- Insecticidas- Saborizantes- Colorantes
Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de interés comercial
• Potencial
- 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las plantas.
- Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 especies vegetales que se creen existentes en el planeta.
- 25% de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen vegetal.
- 75% de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.
- Desarrollo creciente de fitoterapéuticos y nutracéuticos
- Medicinas- Herbicidas- Proteasas
- Fragancias- Antimicrobianos- Enzimas
Ejemplos de terpenoides producidos en plantas Se conocen
unos 25.000 terpenoides presentes en plantas
Taxol (droga anticancerígena)
Forbol (irritante y cocarcinogénico)
Costunólido (repelente de inserctos;
antinutriente de mamíferos)
Azadiractina A (antinutrientede insectos) αααα-Ecdisona
(disruptor de la muda de insectos)
Hecogenina(aglicona de una saponina;
detergente)
Digitoxigenina(aglicona de digitoxina; tratamiento
de congestiones cardíacas)
Taxol(droga anticancerígena)
Forbol(irritante y cocarcinogénico)
Azadiractina A (antinutrientede insectos)
Costunólido(repelente de inserctos;
antinutrientede mamíferos)
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales
Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas
Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocaína
CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca
Cinchona officinalis
Quinina
Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocaína
CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca
Cinchona officinalis
Quinina
Ejemplos de fenólicos derivados de fenilpropanoides
Unos 8.000 fenólicos se forman en las plantas por las rutas del ácido shikimico o del malonato/acetato
gingeroles
Rizoma de ginger
Pimiento rojo y negro
piperina
norhidrocapsaicina
capsaicinaGranos de café
Corteza de canela
cinnamaldehido
ácido clorogénico
Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso terapéutico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 m illones US$ Hiosciamina, escopolamina
Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos
Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata
Antineoplásico
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico Vinblastina, vincristina
Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico
Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae
Afrodisíaco
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2 002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 m illones US$ Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millon es US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de
ipecacuana Cephaelis ipecacuanha
Emético
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico
Antitumoral
Producciónde metabolitos secundariospor cultivo in vitrode células y órganos vegetales: ¿por qué?
- Independizarse de factores externos, tales como:cambios de temperatura, sequías, plagas,variabilidad de la producción, factores políticosy sociales, etc.
- Evitar la extinción de especies vegetales.
- Disponer de condiciones controladas en el procesode producción y extracción.
- Hacer viable la producción de compuestos complejos con uno o más C quirales en forma máseconómica respecto de la síntesis química
- Posibilitar la obtención de nuevos compuestosno presentes en la planta madre.
- Establecer procesos de biotransformación sólorealizables por enzimas provenientes de plantas.
Procesos industriales
Tipo de compuesto
Farmacéuticos
Pigmentos
Fragancias
Saborizantes
Depigmentadores
Producto
Shikonina
Berberina
Sanguinarina
Gingsenósidos
Taxol
Cartamina
Geraniol
Citronerol
Vanillina
Arbutina
Compañía
Mitsui Petrochemical Ind.
Mitsui Petrochemical Ind.
Vigont Researol Lab.
Nitto Denko Co.
Phyton USA
Kibun Kyoto University
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Kanedo Co.
Mitsui Petrochemical Ind.
20 M
0,6 M
4.800
340.000
1.000
n/a
3.250
4.500
-
-
Precio (U$S/kg)
18PigmentosMorinda citrifoliaAntraquinonas
12,4Antibacteriano,
colorante
Lithospermun
erythrorhizon
Shikonina
10,6AntibacterianoThalictrum minusBerberina
8,9PigmentoPerilla frutescensAntocianinas
3,8EsteroideDioscorea deltoideaDiosgenina
0,025AnalgésicoPapaver somniferumMorfina
2,5AntibióticoPapaver somniferumSanguinarina
0AntileucémicoCatharanthus roseusVincristina
0,06AnticancerígenoTaxus brevifoliaPaclitaxel (Taxol)
21-36AntiinflamatorioCloeus blumeiAcido rosmarínico
Rendimiento (%)AplicaciónEspecieProducto
Tomado de: Scragg. Agricultural Biotechnology, 1998.
Productos comerciales potenciales y rendimientos de algunos cultivos de células vegetales
• Condiciones económicas:
- Compuestos de alto precio (>1.000 U$S/kg)
- Alto rendimiento y productividad del cultivocomparado con la planta entera
- Buen crecimiento en biorreactores
- Crecimiento lento de la planta enteracomo fuente alternativa
• Parámetros principales:
- Productividad: g de producto/L/día
- Concentración máxima de producto: g de producto/L
- Rendimiento: g producto/g sustrato
Viabilidad de un proceso para su escalado a nivel industrial
Esquema del patrón de crecimientode una suspensión celular vegetal
Rendimiento de biomasa en sustrato
Cuantificacióny cinéticade un proceso Td: tiempo de duplicación de la biomasa
µ: velocidad específica de crecimiento del organismo
Y: rendimiento
X: biomasa
S: sustrato
• Selección de especies vegetales apropiadas
• Selección de líneas celulares mejoradas
• Optimización de las condiciones de cultivo
• Agregado de precursores
• Tipo de cultivo: suspensiones, órganoso células inmovilizadas
• Uso de elicitores microbianosy estrés abiótico
• Permeabilización y remoción in situ
Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios
• Screening y selección de líneas sobreproductoras
- Se facilita cuando el metabolito de interés es unpigmento, ya que puede hacerse una selección visual.
- Es importante contar con un método rápido y sencillopara seleccionar líneas más productoras (por ejemplo,ELISA).
• Optimización del medio de cultivo (variables másensayadas)
- Fuente de carbono- Limitación en nitrógeno- Limitación en fosfato- Hormonas (auxinas, citoquininas, giberelinas)- Relación C/N
• Agregado de precursores
- Bajo costo- Baja toxicidad- No muy alejado del producto final en la ruta metabólica
Metodologías utilizadas para optimizarla producción de metabolitos secundarios
Diferencias entre suspensiones de células vegetalesy de células microbianas
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Consecuencias paracultivos a gran escala
Sedimentación rápida;sensibilidad a fuerzas de corte;
formación de gradientes;dificultad para tomar muestras
Largos tiempos de proceso;baja productividad
Necesidad de grandescantidades de inóculo;
escalado más largo
Bajas velocidadesde agitación
Baja demanda de oxígeno:fermentadores con bajatransferencia de oxígeno
Permeabilización;remoción in situ
Célulasvegetales
Agregados de 10-200 µm y
de hasta 2 mmde diámetro
Lenta; td ~ 2-5 días
5-20%
Sensible /Tolerante
Baja
Intracelular /a veces extracelular
Célulasmicrobianas
CélulasIndividuales
2-10 µm
Rápida;td ~ 1-2 h
Pequeña
Insensible
Alta
Extracelular
Caracterización
Tamañoy morfología
Velocidadde crecimiento
Densidad de inoculación
Sensibilidad a fuerzas de corte
Aireación
Acumulacióndel producto
• Problemas a considerar:
- Tasa de crecimiento
- Volumen del inóculo
- Tamaño y agregación de las células
- Oxigenación
- Agitación
Cultivos en suspensión
2,30,3080 L (EA)Helianthus annuus
5,90,127 L (EA)Picrasma quassioides
0,720,9615, 30, 130 L (AG)Nicotiana tabacum
0,631,1015, 500 L (AG)Nicotiana tabacum
1,40,4810 L (EA)Morinda citrifolia
2,20,3230 L (EA)Catharanthus roseus
5,20,137 L (EA)Quassia amara
1,70,42600 L (AG)Nicotiana tabacum
Tiempo de duplicación (d)
Tasa de crecimientoespecífica µµµµ(d-1)
BioreactoresLínea celular
AG: bioreactor con agitaciónEA: bioreactor de elevación por aire (airlift)
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Ejemplos de tasas de crecimiento de suspensiones de células vegetales en biorreactores
La densidad el inóculo y del diseño del biorreactor inciden en el desarrollo de las suspensiones celulares
Tamaño y distribución de agregadosde Helianthus annuus en variosbiorreactores y en Erlenmeyer
Efecto de la densidad de inóculo en el crecimiento de cultivos de Picrasma quassiodides.
Tomado de: Scragg. Secondary products from plant tissue culture, 1990.Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Porcentaje de callos de Vitis viniferaque contienen pigmentos de acuerdo
con el tamaño de los agregados
Tomado de: Nagamori et al., Biochemical Engineering Journal, 2001.
Distribución del tamaños obtenido en biorreactores con medio en presencia de carboximetilcelulosa (cí rculos cerrados)
y en medio control (círculos abiertos)
Tomado de: Honda et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002.
Tamaño de agregado y acumulación de metabolitos secundarios
Patrón de flujo de dos diseños de propulsor
Agitador de paletas inclinadas (flujo axial)
Agitador de paletas planas o de Rushton(flujo radial)
Tomado de: Doran. Bioprocess Engineering Principles, 1998.
deflector deflector
Columna de burbujeo Airlift con tubo interno Airlift con loop externo
Biorreactores de agitación neumática
El biorreactor más grande del mundo es de tipo air-lift
ICI, Ltd. factory, Billingham, UK
Instalada en 1980, produce 6.000 Tm de proteína bact eriana ( Methylophilus methylotrophus) por mes.
Biorreactor de tambor rotatorio Biorreactor de membranas
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992. Tomado de: Böhme et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997.
Diseños alternativos para biorreactores con agitación mecánica
Cultivo de órganos: raíces transformadas
Propiedad
Forma de crecimientoPatrón de crecimiento
Tiempo de duplicaciónBiomasa final (peso seco/L)Background genéticoFormación inicial de productoMedio de crecimiento
Localización del producto Tipo de proceso
Suspensiones
Células simples-agregadosDesorganizado; cada célulapuede dividirse y expandirse
15 h-días30-60 g
HeterogéneoUsualmente bajo
Complejo; hormonasy vitaminas
Intracelular- extracelularBatch; continuo, deben
ser inmovilizadas
Raíces transformadas
Red de ramificacionesDivisión celular localizada;
crecimiento linear conramificaciones laterales
36 h-días 30-60 g
EuploideSimilares a la planta madre
Simple, sales y azúcar
Intracelular- extracelularBatch o continuo, no haynecesidad de inmovilizar
Fenotipo de raíz transformada con
Agrobacterium rhizogenes
Género
NicotianaCatharanthus
CinchonaDuboisiaDatura
BetaLippia
ArtemisiaCoreopsis, Bidens
Tagetes
DigitalisCassiaPanax
ChaenactisPodophyllum
LinumLithospermum
Solanum
Metabolito
AlcaloidesAlcaloides piridínicosIndoles
Tropano
OtrosBetalainaSesquiterpenos
PoliacetilenosTiofenos
Glicósidos cardioactivosAntraquinonasSaponinasPolyinesLignanos
NaftoquinonasEsteroides
Algunos metabolitos secundarios producidospor raíces transformadas
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Biorreactor de lecho de niebla(nutrient mist reactor)
Biorreactor de lecho de goteocon malla para inmovilizar a las raíces
Biorreactores para el cultivo de raíces
Bomba de aire
Rot
ámet
ro
Bom
bape
ristá
ltica
Generador de niebla
Cámarade cultivoControlador Controlador
On Off
Intensidad
Filtro de aire
Condensadorde niebla
Adición de nutrientes
Bomba
Salida de aire
AireAire
Inóculo
Reservorio
Malla de inmovilización
Tomado de:Hairy Roots, Culture and Applications,
1997.
Compuesto
PiretrinasCardenólidosArtemisinina
Aceites esencialesAceites esenciales
Planta
Chrysanthemum spp. Digitalis spp.
