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RIO DE JANEIRO 2012
PRODUÇÃO DE ÁCIDO PERÍLICO POR BIOCONVERSÃO DO LIMONENO
UTILIZANDO A LEVEDURA Yarrowia lipolytica.
OTIMIZAÇÃO DO BIOPROCESSO.
Roberta Trovão Santos
ROBERTA TROVÃO SANTOS
Aluna do Curso de Ciências Biológicas
Matrícula 0823800123
RIO DE JANEIRO 2012
Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado ao Curso de Graduação em Ciências Biológicas, da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas, sob a orientação da Doutora Maria Antonieta Ferrara.
PRODUÇÃO DE ÁCIDO PERÍLICO POR BIOCONVERSÃO DO LIMONENO
UTILIZANDO A LEVEDURA Yarrowia lipolytica.
OTIMIZAÇÃO DO BIOPROCESSO.
ii
iii
Elaborado por Roberta Trovão Santos
Aluna do Curso de Ciências Biológicas da UEZO
Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com
Grau:.....................
Rio de Janeiro, 16 de julho de 2012.
RIO DE JANEIRO 2012
PRODUÇÃO DE ÁCIDO PERÍLICO POR BIOCONVERSÃO DO LIMONENO
UTILIZANDO A LEVEDURA Yarrowia lipolytica.
OTIMIZAÇÃO DO BIOPROCESSO.
Adriano Arnóbio, Mestre em Ciências Médicas Examinador I
Ronaldo Figueiró, Doutor em Ecologia Examinador II e Presidente
Sérgio Henrique Seabra, Doutor em Ciências Biológicas Suplente
Maria Antonieta Ferrara, Doutora em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Orientadora (Fiocruz/Farmanguinhos)
iv
Dedico este trabalho aos meus familiares.
v
Agradeço a Deus pela oportunidade de concluir o nível
superior, à minha família que sempre me apoiou e esteve
ao meu lado; ao meu noivo pela força e paciência nos
momentos difíceis; aos meus amigos que me ajudaram e
compreenderam minha ausência; à minha orientadora,
Drª Maria Antonieta Ferrara que sempre me forneceu
orientação segura para este trabalho e aos meus
colaboradores.
vi
Este trabalho faz parte de um projeto desenvolvido em
parceria entre Farmanguinhos – FIOCRUZ e o
Instituto de Química – UFRJ.
As análises de CG/DIC foram realizadas em
Farmanguinhos – FIOCRUZ.
O trabalho experimental foi desenvolvido no
laboratório de Tecnologia Enzimática (ENZITEC)
coordenado pela professora Elba P. S. Bon.
O trabalho foi financiado pelo Cnpq e pela Faperj.
vii
Resumo
O Brasil é o maior produtor e exportador de suco de laranja e durante sua
fabricação são gerados subprodutos como o óleo limoneno. Este óleo é amplamente
distribuído na natureza e estudos mostram sua eficácia no tratamento de algumas doenças,
mas a dosagem requerida seria muito alta tornando esse tratamento inviável. Por este
motivo seus derivados álcool e ácido perílico começaram a ser investigados. O álcool
perílico apresenta efetividade no tratamento de gliomas malignos recorrentes e outros tipos
de câncer. Seu uso terapêutico já evoluiu para ensaios clínicos em fase I/II. O ácido
perílico e derivados também têm sido reportados como possuindo atividade anticâncer e
antimicrobiana. Os processos de bioconversão oferecem vantagens técnicas, econômicas e
ambientais em comparação com a síntese química, como formação de produtos com
químio, régio e enantiosseletividade, menor formação de subprodutos, uso de condições
brandas de reação e baixo consumo de energia.
No presente trabalho utilizou-se um planejamento experimental para otimizar a
biotransformação do limoneno em ácido perílico através da levedura Yarrowia lipolytica.
Verificou-se a influência das variáveis temperatura, pH, limoneno, massa celular e
nutrientes para determinar quais possuem significância 1 através de um planejamento
fatorial fracionado. A maior produção de ácido perílico (1216,8 mg/L) foi obtida na
temperatura de 20°C, pH 7,2, concentração inicial de limoneno de 0,5% v/v, concentração
de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v. As variáveis massa celular,
concentração de limoneno e pH apresentaram significância nos níveis testados para
otimização da produção do ácido perílico.
