Βαλαβάνη Παρασκευή, 2014

«Προβιοτικές ιδιότητες του Lactobacillus kefiri απομονωμένου από κόκκους κεφίρ και δημιουργία

αντιμικροβιακών συμβιωτικών»

ΑΛΕΞΑΝΔΡΕΙΟ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ

ΣΧΟΛΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ & ΔΙΑΤΡΟΦΗΣ

ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

A.ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

• Το κεφίρ

• Οι κεφιρόκοκκοι

• Προβιοτικά

• Πρεβιοτικά

• Συμβιωτικά

• E.coli

• L.monocytogenes

B.ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

• Αντοχή του λακτοβακίλλου σε όξινο περιβάλλον

• Αντοχή του λακτοβακίλλου σε χολικά άλατα

• Προσδιορισμός του ρυθμού ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών σε πέντε εμπορικά διαθέσιμους υδατάνθρακες

• Αντιμικροβιακή δραστηριότητα των συμβιωτικών στα δύο παθογόνα

Το κεφίρΠαραδοσιακό γαλακτοκομικό ρόφημα που προκύπτει από την δράση :• Οξυγαλακτικών και οξικών βακτηριών • Ζυμών

Το συγκεκριμένο μίγμα μικροοργανισμών προσφέρει στο ζυμούμενο ρόφημα μοναδικές ιδιότητες, αφού διαφέρει από άλλα ζυμούμενα γαλακτοκομικά προϊόντα που μεταβολίζονται από ένα ή από μερικά μόνο είδη μικροοργανισμών

Οι κεφιρόκοκκοι

• Οι κεφιρόκοκκοι είναι μια μάζα που αποτελείται από βακτήρια και ζύμες ενσωματωμένα σε ένα σύνθετο πλέγμα πρωτεϊνών και πολυσακχαριτών.

• Από τους σημαντικότερους πολυσακχαρίτες είναι η κεφιράνη η οποία εκτιμάται ότι έχει αντιμικροβιακές, αντιμυκητιακές και αντικαρκινικές ιδιότητες

Βακτήρια και ζύμες που έχουν απομονωθεί σε κόκκους κεφίρ:

Lactobaccilus kefiranofaciens Lactobaccilus kefiri

Lactobaccilus parakefir Saccharomyces cerevisiae

.

Προβιοτικά• FAO/WHO : Ζωντανοί μικροοργανισμοί που όταν χορηγηθούν σε

επαρκή ποσότητα, προσφέρουν ωφέλιμες ιδιότητες στον καταναλωτή

Κριτήρια Επιλογής Προβιοτικών Ανθρώπινης προέλευσης Ταυτοποίηση και ταξινόμηση (γένος, είδος, στέλεχος) Γενετικώς σταθερά, μαζική παραγωγή, διατήρηση βιωσιμότητας Ασφάλεια (GRAS/ Generally Recognized As Safe) Αντοχή στα γαστρικά οξέα και στα χολικά άλατα Ανταγωνιστικότητα της υπάρχουσας μικροχλωρίδας του πεπτικού

συστήματος

Πρεβιοτικά• Μη αφομοιώσιμα συστατικά τροφίμων που επηρεάζουν ευεργετικά

τον ξενιστή διεγείροντας επιλεκτικά την ανάπτυξη ή/και την δραστικότητα ενός περιορισμένου αριθμού βακτηρίων στο παχύ έντερο

Κριτήρια Επιλογής Πρεβιοτικών Να μην υδρολύονται και να μη απορροφόνται στο ανώτερο

σύστημα του πεπτικού συστήματος Να ζυμώνονται επιλεκτικά από ένα ή περιορισμένο αριθμό

βακτηρίων του παχέος εντέρου Να τροποποιούν την εντερική μικροχλωρίδα προς μια πιο υγιή

σύνθεση Να δρουν ευνοϊκά στην υγεία του ξενιστή

ΦΥΣΙΚΕΣ ΠΗΓΕΣ ΠΡΕΒΙΟΤΙΚΩΝ

Ραδίκια Πράσα Σκόρδο Κρεμμύδια Τομάτες Αγκινάρες Μπανάνες Μούρα

Εμπορικά διαθέσιμοι σε υγρή μορφή ή σε σκόνη

Φρουκτοολιγοσακχαρίτες (FOS) Γαλακτοολιγοσακχαρίτες (GOS) Λακτουλόζη Ξυλοολιγοσακχαρίτες (XOS) Ισομαλτοολιγοσακχαρίτες (IMO)

Συμβιωτικά• Τα συμβιωτικά ορίζονται ως μίγματα προβιοτικών και

πρεβιοτικών, τα οποία συνδυάζουν τις ωφέλιμες ιδιότητες των προβιοτικών μικροοργανισμών και των πρεβιοτικών ευνοώντας την ανάπτυξη και την ευημερία των ζωντανών οργανισμών του γαστρεντερικού σωλήνα

E. coli Ο πιο διαδεδομένος μολυσματικός μικροοργανισμός που ανήκει στην ευρύτερη τάξη των Gram αρνητικών εντεροβακτηριδίων

