Produção de maçãs trangénicas, com sobreexpressão de antioxidantes
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Universidade de Évora
Escola de Ciências e Tecnologias
BIOQUÍMICA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
5ºSEMESTRE
Licenciatura em Bioquímica
2013/2014
1 | P á g i n a
............................................................................................................................. 3
................................................................................................................................. 4
.......................................................................................................................... 6
3.1. ........................................................................................................................ 6
3.1.1. ....................................................................................................... 6
3.1.2. .................................................................... 6
3.1.3 .............................................................................. 7
3.1.4. ............................................................................... 7
3.1.5. ............................................................................................................ 7
3.2. ....................................................................................... 9
1. Obtenção do Material Biológico .................................................................................. 9
2. Produção de Maças Transgénicas ................................................................................ 9
3. Preparação das Amostras de Maçãs .......................................................................... 12
4. Extração dos compostos fenólicos das maçãs transgénicas ..................................... 13
5. Identificação dos Compostos Fenólicos por LC-MS ................................................... 13
6. Quantificação dos Compostos Fenólicos pelo Método de HPLC .............................. 14
7. Atividade Antioxidante dos Extratos de Maças......................................................... 14
8. Experiências Nutricionais em Ratos de Laboratório ................................................. 15
9. Parâmetros Hematológicos, Bioquímicos e Imunológicos do Sangue dos Ratos ..... 15
3.3. ................................................................................................. 16
3.3.1. ........................................................................................................... 16
3.3.2. ................................................................................................................... 16
3.3.3. ..................................................................... 17
.................................................................................... 18
............................................................................................................. 19
......................................................................... 19
......................................................................................... 20
................................................................................................... 21
2 | P á g i n a
............................................................................................. 21
............................................................................................................................ 21
............................................................................................... 22
........................................................................................... 22
..................................................................................................................... 23
............................................................................................ 24
.............................................................................................. 24
............................................................................. 24
................................................................................................... 25
......................................................................................................................... 25
............................................................................. 26
.................................................................................... 27
Figura 1-Reação do DNA polimerase em PCR, quando na presença de DNA, primers e
nucleótidos. ................................................................................................................................. 19
Figura 2-Desnaturação térmica, correspondendo á primeira etapa do ciclo ao qual ocorre
separação da dupla cadeia de DNA. ............................................................................................ 22
Figura 3-Hibridação ou Annealing, correspondendo á segunda etapa do ciclo, á qual ocorre,
por complementaridade a definição do segmento a amplificar. ................................................ 22
Figura 4-Extensão, correspondendo á terceira etapa do ciclo ao qual se verifica o
prolongamento das cadeias pela DNA polimerase de acordo com a complementaridade das
bases. ........................................................................................................................................... 23
Figura 5-No fim do ciclo coexistem duas cadeias de DNA idênticas á original, resultado da
amplificação. ............................................................................................................................... 23
Figura 6-Termociclo, equipamento capaz de amplificar de forma automatizada sequências de
DNA. ............................................................................................................................................ 24
Tabela 1-Caracterização dos reagentes químicos envolvidos. .................................................... 7
Tabela 2-Etapas do PCR a programar no termociclo. ................................................................ 12
Tabela 3-Lista de reagentes e orçamento correspondente, com e sem o IVA aplicado á taxa
atual............................................................................................................................................. 18
3 | P á g i n a
Os antioxidantes são moléculas que podem reagir em segurança com os radicais
livres, de modo a neutralizar ou terminar as reacções em cadeia que levam à danificação
de moléculas essenciais para o ser humano. Os radicais livres são responsáveis por
inúmeras doenças, sendo que se encontra comprovado que os antioxidantes ajudam a
prevenir e até a combater estas doenças. Dentro das doenças que os antioxidantes
ajudam a prevenir é de destacar o cancro (de vários tipos), a arteriosclerose, doenças
cardíacas, a doença de Alzheimer, diabetes, artrite reumatóide, entre muitas outras. Os
antioxidantes podem encontrar-se em vários alimentos, como as maçãs, batatas,
tomates, entre muitos outros. Dentro dos antioxidantes que se encontram presentes nos
alimentos, encontram-se os compostos fenólicos antioxidantes, como os ácidos
fenólicos e os flavonóides, que, nas plantas, são produzidas pela via metabólica
fenilpropanoide. A biossíntese dos compostos fenólicos depende essencialmente de três
enzimas: chalcona sintase (CHS), chalcona isomerase (CHI) e dihidroflavonol redutase
(DFR). Estudos comprovam que altos níveis de antioxidantes na dieta podem proteger
contra danos oxidativos ao organismo, sendo que os compostos fenólicos também são
de grande importância na protecção das plantas contras ameaças bióticas e abióticas,
aumentando a produtividade das plantas.
As maçãs (Malus domestica) são frutos comuns, que fazem parte da dieta de
grande parte da população do planeta, estando comprovado que são alimentos ricos em
antioxidantes. Devido ao seu elevado teor em antioxidantes, as maçãs podem ser muito
vantajosas para a saúde humana, sendo que há um ditado antigo, “an apple a day keeps
the doctor away” - uma maçã por dia mantém o doutor afastado. Embora as maçãs já
apresentem elevados teores em antioxidantes, a manipulação genética das mesmas, de
modo a se tentar sobreexpressar as enzimas acima referidas, pode levar a um aumento
da sua capacidade antioxidante, fazendo com as maçãs sejam uma fonte nutritiva mais
eficiente, e ainda ajudar a proteger as próprias macieiras contra ameaças, garantindo
uma melhor produtividade das árvores. Existem várias variedades de maçãs, sendo que
cada uma delas apresenta diferentes níveis de compostos fenólicos e, por sua vez, de
antioxidantes, sendo que com este estudo se pode transformar maçãs com mais baixos
4 | P á g i n a
teores fenólicos, em alimentos mais ricos em antioxidantes e, assim, mais benéficos
para a saúde.
Gerais: Produção de maçãs transgénicas, para sobreexpressão de antioxidantes,
e avaliação da sua eficácia como fontes nutritivas mais eficientes.
Específicos:
o Conhecer:
Os Termos: promotores, terminadores, genes, enzimas de
restrição, plantas transgénicas,
O Enunciado: Etapas envolvidas no PCR,
Os Conceitos: Desnaturação, Hibridação, Transgénese,
organismos geneticamente modificados, transgénicos;
Os Compostos: que não interferem com as propriedades físicas
dos nossos frutos e podem ser utilizados durante o procedimento
para a produção das plantas transgénicas, sem alterar as
propriedades antioxidantes;
O Procedimento Experimental: que leva à montagem dos
métodos necessários à realização do objetivo: produção de maçãs
transgénicas, para sobreexpressão de antioxidantes; e avaliação
da actividade antioxidante de modo às maçãs serem fontes
nutritivas mais eficientes.
o Compreender:
Processo de produção envolvida na transformação das maçãs;
O funcionamento de um termociclo;
o Aplicar:
Conhecimentos adquiridos em segurança de laboratório;
Uso correcto de material de laboratório.