Artemisia annuaMentha spp.
Pelargoium spp.
Cultivode tallos
• Ventajas
- Cultivos genética y bioquímicamente estables
- Productos sintetizados y/o acumulados en tejidospresentes en tallos y hojas (glándulas, epidermis, etc.); caso de los aceites esenciales
- Niveles similares a los de la planta (no siempre se cumple).
• Desventajas
- Sólo para productos sintetizados en tallos y hojas- Vitrificación
Airlift modificados: A: airlift con placas para sostener los cultivos de tallos; B: Igual que A, pero con alimentación por
goteo; C: Igual que A, pero con alimentación por niebla.
Producción de artemisinina en los distintos bioreactoresTomado de: Liu et al., Process Biochemistry, 2003.
Cultivo de tallos de Artemisia annuapara la producción de artemisinina
La inmovilización se define comoel confinamiento de un biocatilizador, enzimático o celular, dentro o sobre una matriz só lida para favorecer la liberación del producto y la reutilización del propio biocatilizador.
Unión a una matriz:
- Covalente - Iónica- Por crosslinking- Por adsorción
• Entrampamiento:
- Geles o polímeros- Membranas: microencapsulacióno reactores de membrana
Inmovilización
• Ventajas
- Posibilita la reutilización del biocatalizador y unarápida separación del medio de cultivo.
- Las células vegetales permanecen viablespor largos períodos de tiempo.
- Es posible establecer sistemas de cultivo continuo, con el consiguiente aumento en la productividad.
- Es posible establecer cultivos de alta densidad permitiendo el uso de biorreactores más pequeños.
- La inmovilización favorecería la interacción entrelas células, favoreciendo cierto gradode diferenciación con el consiguiente incrementoen la producción.
- Es compatible con otras estrategias de optimización. (elicitación, permeabilización y remoción de producto)
- En muchos casos, la misma inmovilización inducela secreción del producto al medio de cultivo.
Inmovilización
• Desventajas
- Se agrega una etapa más al proceso,con el consiguiente aumento en los costos operativos. Esto incluye el costo de la matriz y de toda la maquinaria necesariapara la inmovilización.
- Al agregar un barrera más al sistema, aumentan los problemas relacionadoscon la transferencia de nutrientesy de oxígeno.
- El agregado de otra etapa en el proceso aumenta los riesgos de contaminación.
Inmovilización
Efectos de la inmovilización en la producción de me tabolitos secundarios
Efectos de la inmovilización en la liberación de me tabolitos secundarios
Tomado de: Payne et al., Plant cell and tissues culture en liquid ssytem. 1991.
Inmovilización
Compuesto
FerruginolSolasodinaL-DOPACapsaicina
Planta
Salvia miltiorrhizaSolanum surattense
Mucuna pruriensCapsicum frutescens
Células Libres
267-
Trazas
Inmovilizadas
4547-59
90100
% Producto en el medio
Especie
Capsicum frutescensCapsicum frutescensCofffea arabicaCatharanthus roseusTagetes patula
Producto
CapsaicinaCapsaicina
MetilxantinasAjmalicinaTiofenos
Incremento
> 100> 100
133,520
Tipo de inmovilización
PoliuretanoGelGelGel
Agregados naturales
Tomado de: Payne et al. Plant cell and tissue culture in liquid systems, 1991.
La inmovilización en el contexto de distintas opciones de cultivos de tejidos
Elicitación
• Agentes bióticos
- Extractos de paredes de hongos o bacterias- Acido araquidónico- Quitosano- Metil jasmonato
• Agentes abióticos
- Metales pesados- Radiación UV- Presión osmótica- Ultrasonido
Tomado de: Singh. Hairy Roots, Culture and Applications, 1997.
Incremento de la producción de metabolitos secundariospor elicitación en diferentes cultivos in vitro
Producto despuésde elicitación
75 µmol / L
4,27 mg / g peso seco
1 mg / frasco
2% peso seco
15 mg / g peso fresco
28 µg / 10 mL
9 mg / g peso seco
160 µg / g peso fresco
0,55 g / 100 gpeso seco
Elicitor
Phytium aphanidermatum(extracto crudo)
Phytophtora megasperma(extracto crudo)
Trichoderma virideae(extracto crudo)
Saccaromyces cereviseae(extracto crudo)
Verticilium dahliae(extracto crudo)
Endógeno(extracto crudo)
Penicilinum spp.(extracto crudo)
Glutation abiótico
Fusarium conglutanis(extracto crudo)
Especie
Catharanthus roseus(suspensiones)
Datura stramonium(suspensiones)
Capsicum annum(suspensiones)
Thalictrum rugosum(suspensiones)
Sanguinaria canadensis(suspensiones)
Lithospermum erythrorizon(suspensiones)
Catharanthus roseus(raíces transformadas)
Lotus corniculatus(raíces transformadas)
Tagetes patula(raíces transformadas)
Producto
Alcaloidesindólicos
Alcaloidesdel tropano
Capsidiol
Berberna
Dopamina
Shikonina
Alcaloidesindólicos
Isoflavonoides
Tiofenos
Concentracióndel elicitor
10 ml / 50 mLde cultivo
55 mg / L de cultivo
20 µg / mL
0,2 mg / g peso fresco
1 ml / 15 mLde cultivo
1 mg / mL
0,01 g / L peso seco
10 mM
0,2 mg / mLde medio
Productoen control
50 µmol / L
0,85 mg / g peso seco
0
0,5% peso seco
3 mg / g peso fresco
0
3 mg / g peso seco
0
0,2 g /100 gpeso seco
Dosaje de elicitor necesario para biorreactor en columna de burbujeo
y para biorreactores de lecho de goteo o de niebla en función de la constante de
equilibrio entre el elicitor y receptor
Gastos de elicitor por biorreactor para biorreactor en columna de burbujeo y para
biorreactor de lecho de goteo o niebla.
Efecto de la configuración del biorreactor sobre el proceso de elicitación
Tomado de: Singh, Hairy root Culture and Applications, 1997.
• DMSO
• Shock térmico
• Cambios de pH
• Limitación de fosfato y oxígeno
• Elicitación
• Detergentes y aceites de siliconas
• Electropermeabilización
Liberacióndel productoal medio
• Líquido-líquido :
Compuestos inmiscibles en agua: Se utilizan solventesorgánicos o lípidos (sistemas de dos fases agua-orgánico).Ejemplos: migliol, hexadecano, dodecano.
Compuestos miscibles en agua: Se utilizan sales o solucionesde polímeros (sistemas de dos fases acuosas). Ejemplos: DEAE, PEG.
• Sólido-líquido:
La segunda fase es un material sólido como resinas u otrosabsorbentes. Generalmente resinas como XAD, RP18, etc.
• Requerimientos:
- Autoclavables- No tóxicos- Fácil separación del producto de interés
de la segunda fase- No modificación del medio de cultivo- Permanencia de las células en la fase acuosa
Remoción de producto in situ
Diagrama de un tanque de agitación mecánica modific ado para operar con remoción in situ del producto
1: tanque; 2: malla de acero inoxidable para inmovilizar raíces; 3: sensor de oxígeno; 4: malla acero inoxidable; 5: medidor
DO; 6: agitador; 7: lana de vidrio; 8: resina XAD-2; 9: filtro de vidrio; 10: generador de aire; 11: condensador;
12: marco de la malla
Diagrama de un biorreactor de agitació n por líquido con loop externo
Tomado de: Hairy Roots, Culture and Application, 1997.
Adaptaciones para la extracción in situ del producto
Extracción in situ de alcaloides con aceite de silicona a partir de un cultivo de células de Eschscholtzia californica
A: partición de alcaloides con diferentes cantidades de polimetil-silanos. Los alcaloides se acumulan en la fase superior.
B: Extracción in situ de alcaloides en la parte superior de un fermentador de elevación por aire de 2 L.