Palavras-chave: Limoneno, biotransformação, Yarrowia lipolytica, ácido perílico, planejamento experimental.
viii
Abstract
Brazil is the largest producer and exporter of orange juice and during its
manufacture byproducts such as the mono terpene limonene are generated. This oil is
widely distributed in nature and studies show its effectiveness in treating some diseases,
but the dosage required would be very high making suchtreatment unfeasible. For this
reason its derivatives perillyl alcohol and perillic acid began to be investigated. The perillyl
alcohol presents effectiveness in the treatment of recurrent malignant gliomas and other
types of cancer. Its therapeutic use has progressed to clinical trials in phase I / II. Perillyl
acid and its derivatives have also been reported as having antimicrobial and anticancer
activity. The bioconversion processes offer technical, economic and environmental
advantages when compared to chemical synthesis, such as chemo, region and
enantioselectivity, less formation of byproducts, use of milder reaction conditions and low
energy consumption.
In this study an experimental design was performed to optimize the
biotransformation of limonene to perillyl acid using the yeast Yarrowia lipolytica. The
influence of temperature, pH, limonene, cell mass and nutrients was evaluated through a
fractional factorial design. The highest yield of perillyl acid (1216.8 mg / L) was obtained
at 20 °C, pH 7.2, initial concentration of limonene 0.5% v / v, cell concentration of 20 g / L
and nutrient solution 10% v /v. The variables cell mass, limonene concentration and pH
were significant at the levels tested to optimize the production of perillyl acid.
Keywords: Limonene, biotransformation, Yarrowia lipolytica, perillyl acid, experimental
design.
ix
SUMÁRIO
Página RESUMO .............................................................................................................. vii ABSTRACT........................................................................................................... viii 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
1.1 Limoneno..................................................................................................... 2 1.2 Derivados perílicos ..................................................................................... 3 1.3 Microrganismo............................................................................................ 4 1.4 Bioprocesso.................................................................................................. 5 1.5 Justificativa.................................................................................................. 6
2. OBJETIVOS...................................................................................................... 7 2.1 Objetivo geral.............................................................................................. 7 2.2 Objetivo específico..................................................................................... 7
3. METODOLOGIA ............................................................................................ 8 3.1 Microrganismo............................................................................................ 8 3.2 Bioconversão............................................................................................... 8 3.3 Planejamento fatorial fracionado.............................................................. 8 3.3.1 Planejamento experimental I............................................................... 9 3.3.2 Planejamento experimental II............................................................. 10 3.4 Metodologia analítica.................................................................................. 11
3.4.1 Quantificação da massa celular, dosagem de glicose e determinação do pH............................................................................................................ 11 3.4.2 Análise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama (CG/DIC)..................................................................... 11
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................ 12 4.1 Planejamento experimental I.................................................................... 12 4.1.1 Etapa de crescimento celular.............................................................. 12 4.1.2 Etapa de bioconversão......................................................................... 12
4.1.3 Análise de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CG/DIC).................................................................... 13 4.1.4 Análise estatística............................................................................... 14
4.2 Planejamento experimental II.................................................................. 15 4.2.1 Etapa de crescimento celular.............................................................. 15
4.2.2 Etapa de bioconversão......................................................................... 15 4.2.3 Análise de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização de Chama (CG/DIC).................................................................... 16 4.2.4 Análise estatística................................................................................ 18
5. CONCLUSÃO..................................................................................................... 19 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 20
x
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Porcentagem dos rendimentos de suco e dos principais subprodutos da indústria do suco de laranja.............................................................................................................. 1
Figura 2. Estrutura química do limoneno......................................................................... 2
Figura 3. Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.......................... 3
Figura 4. Microscopia óptica da Y. lipolytica................................................................... 4
Figura 5. Gráfico indicando os setores industriais que utilizam a biotransformação...... 5
Figura 6. Gráfico da concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno (delineamento fatorial fracionado 25-1).................................................... 13
Figura 7. Gráfico de pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 24h............................................................................................................... 14
Figura 8. Gráfico de pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 48h............................................................................................................... 15
Figura 9. Gráfico da concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno (delineamento fatorial fracionado 24-1).................................................. 18
Figura 10. Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 24h............................................................................................................. 19
Figura 11. Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 48h............................................................................................................. 19
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros
significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 25-1)......................... 9
Tabela 2. Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros
significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 24-1).......................... 10
Tabela 3. Valores de pH e glicose correspondente a cada amostra em t=0, t=24 e t=48h do
planejamento experimental I........................................................................................... 12
Tabela 4. Valores de pH e glicose nas amostras iniciais e após 24 e 48 horas de
bioconversão do limoneno do planejamento experimental II....................................... 16
Tabela 5. Concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno
(delineamento fatorial fracionado 24-1)........................................................................ 17
1. INTRODUÇÃO
O maior produtor e exportador
década de 80 é o Brasil, produzindo mais de 50% do volume mundial e exportando 98% de
sua produção, conforme dados da
sucos cítricos (www.citrusbr.com.br)
subprodutos com valor comercial são obtidos e
e o farelo de polpa cítrica (RODRIGUES, 2006
óleos essenciais para uso em indústrias alimentícias e farmacêuticas.
apresentar compostos com atividade biológica, como limonóides e seus glicosídeos, que
causaram a inibição de tumores cancerígen
(REDA et al., 2005). A figura 1 apresenta
subprodutos da indústria do
Figura 1- Porcentagem dos rendimentos
e exportador de suco de laranja industrializado
produzindo mais de 50% do volume mundial e exportando 98% de
, conforme dados da CitrusBR - Associação Nacional dos
sucos cítricos (www.citrusbr.com.br). Durante o processo de fabricação
com valor comercial são obtidos entre eles estão os óleos essenciais, limoneno
(RODRIGUES, 2006). Uma alternativa rentável é a extração de
em indústrias alimentícias e farmacêuticas.
apresentar compostos com atividade biológica, como limonóides e seus glicosídeos, que
causaram a inibição de tumores cancerígenos induzidos em ratos, camundongos e ramsters
A figura 1 apresenta os rendimentos de suco e
indústria do suco de laranja.
Porcentagem dos rendimentos de suco e dos principais subprodutos da indústria do suco de laranjaFonte: http://laranjadositio.com.br/prop.php
industrializado do mundo desde a
produzindo mais de 50% do volume mundial e exportando 98% de
Associação Nacional dos Exportadores de
processo de fabricação do suco vários
estão os óleos essenciais, limoneno
Uma alternativa rentável é a extração de
Estes óleos podem
apresentar compostos com atividade biológica, como limonóides e seus glicosídeos, que
os induzidos em ratos, camundongos e ramsters
de suco e dos principais
principais subprodutos da indústria do suco de laranja.
1.1 Limoneno
O limoneno, 4-isoprenil
pertencente à família dos terpenos
(HUDES et al., 2000). É usado como ingrediente para sabor cítrico em óleos artificiais e
fragrâncias. Pode ser utilizado em tintas, resinas, bebidas não
(CHOW et al., 2002).
O isômero S-(-)-limoneno é principalmente encontrado numa variedade de plantas e
ervas como Mentha spp, enquanto
das cascas de limão e laranja e do óleo essencial
prevenção da desidratação e inibição de crescimento microbiano suas funções naturais nos
vegetais (DEMYTTENAERE
Desde a década de 80, o limoneno é reconhecido como um agente com ações
quimiopreventivas e quimioterapêuticas (OLIVEIRA, 2010
durante a iniciação e a produção da carcinogênese em diversos tumores (
2002) e pode estar relacionado à inibição da isoprenilação de proteínas da família G,
incluindo membros da famíli
considerado um potencial
utilidade clínica e seus m
investigados (BOIK, 2001).
isoprenil-1-metil-ciclo-hexeno, é um monoterpeno monocíclico
pertencente à família dos terpenos encontrado em frutas cítricas, como laranja e limão
, 2000). É usado como ingrediente para sabor cítrico em óleos artificiais e
Pode ser utilizado em tintas, resinas, bebidas não-alcóolicas, sor
limoneno é principalmente encontrado numa variedade de plantas e
spp, enquanto R-(+)-limoneno é o componente majoritário dos óleos
das cascas de limão e laranja e do óleo essencial de alcarávia (Carum carvi
prevenção da desidratação e inibição de crescimento microbiano suas funções naturais nos
DEMYTTENAERE & DE KIMPE, 2001).
Desde a década de 80, o limoneno é reconhecido como um agente com ações
mioterapêuticas (OLIVEIRA, 2010). O limoneno foi eficiente
durante a iniciação e a produção da carcinogênese em diversos tumores (
2002) e pode estar relacionado à inibição da isoprenilação de proteínas da família G,
incluindo membros da família Ras (HAAG et al., 1992). A partir daí o limoneno foi
considerado um potencial agente anticâncer, mas a dose de 1000 mg/Kg/dia limitou sua
utilidade clínica e seus metabólitos álcool perílico e ácido perílico
, 2001). A figura 2 apresenta a estrutura química do limoneno.
Figura 2 – Estrutura química do limoneno.
2
monoterpeno monocíclico
, como laranja e limão
, 2000). É usado como ingrediente para sabor cítrico em óleos artificiais e
alcóolicas, sorvetes e doces
limoneno é principalmente encontrado numa variedade de plantas e
limoneno é o componente majoritário dos óleos
Carum carvi), sendo a
prevenção da desidratação e inibição de crescimento microbiano suas funções naturais nos
Desde a década de 80, o limoneno é reconhecido como um agente com ações
O limoneno foi eficiente
durante a iniciação e a produção da carcinogênese em diversos tumores (CHOW et al.,
2002) e pode estar relacionado à inibição da isoprenilação de proteínas da família G,
., 1992). A partir daí o limoneno foi
mg/Kg/dia limitou sua
etabólitos álcool perílico e ácido perílico passaram a ser
apresenta a estrutura química do limoneno.
1.2 Derivados Perílicos
O ácido, álcool e o aldeído perílico podem ser obtidos a partir da
limoneno de acordo com a reação indicada na figura
literatura demonstrando a eficácia
mamários, pancreáticos e cerebrais (
2006b e 2007; MATOS et al
na ativação de proteínas apoptóticas e
leucêmicas (CLARK, 200
adenocarcinoma (ELEGBEDE
metástase em células da glia (
células de câncer de pulmão (
2002) e proliferação de células de tumor de mama (
álcool perílico é metabolizado no fígado formando
(YERUVA et al., 2007).
recorrentes já evoluiu para testes clínicos em fase I/II (
Poucos estudos do
do álcool perílico, mas já existem descrições de atividades antitumorais como capacidade
de inibir isoprenilação da proteína
de IL-2 (SCHULZ et al., 1997
de tumor pulmonar (YERUVA
antimicrobiana, podendo ser utilizado como agente de preservação na indústria de
cosméticos (RIEKS et al., 2004
bioconversão do limoneno através da
Figura 3 – Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.
erílicos
e o aldeído perílico podem ser obtidos a partir da
limoneno de acordo com a reação indicada na figura 3. Existem diversos estudos na
eficácia do álcool na atividade regressora de diferentes tumores
mamários, pancreáticos e cerebrais (YURI et al., 2004; DA FONSECA
et al., 2008) na inibição da angiogênese (LOUTRARI
na ativação de proteínas apoptóticas e na capacidade de causar apoptose em células
CLARK, 2006), em tumor pulmonar (YERUVA et al
ELEGBEDE et al., 2003; WISEMAN et al., 2007
glia (BALASSIANO et al., 2002), na inibição da
células de câncer de pulmão (XU et al., 2004), na inibição da migração (
proliferação de células de tumor de mama (YURI et al., 2004
álcool perílico é metabolizado no fígado formando majoritariamente o ácido perílico
). Seu uso terapêutico no tratamento de gliomas malignos
iu para testes clínicos em fase I/II (DA FONSECA et al
Poucos estudos do ácido perílico foram encontrados na literatura comparados
, mas já existem descrições de atividades antitumorais como capacidade
isoprenilação da proteína Ras (HOLSTEIN & HOHL, 2003), de
., 1997), de bloquear o ciclo celular e causar apoptose em células
YERUVA et al., 2007). O ácido perílico apresenta também
antimicrobiana, podendo ser utilizado como agente de preservação na indústria de
., 2004). Uma alternativa para a produção desse ácido é a
bioconversão do limoneno através da levedura Yarrowia lipolytica em ácido perílico
Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.
3
e o aldeído perílico podem ser obtidos a partir da oxidação do
Existem diversos estudos na
atividade regressora de diferentes tumores
DA FONSECA et al., 2006a,
LOUTRARI et al., 2004)
capacidade de causar apoptose em células
et al., 2007) e em
., 2007), na inibição de
ção da proliferação de
migração (WAGNER et al.,
., 2004). Em humanos o
majoritariamente o ácido perílico
Seu uso terapêutico no tratamento de gliomas malignos
et al., 2006b; 2007).
encontrados na literatura comparados aos
, mas já existem descrições de atividades antitumorais como capacidade
de inibir a produção
bloquear o ciclo celular e causar apoptose em células
apresenta também atividade
antimicrobiana, podendo ser utilizado como agente de preservação na indústria de
. Uma alternativa para a produção desse ácido é a
ácido perílico.
Estrutura química do limoneno e de seus derivados perílicos.
4
1.3 Microrganismo
A Y. lipolytica é uma levedura estritamente aeróbia, dimórfica, eucarioto, do reino
Fungi, pertencente à classe dos Ascomicetos, subclasse Hemiascomicetos, anteriormente
conhecida como Candida lipolytica (BARTH & GAILLARDIN, 1997) e apresenta
hidrofobicidade celular (MARTINS, et al., 2009). É amplamente utilizada pelas indústrias
na produção de ácido cítrico e proteínas, sendo classificada como segura (GRAS -
Generally Regarded as Safe) pela FDA (American Food and Drug Administration). A
figura 4 apresenta uma microscopia óptica da Y. lipolytica.
Estudos iniciais de caracterização do sistema enzimático de oxidação do limoneno
por Y. lipolytica indicaram que a levedura é capaz de oxidar ambos os enantiômeros R-(+)-
e S-(-)-limoneno e que a presença de oxigênio molecular é essencial para a bioconversão
desta molécula.
Figura 4 – Microscopia óptica da Y. lipolytica.
Fonte: Próprio autor.
1.4 Bioprocesso
Por bioconversão ou biotransformação
de células íntegras (vegetais ou microbianas)
de um número pequeno de
de alto valor agregado. Nos últimos anos vários pesquisadores tem se dedicado ao estudo
de bioprocessos porque diferentemente dos processos químicos, que requerem
valores de pH, temperaturas e pressões extremo
condições brandas com consequente
catalisadas por enzimas apresentam
menor formação de subprodutos
técnicas, econômicas e ambientais em comparação com a síntese química.
permitiu a introdução de reação catalisada por enzimas gerando compostos opticamente
puros além do desenvolvimento de rotas mais eficientes (
biotransformação pode ser utilizada para a
cosméticos, detergentes, perfumaria,
possível observar a biotransformação industrial em diversos setores sendo o farmacêutico
majoritário.
Figura 5 – Gráfico indicando os s
ou biotransformação subentende-se o uso de enzimas isoladas ou
gras (vegetais ou microbianas) para a conversão, através de uma reação ou
de um número pequeno de reações, de uma molécula precursora (xenobiótico) em
Nos últimos anos vários pesquisadores tem se dedicado ao estudo
de bioprocessos porque diferentemente dos processos químicos, que requerem
raturas e pressões extremos, as conversões microbianas ocorrem sob
com consequente menor consumo energético. Além disso, as reações
apresentam químio-, régio- e enantiosseletividade
ubprodutos. Assim, os processos de bioconversão oferecem vantagens
técnicas, econômicas e ambientais em comparação com a síntese química.
permitiu a introdução de reação catalisada por enzimas gerando compostos opticamente
envolvimento de rotas mais eficientes (LOUGHLIN, 2000
pode ser utilizada para a produção de fármacos ou intermediários quirais,
cosméticos, detergentes, perfumaria, aromas, fragrâncias, dentre outras.
possível observar a biotransformação industrial em diversos setores sendo o farmacêutico
Gráfico indicando os setores industriais que utilizam a biotransformação.Fonte: LIESE, et al., 2006.
5
o uso de enzimas isoladas ou
conversão, através de uma reação ou
reações, de uma molécula precursora (xenobiótico) em produtos
Nos últimos anos vários pesquisadores tem se dedicado ao estudo
de bioprocessos porque diferentemente dos processos químicos, que requerem, em geral,
s, as conversões microbianas ocorrem sob
m disso, as reações
e enantiosseletividade e, portanto,
processos de bioconversão oferecem vantagens
técnicas, econômicas e ambientais em comparação com a síntese química. Essa estratégia
permitiu a introdução de reação catalisada por enzimas gerando compostos opticamente
LOUGHLIN, 2000). A
fármacos ou intermediários quirais,
dentre outras. Na figura 5 é
possível observar a biotransformação industrial em diversos setores sendo o farmacêutico
etores industriais que utilizam a biotransformação.
6
1.5 Justificativa
A oxidação química do limoneno tem sido ensaiada para obtenção dos derivados
perílicos contudo não tem resultado satisfatória por, invariavelmente, gerar uma mistura de
produtos com propriedades físico-químicas semelhantes, o que exige métodos sofisticados
e caros de purificação. Assim, a bioconversão apresenta-se como alternativa interessante
para a obtenção destes compostos.
Este trabalho enfoca a obtenção do ácido perílico, agente anticâncer e antimicrobiano, a
partir do monoterpeno limoneno – subproduto abundante da indústria de cítricos.
Apresenta caráter inovador pautado pelo uso da bioconversão aplicada à obtenção de
compostos de alto valor agregado a partir do aproveitamento de subprodutos da
agroindústria.
7
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Otimizar a produção de ácido perílico a partir da biotransformação do R-(+)-
limoneno catalisada pela levedura Y. lipolytica.
2.2 Objetivo específico
Utilizar planejamento experimental a fim de verificar quais das variáveis
(temperatura, pH, limoneno, massa celular e nutrientes) tem significância 1 na produção
de ácido perílico.
8
3. METODOLOGIA
3.1) Microrganismo
A linhagem da levedura Y. lipolytica ATCC 18942, cedida pelo INCQS/FIOCRUZ,
capaz de oxidar o limoneno com elevados rendimentos foi utilizada nos experimentos a
seguir.
3.2) Obtenção de massa celular e bioconversão
O crescimento da levedura foi feito em meio extrato de malte glicose (YMB) a
28°C, sob agitação de 200rpm por 48h.
Para a bioconversão, a massa celular obtida por centrifugação a 3000 rpm foi
quantificada e ressuspendida em meio contendo tampão fosfato de sódio 50 mM e R-(+)-
limoneno. As misturas reacionais foram incubadas a 200 rpm. Após o período de
bioconversão, as células foram separadas por centrifugação. Os sobrenadantes foram
utilizados para análise de pH, nutrientes consumidos, glicose e produtos de bioconversão.
Composição do Meio de Cultura YMB:
- Extrato de levedura 3,0 g/L;
- Extrato de malte 3,0 g/L;
- Peptona 5,0 g/L;
- Glicose 10,0 g/L.
3.3) Planejamento fatorial fracionado
Realizou-se um planejamento fatorial fracionado 25-1 no planejamento I para
estudar o efeito das seguintes variáveis independentes na etapa de bioconversão: pH,
temperatura, concentração de limoneno, concentração de massa celular e adição de
nutrientes. E um planejamento fatorial fracionado 24-1 no planejamento II para estudar o
efeito das seguintes variáveis independentes na etapa de bioconversão: pH, temperatura,
concentração de limoneno e adição de nutrientes. Foi utilizado o Programa JMP – versão 8
para a montagem do desenho de triagem e análise dos resultados.
9
3.3.1) Planejamento experimental I
Utilizou-se o desenho de triagem de Placket-Burman para determinar os parâmetros
significativos estatisticamente conforme descrito na tabela 1. Neste experimento foi testado
a influência de cinco variáveis (massa celular, temperatura, pH, limoneno e adição de
nutrientes) na produção de ácido perílico através do planejamento fatorial fracionado 25-1.
Neste caso, o limoneno foi adicionado uma única vez, ao início da bioconversão;
todos os experimentos foram conduzidos por 48 h, tendo-se retirado alíquotas com 24 h e
48 h para as determinações analíticas.
Tabela 1- Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros
significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 25-1).
* Solução de nutrientes: extrato de levedura 3 g/L; extrato de malte 3 g/L; peptona 5 g/L;
glicose 10 g/L.
10
3.3.2) Planejamento Experimental II
Utilizou-se o desenho de triagem de Placket-Burman para determinar os parâmetros
significativos estatisticamente conforme descrito na tabela 2. Neste experimento foi testado
a influência de quatro variáveis (temperatura, pH, limoneno e adição de nutrientes) na
produção de ácido perílico através do planejamento fatorial fracionado 24-1.
Durante a bioconversão foi utilizado 20g/L de massa celular em todos os ensaios,
com agitação de 200 rpm; e variando as demais condições de acordo com o desenho de
triagem de Placket-Burman descrito na tabela 2. O limoneno foi adicionado uma única
vez, ao início da bioconversão, todos os experimentos foram conduzidos por 48 h a 25°C,
tendo-se retirado alíquotas com 24 h e 48 h para as determinações analíticas.
Tabela 2 - Desenho de triagem de Placket-Burman utilizado para determinar os parâmetros
significativos estatisticamente (planejamento fatorial fracionado 24-1).
* Solução de nutrientes: extrato de levedura 3 g/L; extrato de malte 3 g/L; peptona 5 g/L; glicose 10 g/L.
11
3.4) Metodologia Analítica
3.4.1) Quantificação da massa celular, dosagem de glicose e determinação do pH
A concentração de glicose foi determinada nos sobrenadantes da bioconversão
através do analisador bioquímico YSI 2700 Select. O pH das amostras foi avaliado
utilizando-se o equipamento da Beckman modelo ф 390. A concentração de massa celular
foi avaliada através de medidas de densidade ótica a 600 nm. Uma unidade de absorbância
corresponde a 0,444 g de células (peso seco) /L.
3.4.2) Análise por cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de
chama (CG/DIC)
As amostras de bioconversão foram encaminhadas à Plataforma Analítica de
Farmanguinhos/FIOCRUZ para a realização das análises por cromatografia gasosa.
Uma alíquota (1 mL) da amostra foi transferida para um tubo de centrífuga e 50 µL
de HCl 0,6 M foram adicionados para induzir a precipitação. Após centrifugação a 10.000
rpm por 10 min, o precipitado foi dissolvido em 2 ml de acetato de etila.
As análises foram feitas no equipamento HP modelo 6890N Network nas seguintes
condições:
• Injetor: temperatura: 270ºC, split: 1/15, fluxo: 2 mL/min, Gás de arraste: He;
• Forno: temperatura inicial: 50ºC, tempo inicial: 2 min, rampa de aquecimento:
10ºC/min, temperatura final: 250ºC, mantida por 8 min;
• Coluna: fabricante: HP-INNOwax, fase estacionária: polietilenoglicol da Agilent,
comprimento: 30metros, diâmetro interno de 250 µm, espessura de filme: 0,25 µm;
• Detector: ionização em chama, temperatura: 270ºC.
12
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1) Planejamento experimental I
4.1.1) Etapa de crescimento celular
Após 48h de crescimento da levedura foi realizado a quantificação da massa celular
do cultivo, que foi igual a 55,2 g/L.
4.1.2) Etapa de bioconversão
A tabela 3 apresenta os valores de pH e glicose referentes às amostras de
bioconversão. Foram observadas variações pequenas de pH em 24h e 48h com relação ao
pH inicial em todos os experimentos. Pode-se observar que em 24 horas de bioconversão a
concentração de glicose diminuiu em relação ao valor inicial, ou seja, a levedura Y.
lipolytica consumiu parte da glicose presente no meio. Isso também aconteceu nos
experimentos de tempo de 48horas de reação em relação aos de 24horas.
Tabela 3 - Valores de pH e glicose correspondente a cada amostra em t=0, t=24 e t=48h do
planejamento experimental I.
4.1.3) Análise de terpenosde Chama (CG/DIC)
Nos ensaios de 1 a 8 a concentração de ácido perílico ficou abaixo do limite de
detecção (200mg/L). Em todos os ensaios, a concentração de
48h de bioconversão e, conforme as condições experimentais, variou entre valores menores
do que 200 mg/L até 1216,8 mg/L
temperatura de 20°C, pH 7,2, concentração inicial de limoneno de 0,5% v/v, concentração
de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v, é cerca de 89% maior do
obtido nas condições do ponto central (644,4 mg/L).
Figura 6– Gráfico da concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limonenoanálises de CG/DIC
de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização
Nos ensaios de 1 a 8 a concentração de ácido perílico ficou abaixo do limite de
detecção (200mg/L). Em todos os ensaios, a concentração de ácido perílico
48h de bioconversão e, conforme as condições experimentais, variou entre valores menores
do que 200 mg/L até 1216,8 mg/L de acordo com a figura 6. Este maior valor, obtido na
temperatura de 20°C, pH 7,2, concentração inicial de limoneno de 0,5% v/v, concentração
de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v, é cerca de 89% maior do
obtido nas condições do ponto central (644,4 mg/L).
oncentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limonenoanálises de CG/DIC (delineamento fatorial fracionado 2
5-1).
13
por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização
Nos ensaios de 1 a 8 a concentração de ácido perílico ficou abaixo do limite de
ácido perílico foi maior com
48h de bioconversão e, conforme as condições experimentais, variou entre valores menores
. Este maior valor, obtido na
temperatura de 20°C, pH 7,2, concentração inicial de limoneno de 0,5% v/v, concentração
de células de 20 g/L e solução de nutrientes de 10% v/v, é cerca de 89% maior do que o
oncentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno de acordo com
14
4.1.4) Análise estatística
A análise estatística indicou que a concentração de massa celular foi a variável que
apresentou o maior efeito sobre os rendimentos em ácido perílico, muito superior, nas
faixas estudadas, aos outros parâmetros avaliados, o que pode ter mascarado o efeito
desses últimos. É possível verificar os valores de significância de p através das figuras 7 e
8.
Figura 7 – Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 24h.
15
Figura 8 – Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 48h.
4.2) Planejamento experimental II
4.2.1) Etapa de crescimento celular
Após 48h de crescimento da levedura foi realizado a quantificação da massa celular
do cultivo, que foi igual a 70,20 g/L.
4.2.2) Etapa de bioconversão
A tabela 4 apresenta os valores de pH referentes às amostras de bioconversão.
Foram observadas variações pequenas de pH em 24h e 48h com relação ao pH inicial, com
tendência ao aumento desse valor, em alguns experimentos. Com relação à quantificação
da glicose, apresentada na mesma tabela, pode-se observar que a concentração de glicose
diminuiu em relação ao valor inicial, indicando o consumo desta fonte de carbono pela
levedura.
16
Tabela 4. Valores de pH e glicose nas amostras iniciais e após 24 e 48 horas de
bioconversão do limoneno do planejamento experimental II.
Ensaio pH Glicose (g/L)
inicial 24 h 48 h Inicial 24 h 48 h 1 6,2 6,4 6,7 0,0 0,0 0,0 1' 6,2 6,6 7,0 0,0 0,0 0,0 2 6,2 6,3 6,4 1,0 0,1 0,0 2' 6,2 6,8 6,7 1,0 0,1 0,0 3 7,2 7,6 7,8 1,0 0,0 0,0 3' 7,2 7,6 7,7 1,0 0,0 0,0 4 7,2 7,6 7,1 0,0 0,0 0,0 4' 7,2 7,0 7,5 0,0 0,0 0,0 5 6,2 7,2 7,4 1,0 0,0 0,0 5' 6,2 6,8 7,3 1,0 0,0 0,0 6 6,2 6,9 7,0 0,0 0,0 0,0 6' 6,2 6,1 6,7 0,0 0,0 0,0 7 7,2 7,4 8,0 0,0 0,0 0,0 7' 7,2 8,1 7,9 0,0 0,0 0,0 8 7,2 7,3 7,9 1,0 0,0 0,0 8' 7,2 6,9 7,6 1,0 0,0 0,0 9 6,7 6,4 6,9 0,5 0,0 0,0 10 6,7 7,4 6,3 0,5 0,0 0,0 11 6,7 7,2 6,5 0,5 0,0 0,0
4.2.3) Análise de terpenos por Cromatografia Gasosa com Detector de Ionização
de Chama (CG/DIC)
Os resultados de produção de ácido perílico são apresentados na tabela 5 e figura 9.
O ensaio 4 apresentou maior produção de ácido perílico seguido pela amostra 8. . Os
ensaios 1, 3 e 5 apresentaram concentração de ácido perílico abaixo de 200mg/L e por isso
não foram inseridos no gráfico da figura 9.
O ensaio que apresentou maior produção de ácido perílico (1104,4mg/L) foi
realizado na temperatura 20°C, pH 7,2, concentração de limoneno de 0,5% v/v e 48 h. Este
valor foi cerca de 162% maior do que o obtido nas condições do ponto central (409,25
mg/L).
17
Tabela 5. Concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno (delineamento fatorial fracionado 24-1).
Ensaio Condições do ensaio Ácido Perílico (mg/L)
Temperatura pH Limoneno
(% v/v)
Nutrientes
(% v/v) 24 h 48 h
1 - - - - <200 <200
2 - - + + 560,73 757,78
3 - + - + <200 <200
4 - + + - 639,76 1104,41
5 + - - + <200 <200
6 + - + - 599,58 816,79
7 + + - - 320,07 276,62
8 + + + + 818,73 885,36
9 0 0 0 0 393,27 408,64
10 0 0 0 0 410,16 436,47
11 0 0 0 0 405,87 382,65
18
Figura 9 – Gráfico da Concentração de ácido perílico após 24 e 48 horas de bioconversão do limoneno de acordo com análises de CG/DIC (delineamento fatorial fracionado 2
4-1).
4.2.4) Análise estatística
Os resultados da análise estatística (figuras 10 e 11) mostram que os parâmetros
relevantes são a concentração de limoneno (maior influência) e o pH. A temperatura
apresentou pequena relevância com 24 horas de bioconversão, porem não foi relevante no
tempo de 48 h. A concentração de nutrientes não influiu nos resultados, indicando que a
bioconversão pode ser realizada sem a adição de nutrientes.
Como próxima etapa, deverá ser realizado um delineamento composto central
rotacional -DCCR, para verificar a influência das duas variáveis independentes,
concentração de limoneno e pH, nos rendimentos da bioconversão. A temperatura de
bioconversão será mantida em 25°C, tendo em vista a pequena relevância deste parâmetro
e a economia energética.
0
200
400
600
800
1000
1200
2 4 6 7 8 9 10 11
Áci
do
Pe
rílic
o (
mg/
L)
Ensaios
24 h
48 h
19
Figura 10 – Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 24h.
Figura 11 – Gráfico de Pareto indicando os valores de significância de p para as variáveis testadas em 48h.
20
5. CONCLUSÃO
Os resultados da análise estatística para o planejamento fatorial fracionado 25-1
(massa celular, pH, temperatura, concentração de limoneno e adição de nutrientes)
mostraram que a massa celular foi o parâmetro que apresentou o maior efeito sobre os
rendimentos em ácido perílico, muito superior, nas faixas estudadas, aos demais
parâmetros avaliados, o que pode ter mascarado o efeito desses últimos. Ou seja, pode-se
dizer que esta variável influencia diretamente a produção do ácido perílico a partir da
bioconversão de acordo com os níveis testados.
Os resultados da análise estatística para o planejamento fatorial fracionado 24-1
(variáveis: pH, temperatura, concentração de limoneno e adição de nutrientes; massa
celular fixa em 20 g/L) mostraram que os parâmetros relevantes são a concentração de
limoneno (maior influência) e o pH. A temperatura apresentou pequena relevância com 24
horas de bioconversão, porem não foi relevante no tempo de 48 h. A concentração de
nutrientes não influiu nos resultados, indicando que a bioconversão pode ser realizada sem
a adição de nutrientes.
Para verificar a influência das duas variáveis independentes, concentração de
limoneno e pH, nos rendimentos da bioconversão, deverá ser conduzido um delineamento
composto central rotacional -DCCR. A temperatura de bioconversão deverá ser mantida
em 25°C, tendo em vista a pequena relevância deste parâmetro e a economia energética.
Os resultados obtidos no experimento de bioconversão microbiana do limoneno
encorajam o prosseguimento desta pesquisa no sentido de estabelecer uma rota
biotecnológica para a obtenção desta importante molécula do ponto de vista farmacêutico,
tendo como agente de bioconversão um microrganismo seguro e de fácil cultivo. Ressalta-
se que o produto reacional é estável e majoritário.
21
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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