• Ραβδία

• Καταλάση θετικό

• Οξειδάση αρνητικό

Ανάπτυξη:

• pH 4,5-9

• Βέλτιστη θερμοκρασία 35-39°C

Μετάδοση του μικροοργανισμού

L. monocytogenes

• Gram (+)

• Καταλάση θετικό

• Οξειδάση αρνητικό

• Ραβδία με μορφή μεμονωμένων κυττάρων ή

αλυσίδων μικρού μήκους

Ανάπτυξη:

• pH 5-10

• Βέλτιστη θερμοκρασία 30-37°C

Το βακτηρίδιο Listeria monocytogenes είναι διαδεδομένο στη φύση και αποικίζει το χώμα, τα φυτά και το έντερο των θηλαστικών

Λιστερίωση: Σοβαρή νόσος που προκαλείται από την κατανάλωση μολυσμένων τροφίμων από την L. monocytogenes

Άτομα υψηλού κινδύνου• Ηλικιωμένοι

• Άτομα με χαμηλό ανοσοποιητικό σύστημα

• Εγκυμονούσες, έμβρυα και νεογνά

Τρόφιμα υψηλού κινδύνου• Γαλακτοκομικά προϊόντα

• Κρέας και θαλασσινά

• Ωμά λαχανικά

Σημαντικότερος παράγοντας τοξικότητας: η λιστεριολυσίνη Ο (listeriolysin O/ LLO ). Η LLO είναι μια β-αιμολυσίνη μοριακού βάρους 58 kDa που επιτρέπει στο βακτήριο να επιζήσει στα φαγοκύτταρα αποδομώντας την διπλή λιπώδη μεμβράνη τους, και επιτρέποντας έτσι την ανάπτυξη του βακτηρίου ενδοκυτταρικά.

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ

1.Αντοχή του λακτοβακίλλου σε όξινο περιβάλλον

4.Αντιμικροβιακή δραστηριότητα των συμβιωτικών στα δύο παθογόνα

3.Προσδιορισμός του ρυθμού ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών σε πέντε εμπορικά διαθέσιμους υδατάνθρακες

2.Αντοχή του λακτοβακίλλου σε χολικά άλατα

Υλικά και μέθοδοι

Αποικίες Lb.kefiri B6 σε MRS άγαρ έπειτα από επώαση στους 37°C

για 48h

Μία αποικία σε ζωμό MRS

Επώαση στους 37°C

για 48h

1ml

Πλύση με φυγοκέντριση

με διάλυμα Ringer’s

Καθαρά κύτταρα διαλυμένα σε

Ringer’s με τελική συγκέντρωση 109

cfu/ml

9ml διάλυμα γλυκίνης-υδροχλωρικού οξέος

προσαρμοσμένο σε pH 3 και 2.2

Επώαση για 2h στους 37°C

Δείγματα 1ml λαμβάνονταν σε συγκεκριμένα χρονικά σημεία και αραιώθηκαν δεκαδικά σε

διάλυμα Ringer’s.

100μl

Υλικά και μέθοδοι

Μια αποικία από κάθε βακτηριακό στέλεχος χρησιμοποιήθηκε για τον ενοφθαλμισμό 9ml αποστειρωμένου PY ζωμού καθώς και 1ml από διάλυμα 10% (w/v) αποστειρωμένου υδατάνθρακα.

1 αποικία

1ml υδατάνθρακα

Επώαση στους 37°C

για 24h

200μl

18ml PY ζωμός με 2ml διαλύματος

υδατάνθρακα

1ml

660nm

Υλικά και μέθοδοιΜικτή

καλλιέργεια Μάρτυρας 90ml PY broth 10ml 10%

υδατάνθρακα 100μl Lb.kefiri 100μl L.

monocytogenes

90ml PY broth 10ml 10%

υδατάνθρακα 100μl Lb.kefiri 100μl E. coli

90ml PY broth 10ml 10%

υδατάνθρακα 100μl L.

monocytogenes

90ml PY broth 10ml 10%

υδατάνθρακα 100μl E. coli

Επώαση στους 37°C

για 24h

1ml δεκαδικές αραιώσεις σε Ringer’s 100μl επίστρωση εκλεκτικά υποστρώματα

Αποτελέσματα

0 20 40 60 80 100 1200,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

pH3pH2

Χρόνος έκθεσης (min)

L.ke

firi (

log

cfu/

ml)

Σχήμα 1. Διακύμανση του πληθυσμού του Lb. kefiri Β6 κατά την παραμονή του σε pH 2 και pH 3.

Σχήμα 2. Διακύμανση του πληθυσμού του Lb. kefiri Β6 κατά την παραμονή του σε PBS με 0,4% (w/v) συγκέντρωση χολικών αλάτων και σε PBS χωρίς χολικά άλατα (μάρτυρα) σε σχέση με τον χρόνο έκθεσης.