Secuencia en laoptimización de un proceso para la producciónde metabolitos secundarios
Selección de la planta por su contenido de metabolitos secundarios para iniciar cultivos in vitro
Establecimiento de cultivos in vitro
Estabilización y selección de cultivosin vitro: velocidad de crecimiento, niveles de producto,
liberación al medio
Optimización de medio de cultivo para producciónpor diseño factorial: nutrientes, precursores, elicitación,
liberación y remoción in situ
Optimización en biorreactores: escaladoSistema de cultivo: batch, continuo, fed-batch, perfusión,
en dos etapas. Extracción y purificación del producto
Estrategiaspara modificarel metabolismo secundariomediante manipulación genética
• Completar rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos
• Amplificar rutas normales
• Bloquear rutas alternativas
• Bloquear rutas normales
• Modificar la regulación de rutas normales
• Modificar los mecanismos de secrecióny exportación
• Bloquear rutas de degradación
Ingeniería metabólica del metabolismo secundario
Enzima
Triptofano decarboxilasa(TDC)
Hiosciamina-6-hidroxilasa(H6H)
Triptofano decarboxilasa (TDC)y estrictosidina sintasa (STR)
ORCA3 (factorDe transcripción)
(S)-esculerina 9-O-metiltransferasa (SMT)
Desoxixilulosa fosfatoreductoisomerasa (DXR)
C1 y R (factoresde transcripción)
Especie
Peganum harmala(suspensiones y raíces)
Hyosciamus muticus(raíces transformadas)
Catharanthus roseus(suspensiones)
Catharanthus roseus(suspensiones)
Coptis japonica(suspensiones)
Mentha spp.(planta)
Zea mays(callos)
Producto
Serotonina
Escopolamina
Alcaloides indólicos(TIAs)
Alcaloides indólicos(TIAs)
Berberina
Aceites esenciales
Antocianinas
Observaciones
Incremento de 10-20 vecesen producto
Contenido de producto 4 vecessuperior a planta control
Contenido de TIAs de 300 mg/Lcomparado con control 50mg/L.Líneas inestables
Incremento de la concentración de TIAsde 3 veces después de agregarel precursor secologanina
Incremento del flujo hacia la producciónde berberina de 15%
Incremento del 50% ene l contenidode aceites esenciales
Producción de antocianinas y fenolesque no se producían en los callos sin transformar.
Ingeniería metabólica delmetabolismo secundario
• Problemas
- Clonado de genes
- Estabilidad de líneas transgénicas
- Compartimentalización de productos
- Transporte y acumulación de productos
- Limitaciones y arquitecturade la ruta metabólica
- Canales metabólicos (limitación del flujo metabolico por la capacidad de las enzimas participantes)
La biotransformación es la conversión de un sustrat o (natural o sintético) por medio de un biocatalizador (enzima, célula, tejido, órgano, células inmovilizadas) en un producto complejo. Generalmente involucra uno o pocos pasos enzimáticos.
Requerimientos:
- Se requiere la presencia de las enzimas necesarias en la células y de sus cofactores.
- La velocidad de formación del producto debe ser mayor que su metabolización.
- El cultivo debe tolerar al precursor y al producto formado.
- El precursor debe poder ingresar en la célula y el producto debe ser preferentemente secretado.
- El precursor debe tener un valor mucho menor al del producto formado.
Planta Precursor ProductoCapsicum frutescens(células inmovilizadas)
Acido protocatecuicoy ácido cafeico
Vainillina y capsaicina
Catharanthus roseus(células inmovilizadas)
Vinblastina Vincristina
Daucus carota(células inmovilizadas)
Codeinona Codeína
Mucuna puriens(células inmovilizadas)
Tirosina L-DOPA
Rauwfolia serpentina(células inmovilizadas)
Hidroquinona Arbutina
Mentha spp.(células inmovilizadas)
Mentona Neomentol
Coffea arabica(células inmovilizadas)
Teobromina Cafeína
Adaptado de: Giri et al., Biotechnology Advances, 2001.
Biotransformación
Operación Productoasociado
Productono-asociado
Batch + +Batch alimentado + +Batch alimentadorepetitivos
+ +
En dos etapas - +Continuo + -Perfusión - +
Relación entre el sistema de cultivo y el patrón de síntesis del metabolito secundario
Esquema de un proceso completo para la producción de un metabolito secundario por cultivo in vitro de células y órganos vegetales
Shikonina
• Planta entera- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 3 años.
• Suspensiones celulares- 2,4-D estimula el crecimiento pero no la producción.- Las bajas concentraciones de nitrógeno y la elicitación inducen
la producción de shikonina.- Se utilizan fermentadores de agitación mecánica y tambor rotatorio.- La productividad de shikonina es 840 veces superior a la de planta entera.
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Producción de shikonina por suspensiones celularesde Lithospermum erythrorhizon
Tomado de: Scraag. Plant Biotechnology, 1992.
Proceso para la producción de shikonina a partir de célulasde Lithospermum erythrorhizon por Mitsui Petrochemical Ind.
Berberina
• Planta entera- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente de 5-6 años.
• Suspensiones celulares
- Las líneas celulares productoras se seleccionaron a través de . protoplastos y screening de por fluorescencia.
- El sistema de cultivo utilizado es el de batch alimentado y el producto está. asociado al crecimiento.
Tomado de: Yamasaki Plant Photo Gallery
Producción del alcaloide berberinapor suspensiones celulares de Coptis japonica
Ginsenósidos
• Planta entera- La extracción se realiza en plantas de aproximadamente 5-7 años .- Se requieren períodos prolongados de cuidado que exponen a los cultivosa riesgos de pestes y cambios drásticos de clima.
- La concentración de saponinas es de 0,5 % peso seco.
• Suspensiones celulares- La concentración de saponinas es de 0,65 % peso seco.- La productividad de biomasa es de 700 mg/L/día.- El medio de cultivo contiene bajas concentraciones de amonio.- A gran escala se emplean tanques agitados mecánicamente a bajas velocidades.
• Raíces transformadas- La concentración de saponinas es de 0,95 % peso seco.- El medio de cultivo requiere del agregado de 2 mg/L de IBA y de 0,1 mg/L de quinetina.- A gran escala se emplean tambores rotatorios.
Producción de ginsenósidos por Panax ginseng
Tomado de: Yamasaki. Plant Photo Gallery
Taxol
• Planta entera
- La edad de los árboles para extraer el producto es de 50-100 años.
- La concentración de taxol en la corteza es de 0,01 % del peso seco.- Este método de producción podría llevar a la extinción de la especie.
. - Debido a la gran variedad de taxoides presentes, se hace difícil la purificación del taxol.
. - El material vegeta empleado presenta variación en la concentración de precursores.
- Las plantas empleadas crecen lentamente.
Tomado de: Schoepke Plant Image Gallery
Producción de taxol por Taxus spp
Taxol
• Suspensiones celulares de T. brevifolia
- Se emplean metiljasmonato o extractos fúngicos como elicitores.
- La composición óptima de gases es 10% (v/v) oxígeno, 0,5% (v/v) dióxido de carbono y 5 ppm de etileno.
- El incremento de la presión osmótica, sacarosa (60 g/L), estimula la producción.
- Los precursores como la fenilalanina y el ácido benzoico incrementan la productividad.
- El taxol puede ser removido in situ con resinas como XAD y el solvente dibutilftalato.
- El sistema de operación se realizan en dos etapas: la primera para el crecimiento y la segunda en un medio de producción con elicitación.
- Los reactores que se utilizan son de tipo airlift, columna de burbujeo u otros que produzcanpoco estrés hidrodinámico (escalado hasta 75.000 L).
Schoepke Plant Image Gallery
Producción de taxol por Taxus spp
• Planta entera- La planta tiene bajas concentracionesde alcaloides.
- La purificación y extracción son costosas.
• Suspensiones celulares- La limitación de fosfato y nitrógeno combinado con la elictación, inducen la producción de del precursor ajmalicina (utilizado para tratar hipertención y problemas cardiológicos).
- Las líneas celulares seleccionadas son resistentes a las fuerzas de corte, posibilitandoel desarrollo de cultivos a gran escala,
- En los cultivos a gran escala es necesario re-circular los gases de salida.- Las suspensiones no acumulan alcaloides indólicos diméricos: vinblastina y vincristina.- Se necesitaría aumentar la productividad 40 veces respecto de la productividad específica obtenida actualmente (0,26 mg/g peso seco/día) para que el proceso sea viable.
Vinblastina
Tomado de: Manhart Plant Image Gallery
Producción de alcaloides indólicos de Catharantus roseus:vincristina y vinblastina
Estructuras de vainillina y de distintasantocianinas
Vainillina (1 )
Pelargonidina-3-glucósido R2=OH (1)Cianidina-3-glucósido R2+R3=OH (2)Delfinidina-3-glucósido R1+R2+R3=OH (3)
Wescott et al., 19940,7B5Raíces aéreas transfectadas
Wescott et al., 19940,002-Fruto
Referencia% Peso SecoMedioMaterial
Wescott et al., 19940,7B5Raíces aéreas transfectadas
Wescott et al., 19940,002-Fruto
Referencia% Peso SecoMedioMaterial
Producción de vainillina en células y tallos de Vanilla planifolia cultivados in vitro
a Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/Lb Medio de Gamborg et al. (1968) con 1 mg/L NAA, 0,1 mg/L cinetina, y 15 mM to tal Nc Medio de Murashige y Skoog (1962) con 5 mg ANA y 0,5 mg/L cinetina
Do y Cormier, 1991B5bSuspensión celularVitis vinifera
Oxalis reclinata
Aralia cordata
Especie
Crouch et al., 1993MScSuspensión celular
Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensión celular
Referencia% Peso SecoMedioMaterial
Do y Cormier, 1991B5bSuspensión celularVitis vinifera
Oxalis reclinata
Aralia cordata
Especie
Crouch et al., 1993MScSuspensión celular
Sakamoto et al., 1994cianidin 3-xilosilglucosido 10,3B5aSuspensión celular
Referencia% Peso SecoMedioMaterial
Producción de antocianinas por células cultivadas in vitro
Tomado de: Kurtz and Constabel, Agricultural Biotechnology, 1998.
Fenilpropanoides y flavonoides: algunos casos típicos...
Conclusiones
• Aspectos bioingenieriles a resolver:
- Diseño de biorreactores especiales para cultivos de tejidos vegetales
- Instrumentación y control de los bioprocesos- Diseño de biorreactores más económicos- Métodos no letales para liberación
de los metabolitos secundarios- Método adecuado para la remoción in situ
• Aspectos biológicos a resolver:
- Conocimiento de la regulación de las rutas biosintéticas: enzimas y factores de transcripción
- Conocimiento de la regulación del transportey acumulación de los metabolitos secundarios
- Conocimientos de los mecanismosde degradación del producto
1. Plant Biotechnology. Fowler, M., Gwarren,G.S. andMoo-Young, M. (eds.). Pergamon Press, 1992.
2. Plant cell and tissues culture en liquid system. Payne, G.F., Bringi, V., Prince, C. and Shuler, M.L. Munich Hanser Publishers, 1991.
3. Secondary products from plant tissue culture. Charlwood, B. and Rhodes, M.J.C. (ed.). Oxford University Press, 1990.
4. Design, formulation, and optimization of media. In: Bioreactor System Design. Asenjo, J. and Merchuk, J. (ed.) Marcel Dekker Publishers, 1995.
5. Hairy Roots, Culture and Application. Doran, P. (ed.). Harwood Academic Publishers, 1997.
6. Bioprocess Engineering Principles. Doran, P. AcademicPress, Harcout Brace and Company Publishers, 1998.
Referencias