5 | P á g i n a
o Executar:
A produção dos cinco tipos de maçãs transgénicas, com recurso
aos promotores e vectores adequados;
O PCR e o Northern Blot, para seleccionar as plantas
transgénicas, nas condições adequadas;
A extracção, identificação e quantificação dos compostos
fenólicos, nas condições adequadas;
As experiências nutricionais em ratos de laboratório e às
respectivas análises resultantes;
o Dar Valor:
À Agrobacterium como meio simples de criação de plantas
transgénicas;
Ao PCR como técnica de amplificação;
Ao uso de controlos, negativos e positivos, na realização do PCR;
Aos ciclos de temperatura utilizados durante a realização do
PCR;
À electroforese como técnica suplementar de análise dos
resultados obtidos;
Aos métodos utilizados na extracção, identificação e
quantificação dos compostos fenólicos;
Aos resultados obtidos pelas experiências nutricionais em ratos
de laboratórios;
6 | P á g i n a
3.1. Produção de maçãs transgénicas para sobreexpressão de CHI, CHS e DFR,
responsáveis pela sobreexpressão de antioxidantes.
Avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas produzidas.
Verificação do uso das maçãs transgénicas, com uma maior sobrexpressão de
antioxidantes, como fonte nutritiva mais eficiente, em ratos de laboratório.
3.1.1.
Maçãs de três variedades diferentes: Fuji (as que possuem maior quantidade de
antioxidantes); Gala (das maçãs mais comuns, encontrando-se no meio da
tabela de teores em antioxidantes); e as Empire (maçãs produzidas inicialmente
a partir de clonagem, sendo as que apresentam menor quantidade de
antioxidantes).
3.1.2.
Tipo CHS, com sobreexpressão de chalcona sintase (base de dados
EMBL/GenBank, número de acesso X58339);
Tipo CHI, com sobreexpressão de cDNA de Petunia hybrida, codificando
chalcona isomerase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso
X14589);
Tipo DFR, com sobreexpressão de cDNA de P. hybrida, codificando
dihidroflavonol 4-redutase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso
X15537);
Tipo W95, com sobreexpressão de CHI e DFR;
Tipo W92, com sobreexpressão dos três cDNA de cevada e petúnia.
7 | P á g i n a
3.1.3
Aqui apresentam-se os reagentes químicos que apresentam mais cuidado no seu
manuseamento e quais os cuidados a ter no mesmo.
Reagente Caracterização/Observação
Brometo de
etídeo
Usado como agente intercalante usado como marcador de ácidos
nucleicos. Deve ser usado luvas no seu manuseamento, pois é
mutagénico.
Azoto
líquido
Cuidado para o líquido não entrar em contacto directo com a pele, pois
pode levar ao seu congelamento. O vapor libertado não tem qualquer
efeito na pele.
Catamina Trata-se de um anestésico utilizado essencialmente em animais. Deve-
se ter cuidado no seu manuseamento, evitando a sua inalação.
Tabela 1-Caracterização dos reagentes químicos envolvidos.
3.1.4.
Este trabalho científico encontra-se dividido em duas partes: a produção das
maçãs transgénicas; e a avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas.
A produção das maçãs transgénicas deve ser realizado num laboratório onde se
tenha acesso ao material necessário, sendo que este deve encontrar-se num clima
temperado, com os terrenos adequados para a plantação das macieiras transgénicas. A
plantação das maçãs pode ser feito fora do âmbito do laboratório, caso não estejam
disponíveis os terrenos precisos para este efeito, sendo que neste caso é preciso fazer
um seguimento detalhado da maturação e crescimento das macieiras transgénicas.
A avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas deve ser
realizado num laboratório com as devidas condições de segurança, onde esteja
disponível ou se tenha acesso a tudo o equipamento e material necessário. O laboratório
onde se procede ao estudo da avaliação da capacidade antioxidante das maçãs
transgénicas, pode ser o mesmo onde se procede à produção das maçãs transgénicas,
desde que apresente as devidas condições.
3.1.5.
Este projecto é um trabalho que consiste em duas partes: a produção de plantas
transgénicas e a avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas em ratos
8 | P á g i n a
de laboratório. A primeira parte tem meses estipulados, pois as macieiras têm épocas
para plantação e colheita.
Primeiro apresenta-se o calendário que é necessário respeitar para a produção
das maceiras transgénicas.
Jan Fev Mar Abril Maio Jun Julho Agosto Setem Out Novem Dezem
→ Pesquisa bibliográfica
→ Produção das plantas transgénicas em laboratório
→ Plantação das macieiras transgénicas
As macieiras devem crescer durante 2 anos antes da colheita das primeiras
amostras. Após passado esse tempo, pode-se proceder à colheita das amostras de maçãs
transgénicas das várias variedades, cada uma na sua época apropriada (apresentada na
calendarização seguinte), que se encontrem em estados de maturação semelhantes.
De seguida, encontra-se uma possível calendarização para a segunda parte do
trabalho, avaliação da capacidade antioxidante das maçãs transgénicas em ratos de
laboratório.
Agosto Setem Out Novem Dezem Jan Fev Mar Abril Maio Junho Julho
→ Pesquisa bibliográfica
→ Colher e preparar amostras de maçãs Gala.
→ Colher e preparar amostras de maçãs Fuji e Empire.
→ Extração dos componentes fenólicos das maçãs
→ Identificação dos compostos fenólicos pro LC-MS
→ Quantificação dos compostos fenólicos por
HPLC
→Atividade antioxidante dos extractos
de maçãs
Experiências nutricionais em ratos de laboratório←
Parâmetros hematológico, bioquímicos e imunológicos do sangue do rato←
Realização do artigo←
Durante o período de investigação irão ser entregues relatórios mensais à entidade reguladora da
investigação.
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3.2.
Nota I: Vão ser avaliadas a sobreexpressão de antioxidantes de três variedades de
maçãs diferentes, Fuji, Gala e Empire, que apresentam características semelhantes, no
entanto, as suas conhecidas propriedades fenólicas são diferentes.
1. Obtenção do Material Biológico
1.1. Obter amostras dos três tipos de maçãs a estudar, Fuji, Gala e Empire, que se
encontrem em estados de maturação semelhantes e ainda possuam folhas, sendo
que umas vão ser usadas como controlo e outras vão ser transformadas em
plantas transgénicas (procedimento apresentado no ponto 2.
1.2. Crescer as maçãs de controlo (que não são transgénicas) e as maçãs
transgénicas, num clima temperado, onde as maças estejam expostas a, pelo
menos, 6 horas de luz solar por dia, num local com bom escoamento de água.
1.3. Deixar as maceiras crescerem pelo menos dois anos, antes de começar o estudo.
1.4. Quando as maçãs se encontrarem em estado de maturações semelhantes,
recolher pelo menos 10 amostras de cada um dos três tipos de maçãs a estudar,
de várias árvores diferentes, sem misturar as amostras obtidas de árvores
diferentes.
2. Produção de Maças Transgénicas
Nota II: Neste estudo, são utilizados cinco tipos de plantas transgénicas, produzidas do
mesmo modo, mas com genes diferentes: tipo CHS, sobreexpressão de cDNA de cevada
codificando chalcona sintase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso
X58339); tipo CHI, sobreexpressão de cDNA de Petunia hybrida codificando chalcona
isomerase (base de dados EMBL/GenBank, número de acesso X14589); tipo DFR,
sobreexpressão de cDNA de P. hybrida codificando dihidroflavonol 4-redutase (base de
dados EMBL/GenBank, número de acesso X15537); tipo W95, sobreexpressão de CHI
e DFR; e, por último, tipo W92, sobreexpressão dos três cDNAs de cevada e petúnia.
2.1. Construir os vetores construtores (plasmídeo), usando um vetor pBin, contendo
o respectivo cDNA, e orientado no sentido, sobre o controlo do promotor 35S e
10 | P á g i n a
do terminador OCS, como apresentado na figura 1. Para as plantas controlo
utilizar um vetor vazio.
Figura 1. Representação esquemática dos vectores utilizados para a preparação de maçãs
transgénicas. (a) CHS; (b) CHI; (c) DFR; (d) W95, construtor de dois genes (CHI e DFR); (e) W92,
construtor de três genes (CHS, CHI, DFR).
2.2. Inserir o vetor na Agrobacterium tumefaciens, estirpe C58C1:pGV2260, para
cada um dos cinco tipos de planta transgénica, do seguinte modo:
2.2.1. Colocar o plasmídeo (vetor criado no passo anterior) em contacto com as
células de Agrobacterium.
2.2.2. Acoplar a gene resistente ao antibiótico canamicina, para promover a
inserção do plasmídeo nas células de Agrobacterium.
2.2.3. Verificar a integridade do plasmídeo por análise com enzimas de
restrição.
2.3. Danificar as folhas da maçã, por exemplo, procedendo ao seu corte, e colocar
em contacto com as células de Agrobacterium, agora já contendo o plasmídeo
desejado.
2.4. Aguardar cerca de 10 minutos.
Nota III: 10 minutos deve ser suficiente para a Agrobacterium integrar o seu DNA nas
células expostas das folhas de maçã. Caso ache necessário, pode esperar mais um
pouco.
2.5. Retirar as folhas e cresce-las num meio indutor de callus (meio contendo
antibiótico).
Nota IV: As únicas células que vão crescer no meio contendo antibiótico são as células
transformadas que contem os genes resistentes ao antibiótico e o gene de interesse.
2.6. Transferir para um meio de regeneração, de modo a regenerar as folhas
danificadas anteriormente.
11 | P á g i n a
Nota V: Caso a variedade de maçã a estudar não seja susceptível à integração do DNA
por Agrobacterium, pode-se utilizar um método alternativo, Biobalística, que dispara
pequenas partículas douradas, que estão cobertas de DNA, para a planta, podendo levar
a obtenção de células integradas.
2.7. As células indiferenciadas, começam-se a diferenciar e obtém-se folhas e até
haste.
Nota VI: Pode ajudar-se à diferenciação mais rápida das folhas e das hastes, por adição
de hormonas, como, por exemplo, citoquina, que ajuda a planta a crescer e as folhagens
a alongar, e auxina, que ajuda as raízes a crescer.
2.8. Enxertar as folhas ou hastes transgénicas obtidas num porta-enxerto de
macieira.
Nota VII: Proceder de modo semelhantes para os cinco tipos de plantas de maçãs
transgénicas, referidas na nota II, com os respectivos genes, e para as três variedades de
maçãs estudadas.
2.9. Proceder a análise por PCR de modo a pré-seleccionar as plantas transgénicas,
usando gene neomicina fosfotransferase (npt II) como marcador e usando
primers específicos para o gene resistente à canamicina, do seguinte modo:
2.9.1. Extrair o DNA genómico de folhas in vitro usando DNeasy Plant Mini
Kit (Qiagen, Hiden, Germany), de acordo com as recomendações do
fabricante.
2.9.2. Preparar uma mistura de reacção com um volume final de 25 μl, com os
seguintes constituintes: Tampão de PCR (contendo MgCl2) 10x, com uma
concentração de 1x; dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) numa
concentração final de 200 μmol/L; Primer Forward (5’-
CTCACCTTGCTCCTGCCGAGA-3’) e Primer Reverse (5’-
CGCCTTGAGCCTGGCGAACAG-3’), ambos com uma concentração
final de 0,40 μmol/L; AmpliTaq Gold DNA Polymerase, numa
concentração final de 2,0 UI; e 5 μL DNA Template.
2.9.3. Preparar, pelo menos, um controlo negativo, que não possua o gene que
se deseja detectar, e dois controlos positivos, que possuam o gene que se
deseja detectar, de modo a garantir que não ocorreu nenhum erro.
2.9.4. Seguir os ciclos de temperatura, de acordo com a seguinte tabela:
12 | P á g i n a
Fase Temperatura Tempo Nº de ciclos
Ativação/Desnaturação inicial 95ºC 1 minuto 1
Desnaturação 95ºC 25 segundos
35 Anelação 60ºC 30 segundos
Extensão 72ºC 45 segundos
Extensão Final 72ºC 4,20 minutos 1
Tabela 2-Etapas do PCR a programar no termociclo.
Nota VIII: Se necessário guardar o produto final do PCR a 4ºC.
2.9.5. Visualizar os fragmentos obtidos por PCR em gel de agarose 1% (p/v),
preparado com TBE e brometo de etídeo. Iniciar a electroforese a uma
diferença de potencial constante de 80 V, durante 2-2,5h. Visualizar num
transluminador de UV.
2.10. Finalmente seleccionar as plantas transgénicas por análise Northern blot,
do seguinte modo:
2.10.1. Preparar o RNA total a partir das folhas de árvores novas, usando o
método de hidroclorato de guanidina.
2.10.2. Submeter os fragmentos de RNA obtido anteriormente, a electroforese
em gel de agarose (1,5% (p/v) agarose, 15% (v/v) formaldeído).
2.10.3. Transferir o RNA para membranas de nylon.
2.10.4. Remover os filtros e lava-los com três vezes com 0,1x SSC e 0,1% SDS,
durante 30 minutos a 65ºC.
2.10.5. Hibridizar as membranas de nylon durante a noite, a 42ºC, com sondas de
cDNA marcadas radioactivamente.
2.10.6. Proceder a autoradiografia, de modo a verificar os resultados obtidos.
2.11. Deixar crescer as macieiras transgénicas seleccionadas, pelo menos, dois anos,
antes de proceder à colheita das maçãs para se começar o estudo (como foi
indicado no ponto 1).
3. Preparação das Amostras de Maçãs
Nota IX: Este procedimento deve ser feito para as maçãs de controlo e as transgénicas.
3.1. Pelar 10 maçãs, de cada tipo, com um pelador próprio, obtendo-se peles com 1-
2 mm de espessura.
3.2. Guardar as peles e a polpa separadamente, após pesagem.
13 | P á g i n a
3.3. Moer, desfazendo completamente, as peles e a polpa das maçãs, separadamente,
num almofariz, com recurso a azoto líquido.
3.4. Transferir as amostras moídas para uma proveta com 70% de metanol aquoso,
com um rácio de 1:1 (p/v).
3.5. Homogeneizar a mistura usando um misturador de Polytron.
3.6. Filtrar inicialmente através de um papel de filtro de Whatman nº1, sob vácuo.
3.7. Filtrar novamente através de um filtro seringa Acrodisc 0,45μm.
3.8. Guardar o filtrado final a -20ºC, até posterior uso.
4. Extração dos compostos fenólicos das maçãs transgénicas 4.1. Pesar 1g de filtrado seco para um tubo de ensaio.
4.2. Adicional 20 mL de 80% de metanol aquoso e 1% de HCl e agitar a suspensão
com cuidado.
4.3. Proceder a ultra-sons, dos tubos duas vezes durante 15 minutos.
4.4. Deixar os tubos à temperatura ambiente (≈20ºC), durante 24h, na escuridão.
4.5. Centrifugar o extrato durante 10 minutos, a 20.878g.
4.6. Recolher os sobrenadantes e guardar a 4ºC, para ser utilizado dentro de 24
horas.
5. Identificação dos Compostos Fenólicos por LC-MS
Nota X: A identificação dos compostos fenólicos dos extractos de maçãs foi feita
usando um sistema LC-MS, consistindo em um módulo de separação de um
cromatógrafo liquido de alta-eficiência (HPLC) Waters gradiente 2690, detector de
absorvância ultravioleta-visível (UV-Vis) com sistema de díodos 996, e um
espectrómetro de massa quadrupole, equipado com uma fonte de ionização (ESI)
eletrospray ZQ-spray.
5.1. Proceder à separação numa coluna Symmetry C18 de 5μm a 20ºC.
Nota XI: A fase móvel é composta pelo solvente A (10% de ácido fórmico) e pelo
solvente B (100% de metanol).
5.2. Eluir a coluna inicialmente isocraticamente com 85% de eluente A (0-1 min) e
depois eluir com um gradiente linear durante 41 minutos, baixando eluente A
até 0%.
5.3. Entre os 42 e 51 minutos, continuar a diminuir para 0% o eluente A.
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5.4. Utilizar uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, a temperatura do capilar a 300ºC, o
gás de revestimento e o gás de auxiliar a 50 e 5 unidades, respectivamente, e a
voltagem a 3 kV para ionização negativa e 0,1 kV para ionização positiva.
5.5. Proceder à análise usando um scan MS de m/z de 100 a 1000.
6. Quantificação dos Compostos Fenólicos pelo Método de HPLC
Nota XII: A análise foi realizada numa coluna cromatográfica liquida Merck-Hitachi L-
7455, com um detector de díodo array (DAD) e uma bomba quaternária L-7100,
equipada com um sistema de libertação multisolvente D-7000 e amostrador L-7200.
6.1. Proceder à separação numa coluna Phenomenex Synergi Fusion RP-80ª 150 x
4.6 mm (4 μm), com uma fase móvel composta por solvente A (2,5% ácido
acético) e solvente B (acetonitrilo), e o forno a uma temperatura de 30ºC.
6.2. Correr o programa inicialmente com um gradiente linear de 0% do eluente B,
até ao final de 36 minutos se ter 25% de eluente B, a uma taxa de fluxo de 1.0
mL/min.
6.3. Seguidamente lavar e recondicionar a coluna.
6.4. Seguir os seguintes comprimentos de onda: 280 nm para os flavonóides e as
dihidrichalconas, 320 nm para as hidroxicinamates, 360 nm para os glicosídeos
flavonóides e 520 nm para as antocianinas.
6.5. Obter curvas de calibração, usando epicatequina, catequina, quarcetina-3-O-
rhamnoside, ácido clorogénico, floretina-2’-O-glucósido e procianidina B2, C1
e B1 como padrões.
7. Atividade Antioxidante dos Extratos de Maças
7.1. Extrair 150 mg da polpa e das peles, separadamente, das maçãs com 0,1% de
HCl em solução de metanol.
7.2. Diluir o extrato numa gama de 25000 e 35000 vezes, com água.
7.3. Analisar utilizando um método quimiluminescente.
7.4. Realizar as experiências num volume final de 250 μL, contendo Tris-HCl 0,1M
(pH 9.0) e dihidrocloreto 2,2’-azobis (AAPH).
7.5. Injetar a solução de luminol (100 μM) e os extractos diluídos.
7.6. Contar os protões produzidos na reacção com um luminímetro microplaca
EG&G Berthold LB96P, a 30ºC.
15 | P á g i n a
Nota XIII: O potencial antioxidante é definido como a quantidade de estrato de maçã
que inibe quimiluminescência luminal por 50% e é expresso como o IC50.
8. Experiências Nutricionais em Ratos de Laboratório
Nota XIV: Este estudo deve ser feito de modo a verificar se as maçãs transgénicas
apresentam uma maior eficiência como fonte nutritiva. Realizar com ratos machos com
peso médio de 220g, mantidos em jaulas individuais (com controlo de comida ingerida),
numa sala com temperatura constante de 21ºC, humidade de 60% e em ciclos de 12h de
luz/escuridão.
8.1. Alimentar os ratos ad libitum com uma dieta contendo 30% das maçãs
transgénicas cozidas e secas, cada grupo consumindo a sua variedade, e um
grupo controlo, suplementada com uma mistura de minerais de 3,5%.
8.2. Pesar e registar o peso dos animais uma vez por semana e verificar a sua
situação de saúde todos os dias.
8.3. Após terminar a experiencia de alimentação, manter os ratos em jejum durante
12 horas.
8.4. Pesar os ratos e sacrifica-los com uma overdose de cetamina (50 mg.kg-1 bw).
8.5. Recolher o sangue do coração para posterior análise e preparar e pesar os
seguintes órgãos: cérebro, fígado, intestino delgado, rins e coração.
8.6. Congelar e guardar o fígado e o cérebro a uma temperatura de -70ºC até
posterior análise química.
8.7. Recolher as fezes durante os sete dias da experiencia de digestibilidade.
8.8. Congelar as fezes e secar a 60º. Após retirar o cabelo presente, triturar e analisar
quimicamente segundo o método AOAC.
9. Parâmetros Hematológicos, Bioquímicos e Imunológicos do Sangue
dos Ratos
9.1. Proceder a análise morfológica do sangue em tubos contendo anticoagulantes
(EDTA) e com métodos padrões de laboratório usando um analisador
hematológico ABACUS, Diatron.
9.2. Para proceder a análise bioquímica e imunológica, centrifugar o sangue a 4500
rpm, durante 10 minutos.
9.3. Congelar e guardar o soro a -70ºC.
16 | P á g i n a
9.4. Analisar os parâmetros bioquímicos no soro sanguíneo
espectrofotometricamente usando um analisador Vitros, sistema Ektachem DT-
60-II com um módulo DT, DTE e DTSC, com recurso à colecção Johnson &
Johnson Clinical Diagnostics.
9.5. Determinar as concentrações de IgE, IgA, IgM e IgG no soro sanguíneo, usando
um método quimiluminescente, com um analisador Immulete 2000.
9.6. Analisar a concentração de soro IL-4 com o método de ELISA.
9.7. Analisar os resultados de modo a determinar os resultados obtidos.
3.3.
3.3.1. Vortex;
Termociclo;
Tina de electroforese horizontal e respectivas fontes de energia;
Transluminador de UV;
Equipamento para Northern Blot;
Autoradiografia;
Misturador de Polytron;
Sistema de vácuo;
Ultra-sons;
Centrifugadora;
Equipamento de LC-MS;
Sistema de HPLC;
Espectrofotómetro;
Balança analítica;
Ultracongelador.
3.3.2. Placas de Petri;
Erlenmeyers;
17 | P á g i n a
Bisturi ou faca;
Micropipetas e respectivas pontas;
Eppendorfs;
Varetas;
Membranas de nylon;
Pinças;
Sondas de cDNA marcadas radioactivamente;
Filtros;
Pelador ou faca;
Almofariz;
Provetas;
Filtro de papel Whatman nº1;
Filtro seringa Acrodisc 0,45μm;
Tubos de ensaio;
Pipetas de Pasteur;
Cuvetes;
Materiais necessários para proceder ao sacrifício dos animais;
Seringas.
3.3.3.
Quantidade Pureza
(%)
Entidade
Fornecedora
Preço
(€)
DNeasy Plant Mini Kit 1Kit --- Qiagen 129,17
Tampão de PCR 25ml --- Sigma 291,17
Primer Forward 1 Set --- Sigma 38,13
Primer Reverse 1Set --- Sigma 38,13
AmpliTaq Gold DNA
Polymerase 100ml --- Greener 69,65
DNA Template 1 Kit --- TaqMan 279,46
Agarose 1% 100g --- Sigma-Aldrich 174,94
Ácido bórico 500g --- Sigma 35,28
EDTA 100g --- Sigma-Aldrich 14,52
Tris 250g 99,8 Sigma 81,79
Brometo de etídeo 10 ml --- Sigma 39,02
dNTPs 2UMOL --- Sigma 104,00
MgCl2 100g 98 Sigma 48,20
18 | P á g i n a
TBE 250g 98 Aldrich 33,30
Formaldeído 25mL --- Sigma-Aldrich 26,30
SSC 1L --- Sigma 68,80
SDS 25g 98,5 Sigma 37,40
Metanol 1L 99,9 Fluka 57,80
HCL 100mL 36,5-38 Sigma 50,70
Ácido fórmico 100mL 95 Sigma-Aldrich 34,20
Ácido acético 500mL 99,7 Sigma-Aldrich 51,30
Acetonitrilo 100mL 99,8 Sigma-Aldrich 54,00
AAPH 25g 97 Aldrich 35,00
Luminol 5g 97 Sigma 69,10
Cetamina 10mL --- Sigma 85,90
Total
(sem IVA) 1947,16
Total
(com IVA) 2395,00
Tabela 3-Lista de reagentes e orçamento correspondente, com e sem o IVA aplicado á taxa atual.
Propõe-se financiamento deste projecto científico à Fundação da Ciência e
Tecnologia (FCT), no âmbito da área Bioengenharia, Biotecnologia e Bioquímica.
Neste projecto é desejado produzir plantas transgénicas, mais especificamente, maçãs de
três variedades diferentes, de modo a provocar a sobreexpressão de antioxidantes. Os
antioxidantes são moléculas que se ligam aos radicais livres presentes no organismo,
ajudando a prevenir e a combater várias doenças, como o cancro, doenças cardíacas,
osteoporose, entre muitas outras. Aqui é proposto a manipulação genética das maçãs, de
modo a se obter uma maçã com um maior conteúdo em antioxidantes, com vista a estas
serem uma fonte nutritiva mais eficiente, sendo que a manipulação genética também
ajuda a proteger as plantas contra ameaças externas. Este estudo pode ser usado para
transformar um fruto de consumo relativamente comum, numa fonte nutritiva mais
eficiente, para um melhor efeito para a saúde humana.
19 | P á g i n a
A reação da polimerase em cadeia corresponde
a um método de amplificação e detenção de
sequências de DNA, possibilitando a obtenção de
múltiplas cópias, num processo rápido, simples e
automatizado, sem o recurso a um organismo vivo.
Este método baseia-se na utilização da capacidade do
DNA polimerase (figura 1) em formar polímeros de
nucleótidos pela adição destes a uma extremidade 3’-
OH iniciadora (primer), permitindo assim a síntese de
uma cadeia de DNA complementar a uma cadeia
molde. A possibilidade de delinear uma sequência
iniciadora especifica (primer) complementar á cadeia
molde permite definir uma região a amplificar.
Apesar da necessidade de quantidades
mínimas de material genético verifica-se uma
amplificação viável, por inúmeras vezes e em pouco
tempo, fazendo com que este método permita uma
detenção fiável de marcadores genéticos relacionados
com doenças infeciosas, cancerianas e genéticas.
Figura 1-Reação do DNA polimerase em PCR, quando na presença de DNA, primers
e nucleótidos.
20 | P á g i n a
Purificação da Taq polimerase de uma bactéria termófila.
Remoção da intervenção humana no processo, ao introduzir um
enzima resistente a altas temperaturas, contribuindo para simplificar e
encurtar o processo.
Desenvolvimento de oligonucleotídos manufaturados por Kary Mullis da
empresa Cetus com vista á pesquisa e desenvolvimento de projetos internos;
Avanços no desenvolvimento de protótipos de sintetizadores
automáticos de oligonucleótidos.
Divulgação das experiências de Mullis envolvendo a
sintese de oligonucleotídos.
Kary Mullis propõe a síntese de oligonucleotídos baseando se no método
de sequenciamento de DNA de Sanger;
A dificuldade da aplicação do método para um local específico do genoma
levou Mullis a adicionar um segundo conjunto de primers;
Aplicações repetidas de polimerases conduziu a uma reação em cadeia de
replicação para um segmento específico do genoma (PCR);
Inclusão de ciclos térmicos, direcionados para pequenos segmentos de um
gene clonado.
PerkimElmer, uma outra empresa biotecnológica lança um termociclo,
instrumento capaz de regular a temperatura da reação de forma
programada
21 | P á g i n a
Por forma a proceder á amplificação de sequências de DNA por PCR, devem
estar presentes os seguintes componentes:
Cadeia de DNA Molde: Amostra de DNA que contém a sequência alvo.
No inicio da reação, a elevada temperatura aplicada faz com que as cadeias
da molécula original de DNA se separem;
DNA polimerase-Enzima responsável pela síntese de novas cadeias de
DNA compleamentares com a sequência alvo. O enzima mais usado é o
Taq polimerase (da bactéria Thermis aquaticus) e a Pfu DNA polimerase
(da bactéria Pyrococcus furiosus). Embora estruturalmente diferentes,
estes enzimas possuem duas características que os tornam adequados á sua
utilização em PCR:
o Poder formar novas cadeias de DNA, a partir de uma cadeia
modelo e primers;
o Serem resistentes a elevadas temperaturas.
Primers-Fragmentos de oligonocleótidos sintéticos complementares á
sequencia alvo. Correspondendo ao componente ao qual a DNA
polimerase inicia a extensão de uma nova cadeia a partir de uma das
extremidades;
Nucleotídos (dNTPS ou desoxinucleótidos trifosfato)-Unidades
individuais de bases distintas que representam componentes essenciais á
síntese de uma nova cadeia pela DNA polimerase.
O PCR processa-se em três etapas, no qual, em conjunto definem um ciclo
que se repete um número específico de vezes. Assim, um ciclo consiste nas
seguintes etapas:
22 | P á g i n a
A desnaturação térmica
processa-se a uma temperatura elevada
(em geral para temperaturas superiores
a 90ºC), ao qual ocorre separação da
dupla cadeia de DNA em dois
filamentos. A separação dos dois
filamentos ou cadeias de DNA (figura
2) verificam-se uma vez estes são
mantidos por pontes de hidrogénio,
forças relativamente fracas que sofrem
rutura a elevadas temperaturas, ao passo que as ligações entre nucleótidos, por serem
ligações covalentes, mais fortes, permanecem intactas.
Com o objetivo de amplificar
um segmento de DNA de interesse, são
introduzidos primers que marcam as
extremidades da sequência alvo. São
designados dois tipos de primers, um
para cada cadeia simples de DNA
produzida na etapa de desnaturação.
O inicio da sequência de DNA alvo é
marcada pelos primers que se ligam
(hibridam) com a sequencia complementar, definindo uma região (figura 3). A
temperatura de annealing ou hibridação encontra-se normalmente entre os 40ºC e 65ºC,
dependendo do comprimento dos primers e da sua sequência. A definição rigorosa da
temperatura permite que estas sequências iniciadoras se liguem á sequência alvo com
elevada afinidade.
Figura 2-Desnaturação térmica, correspondendo á primeira etapa do ciclo ao qual ocorre separação da dupla cadeia de
DNA.
Figura 3-Hibridação ou Annealing, correspondendo á segunda etapa do ciclo, á qual ocorre, por complementaridade a
definição do segmento a amplificar.
23 | P á g i n a
Após a ligação dos primers às
sequências de DNA, a temperatura
aumenta para 72ºC ao qual o enzima Taq
polimerase replica a cadeia de DNA
(figura 4). O processo de síntese é
iniciado numa zona com cadeia dupla,
onde os primers se encontram ligados, e
ao qual ocorre incorporação de
nucleótidos complementares à sequência.
Esta etapa inicia-se pela extremidade 3’
do primer, criando uma cadeia dupla a partir de cada uma das cadeias simples.
No final do primeiro ciclo de
PCR verifica-se a existência de duas
novas cadeias e DNA idênticas á
original (figura 5). Como a DNA
polimerase não reconhece o final da
sequência, as novas cadeias
sintetizadas têm o seu inicio definido
pelo primer, mas a sua extremidade
3’ indefinida leva á formação de
fragmentos de diferentes tamanhos. No ciclo que se segue esta cadeia vai servir de
molde à síntese de uma nova cadeia, limitando o primer a outra extremidade da cadeia.
A cadeia de DNA sintetizada a partir deste molde, terá então o comprimento definido
pelos primer. Estas cadeias desigmam se de Amplicons.
Ao fim de alguns ciclos, as cadeias de DNA que correspondem ao tamanho da
sequência alvo, encontram-se presentes em maior quantidade do que as sequencias de
tamanho variável, isto é, a sequência flanqueada pelos primers corresponde àquela que
se amplia.
Figura 4-Extensão, correspondendo á terceira etapa do ciclo ao qual se verifica o prolongamento das cadeias pela DNA
polimerase de acordo com a complementaridade das bases.
Figura 5-No fim do ciclo coexistem duas cadeias de DNA idênticas á original, resultado da amplificação.
24 | P á g i n a
O conjunto das três etapas referidas ocorre
num termociclo (figura 6), um equipamento que
controla e alterna de forma cíclica as temperaturas
automaticamente, durante períodos programados de
tempo para um determinado número de ciclos.
O PCR pode ser aplicado ao nível da sequenciação de segmentos de DNA,
genotipagem, avaliação da expressão de genes, clonagem, entre muitas outras
aplicações.
Apesar de poder ser aplicado de uma forma alargada a um grande número de
áreas apresenta algumas limitações, que fazem com que a quantificação dos produtos de
PCR não seja confiável, tais como:
Determinação da quantidade inicial da sequência alvo só é possivel para uma
fase exponencial da reação de PCR;
Esta fase exponencial pode ser dificultada pela presença de inibidores da
reação de polimerização, verificar-se um reagente que limita essa reação,
ocorrer a acumulação de moléculas de pirofosfato, o auto-anelamento.
Organismos transgênicos são aqueles que receberam material genéticos de
outros organismos, mediante o emprego de técnicas de engenharia genética, como a
tecnologia de DNA recombinante. A geração de transgênicos visa obter organismos
com características novas ou melhoradas relativamente ao organismo original. A
manipulação genética combina características de um ou mais organismos de uma forma
que provavelmente não aconteceria na natureza. Assim podem ser combinados
os moléculas de DNA de organismos que não se cruzariam por métodos naturais.
Figura 6-Termociclo, equipamento capaz de amplificar de forma
automatizada sequências de DNA.
25 | P á g i n a
Frequentemente há uma certa confusão entre organismos transgênicos
e Organismos Geneticamente Modificados (OGM), e os dois conceitos são tomados, de
forma equivocada, como sinônimos. Ocorre que OGMs e transgênicos não são
sinônimos. Os transgênico correspondem a organismos geneticamente modificados, mas
nem todos os OGM são transgênicos. OGM é um organismo que teve o
seu genoma modificado em laboratório, sem todavia receber material genético
(RNA/DNA) de outro organismo. Transgênico é um organismo que foi submetido a
técnicas específicas de inserção de material genético de outro organismo (que pode até
ser de espécie diferente).
Alimentos transgénicos são alimentos produzidos a partir de organismos
cujo embrião foi modificado em laboratório, pela inserção de pelo menos um gene de
outra espécie. Alguns dos motivos de modificação desses alimentos são para que as
plantas possam resistir às pragas (insetos, fungos, vírus, bactérias e outros) e
a herbicidas. O mau uso de pesticidas pode causar riscos ambientais, tais como o
aparecimento de plantas resistentes a herbicidas e a poluição dos terrenos e lençóis de
água.
O uso de herbicidas, inseticidas e outros agrotóxicos pode diminuir com o uso
dos transgênicos, já que eles tornam possível o uso de produtos químicos corretos para o
problema.
A primeira aplicação dos organismos transgênicos e dos organismos
geneticamente modificados é a própria investigação científica. A expressão de um
determinado gene de um organismo em outro organismo pode facilitar a compreensão
da função desse gene. Posteriormente, organismos transgênicos, como plantas e
animais, foram desenvolvidos para estudos, e também vários produtos obtidos a partir
de transgênicos foram desenvolvidos e comercializados. O primeiro produto
comercializado foi a insulina, produzida a partir de uma modificação
da bactéria Escherichia coli, o final dadécada de 1970). Atualmente, alimentos
transgênicos são utilizados para consumo animal e humano.
26 | P á g i n a
AAPH: Dihidrocloreto-2,2’-azobis
cDNA: Ácido desoxirribonucleico complementar
CHI: Chalcona isomerase
CHS: Chalcona sintase
DAD: Detector de díodo array
DFR: Dihidroflavonol redutase
DNA: Ácido desoxirribonucleico
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
ESI: Fonte de ionização electrospray
HCl: Ácido clorídrico
HPLC: Cromatografia líquida de alta eficiência
LC: Cromatografia líquida
MS: Espectrometria de massa
MgCl2: Cloreto de magnésio
npt II: Gene neomicina fosfotransferase
PCR: Reação em cadeia da polimerase
RNA: Ácido ribonucleico
SDS: Dodecil sulfato de sódio
SSC: Tampão salino citrato de sódio
TBE: Tris-Borato-EDTA
UV: Ultravioleta
Vis: Visível
27 | P á g i n a
[1] Kostyn, K., Szatkowski, M., Kulma, A., Kosieradzka, I., Szopa, J. (2013),
Transgenic Potato Plants with Overexpression of Dihydroflavonol Reductase Can Serve
as Efficient Nutrition Source, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 61:
6743-6753;
[2] Vrhovsek, U., Rigo, A., Tonon, D., Mattivi, F. (2004), Quantification of
polyphenols in Different Apple Varieties, Journal of Agriculture and Food Chemistry,
Vol. 52: 6532-6538;
[3] Tsao, R., Yang, R., Young, J.C., Zhu, H. (2003), Polyphenolic Profiles in Eight
Apple Cultivars Using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC), Journal of
Agricultural and Food Chemistry, Vol. 51: 6347-6353;
[4] Wojdylo, A., Oszmianski, J., Laskowski, P. (2008), Polyphenolic Compounds and
Antioxidant Activity of New and Old Apple Varieties, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, Vol. 56: 6520-6530;
[5] Wungaard, H., Brunton, N. (2009), The Optimization of Extraction of Antioxidantes
from Apple Pomace by Pressurized Liquids, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, Vol. 57: 10625-10631;
[6] Plaza, M., Abrahamsson, V., Turner, C. (2013), Extraction and Neoformation of
Antioxidant Compounds by Pressurized Hot Water Extraction from Apple Byproducts,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 61: 5500-5510;
[7] Plaza, M. Kariuki, J., Tumer, C. (2013), Quantification of Individual Phenolic
Compounds’ Contribution to Antioxidant Capacity in Apple: A Novel Analytical Tool
Based on Liquid Chromatography with Diode Array, Electrochemical, and Charged
Aerosol Detection, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 62: 409-418;
[8] Fromm, M., Bayha, S., Carle, R., Kammerer, D.R. (2012), Characterization and
Quantitation of Low and high Molecular Weight Phenolic Compounds in Apple Seeds,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 60: 1232-1242;
[9] Sluis, A., Dekker, M., Skrede, G., Jongen, W. (2004), Activity and Concentration of
Polyohenolic Antioxidants in Apple Juice 2. Effect of Novel Production Methods,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 53: 2840-2848;
28 | P á g i n a
[10] Hamauzu, Y., Inno, T., Kume, C., Irie, M., Hiramatsu, K. (2006), Antioxidant and
Antiilcerative Properties of Phenolics from Chinese Quince, Quince, and Apple Fruits,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 54: 765-772;
[11] Botton, A., Lezzer, P., Dorigoni, A., Barcaccia, G., Ruperti, B., Ramina, A. (2008),
Genetic and Environmental Factors Affecting Allergen-Related Gene Expression in
Apple Fruit (Malus domestica L.Borkh), Journal of Agricultural and Food Chemistry,
Vol. 56: 6707-6716;
[12] Oszmianski, J., Wojdyelo, A., Kolniak, J. (2009), Effect of Enzymatic Mash
Treatment and Storage on Phenolic Composition, Antioxidant Activity, and Turbidity of
Cloudy Apple Juice, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 57: 7078-7085;
[13] Hamauzu, Y., Yasui, H., Inno, T., Kume, C., Omanyuda, M. (2005), Phenolic
Profile, Antioxidant Property, and Anti-influenza Viral Activity of Chinese Quince
(Pseudocydonia sinensis Schneid.), Quince (Cydonia oblonga Mill.), and Apple (Malus
domestica Mill.) Fruits, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 53: 928-934;
[14] Angelo, S.D., Cimmino, A., Raino, M., Salvatore, A., Zappia, V., Galletti, P.
(2007), Effect of Reddening-Ripening on the Antioxidant Activity of Polyphenol
Extracts from Cv. ‘Annurca’ Apple Fruits, Journal of Agricultural and food Chemistry,
Vol. 55: 9977-9985;
[15] Ruhmann, S., Treutter, D., Fritsche, S., Brivida, K., Szankowski, I. (2006), Piceid
(Resveratrol Glucoside) Synthesis in Stilbene Synthase Transgenic Apple Fruit, Journal
of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 54: 4633-4640;
[16] Napolitano, A., Cascone, A., Graziani, G., Ferracane, R., Scalfi, L., Vaio, C.D.,
Ritieni, A., Fogliano, V. (2004), Influence of Variety and Storage on the Polyphenol
Composition of Apple Flesh, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 52:
6526-6531;
[17] Tsao, R., Yang, R., Xie, S., Sockovie, E., Khanizadeh, S. (2005), Which
Polyphenolic Compounds Contribute to the Total Antioxidant Activities of Apple?,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 53:4989-4995;
[18] Kahle, K., Huemmer, W., Kempf, M., Scheppach, W., Erk, T., Richling, E. (2007),
Polyphenols Are intensively Metabolized in the Human Gastrointestinal Tract after
Apple Juice Consumption, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 55: 10605-
10614;
29 | P á g i n a
[19] Alonso-Salces, R.M., Barranco, A., Abad, B., Berrueta, L.A., Gallo, B., Vicente, F.
(2004), Polyphenolic Profiles of Basque Cider Apple Cultivars and Their Technological
Properties, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 42: 2938-2952;
[20] Boyer, J., Liu, R.H. (2004), Antioxidants of Apples, New York Fruit Quarterly,
Vol. 11: 11-15;
[21] Ghanem, S. (2011), Cloning of the nptII gene of Escherichia coli and construction
of a recombinant strain harboring functional recA and nptII antibiotic resistance,
Genetics and Molecular Research, Vol. 10: 1445-1454;
[22] Khan, S.A., Chibon, P., Vos, R., Schipper, B.A., Walraven, E., Beekwilder, J.,
Dijk, T., Finkers, R., Visser, R.G.F., Weg, E., Bovy, A., Castaro, A., Velasco, R.,
Jacobsen, E., Schouten, H.J. (2012), Genetic analysis of metabolites in apple fruits
indicates an mQTL hotspot for phenolic compounds on linkage group 16, Journal of
Experimental Botary, pp 1-14;
[23] Bouayed, J., Bohn, T. (2012), Dietary Derived Antioxidants: Implications on
Health, Nutrition, Well-Being and Health, Edited by Dr. Jaouad Bouayed, Chapter 1;
[24] Boyer, J., Liu, R.H. (2004), Apple phytochemicals and their health benefits,
Nutrition Journal, Vol. 3;
[25] Kindt, M., Orsini, M. O., Costantini, B. (2007), Improved High-Performance
Liquid Chromatography-Diode Array Detection Method for the Determination of
Phenolic Compounds in Leaves and Peels From Different Apple Varieties, Journal of
Chromatographic Science, Vol. 45;
[26] Wolfe, K., Wu, X., Liu, R.H. (2003), Antioxidant Activity of Apple Peels, Journal
Agricultural and Food Chemistry, Vol. 51: 609-614;
[27] Defilippi, B., Dandekar, A.M., Kader, A.A. (2004), Impact of Supression of
Ethylene Action or Biosynthesis on Flavor Metabolites in Apple (Malus domestica
Borkh) Fruits, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 52: 5694-5701;
[28] Adyanthaya, I. (2007), Antioxidant Response Mechanism in Apples during Pos-
Harvest Storage and Implications for Human Health Benefits, Masters Dissertations ans
Theses, University of Massachusetts – Amherst;
[29] Atkinson, R.G., Schroder, R., Hallett, I.A., Cohen, D., MacRae, E.A. (2002),
Overexpression of Polygalacturonase in Transgenuc Trees Leads to a Range of Novel
Phenotypes Involving Changes in Cell Adhesion, Plant Physiology, Vol. 129: 122-133;
[30] Barth, S.W., Fahndrich, C., Bub, A., Dietrich, H., Watzl, B., Will, F., Briviba, K.,
Rechkemmer, G. (2005), Cloudy apple juice decreases DNA damage, hyperproliferation
30 | P á g i n a
and aberrant crypt foci development in the distal colon of DMH-initiated rats,
Carginogenesis, Vol. 26: 1414-1421;
[31] Krens, F.A., Pelgrom, J.G., den Nijs, A.P.M., Rouwendal, G.J.A. (2004), Clean
Vector Technology for Marker-free Transgenic Ornamentals, Proc 21st IS on Breeding
Ornamentals, Part II, pp 101-105, Eds: G. Forkmann & S. Michaelis;
[32] Miura, T., Chiba, M., Kasai, K., Nozaka, H., Nakamura, T., Shoji, T., Kanda, T.,
Ohtake, Y., Sato, T. (2008), Apple procyanidins induce tumor cell apoptosis through
mitochondrial pathway activation of caspase-3, Carcinodenesis, Vol. 29: 585-593;
[33] Cheynier, V. (2005), Polyphenols in foods are more complex than often thought,
The American Journal of Clinical Nutrition, Vol. 81: 223S-229S;
[34] Graziani, G., Argenio, G.D’., Tuccillo, C., Loguercio, C., Ritieni, A., Morisco, F.,
Blanco, C.D.V., Fogliano, V., Romano, M. (2005), Apple polyphenol extracts prevent
damage to human gastric epitelial cells in vitro and to rat gastric mucosa in vivo, Gut,
Vol. 54: 193-200;
[35] Herzog, K., Flachowsky, H., Deising, H., Hanke, M. (2012), Heat-shock-mediated
elimination of the nptII marker gene in transgenic apple (Malus x domestica Borkh.),
Gene, Vol. 498: 41-49;
[36] Arabbi, P.R., Genovese, M.I., Lajolo, F.M. (2004), Flavonoids in Vegetable Foods
Commonly Consumed in Brazil and Estimated Ingestion by the Brazilian Population,
Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 52: 1124-1131;
[37] Cervera, M., Navarro, A., Navarro, L., Peña, L. (2008), Production of transgenic
adult plants from clementine mandarin by enhancing cell competence for transformation
and regeneration, Tree Physiology, Vol. 28: 55-66;
[38] Kumar, V., Yadav, S.K. (2013) Overexpression os CsDFR and CsANR enhanced
flavonoids accumulation and antioxidant potential of roots in tobacco, Plant Root, Vol.
7: 65-76;
[39] Wang, Y., Wisniewski, M., Meilan, R., Cui, M., Fuchigame, L. (2006), Transgenic
tomato (Lycopersicon esculentum) overexpressing cAPX exhibts enhanced tolarense to
UV-B and heat stress, Journal of Applied Horticulture, Vol. 8: 87-90;
[40] He, L., Ban, Y., Inoue, H., Matsuda, N., Liu, J., Moriguchi, T. (2008),
Enhancement of spermidine content and antioxidant capacity in transgenic pear shoots
overexpressing apple spermidine synthase in response to salinity and hyperosmosis,
Phytochemistry, Vol. 69: 2133-2141;
31 | P á g i n a
[41] Loake, G.J., Choudhary, A.D., Harrison, M.J., Mavandad, M., Lamb, C.J, Dixon,
R.A. (1991), Phenylpropanoid Pathway Intermediates Regulate Transient Expressionof
a Chalcone Synthase Gene Promoter, The Plant Cell, Vol. 3: 829-840;
[42] Yenofsky, R.L., Fine, M., Pellow, J.W. (1990), A mutant neomycin
phosphotransferase II gene reduces the resistance of transformants to antibiotic selection
pressure, Proc. Natl, Acad., Sci. USA, Vol. 87: 3435-3439;
[43] Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. (1990), Introduction of a Chimeric
Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of
Homologous Genes in trans, The Plant Cell, Vol. 2: 279-289;
[44] Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J.,
Willmitzer, L. (1989), Both developmental and metabolic signals activate the promoter
of a class I patatin gene, The EMBO Journal, Vol. 8: 23-29;
[45] Tsao, R. (2007), Extraction, Separation, Detection and Antioxidant Activity of
Apple Polyphenols, Antioxidant Measurement and Applications, Chapter 20, pp 302-
324;
[46] Sanghera, G.S., Malhotra, P.K., Sidhu, G.S., Sharma, V.K., Sharma, B.B., Karan,
R. (2013), Genetic Engineering of Crop Plants for Enhanced Antioxidants Activity,
International Journal of Advancements in Research & Technology, Vol. 2: 428-458;
[47] James, D.J., Passey, A.J., Baker, S.A. (1994), Stable gene expression in transgenic
apple tree tissues and segregation of transgenes in the progeny – Preliminary evidence,
Euphytica, Vol. 77: 119-121;