0 1 2 3 4 5 60,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

OxgallPBS

Χρόνος έκθεσης (h)

L. k

efiri

(log

cfu/

ml)

0 2 3 4 5 6 8 240

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Lb. kefiri B6

Synergy GOS Lactulose P95 Glucose

0 2 3 4 5 6 8 240

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Escherichia coli

Synergy GOS Lactulose P95 Glucose

0 2 3 4 5 6 8 240

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

Listeria monocytogenes

Synergy GOS Lactulose P95 Glucose

Σχήμα 3. Ανάπτυξη της L. monocytogenes σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v)

πρεβιοτικού Synergy 1 σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲ με

τον Lb. kefiri Β6 ♦. Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Σχήμα 4. Ανάπτυξη της L. monocytogenes σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v)

πρεβιοτικού GOS σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲ με τον

Lb. kefiri Β6 ♦. Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Σχήμα 5.Ανάπτυξη της L. monocytogenes σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v)

πρεβιοτικού Lactulose σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲ με

τον Lb. kefiri Β6 ♦. Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Σχήμα 6. Ανάπτυξη της L. monocytogenes σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v)

πρεβιοτικού Raftilose P95 σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲

με τον Lb. kefiri Β6 ♦. Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Σχήμα 7. Ανάπτυξη της E.coli σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v) πρεβιοτικού

Synergy 1 σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲ με τον Lb. kefiri

Β6 ♦. Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Σχήμα 8. Ανάπτυξη της E. coli σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v) πρεβιοτικού

GOS σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲ με τον Lb. kefiri Β6 ♦.

Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Σχήμα 9. Ανάπτυξη της E. coli σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v) πρεβιοτικού

Lactulose σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲ με τον Lb. kefiri

Β6 ♦. Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Σχήμα 10. Ανάπτυξη της E. coli σε PY ζωμό με προσθήκη 1% (w/v) πρεβιοτικού

Raftilose P95 σε καθαρή καλλιέργεια ■ και σε μικτή καλλιέργεια ▲ με τον Lb.

kefiri Β6 ♦. Η τιμή του pH συμβολίζεται με διακεκομμένες γραμμές.

Συμπεράσματα• Ο Lactobacillus kefiri B6 έδειξε αντοχή σε όξινο περιβάλλον αλλά δε θα μπορούσε να

χαρακτηριστεί ως οξεάντοχος

• Ήταν ανθεκτικός σε συγκέντρωση χολικών αλάτων 0,4%(w/v) Oxgall (~5,6mM συζευγμένα χολικά οξέα). Ποσότητα μεγαλύτερη από αυτήν που υπάρχει στο λεπτό έντερο (2,8-4,0 mM)

• Ο ρυθμός ανάπτυξης των βακτηρίων δεν επηρεάστηκε σημαντικά από την αντικατάσταση της γλυκόζης με τα πρεβιοτικά στο ζωμό της καλλιέργειας.

• Ο Lb. kefiri B6 μεταβόλισε/διέσπασε μέρος από τους υπό εξέταση υδατάνθρακες

• Παρατηρήθηκε σημαντική αντιμικροβιακή δράση από τον Lb. kefiri B6 κατά της L. monocytogenes όταν το GOS προστέθηκε στην καλλιέργεια ενώ δεν παρατηρήθηκε το ίδιο αποτέλεσμα με τη λακτουλόζη ή τους φρουκτοολιγοσακχαρίτες.

Είναι σχετικά απίθανο η μείωση του πληθυσμού της L. monocytogenes να οφείλεται μόνο στη μείωση του pH και στην αντίστοιχη παραγωγή οργανικών οξέων. Παρόμοια επίδραση δεν παρατηρήθηκε στην λακτουλόζη αν και το προφίλ οξίνισης ήταν παρόμοιο (μπορεί να διαφέρει η σύνθεση των οξέων)

Άλλοι πιθανοί αντιμικροβιακοί παράγοντες

Κεφιράνη: Πολυσακχαρίτης που αποτελείται από γαλακτόζη και γλυκόζη. Έχει αντιμικροβιακές ιδιότητες τόσο στα Gram θετικά όσο και στα Gram αρνητικά βακτήρια διαταράσσοντας την ακεραιότητα της κυτταρικής μεμβράνης.

Βακτηριοσίνες : Ο Lb. kefiri B6 δεν έχει αναφερθεί να παράγει βακτηριοσίνες.

Με λίγα λόγια…

Ο Lb. kefiri B6 έχει δυνατότητες ως προβιοτικό καθώς είναι ανθεκτικός στα χολικά άλατα και εμφανίζει αντιπαθογόνο δράση (σε συγκεκριμένα υποστρώματα)

Είναι λιγότερο ανθεκτικό σε όξινο περιβάλλον αλλά αυτό μπορεί να ενισχυθεί με τεχνολογίες ενθυλάκωσης ή μέσω του κατάλληλου τροφίμου.

Το στέλεχος αναπτύχθηκε καλά σε μια σειρά από πρεβιοτικά που βοηθάει στην δημιουργία συμβιωτικών συνδυασμών.

ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΡΟΣΟΧΗ ΣΑΣ