Pro€gradu - University of Helsinki...3 Alkusanat Pro€ gradu€ työni€ oli€ osa€...
Transcript of Pro€gradu - University of Helsinki...3 Alkusanat Pro€ gradu€ työni€ oli€ osa€...
Viljely ja DNApohjaiset menetelmät polttoöljyllä
saastuneen maan ritsoremediaatioprosessin
tutkimisessa
Pro gradu
Kaisa LappiHuhtikuu
2007
Helsingin YliopistoSoveltavan kemian ja mikrobiologian laitos
Mikrobiologian osasto
3
AlkusanatPro gradu työni oli osa Helsingin Yliopiston Soveltavan kemian ja mikrobiologian
laitoksella vuonna 2005 toteutettua tutkimusta, jossa seurattiin polttoöljyn
hajoamisprosessia rehuvuohenherneen (Galega orientalis) juuristossa. Vuoden 2005
keväällä perustettiin Viikin kasvihuoneille koe, jossa prosessia seurattiin 21viikon ajan
sekä mikrobiologisin että kemiallisin menetelmin.
Tutkimuksen suunnitteluun ja toteutukseen osallistuivat ohjaajina Leena Suominen ja
Kaisa Wallenius sekä pro gradu työntekijöinä itseni lisäksi Elina Kondo ja Anu Mikkonen.
Omassa pro gradu työssäni arvioin erilaisten mikrobiologisten menetelmien soveltuvuutta
öljynhajotusprosessin seurantaan. Elina Kondo vastasi projektin kemiallisista analyyseistä
ja seurasi pro gradu työssään muun muassa öljyhiilivetyjen kokonaismäärien muutoksia
kokeen kuluessa sekä suoritti käytetyn koemaan maaanalyysit (Kondo 2006). Anu
Mikkonen seurasi pro gradu työssään hajoamisprosessin aikana tapahtuvia
mikrobiekologisia muutoksia (Mikkonen 2007).
Haluan kiittää kaikkia tähän projektiin osallistuneita tuesta, jota olen saanut gradutyöni eri
vaiheissa. Erityisesti haluan välittää kiitokseni ohjaajalleni Kaisa Walleniukselle, joka on
ollut korvaamaton tuki kaikissa gradutyöni vaiheissa. Anu Mikkosta ja Elina Kondoa halua
kiittää kaikesta siitä vertaistuesta, jota he ovat tarjonneet koko gradutyöni ajan. Dosentti
Kristina Lindströmiä haluan kiittää mahdollisuudesta työskennellä hänen
tutkimusryhmässään sekä hänen tarjoamistaan mahdollisuuksista osallistua useisiin alan
kansainvälisiin tapaamisiin. Leena Suomista haluan kiittää ohjauksesta ja arvokkaista
kommenteista gradun kirjoitusvaiheessa. Haluan lisäksi kiittää Ekokemin stipendirahastoa
sekä Neste Oy:n tutkimussäätiötä, joiden rahoitus mahdollisti tämän tutkimusprojektin
toteuttamisen.
4
SisällysluetteloAlkusanat...................................................................................................... 3Kuvaluettelo ................................................................................................. 6Taulukkoluettelo .......................................................................................... 8Johdanto..................................................................................................... 10Kirjallisuuskatsaus .................................................................................... 121. Biologinen öljynhajotus ........................................................................ 12
1.1 Öljyn muodostuminen ja rakenne ...................................................................................13
1.2 Aerobinen öljynhajotus....................................................................................................141.2.1 Alifaattisten öljyhiilivetyjen aerobinen hajotus..........................................................................151.2.2 Aromaattisten hiilivetyjen aerobinen hajotus.............................................................................17
1.3 Anaerobinen öljynhajotus................................................................................................201.3.1 Aromaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus .........................................................................201.3.2 Alifaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus............................................................................22
2. Öljyllä saastuneiden maiden puhdistus .............................................. 232.1 Bioremediaatio .................................................................................................................23
2.1.1 Luontainen bioremediaatio .......................................................................................................242.1.2 Biostimulaatio..........................................................................................................................252.1.3 Bioaugmentaatio ......................................................................................................................252.1.4 Ex situ menetelmät ..................................................................................................................26
2.2 Fytoremediaatio ...............................................................................................................272.2.1 Ritsoremediaatio ......................................................................................................................28
3. Bioremediaation tutkimusmenetelmät öljyllä saastuneilla maaalueilla......................................................................................................... 30
3.1 Viljelyyn perustuvat menetelmät.....................................................................................333.1.1 MPN........................................................................................................................................33
3.2 DNApohjaiset menetelmät..............................................................................................373.2.1 DNA:n eristys maanäytteistä.....................................................................................................403.2.2 DNA:n pitoisuuden mittaus ......................................................................................................413.2.3 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR .........................................................................................43
Kokeellinen osuus ..................................................................................... 464. Tutkimuksen tavoitteet.......................................................................... 465. Materiaalit ja menetelmät ...................................................................... 47
5.1 Kasvihuonekoe .................................................................................................................475.1.1 Koeasetelma.............................................................................................................................475.1.2 Kasvihuonekokeen hoito...........................................................................................................515.1.3 Näytteenotto.............................................................................................................................54
5.2 MPNmenetelmä polttoöljynhajottajille..........................................................................545.2.1 MPNlevyjen valmistus ja inkubointi ........................................................................................555.2.2 MPNlukumäärän määritys .......................................................................................................565.2.3 MPNkasvatusten toteutus ........................................................................................................57
5.3 DNA:n eristys maanäytteistä ...........................................................................................59
5
5.4 DNA:n pitoisuuden määritys ...........................................................................................605.4.1 NanoDrop® ND1000 UVVis spektrofotometrimittaus.............................................................605.4.2 PicoGreen®mittaus..................................................................................................................61
5.5 NahAcgeenin monistaminen QRTmPCR:llä...............................................................625.5.1 PCRalukkeet ...........................................................................................................................625.5.2 Standardin valmistaminen PCRtuotteesta.................................................................................625.5.3 Näytelevyjen valmistus ja ajo ABI 7300laitteella .....................................................................645.5.4 Standardiplasmidin valmistus ...................................................................................................65
5.6 Kasvihuonekokeesta saatu muu aineisto .........................................................................68
6. Tulokset .................................................................................................. 726.1 Menetelmien testauksen ja optimoinnin tulokset ............................................................72
6.1.1 MPNmenetelmän optimointitulokset........................................................................................726.1.2 NanoDrop® ja PicoGreen® menetelmien arviointi ...................................................................796.1.3 NahAcgeenin monistuminen kasvihuonekokeen näytteistä .......................................................816.1.4 NahAcfragmentin siirtyminen plasmidiin .................................................................................84
6.2 Ritsoremediaatioprosessin seuranta................................................................................876.2.1 Kasvien kasvu ..........................................................................................................................876.2.2 Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärien vaihtelu kokeen aikana ..............................................906.2.3 DNApitoisuuden vaihtelu kasvihuonekokeen aikana ................................................................91
7. Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset ................................................. 937.1 Kasvihuonekokeen ritsoremediaatioprosessin tarkastelu eri menetelmillä ...................93
7.1.1 Kasvien kasvu ..........................................................................................................................937.1.2 Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärien vaihtelu.....................................................................947.1.3 Bakteeribiomassan muutokset DNA:n pitoisuuden perusteella...................................................967.1.4 NahAcgeenin monistuminen ....................................................................................................98
7.2 Käytettyjen menetelmien arviointi ..................................................................................987.2.1 MPNmenetelmä ......................................................................................................................987.2.2 DNApitoisuuden mittaus NanoDrop®:illa ..............................................................................1007.2.3 PicoGreen®mittaus................................................................................................................1007.2.4 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR .......................................................................................101
8. Loppupäätelmät ................................................................................... 1039. Lähdeluettelo ....................................................................................... 104Liitteet ....................................................................................................... 112
6
Kuvaluettelo1. Pseudomonas putida Gpo1kannan OCTplasmidin koodaama alkaanienhajotusreitti. s. 16
2. Prokaryoottien ja eukaryoottien aromaattisten hiilivetyjen aerobisenhajotuksen reittejä. s. 18
3. Pseudomonas stutzeri AN10kannan kromosomaalisesti koodattu ylempinaftaleenin hajotusreitti. s. 19
4. Aromaattisten öljyhiilivetyjen anaerobisia hajoamisreittejä. s. 21
5. Tetratsoliumsuolojen rakenne ja elektronien siirtyminen dehydrogenaasiltatetratsoliumsuoloille. s. 35
6. Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n standardisuoran fluoresessinmuutokset PCR:n aikana. s. 45
7. Näyteruukkujen kosteuden säätäminen vaa´an avulla. s. 52
8. Kokeen kolmen eri kerranteen sijainnit kasvihuoneessa. s. 53
9. Koeviikon 12 näytteenottoruukut. s. 54
10. MPNlevyjen inkuboinnin aikana käytetyt rasiat. s. 56
11. NanoDrop® ND1000 UVVis –spektrofotometri. s. 60
12. Näyte NanoDrop® ND1000 UVVis –spektrofotometrissä. s. 61
13. Polttoöljyn pitoisuuden (mg/kg) muutokset kasvillisessa (ÖKR), kasvittomassa(Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa 21viikoisen kasvihuonekokeen aikana. s. 69
14. Kasvibiomassan tuotto puhtaassa (PKR) ja polttoöljyllä saastutetussa(ÖKR) maassa. s. 70
15. Koemaan typpipitoisuus (% maan kuivapainosta) kasvillisessa (ÖKR),kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa viikolta 6 viikolle 21. s. 71
16. INTsoluhengitysindikaattorin avulla saatujen positiivisten kaivojenlukumäärät näytteenottoviikon 0 MPNnäyte ja kontrollilevyillä. s. 73
17. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 MPNnäyte jakontrollilevyillä 1, 2 ja 3 vuorokautta WST1 lisäyksen jälkeen. s. 73
18. Näytelevy kahden vuorokauden jälkeen WST1 ja INTreagenssienlisäämisestä (vasemmalla) ja sama levy viikon päästä WST1 ja INTreagenssien lisäämisestä (oikealla). s. 74
7
19. MPNtulokset näytteenottoviikoilta 0 ja 3. s. 76
20. MPNtulokset näytteenottoviikoilta 6 ja 8. s. 77
21. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 8 kasvillisen öljykäsittelyn(ÖKR) MPNnäytelevyllä ja negatiivisella kontrollilevyllä. s. 78
22. MPNtulokset viikoilta 12, 16 ja 21. s. 79
23. NanoDrop®laitteen antamat spektrit QRTmPCR:ssä käytetylle PCRtuotteelle(vasemmalla) ja näytteenottoviikon 0 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR)maaDNAuutteelle (oikealla). s. 81
24. Näytteenottoviikon 0 saastutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) DNAuutelaimennustenmonistuminen QRTmPCR:llä. s. 82
25. NäyteDNA:n 103laimennuksen, negatiivisen kontrollin sekästandardiPCRtuotteen reaktiotuotteiden sulamiskäyrät. s. 83
26. Näytteenottoviikkojen 0, 3, 8 ja 21 maaDNAuutteidenmonistuminen QRTmPCR:llä. s. 84
27. P. putida G7 –kannasta nah_pitkäalukkeilla monistetut PCRtuotteet. s. 85
28. Kloonauksen onnistumisen tarkistus. s. 85
29. Klooneista nah_pitkäalukkeille saadut PCRtuotteet. s. 86
30. Kahdesta kloonatusta plasmidista sekä P. putida G7kannasta nah_pitkäalukkeilla monistetut PCRtuotteet ajettuna 2 %:lla agaroosigeelillä. s. 87
31. Rehuvuohenherneet viikolla 5. s. 89
32. Näytteenottoviikolla 6 ÖKRruukusta harvennettu kasvi. s. 89
33. Rehuvuohenherneet viikolla 10. s. 89
34. Kasvihuonekokeen jäljellä olevat ruukut viikolla 13. s. 89
35. Rehuvuohenherneet viikolla 14. s. 89
36. Viikon 21 näytteenottoruukut. s. 89
37. Kasvihuonekokeen MPNtulokset. s. 90
38. PicoGreen®mittauksella saadut keskimääräiset DNApitoisuudetkasvihuonekokeen eri käsittelyille kokeen kuluessa. s. 92
8
Taulukkoluettelo1. Raakaöljyn ensimmäisessä jalostusvaiheessa eli jakotislauksessa saatavat jakeet. s. 14
2. Öljyllä saastuneiden maiden bioremediaation tutkimusmenetelmiä. s. 32
3. Kasvihuonekokeen koeasetelma. s. 48
4. Näyteruukkujen koostumus. s.49
5. Kasvihuonekokeessa käytetyn maasekoituksen kivennäisaineksenlajitekoostumus. s. 50
6. Kasvihuonekokeessa käytetyn maasekoituksen perusominaisuuksia. s. 50
7. QRTmPCR:ssä käytetyt NAHalukkeet. s. 62
8. PCRreaktioliuoksen koostumus monistettaessa nahAcgeenifragmenttiaP. putida G7kannasta pesäkePCR:llä. s. 63
9. NahAcgeenifragmentin monistamisessa P. putida G7kannasta käytettypesäkePCRohjelma. s. 63
10. MaaDNAuutteiden sopivan laimennustason määrittämiseenkäytetty QRTmPCRohjelma. s. 65
11. Kloonattavan nahAcfragmentin monistamiseen suunnitellut alukkeet. s. 66
12. Ligaatioseoksen koostumus. s. 67
13. QRTmPCR:n standardina käytetyn PCRtuotteen NanoDrop® mittaustulokset. s. 80
14. MaaDNAuutteiden NanoDrop® ja PicoGreen® mittaustulokset sekäNanoDrop® laitteen antamat puhtausarvot maaDNAuutteille. s. 80
9
Lyhenneluettelobp Emäspari (Basepair)
BTEX Bentseeni, tolueeni, etyylibentseeni, ksyleenit
DGGE Denaturoiva gradienttigeelieletroforeesi
FISH Fluoresenssi insitu hybridisaatio
GCMS Kaasukromatografiamassaspektrometria
HAMBI Helsingin yliopiston Soveltavan kemian ja mikrobiologian
laitoksen mikrobikantakokoelma
HUM Hiivauutemannitoli
INT 2(piodofenyyli)3(pnitrofenyyli)5fenyylitetratsolium
kloridi
LHPCR Pituusheterogeniapolymeraasiketjureaktio
MPN Todennäköisin lukumäärä (Most probable number)
nt Nukleotidi
PAH Polyaromaattinen hiilivety (Polyaromatic hydrocarbon)
PCR Polymeraasiketjureaktio (Polymerase chain reaction)
PLFA Fosfolipidirasvahappo (Phospholipid fatty acid)
QRTmPCR Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio
(Quantitative realtime polymerase chain reaction)
SIP (Stable isotope probing)
TRFLP Terminaalisen restriktiofragmentin pituuspolymorfia
WST1 4[3(4iodofenyyli)2(4nitrofenyyli)2H5tetratsolio]1,3
bentseenidisulfonaatti
XGal 5bromo4kloro3indolyyli Dgalaktopyranosidi
10
JohdantoViimeisen vuosisadan aikana öljyn teollinen tuotanto, kuljetus ja jakelu ovat aiheuttaneet
öljyhiilivetyjen leviämisen ympäristöön ja muodostumisen merkittäväksi
ympäristöongelmaksi. Ympäristöministeriön vuonna 1994 julkaiseman SAMASE
kartoituksen loppuraportin mukaan Suomessa on yli 20 000 aluetta, joita epäillään
saastuneiksi. Näistä 33 % eli noin 6 000 aluetta on erilaisten polttoaineiden saastuttamia.
Yleisimmiksi maaperän saastuttajiksi todettiin erilaiset korjaamot, romuttamot ja
huoltoasemat (Puolanne ym. 1994). Koska näiden toimialojen valvonta on Suomessa
viimeaikoina huomattavasti tiukentunut, syntyy uusia pilaantuneita maaalueita Suomessa
nykyään pääasiassa erilaisten onnettomuuksien seurauksena (Salo 2003). Yleisimpänä
onnettomuustyyppinä Salo (2003) pitää öljylämmitteisen omakotitalon öljysäiliötä
täytettäessä sattuneita vahinkoja ja laiterikkoja. Koska maaperän saastuneisuus heikentää
maaalueiden käyttökelpoisuutta, pilaa pohjavesiä sekä voi aiheuttaa vaaraa ihmisten ja
eläinten terveydelle, korostavat Puolanne ym. (1994) SAMASEprojektin
loppuraportissaan saastuneiden maaalueiden kunnostustoimien tärkeyttä.
Saastuneita maaalueita voidaan kunnostaa erilaisilla fysikaalisilla tai kemiallisilla
menetelmillä, kuten lämpökäsittelyllä tai pesulla, tai erilaisilla biologisilla menetelmillä eli
bioremediaatiolla. Bioremediaatiomenetelmät perustuvat pääasiassa maaperän mikrobien
kykyyn hajottaa erilaisia haittaaineita. Koska bioremediaatio perustuu biologisiin
prosesseihin, joihin vaikuttavat maaperässä monet ympäristötekijät yhtäaikaisesti, on
bioremediaation etenemisen ennustaminen usein hankalaa. Näin ollen tarvitaan tarkkoja,
monipuolisia ja luotettavia menetelmiä, joiden avulla voidaan seurata bioremediaation
etenemistä maaperässä. Tässä tutkimuksessa asiaa lähestyttiin tutkimalla
rehuvuohenherneen (Galega orientalis) juuristossa tapahtuvaa ritsomediaatiota
yhdistämällä monia erilaisia mikrobiologisia ja kemiallisia tutkimusmenetelmiä.
Kirjallisuuskatsaukseni koostuu kolmesta erillisestä aihealueesta. Ensimmäisessä osiossa
käsittelen öljyn biologista hajoamista sekä hapellisissa että hapettomissa oloissa. Lisäksi
tarkastelen muutamia yleisimpien öljyn yhdisteiden hajotusreittejä, koska erityisesti
käytettäessä DNApohjaisia menetelmiä, on tärkeää tuntea erilaiset öljynhajotusreitit ja
niiden avainentsyymit. Toisessa osiossa käsittelen erilaisia bioremediaatiometelmiä, joita
on hyödynnetty öljyllä saastuneiden maiden puhdistuksessa. Viimeisessä osuudessa
11
tarkastelen erilaisia bioremediaation tutkimusmenetelmiä keskittyen pääasiassa
mikrobiologisiin menetelmiin.
Kokeellisen osuuteni alussa on esitetty 2005 vuoden alussa perustettu kasvihuonekoe,
jonka perustamiseen sekä ylläpitoon osallistuivat itseni lisäksi Elina Kondo, Anu
Mikkonen, Kaisa Wallenius ja Leena Suominen. Tämän jälkeen kokeellinen osuuteni
keskittyy MPNmenetelmän, DNApitoisuusmittausten sekä reaaliaikaisen kvantitatiivisen
PCR:n optimointiin ja soveltamiseen kasvihuonekokeen ritsoremediaatioprosessin
tutkimisessa.
Koska pro gradu työni oli osa laajempaa kokonaisuutta, on tulosteni tarkastelun kannalta
välttämätöntä esittää myös Elina Kondon saamia tuloksia (Kondo 2006). Elina Kondon
tulokset on esitetty tämän pro gradu tutkielman materiaalit ja menetelmät osion lopussa
kappaleessa 5.6.
12
Kirjallisuuskatsaus
1. Biologinen öljynhajotusBiologista öljynhajoamista tapahtuu sekä hapellisissa että hapettomissa oloissa. Maaperän
mikrobeista useiden bakteeri ja sienisukujen edustajat kykenevät hyödyntämään
öljyhiilivetyjä energian ja hiilenlähteenään. Myös muutamien mikrolevien on todettu
pystyvän öljyhiilivetyjen hajotukseen (van Hamme ym. 2003). Atlas ja Cernilian (1995)
mukaan hapellisissa oloissa merkittävin maaperän öljyhiilivetyjen hajotukseen osallistuva
bakteerisuku on proteobakteereihin kuuluva Pseudomonas. Tämän lisäksi öljyhiilivetyjen
hajotukseen kykeneviä bakteereita löytyy muun muassa Burkholderia, Sphingomonas,
Achromobacter, Nocardia, Mycobacterium, Vibrio ja Bacillussuvuista (Atlas ja
Cernilia 1995). Myös sienet ovat hapellisissa oloissa merkittäviä öljyhiilivetyjen hajottajia
ja niiden on arveltu olevan maaperässä joissain tapauksissa jopa bakteereita
merkittävämpiä hajottajia. Muiden muassa sienisuvuista Candida, Rhodotorula,
Aureobasidium, Penicillium, Aspergillus ja Fusarium löytyy öljyhiilivetyjen hajotukseen
kykeneviä lajeja (RiserRoberts 1998).
Öljyhiilivetyjen hajotustehokkuus on suuresti riippuvainen maaperän luontaisten
mikrobien geneettisestä sopeutumisesta öljyhiilivetyjen hajotukseen. Lisäksi
öljyhiilivetyjen hajotustehokkuuteen vaikuttavat monet ympäristötekijät, kuten maan
rakenne, orgaanisen aineksen määrä, hapen ja ravinteiden saatavuus, lämpötila, pH,
suolapitoisuus ja vedenaktiivisuus. Nämä tekijät vaikuttavat sekä maan mikrobistoon että
öljyhiilivetyjen sitoutumiseen maapartikkeleihin. Huonosti veteen liukenevien yhdisteiden,
kuten öljyhiilivetyjen, hajotusta rajoittaa merkittävästi myös niiden biosaatavuus. Jotta
mikrobit pystyvät olemaan metabolisesti aktiivisia, ne vaativat korkean vedenaktiivisuuden.
Tällöin öljyhiilivetyjä hajottavat mikrobit ja heikosti vesiliukoiset öljyhiilivedyt eivät usein
kohtaa toisiaan maaperässä. (Maier 2000)
13
1.1 Öljyn muodostuminen ja rakenne
Öljy on muodostunut meressä eläneiden eläinten ja kasvien jäänteistä noin 50200
miljoonaa vuotta sitten. Kovassa paineessa ja kuumuudessa pitkien aikojen kuluessa
monimutkaiset fysikaaliset ja kemialliset reaktiot muuttivat kuolleen eläin ja
kasvikudoksen raakaöljyksi ja maakaasuksi. Sopivat olosuhteet merien pohjiin syntyivät,
kun uudemmat sedimenttikerrostumat painoivat alempia kerrostumia aiheuttaen valtavan
paineen.
Raakaöljy koostuu pääasiassa erilaisista hiilivedyistä, jotka voidaan jakaa
molekyylirakenteen perusteella toisaalta suoriin, haaroittuneisiin ja rengasmaisiin
yhdisteisiin, toisaalta tyydyttyneisiin, tyydyttämättömiin ja aromaattisiin yhdisteisiin.
Raakaöljyn koostumus vaihtelee huomattavasti eri esiintymisalueiden välillä, mutta
keskimäärin raakaöljyssä on 50 % rengasmaisia tyydyttyneitä hiilivetyjä ja 25 %
avoketjuisia hiilivetyjä. Aromaattisten osuus on raakaöljyssä yleensä korkeintaan 15 %.
Aromaattiset hiilivedyt jaetaan mono, di ja polyaromaatteihin (PAH), joista
monoaromaattisissa yhdisteissä on yksi aromaattinen rengas, diaromaateissa kaksi ja
polyaromaateissa kolme tai enemmän. Vedyn ja hiilen lisäksi raakaöljy sisältää pieniä
määriä rikkiä, typpeä ja happea sitoutuneena orgaanisiin yhdisteisiin. Raakaöljyssä on
myös pieniä määriä metalleja, joista merkittävimmät ovat vanadiini ja nikkeli. (Aatelo
1995a)
Öljytuotteet valmistetaan raakaöljystä tislaamalla raakaöljy jakotislauskolonnissa (Aatelo
1995b). Jakotilauskolonni on jopa 80 metriä korkea uuni, jossa yhdisteet erottuvat
kiehumispisteensä mukaisesti. Uunin yläpäässä lämpötila on 3040 ºC ja pohjalla noin 400
ºC. Jakotislauksessa raakaöljystä erotetaan seitsemän eri jaetta. Eri jakeet kerätään uunista
niin, että kevyin raakaöljyn jae, polttokaasu, kerätään putkiuunin yläpäästä ja öljyn raskain
jae, josta valmistetaan raskaat polttoöljyt ja bitumituotteet, jää putkiuunin pohjalle.
Taulukossa 1 on esitetty jakotislauksessa saatavat jakeet ja lämpötilaväli, jolta kyseinen jae
on kerätty. Jakotislauksen jälkeen jakeita usein jatkokäsitellään muun muassa pilkkomalla
suurimpia öljyhiilivetyjä pienemmiksi molekyyleiksi ja tislaamalla jakeita uudelleen, jotta
saadaan haluttuja lopputuotteita.
14
Polttoöljy, jota käytetään muun muassa talojen lämmityksessä, kuuluu kaasuöljyihin ja sen
tislausalue on laajimmillaan 170 ºC:sta 390 ºC:een. Kaasuöljyn raskaampia jakeita
käytetään polttoöljyn talvilaadussa ja kevyempiä jakeita kesälaadussa. (Hästbacka 1992)
Taulukko 1. Raakaöljyn ensimmäisessä jalostusvaiheessaeli jakotislauksessa saatavat jakeet. Muokattu Aatelon (1995b)julkaisemasta taulukosta.Jae Tislauksen
alkupiste ºCTislauksen
loppupiste ºCPolttokaasut
Bensiinit 10 150180
Petrolit 150180 200220
Kevyt kaasuöljy 200220 280320
Kaasuöljy 280320 360400
Raskas kaasuöljy 330420 470500
Pohjaöljy 390420
Öljyn sisältämien yhdisteiden rakenteet vaikuttavan monin tavoin öljyn biologiseen
hajoavuuteen. Öljyhiilivedyistä suoraketjuiset nalkaanit ovat helpoiten mikrobien
hajotettavissa (van Hamme ym. 2003). Tämän jälkeen järjestyksessä helpoiten hajotettavia
ovat haaroittuneet alkaanit ja alkeenit, alle neljärenkaiset nalkyyliaromaatit,
monoaromaatit, sykliset alkaanit ja polyaromaatit. Vaikeimmin hajotettavia ovat
kompleksiset rengasrakenteiset asfalteenit. Lisäksi monet öljyhiilivedyt voivat olla
myrkyllisiä mikrobeille, mikä hidastaa näiden öljyhiilivetyjen hajoamista (Maier 2000).
Maierin (2000) mukaan öljyhiilivetyjen myrkyllisyys perustuu yleensä niiden lipofiiliseen
luonteeseen. Myrkylliset öljyhiilivedyt sitoutuvat mikrobien solukalvoon, jolloin
solukalvon rakenne häiriintyy.
1.2 Aerobinen öljynhajotus
Aerobinen hajotus vaatii tapahtuakseen molekulaarista happea ja voi tapahtua näin ollen
ainoastaan hapellisissa oloissa. Aerobinen hajotus on yleensä aina hapettomissa oloissa
tapahtuvaa anaerobista hajotusta tehokkaampaa. Aerobinen hajotus käynnistyy, kun
oksygenaasientsyymi liittää öljyhiilivetyyn yhden tai kaksi happiatomia (RiserRobets
1998). Sekä alifaattisia että aromaattisia yhdisteitä voidaan hajottaa aerobisissa oloissa.
15
Usein öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevät mikrobit ovat kuitenkin erikoistuneet joko
alifaattisten tai aromaattisten hiilivetyjen hajotukseen ja pystyvät hajottamaan vain tietyn
kokoisia aromaattisia tai alifaattisia yhdisteistä. (Whyte ym. 1997)
1.2.1 Alifaattisten öljyhiilivetyjen aerobinen hajotus
Monet mikrobit pystyvät aerobisissa oloissa käyttämään erikokoisia alkaaneja hiilen ja
energianlähteenään. Alkaanien on todettu hajoavan aerobisissa oloissa useampaa erilaista
reittiä. Jopa samalta mikrobikannalta on löydetty useita entsyymejä, jotka voivat toimia
toisistaan riippumatta metaboliareitin samassa vaiheessa (van Hamme ym. 2003).
Perusteellisimmin tyydyttyneiden öljyhiilivetyjen hajoamista on tutkittu Pseudomonas
putida Gpo1kannalla, jolla alkaanien hajotukseen vaadittavia entsyymejä koodaa OTC
plasmidi (van Hamme ym. 2003). Alkaanien hajotukseen osallistuvat geenit ovat OTC
plasmidissa kahdessa operonissa. Isompi operoneista (alkBFGHJKL) koodaa suurinta osaa
metaboliareitillä tarvittavista entsyymeistä (kuva 1). Toinen operoni koodaa geenejä alkT
ja alkS. Pienemmän operonin alkTgeeni koodaa alkaanien hajotusreitillä tarvittavaa
rubredoksiinireduktaasientsyymiä (kuva 1) kun taas AlkS osallistuu hajotusreitin säätelyyn.
Operoneja luetaan plasmidissa toisiaan kohti ja niiden 3´päiden etäisyys toisistaan on 9,7
kiloemästä. Tällä 9,7 kiloemäksen välialueella on todettu olevan vielä yksi alkaanien
hajotukseen osallistuva geeni, alkN. AlkN on siirtäjäproteiini (methylaccepting
transducer), joka pystyy ottamaan vastaan metyyliryhmän. AlkNproteiinin tehtävää
alkaanien hajotuksessa ei ole pystytty vielä täysin selvittämään, mutta van Bailen ym.
(2001) mukaan sen uskotaan liittyvän alkaanikemotaksikseen.
16
Kuva 1. Pseudomonas putida Gpo1kannan OCTplasmidin koodaama alkaanienhajotusreitti. Metaboliareitin entsyymit ovat monooksygenaasi (AlkB), rubredoksiinit (AlkG jaAlkF), rubredoksiinireduktaasi (AlkT), alkoholidehydrogenaasi (AlkJ), aldehydidehydrogenaasi(AlkH) sekä asetyyli koentsyymiAsyntetaasi (AlkK). AlkS on metaboliareitin positiivinensäätelijä. Proteiinien AlkL ja AlkN merkitystä ei ole pystytty vielä täysin selvittämään. Kuva onmuokattu van Beilen ym. (2001) julkaisemasta kuvasta.
Kuvassa 1 on esitetty OTCplasmidin koodaaman alkaanihajotusreitin entsyymien sijainti
solussa. Proteiini AlkB on alkaanimonooksygenaasi, joka aloittaa nalkaanien hajotuksen
liittämällä yhden happiatomin alkaanin hiilivetyketjun päähän, jolloin muodostuu
primaarinen alkoholi (van Beilen ym. 1994). Molekylaarisen hapen toinen happiatomi
muodostaa kahden protonin kanssa vesimolekyylin. Tarvittavat elektronit reaktioon
saadaan nikotiiniamidinukleotidiltä (NADH). Elektronit siirtyvät NADH:ltä mono
oksygeenasille (AlkB) rubredoksiinireduktaasin (AlkT) ja rubredoksiinien (AlkF ja AlkG)
kautta (van Beilen ym. 1994).
Alkoholidehydrogenaasi (AlkJ) muuttaa primaarisen alkoholin aldehydiksi, jonka jälkeen
proteiini AlkH muodostaa aldehydistä karboksyylihapon (van Beilen ym. 1994). Lopuksi
AlkK liittää hiilivetyketjun karboksyylipäähän asetyylikoentsyymiA:n, minkä jälkeen
hiilivetyketju siirtyy oksidaatioon hajotettavaksi. oksidaatio ei vaadi enää happea
tapahtuakseen ja voi näin ollen tapahtua myös hapettomissa oloissa.
17
Edellä esitetystä P. putida Gpo 1 kannan metaboliareitistä poikkeavilla alkaanien
hajotusreitteillä monooksygenaasi voi olla esimerkiksi korvautunut dioksygenaasilla.
Tällöin metaboliareittiä kutsutaan Finnertyn reitiksi (Tani ym. 2001). Alkaanien
hajotuksen aloittava monooksygenaasi voi myös liittää happiatomin hiilivetyketjun pään
sijasta keskelle hiilivetyketjua (Atlas ja Bartha 1998). Tällöin muodostuu sekundaarinen
alkoholi, joka muutetaan ketoni ja asetyyliesterivälituotteiden kautta primaariseksi
alkoholiksi ja edelleen asetaattihapoksi.
1.2.2 Aromaattisten hiilivetyjen aerobinen hajotus
Aromaattisten hiilivetyjen hajoaminen maaperässä on yleensä alifaattisten öljyhiilivetyjen
hajoamista huomattavasti hitaampaa. Aromaattisten yhdisteiden hajoamista hidastaa muun
muassa niiden heikko vesiliukoisuus ja voimakas sitoutuminen maapartikkeleihin (Maier
2000). Monet mikroorganismit (bakteerit, sienet ja levät) pystyvät kuitenkin hajottamaan
aromaattisia yhdisteitä (van Hamme ym. 2003). Mitä vähemmän aromaattisessa
yhdisteessä on renkaita, sitä helpommin se on yleensä mikrobien hajotettavissa. Raskain
aromaattinen yhdiste, jota mikroorganismit tämän hetkisen tiedon mukaan pystyvät
hyödyntämään ainoana hiilen ja energianlähteenä on nelirenkainen. Tosin viisirenkainen
bentso[a]pyreenin on todettu hajoavan myös hitaasti luonnossa, mutta sen täydellinen
hajotus vaatii useiden mikrobilajien osallistumista hajotusprosessiin (van Hamme ym.
2003).
Bakteereilla aromaattisten yhdisteiden hajotuksen aloittaa dioksygenaasi, joka liittää
bentseenirenkaaseen kaksi happiatomia, jolloin muodostuu ensin epästabiili cis,cis
dihydroksidioli, joka spontaanisti muuttuu katekoliksi (kuva 2). Tämän jälkeen
hajotusreaktio etenee organismista riippuen meta tai ortoreitti (Smith 1990). Metareitillä
katekoli2,3dioksygenaasi avaa katekolin aromaattisen renkaan renkaaseen liittyneiden
hydroksyyliryhmien vierestä, jolloin muodostuu 2hydroksimukonisemialdehydi (kuva 2).
Ortoreitillä katekoli1,2dioksygenaasi avaa katekolin aromaattisen renkaan
hydroksyyliryhmien välistä, jolloin muodostuu cic,cismukonihappo (kuva 2). Metareitin
lopputuotteina syntyy pyruvaatti ja asetaldehydi ja ortoreitin lopputuotteina sukkinaatti ja
asetyylikoentsyymiA (Smith 1990). Nämä yhdisteet bakteeri pystyy hyödyntämään
esimerkiksi sitruunahappokierrossaan.
18
Sienien on todettu olevan maaperässä merkittäviä erityisesti polyaromaattisten
öljyhiilivetyjen hajottajina. Kuvassa 2 on esitetty myös sienten aromaattisten
öljyhiilivetyjen hajotusreitti, joka eroaa prokaryoottien hajotusreitistä. Sienillä hajotuksen
aloittaa sytokromi P450monooksygenaasi. Tämä seuraa entsymaattinen veden lisääminen,
jossa syntyy transdihydrodioleita ja fenoleita. Nämä yhdisteet hajoavat usein nopeasti
aerobisissa oloissa joko bakteerien tai sienten toimesta. (Cernilia 1997)
Kuva 2. Prokaryoottien ja eukaryoottien aromaattisten hiilivetyjen aerobisenhajotuksen reittejä. Kuva muokattu Scraggin (2005a) julkaisemasta kuvasta.
Naftaleeni on niin kutsuttu diaromaatti, joka koostuu kahdesta fuusiotuneesta
bentseenirenkaasta. Se on yksi myrkyllisimmistä öljyn vesiliukoisen fraktion yhdisteistä
(RiserRoberts 1998) ja tästä syystä sen biologista hajoamista on tutkittu paljon. Muun
muassa katabolisen plasmidin NAH7 koodaama naftaleenin hajotusreitti on jo pystytty
selvittämään yksityiskohtaisesti. Hajotusreittiä koodaavat geenit ovat ryhmittyneet
19
plasmidiin kahdeksi operoniksi. Toinen operoneista koodaa niin sanottua ylempää reittiä
(eng. upper pathway), ja toinen niin sanottua alempaa reittiä (eng. lower pathway).
Ylempää reittiä koodaava operoni koostuu geeneistä nahAaAbAcAdBFCED. Ylemmällä
reitillä naftaleeni muutetaan salisylaatiksi (kuva 3). Ylemmän reitin ja naftaleenin
hajotuksen aloittava entsyymi on naftaleenidioksygenaasi. Se koostuu neljästä eri
alayksiköstä: naftaleenidioksygenaasisreduktaasista (NahAa),
naftaleenidioksygenaasiferredoksiinista (NahAb), naftaleenidioksygenaasin FeSproteiinin
isosta alayksiköstä (NahAc) ja naftaleenidioksygenaasin FeSproteiinin pienestä
alayksiköstä (NahAd) (Bosch ym. 1999). Ylemmän reitin jälkeen salisylaatin hajotus
jatkuu alemmalla reitillä, jota koodaava operoni koostuu geeneistä nahGTHINLOMKJ (van
Hamme ym. 2003). Alemmalla reitillä salisylaatti muutetaan metareittiä
sitruunahappokierron välituotteiksi, pyruvaatiksi ja asetaldehydiksi.
Kuva 3. Pseudomonas tutzeri AN10kannan kromosomaalisesti koodattu ylempinaftaleenin hajotusreitti. Kuvan aineenvaihduntatuotteet ovat 1) naftaleeni, 2) cisnaftaleenidihydrodioli, 3) 1,2dihydroksinafteleeni, 4) 2hydroksikromene2karboksylaatti, 5) cisohydroksibensaalipyruvaatti, 6) salisyylialdehydi ja 7) salisylaatti. Metaboliareitin ensyymit ovatnaftaleenidioksygenaasi (NahA), naftaleenicisdihydrodiolidehydrogenaasi (NahB), 1,2dihydroksinaftaleenidioksygenaasi (NahC), 2hydroksikromene2karboksylaattidehydrogenaasi(NahD), 1,2dihydroksibentsyylipyruvaattialdolaasi (NahE) ja salisyylialdehydidihydrogenaasi(NahF). Kuva muokattu Bosch ym. (1999) julkaisemasta kuvasta.
Naftaleenin hajotusreitin geenit sijaitsevat yleisesti katabolisessa plasmidissa, mutta on
löydetty myös useita kantoja, joissa naftaleenin hajotusreittiä koodaavat geenit sijaitsevat
bakteerin genomissa. Bosch ym. (1999) totesivat Pseudomonas stutzeri AN10kannan
kromosomissa sijaitsevan ylemmän naftaleenin hajotusreitin olevan hyvin samanlainen
kuin plasmidin NAH7 koodaama hajotusreitti (kuva 3). Heidän mielestään on hyvin
todennäköistä, että koko ylempi hajotusreitti on siirtynyt NAH7kaltaisesta plasmidista
osaksi P. stutzeri AN10kannan genomia. Lisäksi Bosch ym. ovat havainneet viitteitä siitä,
että P. stutzeri AN10kannalla olisi mahdollisesti rinnakkain kaksi erillistä ylempää
hajotusreittiä. Öljyhiilivetyjen hajotukseen tarvittavien geenien onkin todettu usein olevan
osana niin kutsuttuja liikkuvia elementtejä (Tsuda ym. 1999). Tästä johtuen hyvin
samanlaisia metabolisia reittejä voidaan löytää kaukaista sukua olevilta bakteereilta.
20
1.3 Anaerobinen öljynhajotus
Anaerobista öljyhiilivetyjen hajoamista on tutkittu vasta muutamien vuosikymmenien ajan.
Viimeisen kymmenen vuoden aikana on löydetty useita anaerobisia öljyhiilivetyjen
hajotusreittejä monilta eri bakteerilajien edustajilta (Heider ym. 1999). Monia kantoja on
onnistuttu myös eristämään puhdasviljelmiksi. Kaikissa tähän asti eristetyissä kannoissa
anaerobinen öljyhiilivetyjen hajotus perustuu anaerobiseen soluhengitykseen eli vaatii
ulkoisen elektronin vastaanottajan (Heider ym. 1999). Kaikki öljyhiilivetyjen anaerobinen
hajoaminen maaperässä ei kuitenkaan perustu anaerobiseen soluhengitykseen.
Meckenstock (1999) on onnistunut eristämään öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevän
fermentatiivisen bakteerikonsortion. Lisäksi Heider ym. (1999) esittävät, että
anoksygeeniset fotosynteettiset bakteerit kykenisivät hajottamaan öljyhiilivetyjä.
Yleisimmin elektronien vastaanottajina anaerobisessa öljyhiilivetyjen pelkistyksessä
toimivat nitraatti, ferrirauta, sulfaatti ja vetyioni (Heider ym. 1999). Vetyionin
pelkistykseen perustuvalla anaerobisella soluhengityksellä voidaan tuottaa energiaa
ainoastaan ympäristöissä, joissa reaktion tuottamaa vetyä poistetaan jatkuvasti. Sopivan
ympäristön luovat metanogeenit, jotka kuluttavat vetyä tuottaessaan metaanikaasua
(Heider ym. 1999). Eristettyjen bakteerikantojen on osoitettu pystyvän hajottamaan
anaerobisissa oloissa aromaattisista yhdisteistä bentseeniä, alkyylibentseenejä, naftaleenia
ja fenantreenia (van Hamme ym. 2003). Lisäksi alifaattisista alkaaneista ja alkeeneista 6
20hiilisten yhdisteiden on osoitettu hajoavan anaerobisesti (van Hamme ym 2003).
1.3.1 Aromaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus
Aromaattisten öljyhiilivetyjen on todettu hajoavat anaerobisissa oloissa hyvin monenlaisia
reittejä. Kuvassa 4 on esitetty BTEX (bentseeni, tolueeni, etyylibentseeni ja ksyleenit)
yhdisteiden tällä hetkellä tunnettuja anaerobisia metaboliareittejä. Koska anaerobista
öljyhiilivetyjen hajotusta tapahtuu monenlaisissa ympäristöissä erilaisten elektronien
vastaanottajien läsnäollessa, ei ole yllättävää, että myös metaboliareitit poikkeavat
toisistaan (Zhang ja Bennett 2005).
BentsoyylikoentsyymiA on yleinen välituote BTEXyhdisteiden hajotuksessa (kuva 4).
Seuraava reaktio on pelkistysreaktio, jossa aromaattisesta renkaasta muodostuu alisyklinen
dienoyylikoentsyymiA (Harwood ym. 1999). Reaktiossa toimiva entsyymi on
21
bentsoyylikoentsyymiA reduktaasi, joka on aromaattisten yhdisteiden anaerobisen
hajotuksen avainentsyymi (Harwood ym. 1999). BentsoyylikoentsyymiAreduktaasi ei
vielä saa aikaan aromaattisen renkaan aukeamista, vaan aromaattisen renkaan pelkistystä
seuraa sarja tavanomaisia hydraatio ja dehydrogenaatioreaktioita, jotka lopulta johtavat
alisyklisen renkaan hydrolyyttiseen avaamiseen (Harwood ym. 1999). Yhdestä moolista
BTEXyhdistettä syntyy täydellisen anaerobisen hajoamisen seurauksena kolme moolia
asetyylikoentsyymiA:ta ja yksi mooli hiilidioksidia (Zhang ja Bennett 2005).
AsetyylikoentsyymiA:n myös anaerobiset bakteerit pystyvät hyödyntämään oksidaatiolla.
Kuva 4. Aromaattisten öljyhiilivetyjen anaerobisia hajoamisreittejä. Reaktioissatoimivat entsyymit: E1) bentsyylisukkinaattisyntaasi, E2 ja E4) etyylibentsyylisukkinaattisyntaasi,E3) etyylibentseenidehydrogenaasi ja E5) bentsoyyliCoAreduktaasi. Entsyymien E1, E2 ja E4reaktioihin merkitty Akirjain on fumaraatti (HOOCCH=CHCOOH). Kuva muokattu Zhangin jaBenettin (2005) julkaisemasta kuvasta.
22
1.3.2 Alifaattisten hiilivetyjen anaerobinen hajotus
Alkaanien ja alkeenien anaerobista hajotusta on tutkittu aromaattisten yhdisteiden
hajoamista huomattavasti vähemmän. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että aromaattisten
yhdisteiden myrkyllisyyden vuoksi niistä ollaan yhteiskunnallisesti huomattavasti
kiinnostuneempia (Zhang ja Bennett 2005).
Ensimmäinen alkaanien anaerobiseen hajotukseen kykenevä bakteeri, sulfaatin pelkistäjä
Hxd3, eristettiin vuonna 1991. Hdx3 pystyy kasvamaan anaerobisesti 16hiilisellä
heksadekaanilla ja muilla pitkäketjuisilla alkaaneilla sekä pystyy heksadekaanin
täydelliseen mineralisaatioon anaerobisissa oloissa (Heider ym. 1999). Hxd3kannan
jälkeen useita anaerobiseen alkaanien hajotukseen kykeneviä sulfaatin pelkistäjiä sekä
muutamia nitraatin pelkistäjiä on onnistuttu eristämään puhdasviljelmiksi (Wilkes ym.
2002). Lisäksi on todettu rautaa pelkistävien sekä metanogeenisten konsortioiden pystyvän
anaerobiseen alkaanien hajotukseen (So ja Young 2001). Alkaanien hajotuksen
biokemiallista taustaa ei vielä kovin hyvin tunneta. On kuitenkin selvää, että myös
anaerobisen alkaanien hajotuksen käynnistäviä reaktioita on useita (Heider ym. 1999).
Wilkes ym. (2001) esittävät nitraatin pelkistäjän, HxN1, käynnistävän anaerobisen n
heksaanin hajotuksen liittämällä entsymaattisesti fumaraatin heksaanin toiseen hiileen
muodostaen 1metyylipentyylisukkinaatin. Reaktio on hyvin samanlainen kuin
aromaattisten yhdisteiden hajotuksen yhteydessä tapahtuva fumaraatin liittäminen
aromaattiseen renkaaseen (kuva 4). So ym. (2003) esittävät puolestaan sulfaatin
pelkistäjien aloittavan anaerobisen alkaanien hajotuksen liittämällä hiilidioksidin n
alkaanin kolmanteen hiileen. Tämän jälkeen hiilivetyketju katkaistaan toisen ja kolmannen
hiilen välistä niin, että kaksi ensimmäistä hiiltä irtoavat ja jäljelle jää rasvahappo.
Rasvahappo voidaan edelleen hajottaa oksidaatiolla. Tämänhetkinen tietämys alkaanien
anaerobisesta hajoamisesta on kuitenkin vähäistä.
23
2. Öljyllä saastuneiden maiden puhdistusPerinteisesti saastuneita maita on käsitelty erilaisilla kemiallisilla ja fysikaalisilla
puhdistusmenetelmillä. Menetelminä on käytetty muun muassa maaaineksen pesua, jossa
saastunut maaperä joko huuhdellaan paikan päällä tai käsitellään pesulaitteistossa.
Puhdistus perustuu saastuttavien aineiden siirtämiseen nestefaasiin ja poistoon pesuveden
mukana. Haittaaineita voidaan myös poistaa polttamalla tai muilla termisillä käsittelyillä.
Lisäksi voidaan käyttää haittaaineiden stabilointia, jossa haittaaineet sidotaan
fysikaalisilla tai kemiallisilla käsittelyillä maaperän rakenteeseen siten, että niiden
kulkeutuminen ympäristöön estyy. (Puolanne ym. 1994)
Kaikki edellä mainitut perinteiset puhdistusmenetelmät vaikuttavat suuresti maan
rakenteeseen ja sen luonnollisiin biologisiin prosesseihin. Tällä hetkellä ollaankin hyvin
kiinnostuneita löytämään ympäristöystävällisempiä maaperän puhdistusmenetelmiä
erilaisista biologisista menetelmistä. Biologiset menetelmät ovat perinteisiä menetelmiä
halvempia ja niillä voidaan käsitellä tehokkaammin matalampia saastepitoisuuksia.
(Scragg 2005a)
2.1 Bioremediaatio
Bioremediaatiolla tarkoitetaan ympäristöön joutuneiden haittaaineiden poistamista
biologisilla menetelmillä. Yleensä bioremediaatiolla tarkoitetaan mikrobien tai kasvien
tuottamien entsyymien aikaansaamaa haittaaineiden hajoamista, mutta bioremediaationa
pidetään myös haittaaineiden kertymistä kasveihin ja mikrobeihin. Bioremediaation avulla
voidaan puhdistaa ympäristöstä ennen kaikkea luonnollisissa prosesseissa syntyneitä
haittaaineita kuten öljyä, mutta myös raskasmetalleja ja erilaisia synteettisiä orgaanisia
yhdisteitä, kuten liuottimia, hyönteis ja kasvimyrkkyjä sekä räjähdysaineita. (Scragg
2005a)
Haittaaineita hajottavat organismit voivat joko hyödyntää yhdisteitä hiilen ja
energianlähteinä tai hajotus voi tapahtua niin kutsutun kometabolian kautta.
Kometaboliassa organismin tuottamat epäspesifiset entsyymit muokkaavat yhdistettä ilman
että yhdistettä käytetään hiilen tai energianlähteenä. Haittaaineiden hajotus tapahtuu
yleensä vaiheittain useiden entsyymien peräkkäisen toiminnan seurauksena. Maaperässä
24
tämä tapahtuu usein monien mikrobien yhteisvaikutuksen seurauksena. Haittaaineiden
täydellisessä hajoamisessa eli mineralisaatiossa haittaaineet hajoavat täydellisesti tuottaen
hiilioksidia, vettä ja muita epäorgaanisia yhdisteitä. Jos maaperän mikrobipopulaatiosta
puuttuu jokin yhdisteen hajotukseen vaadittava entsyymi, yhdisteen hajotusprosessi
pysähtyy. Tällä tavoin maaperään voi kertyä hajoamattomia yhdisteitä. (Maier 2000)
Saastuneiden maiden biologista puhdistusta voidaan tehdä sekä paikan päällä ilman maan
siirtämistä eli in situ tai siirretylle maaainekselle eli ex situ. In situ menetelmien etuna on,
ettei se edellytä kallista maamassojen siirtelyä. Lisäksi in situ menetelmät yleensä
häiritsevät hyvin vähän maan luonnollista toimintaa. (Sylvia ym. 2005)
2.1.1 Luontainen bioremediaatio
Yksinkertaisin in situ puhdistusmenetelmä on luontainen bioremediaatio, jossa saastuneen
ympäristön luontaisten mikrobien annetaan hajottaa ympäristöön joutuneita haittaaineita
ilman että prosessiin mitenkään vaikutetaan. Kun luontaista bioremediaatiota käytetään
saastuneen alueen puhdistusmenetelmänä, on hajoamisen etenemistä seurattava sekä
alueen mahdollisia riskejä kartoitettava. (Sylvia ym. 2005)
Maan mikrobiyhteisöjen aineenvaihdunnan monipuolisuus ja kyky hajottaa erilaisia
yhdisteitä on valtava. Monet mikrobiyhteisöt pystyvät myös hajottamaan monia niin
kutsuttuja ksenobiootteja eli yhdisteitä joita ei luonnossa esiinny. Penet ym. (2006) sekä
SolanoSerena ym. (2000) ovat todenneet saastuneiden maiden mikrobiyhteisöjen olevan
huomattavasti tehokkaampia hajottamaan kyseisiä haittaaineita kuin saastumattomien
maiden mikrobiyhteisöt. Tästä he ovat päätelleet maan mikrobiyhteisöjen sopeutuvan
erilaisten haittaaineiden hajotukseen. Sopeutuminen voi olla sekä hajottajien määrällistä
lisääntymistä että mikrobien geneettistä muuntumista (SolanoSerena ym. 2000).
Vertaillessaan öljyhiilivedyillä saastuneen ja saastumattoman maan kykyä hajottaa
bensiinin yleisimpiä yhdisteitä laboratoriossa SolanoSerena ym. (2000) totesivat
saastuneiden maiden mikrobiyhteisön pystyvän hajottamaan sellaisia öljyhiilivety
yhdisteitä, joita saastumattomien maiden mikrobiyhteisöt eivät pystyneet lainkaan
hajottamaan.
25
2.1.2 Biostimulaatio
Vaikka maaperän luontaiset mikrobit pystyvät hajottamaan valtavaa määrää erilaisia
yhdisteitä, luontainen bioremediaatio etenee usein hyvin hitaasti ja sen tehostaminen on
usein tarpeellista. Vaikuttamalla hajotusprosessia hidastaviin tekijöihin, kuten ravinteiden
tai hapen puutteeseen, voidaan haittaaineiden hajotusta maaperässä tehostaa. Näitä
maaperän luonnollisen mikrobiston aktiivisuuden lisäämiseen pyrkiviä menetelmiä
kutsutaan biostimulaatioksi. (Scragg 2005a)
Biostimulaation avulla on onnistuttu useissa tapauksissa tehostamaan luontaista
bioremediaatiota. Biostimulaatiota hyödynnettiin laajamittaisesti vuonna 1989, kun Exxon
Valdezöljytankkeri haaksirikkoutui Alaskan rannikolle (Scragg 2005b). Tällöin 1700 km
rannikkoaluetta saastui raakaöljyllä. Biostimulaatio toteutettiin tällöin lisäämällä
saastuneille maaalueille fosforityppilannoitetta (Scragg 2005b). Öljyhiilivetyjen tiedetään
muuttavan maaperän hiilityppi ja hiilifosforisuhteita mikrobeille epäedullisempaan
suuntaan, jolloin parantamalla näitä suhteita voidaan usein lisätä maaperän mikrobien
aktiivisuutta (Sylvia ym. 2005). Exxon Valdezin tapauksessa lannoituksen vaikutuksia
seurattiin vertailemalla lannoitettuja alueita kontrollialueisiin, joita ei oltu lannoittettu
(Lindstrom ym. 1991). Lannoituksen todettiin tehostavan öljyhiilivetyjen hajotusta silmin
nähtävästi. Lisäksi lannoitetuilla alueilla mitattiin korkeampia öljyyhdisteiden
mineralisaationopeuksia ja todettiin öljynhajottajien lukumäärien olevan selvästi
korkeampia. (Lindstrom ym. 1991) Lannoituksen avulla saastuneiden maaalueiden
öljyhiilivetypitoisuudet onnistuttiin Exxon Valdezin tapauksessa laskemaan
öljyonnettomuutta edeltäneelle tasolle 34 vuodessa (Scragg 2005b).
2.1.3 Bioaugmentaatio
Sen lisäksi, että saastuneen maaalueen luontaisten mikrobien hajotustehokkuutta voidaan
parantaa biostimulaation avulla, voidaan hajotusta tehostaa myös lisäämällä haittaaineiden
hajotukseen kykeneviä mikrobeja ympäristöön. Tätä lähestymistapaa kutsutaan
bioaugmentaatioksi. Monissa tapauksissa lisättyjen bakteereiden on kuitenkin todettu
häviävän nopeasti maaperästä (Thompson ym. 2005). Tämän nopean häviämisen on
päätelty olevan seurausta laboratoriossa kasvatettujen mikrobien heikentyneestä
kilpailukyvystä, jolloin ne maahan lisättäessä häviävät kilpailussa maaperän luontaiselle
mikrobistolle.
26
MarquezRocha ym. (2001) ovat keskittyneet tutkimaan puhdasviljelmien sijasta
mikrobikonsortioiden hyödyntämistä bioaugmentaatiossa. Lisäksi sekä Barbeau ym. (1997)
että Gentry ym. (2004) ovat tutkineet aktivoidun maaaineksen
hyödyntämismahdollisuuksia bioaugmentaatiossa. Maaaineksen aktivointi tapahtuu
bioreaktorissa, jossa maaainekseen sekoitetaan tutkittavaa haittaainetta. Tämän on todettu
lisäävän kyseistä haittaainetta hajottavien mikrobien määrää maaaineksessa. Aktivoitu
maaaines hyödynnetään mikrobiymppinä saastuneella maaalueella.
Koska haittaaineiden hajoamiseen luonnossa vaikuttavat aina monet ympäristötekijät, on
hajotusta rajoittavat tekijät määritettävä jokaisessa tapauksessa erikseen. Jos alueella on
hyvin vähän mikrobiaktiivisuutta tai hajotettavat yhdisteet ovat hyvin hankalasti hajoavia
voi yhdisteiden hajotukseen kykenevien mikrobiymppien lisääminen eli bioaugmentaatio
tehostaa hajotusta (Maier 2000). Suurimman osan haittaaineista on kuitenkin todettu
hajoavan luontaisten mikrobien toimesta kaikissa ympäristöissä (Maier 2000). Hajotus voi
tosin olla hidasta. Tällöin on tärkeää selvittää mitkä tekijät rajoittavat hajotusta ja yrittää
vaikuttaa näihin tekijöihin biostimulaation avulla.
2.1.4 Ex situ menetelmät
Kun saastuneen maaaineksen puhdistusta ei voida syystä tai toisesta tehdä paikan päällä,
voidaan biologisia puhdistusmenetelmiä hyödyntää myös siirretylle maaainekselle.
Menetelmiä, joissa maaainesta siirretään käsittelyä varten kutsutaan ex situ menetelmiksi.
Ex situ menetelmissä maaaines puhdistetaan esimerkiksi bioreaktorissa, kompostoimalla
tai ns. peltokäsittelyllä. Koska maan siirtäminen tuo kustannuksia, ovat ex situ menetelmät
aina in situ menetelmiä kalliimpia. Tosin esimerkiksi bioreaktorissa maaaines voidaan
puhdistaa paljon nopeammin kuin in situ menetelmillä. (Sylvia ym. 2005)
Ex situ menetelmissä haittaaineiden hajotusta tehostetaan samoilla menetelmillä kuin in
situ menetelmissä. Pellolle, bioreaktoriin ja kompostiin luodaan lannoittamalla
optimaaliset ravinneolosuhteet. Bioreaktorissa taataan optimaaliset happiolosuhteet
ilmastamalla; pellolla ja kompostissa sekoittamalla maaainesta. Lisäksi voidaan säädellä
pH:ta, hapetuspelkistyspotentiaalia ja veden aktiivisuutta. Bioreaktorissa voidaan
säädellä myös lämpötilaa. Olosuhteiden säätäminen optimaalisiksi on helpointa
bioreaktorissa ja hajotustehokkuus saadaan bioreaktorissa korkeammaksi kuin muilla
27
menetelmillä (Sylvia ym. 2005). Bioreaktorin käyttö on kuitenkin kallista eikä sillä voida
käsitellä suuria maamassoja yhtäaikaisesti.
Kontrolloiduissa oloissa, kuten bioreaktorissa, bioaugmentaatiota on hyödynnetty
huomattavasti paremmin tuloksin kuin in situ menetelmissä (Sylvia ym. 2005).
Bioaugmentaation tulevaisuuden sovellutukset voisivat näin ollen hyvin olla erilaisissa e x
situ menetelmissä. Lisäksi laboratoriooloissa on tutkittu geneettisesti muunneltujen
organismien hyödyntämistä öljyhiilivetyjen hajotuksen tehostamisessa (Dua ym. 2002).
Näitä geneettisesti muunneltuja superhajottajia voitaisiin mahdollisesti tulevaisuudessa
käyttää bioreaktorin kaltaisessa suljetussa ympäristössä tapahtuvassa puhdistuksessa
(Scragg 2005a).
2.2 Fytoremediaatio
Fytoremediaatio on bioremediaation osaalue, joka hyödyntää kasveja haittaaineiden
poistamisessa. Kasveja voidaan hyödyntää monin eri tavoin ympäristönpuhdistuksessa.
Newman ja Renolds (2004) ovat jaotelleet katsauksessaan fytoremediaatiomenetelmät
neljään eri ryhmään, joita ovat fytodegradaatio, fytoakkumulaatio, fytostabilointi ja
ritsoremediaatio. Fytodegradaatiossa kasvit ottavat sisäänsä ympäristömyrkkyjä ja
hajottavat niitä solujensa sisällä. Fytoakkumulaatiossa kasvit ainoastaan keräävät
ympäristömyrkkyjä biomassaansa, mutta eivät hajota niitä. Fytostabiloinnissa kasvien
juuriston avulla estetään haittaaineita valumasta esimerkiksi vesistöihin tai pohjaveteen.
Fytoremediaation osaaluetta, joka hyödyntää kasvin juuriston mikrobiaktiivisuutta
nostavaa vaikutusta haittaaineiden hajotuksessa, kutsutaan ritsoremediaatioksi. Erityisesti
ritsoremediaatiota pidetään lupaavana menetelmänä öljyhiilivetyjen poistamisessa
maaperästä (Kuiper ym. 2004).
Fytoremediaatio soveltuu pintamaiden matalien saastepitoisuuksien käsittelyyn alueilla,
joilla ei ole kiireellistä kunnostuksen tarvetta. Alkorta ja Garbisu (2001) pitävät
fytoremediaation hyvinä puolina sitä, että se häiritsee hyvin vähän maaperän luonnollista
toimintaa ja on lisäksi edullinen ja esteettisesti miellyttävä menetelmä. Artikkelissaan he
kuitenkin korostavat, että ennen fytoremediaation soveltamista saastuneille maaalueille on
selvitettävä, etteivät haittaaineet haihdu kasvien kautta ilmakehään tai ettei kasveissa
muodostu haittaaineista vielä myrkyllisempiä yhdisteitä kasvin metabolian seurauksena.
28
Jos kasveihin kertyy jotain myrkyllisiä yhdisteitä, on varmistettava, etteivät nämä
myrkylliset yhdisteet siirry ravintoketjussa eteenpäin.
2.2.1 Ritsoremediaatio
Ritsoremediaatiossa hyödynnetään kasvin juuriston edistävää vaikutusta haittaaineiden
hajotuksessa. Juuristo vaikuttaa monin tavoin maan ominaisuuksiin. Juuristolla on
vaikutusta muun muassa maan hiilidioksidi, happi ja vesipitoisuuteen, happamuuteen,
osmoottiseen paineeseen sekä hapetuspelkistyspotentiaaliin (Parrish ym. 2005). Lisäksi
mikrobiaktiivisuus on huomattavasti korkeampaa kasvien juuristossa kuin sitä
ympäröivässä maassa. Tämän havainnon teki Hiltner jo vuonna 1904. Samalla Hiltner
esitti termin ritsosfääri, jonka hän määritteli alueeksi, jolle kasvin juuriston vaikutus
maaperässä ylettyy. (Kuiper ym. 2004)
Sen lisäksi, että ritsosfäärissä on ympäröivää maata korkeampi mikrobitiheys, on
ritsosfäärin mikrobiyhteisön todettu poikkeavan huomattavasti ympäröivän maan
mikrobiyhteisöistä. Mikrobiyhteisöjen koostumuksen on todettu myös olevan erilainen eri
kasvilajien juuristossa. Mikrobiyhteisöjen rakenteeseen juuristossa vaikuttaa kasvilajin
lisäksi kasvin juurieritteiden koostumus, juurten rakenne, kasvin ikä sekä maan
ominaisuudet. Gramnegatiivisten bakteerien, kuten Pseudomonassuvun edustajien on
todettu olevan vallitsevia ritsosfäärissä. (Kuiper ym. 2004)
Haittaaineiden tehostunut hajotus ritsosfäärissä perustuu pääasiassa mikrobien
kohonneeseen lukumäärään sekä korkeampaan metaboliseen aktiivisuuteen (Kuiper ym.
2004). Tosin on esitetty ainakin joidenkin kasvien juurieritteiden edistävän erityisesti
polyaromaattisten hiilivetyjen (PAH) hajotusta (Parrish ym. 2005, Spriggs ym. 2005).
Parrish ym. (2005) tutkivat PAHyhdisteiden hajoamista rohtomesikän (Melilotus
officinalis) ja ruokonatan (Festuca arundinacea) juuristossa. He totesivat
kasvihuonekokeissaan erityisesti rohtomesikän juuriston tehostavan merkittävästi
polyaromaattisten hiilivetyjen hajoamista. Parrish ym. uskovat PAH:ien tehostuneen
hajotuksen johtuvan kasvin juurisolujen erittämistä rengasrakenteisista yhdisteistä, jotka
aktivoivat epäspesifisiä, rengasrakenteisia yhdisteitä hajottavia entsyymejä. He esittävät
näiden entsyymien osallistuvan myös PAH:ien hajotukseen.
29
Useiden haittaaineiden on todettu hajoavan tehokkaammin usean kasvilajin yhteisössä
kuin monokulttuurissa (Maila ym. 2005, Palmroth ym. 2002). Maila ym. vertailivat
Brachiaria serrata kasvin ja sormihirssin (Eleusine coracana) vaikutusta PAH
yhdisteiden hajoamiseen kyseisten kasvien monokulttuureissa sekä niiden yhteisössä.
Maila ym. totesivat Brachiarian ja sormihirssin yhteisön tehostavan PAH:ien hajotusta
huomattavasti enemmän kuin kyseisten kasvien monokulttuurien. Monokulttuuriin
verrattuna usean kasvilajin yhteisö ylläpitää maassa monimuotoisempaa mikrobistoa, ja
tarjoaa siten paremmat edellytykset hajottaa hankalasti hajoavia yhdisteitä, kuten PAH
yhdisteitä.
Eri kasvilajien kyky edistää haittaaineiden hajotusta juuristonsa avulla poikkeaa
huomattavasti toisistaan. Palmroth ym. (2002) vertailivat neljän erilaisen kasvipeitteen,
männyn taimiston, poppelin taimiston, ruohokasviyhteisön ja palkokasviyhteisön, kykyä
edistää dieselöljyn hajotusta. He totesivat tutkimuksessaan palkokasvien edistävän selvästi
tehokkaimmin dieselöljyn hajotusta. Ruohokasviyhteisön ei puolestaan todettu
merkittävästi edistävän dieselöljyn hajotusta.
Lisäksi Palmroth ym. (2002) totesivat kaksivuotisen kokeensa aikana dieselöljyn häviävän
selvästi nopeammin maasta kokeen toisena vuonna, jolloin dieselöljyä lisättiin samaan
maahan toiseen kertaan kokeen toistamiseksi. Palmroth ym. päättelivät ritsosfäärin
mikrobiston sopeutuneen öljynhajotukseen ja öljynhajottajien rikastuneen maassa kokeen
ensimmäisen vuoden aikana.
Joissain tapauksissa kasvien ei ole todettu edistävän lainkaan haittaaineiden hajotusta,
vaan vaikutus on voinut olla jopa päinvastainen. Lalende ym. (2003) seurasivat
kenttäkokeessaan kymmenen kuukauden ajan pyreenin hajoamista italianraiheinän (Lolium
multiflorum) juuristossa ja vertasivat sitä kasvittomaan verrokkimaahan. He totesivat
yllätyksekseen pyreenin hajoavan jopa nopeammin kasvittomassa verrokkimaassa kuin
tutkimuksen kohteena olevassa kasvillisessa maassa. Syyksi tähän Lalende ym. esittävät
kasvien juurten erittämiä orgaanisia yhdisteitä, joita osa pyreenin hajottajista mahdollisesti
käyttää pyreenin sijasta energian ja hiilenlähteinään. Vaikeasti hajoavien yhdisteiden
hajoaminen maaperässä voi näin ollen myös hidastua kasvien läsnäollessa niiden tuottaessa
maaperään helpommin hyödynnettäviä energian ja hiilenlähteitä.
30
Toisaalta hyödynnettäessä eri kasvilajeja ja mahdollisesti hieman erilaisia olosuhteita, on
todettu pyreenin hajotuksen tehostamisen olevan mahdollista ritsoremediaation avulla.
Esimerkiksi Chen ym. (2003) ovat omassa tutkimuksessaan todenneet pyreenin hajotuksen
olevan huomattavasti tehokkaampaa sekä ruohonatan (Festuca arundinacea) että
luutahirssin (Panicum virtacum L.) ritsosfäärissä kuin verrokkina toimivassa kasvittomassa
maassa.
Toimiessaan ritsoremediaatio on edullinen ja erittäin ympäristöystävällinen menetelmä.
Sen lisäksi että ritsoremediaation avulla voidaan edistää haittaaineiden hajotusta, kasvit
parantavat maan ominaisuuksia ravitsemalla ja ilmastamalla maata. Lisäksi kasveja
voidaan hyödyntää saastuneen maaalueen maisemoinnissa. Ritsoremediaatio tosin vaatii
usein usean kasvukauden ennen kuin saadaan näkyviä tuloksia. (Scragg 2005a, Sylvia ym.
2005)
3. Bioremediaation tutkimusmenetelmät
öljyllä saastuneilla maaalueillaBioremediaatio perustuu suurimmalta osaltaan mikrobien kykyyn hajottaa haittaaineita.
Näin ollen on tärkeää tuntea bioremediaation taustalla olevat mikrobiologiset prosessit.
Ensimmäiset öljynhajotuksen mikrobiologiaa koskevat tutkimukset hyödynsivät erilaisia
viljelymenetelmiä, joiden avulla rikastettiin öljynhajottajia tai määritettiin öljynhajottajien
lukumääriä erilaisissa näytteissä (Mills ym. 1978, Walker ja Colwell 1976). Tällä hetkellä
mikrobiologinen tutkimus hyödyntää enenevässä määrin erilaisia molekyylibiologisia
menetelmiä. Molekyylibiologiset menetelmät perustuvat solun molekyylien, kuten
nukleiinihappojen, proteiinien ja rasvahappojen, tutkimiseen.
Seuraamalla bioremediaation mikrobiologisia tapahtumia, kuten hajottajamikrobien
lukumääriä ja aktiivisuutta hajotusprosessin aikana, voidaan saada käsitys bioremediaation
etenemisestä ja tehokkuudesta kunakin ajankohtana. Tarkasteltaessa saastuneen maa
alueen mikrobiyhteisöjä ja niissä tapahtuvia muutoksia voidaan selvittää bioremediaation
mikrobiekologisia vaikutuksia maaperässä.
31
Tutkittaessa bioremediaatiota on mikrobiologisen tutkimuksen rinnalla tarpeellista
kuitenkin hyödyntää myös muita menetelmiä. Esimerkiksi öljyyhdisteiden pitoisuuksissa
tapahtuvia muutoksia bioremediaatioprosessin aikana on helpointa seurata kemiallisilla
menetelmillä (IvnacevTumbas ym. 2004). Muutoksia maaperän myrkyllisyydessä voidaan
seurata erilaisilla toksisuustesteillä. Fernandez ym. (2005) painottavat artikkelissaan
toksisuustestien merkitystä tutkittaessa saastuneita maaalueita ja huomauttavat pelkkien
kemiallisten menetelmien antavan joissain tapauksissa virheellisen kuvan maaperän
saastuneisuudesta.
Fernandezin ym. (2005) mukaan toksisuustestien etu kemiallisiin menetelmiin verrattuna
on, että niiden avulla voidaan myös selvittää hajoamisprosesseissa syntyvien väli ja
sivutuotteiden myrkyllisyyttä sekä erilaisten yhdisteiden yhteisvaikutusta. Lisäksi
toksisuustestien avulla saadaan myös käsitys maaperän myrkyllisten yhdisteiden
biosaatavuudesta, jota kemiallisilla menetelmillä ei voida selvittää. Fernandez ym. (2005)
mainitsevat myös, että tutkittaessa ikääntyneitä maita, joissa myrkylliset yhdisteet ovat
sitoutuneet hyvin tiukasti maahan, kemialliset analyysit voivat yliarvioida haittaaineiden
todellista riskiä. Tiukasti maahan sitoutunut myrkyllinen yhdiste ei ole biosaatavaa eikä
siten aiheuta välitöntä riskiä maaperän eliöstölle (Fernandez ym. 2005).
Jotta voidaan saada luotettava ja kattava kuva bioremediaation etenemisestä saastuneella
maaalueella, on järkevää hyödyntää useita seurantamenetelmiä yhtäaikaisesti. Taulukkoon
2 on koottu bioremediaation tutkimuksessa yleisimmin käytettyjä tutkimusmenetelmiä.
Taulukko 2. Öljyllä saastuneiden maiden bioremediaation tutkimusmenetelmiä. Kirjaimet A, B, C ja D edustavat erityyppisiä menetelmiä siten, että Atarkoittaa viljelypohjaisia menetelmiä, B molekyylibiologisia menetelmiä, C kemiallisia menetelmiä ja D ekotoksikologisia menetelmiä.
Tutkimusaihe Menetelmä ViiteMaljaus Walker ja Colwell 1975Viljeltävien öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevien mikrobien
lukumäärän määritys MPNmenetelmä Wrenn ja Venosa 1996
Öljyhiilivetyjen hajotukseen kykenevien mikrobien eristys Maljaus Mills ym. 1978
A
Saastuneen maan mikrobiyhteisön hiilenkäyttöprofiilin muutostenseuraaminen Biolog Hadwin ym. 2006
Valitun geenien kopioluvun määrittäminen maanäytteistä Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR Powell ym. 2006
Valitun mikrobiryhmän edustajien lukumäärän määrittäminen suoraanmaanäytteistä Fluoresenssi insitu hybridisaatio (FISH) Duteau ym. 1998 ja
Jjemba ym. 2006
Valitun yhdisteen hajotukseen osallistuvien aktiivisten mikrobientutkiminen Stable isotope probing (SIP) Singleton ym. 2005
Rasvahappoanalyysi (PLFA) Hadwin 2006
Denaturoiva gradienttigeelieletroforeesi (DGGE) Koizumi ym. 2002
B
Mikrobiekologisten muutosten seuraaminenTerminaalisen restriktiofragmentin pituuspolymorfia(TRFLP) Katsivela ym. 2005
Öljyhiilivetyjen pitoisuuksien määrittäminen kaasukromatografiamassaspektrometria (GCMS) IvancevTumbas ym. 2004CMaaperän mikrobien öljyhiilivetyjen hajotuspotentiaalin määrittäminen Leimattujen 14Cyhdisteiden mineralisaatio Tuomi ym. 2004
Vibrio fischeri valobakteeritesti Juvonen ym. 2000
Kasvien itäminen / biomassan tuotto Fernandez ym. 2005D
Maaperän toksisuuden selvittäminen
Kastematojen elinkykyisyys Fernandez ym. 2005
33
3.1 Viljelyyn perustuvat menetelmät
Öljynhajotukseen kykeneviä mikrobeja on tutkittu 1900luvun alusta lähtien (Bushnell ja
Haas 1941, Edmonds ja Cooney 1966). 1900luvun alkupuolella öljynhajottajamikrobeja
tutkittiin viljelemällä niitä joko nestemäisille tai kiinteille kasvatusalustoille. Käyttämällä
sopivaa kasvatusalustaa ja olosuhteita on onnistuttu rikastamaan muun muassa
maanäytteistä halutunlaisia mikrobeja. Öljynhajottajia tutkittaessa on perinteisesti käytetty
kasvatusalustaa, jossa ainoana hiilenlähteenä on jokin öljyn yhdiste (Bushnell ja Haas
1941).
Viljelymenetelmien avulla pystytään eristämään haittaaineiden hajotukseen kykeneviä
mikrobeja tarkempia tutkimuksia varten (Bushnell ja Haas 1941) tai voidaan esimerkiksi
määrittää elinkykyisten mikrobien lukumäärää maanäytteistä (Mills ym. 1978, Walker ja
Colwell 1976) joko maljaamalla tai niin kutsutulla MPNmenetelmällä.
Viljelymenetelmien suurimpana rajoituksena on, että niiden avulla voidaan tutkia vain
hyvin pientä osaa maaperän kaikista mikrobeista. Kirkin ym. (2005) mukaan
tämänhetkisillä viljelymenetelmillä pystytään maaperän mikrobilajeista tutkimaan
ainoastaan noin yhtä prosenttia.
3.1.1 MPN
MPN on lyhenne sanoista most probable number eli todennäköisin lukumäärä.
Menetelmän kehitti Joseph Lister jo 1800luvun puolivälissä heterotrofisen
kokonaisbakteerilukumäärän määrittämiseen. MPNmenetelmässä nestemäistä näytettä
laimennetaan kunnes viimeisimmissä laimennuksissa ole enää lainkaan tutkimuksen
kohteena olevia mikrobeja. Tämän jälkeen laimennussarja viljellään ravintoliemiputkiin.
Mitä useampia rinnakkaisia putkia käytetään, sitä luotettavampi tulos saadaan.
Kasvatuksen jälkeen lasketaan samentuneiden eli kasvua sisältävien putkien lukumäärät
kullakin laimennustasolla ja arvioidaan niiden perusteella alkuperäisen näytteen
todennäköisin mikrobilukumäärä eli MPN.
Nykyään menetelmää käytetään myös monien spesifisten mikrobiryhmien, kuten
öljynhajottajien, tutkimiseen. Kun tutkitaan öljynhajottajia MPNmenetelmällä, käytetään
34
kasvualustana jotain hiiletöntä alustaa, johon lisätään öljyä ainoaksi hiilenlähteeksi. Tällöin
vain öljyä ravinnokseen käyttävät mikrobit kasvavat alustalla.
MPN:ssä oletetaan, että mikrobit ovat tasaisesti jakautuneena nestemäisessä näytteessä ja
että jokaisen laimennuksen rinnakkaiset näytteet sisältävät saman keskimääräisen
mikrobilukumäärän (RiserRoberts 1998). Tämä oletus ei kuitenkaan koskaan täysin
toteudu, sillä mikrobit eivät koskaan ole näytteessä täysin tasaisesti jakautuneina. Tästä
johtuen MPNmenetelmä on epätarkka ja sen avulla saadaan vain likimääräinen käsitys
viljeltävien mikrobien lukumäärästä tutkittavissa näytteissä (RiserRoberts 1998).
MPNmenetelmää voidaan käyttää sekä prokaryooteille että eukaryooteille ja kasvatus
voidaan tehdä sekä hapellisissa että hapettomissa oloissa. Edellytys on, että kasvatuksen
jälkeen mikrobien kasvu voidaan havaita jollain menetelmällä. Mikrobien kasvua on MPN
menetelmissä mitattu muun muassa hapon tuoton tai kasvualustan samentumisen
perusteella (RiserRoberts 1998). Lisäksi voidaan hyödyntää erilaisia
soluhengistysindikaattoreita, jotka osoittavat värireaktiolla metabolisesti aktiivisten solujen
läsnäolon (RiserRoberts 1998).
Soluhengitysindikaatoreina MPNmenetelmissä on käytetty esimerkiksi
tetratsoliumsuoloihin kuuluvia 2(piodofenyyli)3(pnitrofenyyli)5fenyylitetratsolium
kloridia (INT) (Haines ym. 1996, Mosher ym. 2003) sekä 4[3(4iodofenyyli)2(4
nitrofenyyli)2H5tetratsolio]1,3benseenidisulfonaattia (WST1) (Johnsen ym. 2002).
Tetratsoliumsuolojen toiminta perustuu siihen, että ne pystyvät ottamaan vastaan
elektroneja solujen hengitysketjuun kuuluvalta dehydrogenaasientsyymiltä ja pelkistyvät
tällöin värilliseksi formatsaaniksi (kuva 5). Tetrasoliumsuoloihin kuuluvien INT ja WST
1yhdisteiden värireaktiot voidaan määrittää silmämääräisesti. Lisäksi käytettäessä WST1
reagenssia voidaan hyödyntää myös sen muodostaman formatsaanin absorptiomaksimia
450 nanometrissä ja lukea tulokset absorptiolukijalla (Johnsen ym. 2002).
35
Kuva 5. Tetratsoliumsuolojen rakenne ja elektronien siirtyminen dehydrogenaasiltatetratsoliumsuoloille. Kuva muokattu Dojindo Molecular Technologies:in sivuilta otetustakuvasta (www.dojindo.com).
Ensimmäiset MPNmenetelmät öljynhajottajien lukumäärien määrittämiseen kehitettiin
1970luvulla (Mills ym. 1978, Walker ja Colwell 1976). Määritykset tehtiin koeputkissa ja
kasvun määrittäminen tapahtui silmämääräisesti kasvualustan samentumisen perusteella.
Vuonna 1990 Brownin ja Braddockin julkaisema Sheen Screen MPNmenetelmä tehtiin
24kuoppalevyllä ja tällöin kasvun havainnointi ei enää perustunut kasvualustan
samentumisen seuraamiseen. Brownin ja Braddockin (1990) menetelmässä kuoppalevyllä
olevien näytelaimennusten päälle ruiskutettiin ohut raakaöljykalvo. Kasvatuksen jälkeen
positiivisiksi kaivoiksi laskettiin kaivot, joissa pinnalla oleva öljykalvo oli emulgoitunut eli
hajonnut pieniksi pisaroiksi.
Vuonna 1996 sekä Haines ym. että Wrenn ja Venosa julkaisivat molemmat 96
kuoppalevyllä tehtävän MPNmenetelmän, jossa ensimmäistä kertaa hyödynnettiin
öljynhajottajien lukumäärän määrittämiseen tetrasoliumsuoloihin kuuluvaa
soluhengitysindikaatoria INT:ä. Haines ym. (1996) käyttivät kehittämäänsä menetelmää
öljynhajottajien kokonaislukumäärän määrittämiseksi. Wrenn ja Venosa (1996) puolestaan
määrittivät öljynhajottajien kokonaislukumäärän lisäksi ensimmäistä kertaa MPN
menetelmällä myös alkaanien ja aromaattisten öljyhiilivetyjen hajottajien lukumääriä.
Wrenn ja Venosa (1996) totesivat tutkimuksissaan, ettei soluhengitysindikaattori INT
sovellu PAH:in hajottajien lukumäärän määrittämiseen. He kuitenkin huomasivat, että
PAHyhdisteiden hajotessa muodostuu keltaruskeita hajoamistuotteita, jotka ovat
silminhavaittavissa näytekaivojen pohjalla. Nämä kaivot he määrittivät aromaattisten
36
yhdisteiden hajottajille kehittämässään MPNmenetelmässä positiiviksi kaivoiksi.
Käytettäessään INT soluhengitysindikaattoria öljynhajottajien kokonaislukumäärän
määrittämiseen Wrenn ja Venosa (1996) havaitsivat muutamia vääriä positiivisia reaktioita.
Myös Mosher ym. (2003) mainitsevat artikkelissaan, että INT soluhengitysindikaattorin
on todettu jossain tutkimuksissa reagoivan epätoivotusti joidenkin liuottimien kanssa.
Vuonna 2002 Johnsen ym. julkaisivat uuden 96kuoppalevyllä tehtävän MPNmenetelmän
PAH:in hajottajien lukumäärän määrittämiseen. Menetelmässä positiiviset kaivot
määritetään silmämääräisen arvioinnin sijasta absorptiolukijalla. Menetelmä hyödyntää
tetrasoliumsuoloihin kuuluvaa WST1 soluhengitysindikaattoria, joka voidaan
pelkistyneen yhdisteen vesiliukoisuuden ansiosta määrittää myös absorptiolukijalla. Näin
ollen saadaan yksiselitteiset tulokset, jotka eivät riipu tuloksia lukevasta henkilöstä.
Johnsen ym. (2002) nimittäin totesivat, että kun useampi henkilö määritti samoja INT
soluhenhditysindikaattorin avulla saatuja tuloksia, eri henkilöiden saamat tulokset usein
poikkesivat toisistaan huomattavasti.
Bioremediaatiotutkimuksissa on useimmin hyödynnetty Wrennin ja Venosan (1996)
kehittämää INTsoluhengitysindikaattoriin käyttöön perustuvaa MPNmenetelmää (Kirk
ym. 2005, Miya ja Firestone 2001). Menetelmän avulla on määritetty
bioremediaatiotutkimuksissa sekä öljynhajottajien kokonaislukumääriä että PAH:in
hajottajien lukumääriä. Bachoon ym. (2001a) puolestaan ovat käyttäneet omassa
bioremediaatiotutkimuksessaan Brownin ja Braddockin (1990) kehittämää Sheen Screen
menetelmää öljynhajottajien kokonaislukumäärän määrittämiseen. Myös joitain uusia
MPNmenetelmiä on kokeiltu viimeaikaisissa bioremediaatiotutkimuksissa (Brakstad ja
Lødeng 2005).
MPNmenetelmä on käyttökelpoinen silloin kun halutaan seurata mikrobipopulaatioissa
tapahtuvia suuria muutoksia (RiserRoberts 1998). Jotta saadaan tarkempi ja kattavampi
kuva maaperän mikrobistosta, on viljelyyn perustuvien menetelmien lisäksi hyvä käyttää
joitain molekyylibiologisia, kuten DNApohjaisia, menetelmiä.
37
3.2 DNApohjaiset menetelmät
DNAmenetelmien avulla tarkasteluun voidaan sisällyttää myös ne mikrobilajit, joita ei
tämän hetkisillä menetelmillä pystytä viljelemään. Käytettäessä DNApohjaisia
menetelmiä tutkittavia mikrobeja ei tarvitse viljellä vaan DNA voidaan uuttaa suoraan
näytteistä. DNA:n eristyksen jälkeen tutkittava kohde rajataan valitsemalla oikeanlaiset
alukkeet tai koettimet haluttujen geenisekvenssien tutkimiseen.
Tärkeintä hyödynnettäessä DNApohjaisia menetelmiä ympäristönäytteille onkin valita
käytettävät alukkeet huolellisesti. Alukkeiden tai koettimien suunnittelu ja valinta ei
kuitenkaan aina ole aivan yksinkertaista (Baker ym. 2003). Alukkeiden tulee olla spesifiset
tutkittavalle geenille, mutta toisaalta riittävän degeneroituneet, jotta niiden avulla voidaan
tutkia mahdollisimman laajasti kyseisen geenin esiintymistä maaperän mikrobistossa
(Baker ym. 2003). Jotta tarkastelu pystytään rajaamaan tarkasti haluttuun kohteeseen,
esimerkiksi tiettyyn mikrobilajiin tai ryhmään, on tutkittavasta geenistä oltava riittävästi
sekvenssitietoa.
Jos tutkimuskohdetta taas ei haluta rajata tiettyyn ryhmään, vaan sen sijaan halutaan tutkia
maaperän mikrobiekologiaa mahdollisimman laajasti, on käytettävä niin sanottuja
universaaleja alukkeita ja koettimia, jotka teoriassa ovat komplementaarisia kaikkien
maaperän mikrobien tietyn geenin geenisekvenssiin. Kuten Baker ym. (2003) kuitenkin
artikkelissaan toteavat, kaikkien maaperän mikrobien geenisekvenssejä ei yhdellä
alukeparilla tai koettimella pystytä kattamaan. Näin ollen kehitettäessä näitä ns.
universaaleja alukkeita, voidaan ainoastaan pyrkiä kattamaan mahdollisimman suuri osa
maaperän mikrobiston geenisekvensseistä. Kaikkien maaperän mikrobien yhtäaikainen
tutkiminen on mahdotonta (Baker ym. 2003).
Mikrobilukumäärän määrittäminen
DNApohjaisista menetelmistä muiden muassa kvantitatiivista reaaliaikaista PCR:ää (Q
RTmPCR), sekä mikroskopointiin perustuvaa FISH (eng. fluorescent in situ hybridization)
menetelmää voidaan käyttää mikrobilukumäärien määrittämiseen maanäytteistä.
Käytettäessä QRTmPCR:ää on maanäytteistä ensin eristettävä DNA. FISHmenetelmässä
eristystä tai rikastusta ei tarvita.
38
Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR:ää (QRTmPCR) perustuu valitun geenin
monistamiseen näytteistä. Sitä on käytetty useiden eri mikrobiryhmien edustajien
lukumäärän määrittämiseen maanäytteistä (Henry ym. 2004, Kurola ym. 2005, Labrenz ym.
2004). Muutamissa tutkimuksissa on QRTmPCR:llä määritetty ympäristönäytteistä myös
bakteerien kokonaislukumääriä (Bach ym. 2002, Takahashi ym. 2006). On kuitenkin tärkeä
muistaa, että menetelmällä ei varsinaisesti määritetä mikrobien lukumäärää vaan sen sijaan
valitun geenin kopiolukua (Zhang ja Fang 2006). Tämä on tärkeää huomata, koska tiettyjen
geenien kopioluku voi vaihdella suuresti eri bakteerilajien välillä. Esimerkiksi
määritettäessä mikrobien kokonaislukumäärää monistamalla 16S rRNAgeeniä, ongelmana
on, että bakteerien 16SrRNAgeenikopioluvut vaihtelevat eri bakteerilajien välillä yhdestä
geenikopiosta jopa 13 kopioon (Bach ym. 2002). Tällöin näytteen todellisen
mikrobilukumäärän arvioiminen geenikopioluvun perusteella on todella hankalaa.
Mikroskopointiin perustuvassa FISHmenetelmässä käytetään kiinnostuksen kohteena
olevalle mikrobiryhmälle spesifisiä fluoresoivia nukleotidikoettimia, joiden avulla voidaan
tutkittavaan ryhmään kuuluvat mikrobit erottaa fluoresenssimikroskopialla näytteen muista
mikrobeista. Koska mikroskopointi voidaan tehdä myös suoraan maanäytteistä,
menetelmässä ei synny bakteerien tai DNA:n eristyksestä johtuvaa virhettä. Toisaalta
menetelmä on hyvin työläs ja bakteerien tunnistaminen maapartikkelien seasta voi olla
hankalaa.
Mikrobiekologian tutkiminen
Kun halutaan saada kokonaiskuva maaperän mikrobiekologiasta, hyödynnetään
tutkimuksissa usein 16S rRNAgeeniä (Baker ym. 2003). 16S rRNAgeeni koodaa
ribosomien pienempää alayksikköä ja se löytyy kaikilta bakteereilta. Se sisältää sekä
vaihtelevia että konservoituneita alueita. Kun halutaan tutkia yhtäaikaisesti
mahdollisimman suurta osaa maaperän mikrobeista, suunnitellaan alukkeet
konservoituneelle alueelle. Kun halutaan tutkia tiettyä mikrobiryhmää, hyödynnetään
puolestaan vaihtelevia alueita. Toinen vaihtoehto haluttaessa rajata tutkimus pienempään
mikrobijoukkoon, on valita tutkittavaksi geeni, joka löytyy vain kiinnostuksen kohteena
olevan ryhmän mikrobeilta. Kun halutaan tutkia esimerkiksi öljynhajotukseen kykeneviä
mikrobiyhteisöjä, voidaan valita tutkittavaksi jokin öljynhajotukseen osallistuva geeni.
39
Öljyllä saastuneiden maiden mikrobiekologisissa tutkimuksissa on käytetty monia erilaisia
DNAsormenjälkimenetelmiä, kuten denaturoivaa gradienttigeelielektroforeesia (DGGE)
(Koizumi ym. 2002), terminaalisen restriktiofragmentin pituuspolymorfiaa (TRFLP)
(Katsivela ym. 2005) ja pituusheterogeniaPCR:ää (LHPCR) (Mills ym. 2003). Kaikki
edellä mainitut menetelmät perustuvat tutkittavan geenissekvenssin monistamiseen.
Monistamisen jälkeen erilaiset geenisekvenssit erotellaan toisistaan ja erilaisten
geenisekvenssien lukumäärä ja esiintyvyys näytteissä määritetään. Edellä mainittuja DNA
sormenjälkimenetelmiä voidaan hyödyntää tutkittaessa laajasti maaperän mikrobiekologiaa
tai silloin kun halutaan keskittyä tutkimaan vain tiettyä mikrobiryhmää.
Aktiivisten mikrobien tutkiminen
Yksi tapa tutkia maanäytteiden aktiivisia mikrobeja on keskittyä RNA:n tutkimiseen (Ka
ym. 2001, Prosser 2002, Sharma ym. 2005). Prosser (2002) jakaa artikkelissaan RNA:n
tutkimusmenetelmät kahteen eri tapaan. Ensinnäkin voidaan keskittyä tutkimaan lähetti
RNA:ta. Tällöin voidaan selvittää mitkä geenit ovat aktiivisia vallitsevissa olosuhteissa.
LähettiRNA:n tutkiminen voi kuitenkin olla hankalaa muun muassa lähettiRNA:n lyhyen
puoliintumisajan takia. Toinen vaihtoehto onkin tutkia solujen ribosomaalista RNA:ta.
Ribosomaalisen RNA:n määrä on soluissa moninkertainen verrattuna lähettiRNA:han ja
tämän takia ribosomaalisen RNA:n eristäminen ja tutkiminen on huomattavasti helpompaa.
Ribosomaalisen RNA:n tutkiminen perustuu oletukseen, että aktiivisissa mikrobeissa on
lepotilassa olevia mikrobeja huomattavasti enemmän ribosomeja (Prosser 2002).
SIP (eng. stable isotope probing) on kehitetty metabolisesti aktiivisten mikrobien
tutkimiseen (Lueders ym. 2004, Singelton ym. 2005). Menetelmä perustuu leimattujen
substraattien käyttöön. Tutkittava yhdiste, esimerkiksi jokin öljyn yhdiste, leimataan hiilen
painavammalla isotoopilla 13C ja tutkittavaa maanäytettä inkuboidaan tämän painavamman
yhdisteen läsnä ollessa (Singelton ym. 2005). Tällöin tutkittavaa yhdistettä hajottavien
mikrobien DNA leimautuu muuta DNA:ta painavammaksi, hiilen painavamman isotoopin
liittyessä metabolian seurauksena osaksi mikrobien DNA:ta. Tämä painavampi DNA
voidaan DNA:n eristyksen jälkeen erottaa muusta DNA:sta ultrasentrifugoinnilla (Lueders
ym. 2004, Singelton ym. 2005). Tällä tavoin voidaan keskittyä tutkimaan ainoastaan tiettyä
yhdistettä hajottavia mikrobeja.
40
3.2.1 DNA:n eristys maanäytteistä
Sovellettaessa DNApohjaisia menetelmiä ympäristönäytteille joudutaan usein eristämään
ensin näytteen kokonaisDNA. Frostegård ym. (1999) jakavat artikkelissaan maanäytteiden
DNA:n eristysmenetelmät kahteen eri tapaan. Ensinnäkin DNA voidaan eristää suoraan
maanäytteistä tai vaihtoehtoisesti voidaan maanäytteestä ensin eristää solut, minkä jälkeen
eristetyistä soluista tehdään DNA:n eristys. Frostegård ym. (1999) mainitsevat solujen
eristykseen perustuvien menetelmien etuna huomattavasti puhtaamman DNA:n sekä sen,
että solunulkoista DNA:ta uuttuu menetelmällä hyvin vähän. Toisaalta Frostegård ym.
(1999) mainitsevat, että yleensä DNA:n eristystä varten saadaan eristettyä ainoastaan noin
2535 % kaikista maanäytteen soluista. Tämä voi johtaa Frostegårdin ym. (1999) mukaan
vääristyneeseen kuvaan maaperän mikrobiyhteisön rakenteesta. Eri mikrobilajien edustajat
sitoutuvat eri tavalla maapartikkeleihin, jolloin tietyn bakteerilajin edustajat uuttuvat
maanäytteistä toisia helpommin.
MaaDNA:n eristykseen tuo usein virhettä myös se, että solujen hajotusmenetelmät
vaikuttavat eri tavalla eri tyyppisiin soluihin. On todettu muun muassa että gram
positiivisten bakteerien DNA:n vapauttaminen soluista on huomattavasti hankalampaa kuin
gramnegatiivisten bakteerien (Frostegård ym. 1999). Tämä johtuu siitä, että gram
positiivisten bakteerien soluseinä on kestävämpi erilaisille hajotusmenetelmille kuin gram
negatiivisten bakteerien.
Edustavan DNAnäytteen saamista hankaloittaa lisäksi se, että eri bakteerilajit jakautuvat
maahan epätasaisesti. Grampositiivisten aktinobakteerien on todettu olevan valtalajeja
maaaggregaattien sisällä ja gramnegatiivisten ja proteobakteerien maaaggregaattien
pinnoilla (Mummey ja Stahl 2004). Tämän lisäksi bakteerit esiintyvät maassa usein
rykelminä. Toisin sanoen maaperän tietyissä kohdissa, ns. hot spoteissa, mikrobiaktiivisuus
voi olla moninkertainen ympärillä olevaan maahan verrattuna. Bakteerien epätasainen
jakautuminen maassa on hyvin merkittävää erityisesti koska DNAuuttoon otetaan yleensä
hyvin pieni näyte (Kirk ym. 2004). Sovellettaessa DNApohjaisia menetelmiä
maanäytteille DNAuutto on merkittävä virhelähde (Kirk 2004).
41
3.2.2 DNA:n pitoisuuden mittaus
DNApitoisuuden määrittäminen on monissa DNApohjaisissa menetelmissä välttämätöntä
(Singer ym. 1997). Sen lisäksi erilaisten DNApitoisuusmittausten avulla saadaan tietoa
muun muassa DNAuuton onnistumisesta, näytteiden puhtaudesta sekä DNAmolekyylien
hajonneisuudesta. Karkeasti DNA:n pitoisuuden mittausmenetelmät voidaan jakaa kahteen
ryhmään, spektrofotometrisiin sekä fluoresoivia väriaineita hyödyntäviin
mittausmenetelmiin.
Spekrofotometrinen mittaus
Helpoin ja nopein menetelmä DNApitoisuuden määritykseen on spektrofotometrinen
mittaus, joka perustuu DNA:n absorptiomaksimiin 260 nm:ssä. Kokeellisesti on osoitettu,
että kun puhtaan DNAliuoksen absorptio 260 nm:ssä on 1, vastaa se DNAkonsentraatiota
50 g/ml (Suominen ja Ollikka, 1999).
Spektrofotometrisen mittauksen avulla voidaan myös määrittää DNAnäytteen puhtautta.
Tämä tehdään mittaamalla DNAnäytteen absorptiota 260 nm:n lisäksi myös
aallonpituuksilla 280 nm ja 230 nm (NanoDrop® Tecnologies 2004). Näillä
aallonpituuksilla saatujen tulosten avulla lasketaan DNAnäytteelle sen puhtaudesta
kertovat suhdeluvut A260nm/A280nm sekä A260nm/A230nm. Puhtaalle DNA:lle suhdeluku
A260nm/A280nm on noin 1,8 ja puhtaalle RNA:lle noin 2,0. Kun A260nm/A280nm suhdeluku on
DNAnäytteelle alle 1,8 ja RNAnäytteelle alle 2,0 sisältää näyte todennäköisesti myös
proteiineja, fenoleja tai muita epäpuhtauksia. On huomattava, että DNAnäytteessä, jossa
proteiinikontaminaatio laskee A260nm/A280nm suhdeluvun arvoa, RNAkontaminaatio
puolestaan nostaa tätä. Näin ollen DNAnäytteiden, joissa on sekä proteiini että RNA
epäpuhtauksia, puhtaudesta on vaikea sanoa mitään A260nm/A280nm suhdeluvun avulla.
Tällöin voidaan turvautua suhdelukuun A260nm/A230nm, jonka arvo on puhtaalle DNA:lle
noin 1,82,2. Jos suhdeluvun arvo on näytteelle merkittävästi pienempi, on DNAnäyte
todennäköisesti epäpuhdas. (Suominen ja Ollikka, 1999)
Perinteisen spektrofotometrisen mittauksen heikkous on se että, mittaus vaatii paljon
DNA:ta, jota ei mittauksen jälkeen voida hyödyntää muihin tarkoituksiin. Nykyään on
kuitenkin kehitetty myös spektrofotometrejä, joilla DNApitoisuden mittaus voidaan tehdä
jopa 1 l:sta DNAuutetta. Tälläinen laite on NanoDrop® ND1000 UVVis –
42
spektrofotometri (NanoDrop® 2004). Laite pystyy mittaamaan kaksijuosteisen DNA
pitoisuuksia yhden mikrolitran tilavuudesta konsentraatioalueella 2 ng/ l 3700 ng/ l
(NanoDrop® 2004).
Tämä ei kuitenkaan poista spektrofotometrisen mittauksen suurinta ongelmaa.
Spektrofometristä mittausta voidaan nimittäin soveltaa luotettavasti vain puhtaille DNA
uutteille. Esimerkiksi maasta eristetyssä DNA:ssa on niin paljon mittausta häiritseviä
epäpuhtauksia, että saatujen tulosten tarkkuuteen ei voida luottaa (Kabir ym. 2003). Maa
DNAuutteille käytetäänkin usein fluoresoiviin väriaineisiin perustuvia mittausmenetelmiä
(Sandaa ym. 1998).
Fluoresoiviin väriaineisiin perustuva mittaus
Monet DNApitoisuuden mittausmenetelmät perustuvat erilaisten fluoresoivien DNA
värien käyttöön. Yleisin näistä menetelmistä on geelielektroforeesi, jossa DNAnäytteet
ajetaan sähkövirran avulla agaroosigeelissä. Tämän jälkeen DNA saadaan näkyviin
etidiumbromidin avulla. Etidiumbromidi sitoutuu DNA:han ja fluoresoi DNA:han
sitoutuneena kirkkaasti UVvalossa. DNA:n pitoisuus voidaan arvioida geeliltä
silmämääräisesti vertaamalla näytejuovien fluoresenssin määrää tunnettuihin DNA
standardeihin, jotka ajetaan geelillä näytteiden kanssa. Menetelmän etuna on, että proteiinit
ja pienet määrät RNA:ta eivät häiritse määritystä. Lisäksi geelielektroforeesin avulla
voidaan määrittää myös DNAmolekyylien kokoa, jota ei spektrofotometrisellä
mittauksella voida tehdä. Geelielektroforeesimenetelmä on kuitenkin hyvin epätarkka,
koska se perustuu vain silmämääräiseen määritykseen, eikä se sovellu matalille DNA
pitoisuuksille (Suominen ja Ollikka 1999).
Tarkimpiin mittaustuloksiin päästään mitattaessa DNA:han sitoutuvien väriaineiden
fluoresenssia fluoresenssin intensiteettiä mittaavilla laitteilla eli fluorometreillä. Tällöin
fluoresenssin voimakkuus voidaan muuttaa DNApitoisuudeksi standardisuoran avulla.
Yksi DNApitoisuuden fluorometrisissä mittauksissa yleisesti käytetty väriaine on
PicoGreen® (Molecular Probes® 2003, Sandaa ym. 1998). Käytettäessä PicoGreen® :iä
voidaan fluorometrisesti määrittää DNApitoisuuksia 25 pikogrammasta 1 mikrogrammaan
millilitrassa (Sandaa ym. 1998). Fluorometristä riippuen myös fluorometrinen mittaus
voidaan suorittaa jopa yhden mikrolitran tilavuudesta (NanoDrop® 2004).
43
3.2.3 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR
Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (QRTmPCR) on kehitetty geenilukumäärien
määrittämiseen DNAnäytteistä. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR eroaa tavallisesta
PCR:stä merkittävimmin siinä, että QRTmPCR:ssä syntyvän PCRtuotteen määrää
seurataan reaaliaikaisesti jokaisen syklin jälkeen (Zhang ja Fang 2006). QRTmPCR:n
edellytyksenä onkin, että PCRtuotteen kertymistä pystytään seuraamaan PCRreaktion
aikana. PCRreaktion aikana tapahtuvassa detektiossa hyödynnetään QRTmPCR:ssä joko
kaksijuosteiseen DNA:han sitoutuvia fluoresoivia väriaineita, kuten SYBR®Green:iä, tai
fluoresoivia koettimia, kuten TaqMankoettimia (Mackay ym. 2002).
Fluoresoiva väriaine SYBR®Green sitoutuu PCR:n synteesivaiheen jälkeen syntyneisiin
PCRtuotteisiin (Zhang ja Fang 2006). SYBR®Green fluoresenssi voimistuu 200
kertaiseksi sen sitoutuessa kaksijuosteiseen DNA:han. PCRlaite mittaa automaattisesti
SYBR®Green:in lähettämän fluoresenssin intensiteetin joka syklin jälkeen.
Denaturaatiovaiheessa SYBR®Green taas irtoaa DNA:sta ja PCRreaktio voi jatkua
normaalisti.
Zhang ja Fang (2006) mainitsevat SYBR®Greenmenetelmän hyviksi puoliksi menetemän
yksinkertaisuuden ja sen että se ei vaadi koettimien suunnittelua. SYBR®Green:iin
perustuvan detektion heikkous on Zhangin ja Fangin (2006) mukaan sen epäspesifisyys.
SYBR®Greenväriaine nimittäin kiinnittyy täysin epäpesifisesti kaikkeen kaksijuosteiseen
DNA:han. Näin ollen SYBR®Green detektoi myös PCRreaktiossa mahdollisesti syntyvät
epäspesifiset tuotteet.
PCRreaktiossa mahdollisesti syntyvien epäspesifisten tuotteiden tunnistamiseksi on
kehitetty niin sanottu sulamiskäyräanalyysi (Mackay ym. 2002). PCRajon jälkeen
suoritettavan sulamiskäyräanalyysin avulla määritetään saatujen PCRtuotteiden
sulamispiste ja verrataan sitä oikean tuotteen tunnettuun sulamispisteeseen.
Sulamiskäyräanalyysin perusteella voidaan siis päätellä onko saatu monistettua oikeaa
tuotetta.
TaqMankoettimeen perustuvassa detektiossa puolestaan käytetään monistettavalle PCR
tuotteelle spesifisiä koettimia, jolloin detektio on huomattavasti spesifisempää kuin
44
SYBR®Greenmenetelmässä (Mackay ym. 2002). TaqMankoettimen toiseen päähän on
liitetty fluoresoiva leima ja toiseen päähän ns. vaimennin (eng. quencher). Vaimennin
himmentää fluoresoivan leiman lähettämää fluoresenssia ollessaan kiinni leimatussa
koettimessa (Mackay ym. 2002). PCRreaktiossa koetin kiinnittyy syntyneisiin DNA
juosteisiin denaturaation jälkeisessä kiinnittymisvaiheessa. Synteesin aikana Taq
polymeraasi katkaisee DNAjuosteisiin sitoutuneen koettimen niin että fluoresoiva leima
irtoaa koettimen toisessa päässä olevasta vaimentimesta. Tällöin fluoresoiva leima alkaa
fluoresoida voimakkaasti. Jokaisen syklin synteesivaiheen jälkeen fluoresoivien leimojen
lähettämä fluoresenssi mitataan.
Jotta PCRnäytteiden lähettämät fluoresenssit voidaan QRTmPCR:ssä muuttaa
geenijuosteiden lukumääriksi, on jokaisessa ajossa näytteiden lisäksi ajettava myös
standardisarja. Standardisarja valmistetaan referenssimikrobin DNA:sta, jonka DNA
pitoisuus on määritetty spektrofotometrisesti. StandardiDNA:na voidaan käyttää
esimerkiksi PCRtuotetta (Kabir ym. 2003), plasmidia (Henry ym. 2004) tai genomista
DNA:ta (Filion ym. 2003). Standardien geenikopioluku määritetään ennen PCRajoa
mittaamalla standardiDNA:n pitoisuus ja laskemalla sen avulla standardin sisältämien
tutkittavien geenien kopiolukumäärä.
Koska standardisuoran geenikopioluvut tunnetaan, voidaan näytteiden
geenikopiolukumäärä määrittää standardisuoran avulla. Näytteiden ja standardien vertailu
perustuu ns. kynnyssyklin (threshold cycle) määrittämiseen jokaiselle näytteelle sekä
standardeille (Zhang ja Fang 2006). Näytteen kynnyssykli on se PCRreaktion sykli, jolla
näytteen fluoresenssi ylittää valitun kynnysarvon (threshold) (Zhang ja Fang 2006).
Fluoresenssin kynnysarvo, jonka perusteella kynnyssykli määräytyy, valitaan niin, että se
asettuu PCRtuotteen monistumisen logaritmisen vaiheen alkuun (kuva 6). Jokainen näyte
siis ylittää fluoresenssin kynnysarvon eri syklillä, riippuen kopioitavan geenin
alkuperäisestä kopioluvusta näytteessä. Mitä suurempi näytteen kopioluku on sitä,
aiemmin näyte saavuttaa fluoresenssin kynnysarvon.
45
Kuva 6. Kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n standardisuoran fluoresessinmuutokset PCR:n aikana. Kynnyssykli (Ct) määräytyy valitun fluoresenssin intensiteetinkynnysarvon perusteella. Kuva muokattu Zhangin ja Fangin (2006) julkaisemasta kuvasta.
Ympäristönäytteet asettavat useita haasteita QRTmPCR:lle. Zhang ja Fang (2006)
esittävät artikkelissaan yhtenä suurena ongelmana maasta eristettyjen DNAuutteiden
sisältämät epäpuhtaudet, kuten humushapot, jotka usein alentavat merkittävästi PCR
reaktion tehokkuutta. Tämä aiheuttaa ongelmia ympäristönäytteiden geenikopioluvun
määrittämisessä standardisuoran avulla. Standardisuoran käyttö geenikopioluvun
määrittämisessä nimittäin edellyttää, että näytteiden ja standardien PCRtehokkuudet ovat
yhtä suuret. Tämä ei kuitenkaan toteudu käytettäessä epäpuhtaille maaDNAuutteille
standardeina puhdasviljelmästä eristettyä puhdasta DNA:ta (Zhang ja Fang 2006).
Lisäksi alukkeiden ja koettimien suunnittelu ympäristönäytteille on usein hyvin hankalaa,
koska vain hyvin pieni osa maaperän mikrobien sekvensseistä tunnetaan. Myös
kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa PCR:ssä, kuten muissakin DNApohjaisissa
menetelmissä, on riskinä sekä epäspesifisten tuotteiden monistuminen valituilla alukkeilla
sekä se, ettei valittujen alukkeiden avulla saada monistettua kaikkia tutkimuksen kohteena
olevan mikrobiryhmän geenisekvenssejä (Kurola ym. 2005).
46
Kokeellinen osuus
4. Tutkimuksen tavoitteetGradutyöni oli osa laajempaa tutkimusta, jonka tavoitteena oli tarkastella
rehuvuohenherneen käyttöä ja soveltuvuutta polttoöljyllä saastuneen maan biologiseen
puhdistukseen. Tutkimus suoritettiin kasvihuoneessa 21viikkoisena astiakokeena. Oma
osuuteni oli kasvihuonekokeen mikrobiologisten muutosten seuranta MPNmenetelmän,
DNApitoisuusmittausten ja kvantitatiivisen reaaliaikaisen PCR:n avulla.
Gradutyöni keskeiset tavoitteet olivat:
1) optimoida MPNmenetelmä polttoöljynhajottajien lukumäärän määrittämiseen,
2) selvittää MPNmenetelmällä kasvin vaikutusta öljynhajottajien lukumääriin polttoöljyllä
saastutetussa maassa,
3) vertailla kahden DNApitoisuuden määritysmenetelmän soveltuvuutta maasta
eristetyille DNAuutteille,
4) tarkastella DNApitoisuuden muutoksia eri käsittelyissä kokeen aikana,
5) määrittää naftaleenin hajottajien lukumäärissä tapahtuvia muutoksia kokeen aikana
kvantitoimalla nahAcgeenin lukumääriä kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä ja
6) arvioida saatujen tulosten perusteella rehuvuohenherneen vaikutusta
öljynhajotusprosessiin.
47
5. Materiaalit ja menetelmät
5.1 Kasvihuonekoe
5.1.1 Koeasetelma
Kasvihuonekoe perustettiin vuoden 2005 helmikuussa Viikin tiedepuiston kasvihuoneelle.
Kokeen käsittelyt olivat:
1) polttoöljyllä saastutettu maa, johon kylvettiin vuohenhernettä,
2) polttoöljyllä saastutettu maa ilman vuohenhernettä,
3) saastuttamaton maa, johon kylvettiin vuohenhernettä sekä
4) steriloitu polttoöljyllä saastutettu maa ilman vuohenhernettä.
Koe koostui yhteensä 120 näyteruukusta. Näyteruukkuina käytettiin 2 litran muovisia
kukkaruukkuja savisilla aluslautasilla (Pirilän Kukkatalo Oy, Tuusula). Jokaisesta
käsittelystä oli kolme rinnakkaista ruukkua kutakin näytteenottoajankohtaa varten, jolloin
kaksitoista ruukkua poistui kokeesta jokaisessa näytteenotossa. Koeasetelma on esitetty
kokonaisuudessaan taulukossa 3.
48
Taulukko 3. Kasvihuonekokeen koeasetelma
1Nesteen kevyt polttoöljy, pitoisuus valmiissa koemaassa 3000 ppm (paino / kuivapaino)2Rhizobium galegae lisättiin vuohenherneen siemenien pinnalle kylvön yhteydessä symbionttisen typensidonnan aikaansaamiseksi3 Steriloituja öljymaa ruukkuja hyödynnettiin vain kemiallisissa analyyseissä, joihin otettiin näytteitä viikoilla 0, 1, 3, 6, 12 ja 214Näytteenottoviikot on laskettu viikkoina kokeen aloittamisesta.5Jokaisesta käsittelystä tehtiin kolme ylimääräistä ruukkua6Jokaisesta käsittelystä tehtiin kolme rinnakkaista ruukkua jokaista näytteenottoa varten
Näytteenottoviikot4
0 1 2 3 4 6 8 12 16 21 E5
Käsittely Lyhenne Tutkimuskohde Näytteenottoon varattujen ruukkujen lukumäärä6 Yhteensä
Öljymaa1, kasvija R. galegae2 ÖKR
Kasvin juuriston vaikutus öljylläsaastuneen maan mikrobistoon ja öljynhajoamiseen
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 33
Öljymaa ÖÖljyllä saastuneen maan mikrobistonkehitys ja öljyn hajoaminen ilmanjuuriston vaikutusta
3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 33
Puhdas maa,kasvi ja R.galegae
PKR Vuohenherneen kasvu ja ritsosfäärinmikrobisto saastuttamattomassa maassa 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 33
Steriloituöljymaa3 ÖS Fysikaaliskemiallisen hajoamisen
osuus öljynhajoamisesta3 3 3 3 3 3 3 21
120
49
Koemaa oli seos Juvan Partalan hietamaata (73 %), Viikin peltomaata (4 %) ja
Hiekkatuotehiekkaa (Optiroc) (23 %). Hiekan raekoko oli 0,51,2 mm. Lisäksi kaikkiin
ruukkuihin lisättiin Puutarhan Ystävä LUOMU perusvoima lannoitetta (NPK 053 + Ca
17, Mg 6, Kemira Agro Oy) viisi millilitraa. Ennen koemaan sekoittamista ja
näyteruukkujen kokoamista hieta ja multamaa seulottiin 4 mm seulan läpi. Hietamaan
seulonta tehtiin noin kolme viikkoa ja Viikin maan yhtä viikkoa ennen näyteruukkujen
kokoamista. Hietamaa kasteltiin 30 %:iin sen vedenpidätyskyvystä yhtä viikkoa ennen
kokeen perustamista.
Kaikkien käsittelyjen näyteruukkujen koostumukset on esitetty taulukossa 4. Näyteruukut
koottiin jokainen erikseen, jotta voitiin varmistaa rinnakkaisten ruukkujen mahdollisimman
yhdenmukainen koostumus. Sekoitus tehtiin käsin metallisen kulhon pohjalla käyttäen
muovisia kauhoja ja metallilusikoita. Sekoitusvälineet puhdistettiin jokaisen ruukun
käsittelyn välissä. Ennen koemaiden lisäämistä ruukkuihin, ruukkujen pohjalle laitettiin
peiteharsoa (Tarhatuote) ja n. 4 dl kevytsoraa (Leca Kevytsora KS410, Optiroc tai
Kevytsora, Kekkilä Oyj, Parkano). Taulukoissa 5 ja 6 on esitetty valmiin koemaan
lajitekoostumus ja perusominaisuuksia. Valmis koemaa oli vähätyppistä hietamaata, joka
sisälsi niukasti orgaanista ainesta (Kondo 2006).
Taulukko 4. Näyteruukkujen koostumus. ÖKR on öljyllä saastutettu maa kasvilla, Ö öljylläsaastutettu maa ilman kasvia, ÖS öljyllä saastutettu steriloitu maa ja PKR saastuttamaton maakasvilla.
Lisäys/ruukku Prosenttiosuus(%)
Käsittely
Juvan hietamaa 920 g1 (1 litra) 73
Viikin peltomaa56 g1 (½ dl) 4
Hiekkatuotehiekka
n. 280 g (2 dl) 23
Perusvoima –lannoite 5 ml
Kaikissa käsittelyissä(PKR, ÖKR, Ö, ÖS)
Polttoöljy1 3,62 ml2 Öljykäsittelyissä (ÖKR, Ö, ÖS)1Painot ilmoitettu maan tuorepainona1Kevyt polttoöljy, kesälaatu (Neste), tarkat kemialliset tiedot liitteessä 12Vastaa öljynpitoisuutta 3000 ppm (paino/kuivapaino)
50
Taulukko 5. Kasvihuonekokeessa käytetynmaasekoituksen kivennäisaineksen lajitekoostumus.(Kondo 2006)
Lajite Osuus (%)
Sora 0
Karkea hiekka 20
Hieno hiekka 11
Karkea hieta 17
Hieno hieta 35
Karkea hiesu 9
Hieno hiesu 3
Saves 6
Taulukko 6. Kasvihuonekokeessa käytetynmaasekoituksen perusominaisuuksia. (Kondo 2006)
Hehkutuskevennys 4,8
C (%) 1,8
N (%) 0,1
pHCaCl2 5,4
Kakapo [(cmol(+)kg1] 7,3
KVKef [cmol(+)kg1] 6,4
Feox (mg kg1) 6100
Alox (mg kg1) 400
Saastuttamattoman maan (PKR) ruukkuja tehtäessä kaikki taulukossa 4 esitetyt ainesosat
sekoitettiin yhtäaikaisesti samassa astiassa. Öljymaaruukkuja (ÖKR, Ö ja ÖS) koottaessa
sekoitettiin ensin polttoöljy ja hiekka keskenään, minkä jälkeen tämä seos sekoitettiin
hietamaan, multamaan ja lannoitteen seokseen. Näin yritettiin välttää polttoöljyn
epätasainen jakautuminen valmiissa koemaassa. Steriilikontrollit (ÖS) valmistettiin
51
lisäämällä veteen liuotettu hopeanitraatti (AgNO3) valmiisiin öljymaaruukkuihin pinnalle,
niin että koemaan lopullinen hopeanitraattipitoisuus steriilikontrolleissa oli 0,3 % (paino /
tuorepaino).
Näytemaiden annettiin tasapainottua neljä vuorokautta ennen kylvöä ja ensimmäistä
näytteenottoa. Kylvöä varten kaikkiin ruukkuihin lisättiin noin yhden cm:n kerros
saastuttamatonta koemaata (ilman lannoitetta) ns. itämiskerrokseksi. Kaikki ruukut
punnittiin ja punnitustulos merkittiin jokaisen ruukun kylkeen. PKR ja ÖKR käsittelyiden
ruukkuihin kylvettiin pinnalle 20 kpl vuohenherneen siemeniä (Naturcom Oy, Ruukki).
Siemenet siirrostettiin symbioottisen typensidonnan aikaansaamiseksi ruiskuttamalla
HUMliemessä (liite 3) kasvanutta Rhizobium galegae HAMBI 540 bakteeriviljelmää
siementen pinnalle kylvön yhteydessä.
Viikon kuluttua ensimmäisestä kylvöstä kylvettiin jokaiseen kasvilliseen purkkiin 5
siementä lisää kasvun varmistamiseksi. Tällä kertaa siemenet laitettiin n. 0,5 cm:n
syvyiseen kuoppaan, joka peitettiin ohuella maakerroksella.
5.1.2 Kasvihuonekokeen hoito
Kasvihuoneen lämpötilaasetukset olivat vuorokausittain 12 tuntia 20 ºC ja 12 tuntia 15 ºC.
Ruukkuja kasteltiin automaattisesti kastelutikkujen avulla. Aluksi automaattinen kastelu
säädettiin 3,5 desilitraan päivässä ja myöhemmin kasvien kasvaessa automaattikastelun
määrää lisättiin. Kastelua täydennettiin lisäksi tarvittaessa käsinkastelulla (kuva 7).
Käsinkastelussa hyödynnettiin ruukkujen kylvöhetken punnitustuloksia. Kylvöhetken
punnitustuloksiin lisättiin 50 grammaa ja tätä painoa pidettiin ruukun tavoitepainona.
Näyteruukkujen alittaessa tavoitepainon niitä kasteltiin käsin vaa´an avulla tavoitepainoon
(kuva 7). Käsinkastelu suoritettiin tarvittaessa useita kertoja viikossa. Kasvien kasvusta ja
siitä johtuvan suuremman haihdutuksen seurauksena koeviikolla 14 jokaisen ruukun (myös
kasvittomien käsittelyiden) tavoitepainoon lisättiin vielä 50 grammaa.
Ilman kosteusprosentti säädettiin itämisen ajaksi 70 %:iin, minkä jälkeen se oli 50 %
kokeen loppuun saakka. Varjostusverhot säädettiin estämään auringonvalon pääsy
kasvihuoneeseen, kun kasvihuoneen lämpötila ylitti 25 ºC tai kun auringonsäteily ylitti
arvon 400 W/m2. Kun ulkoa tulevan valon määrä jäi kasvihuoneessa valaistuna aikana
52
(lämpötilasäätö 20 ºC) alle arvon 400 W/m2, valon puute korvattiin automaattisella
keinovalaistuksella.
Koeviikolla 6 kasvilliset ruukut harvennettiin niin, että jokaiseen näyteruukkuun jäi viisi
vuohenherneen tainta. Harvennus tehtiin poistamalla kasvit ruukuista juurineen.
Koeviikolla 12 saastuttamattoman kasvikäsittelyn (PKR) ruukuista harvennettiin vielä
kaksi tainta jokaisesta ruukusta. Tällä kertaa harvennus tehtiin leikkaamalla jokaisesta
ruukusta kaksi kasvia tyvestä poikki, koska kasvien irrottaminen juurineen oli tässä
vaiheessa jo mahdotonta.
Koeviikolla 14 kaikkiin ruukkuihin lisättiin pinnalle typetöntä PKlannoitetta (Kukkaloisto
Syyslannoite PK 02227, Nutriforte Oy, Suomi). Veteen liuotettua lannoitetta lisättiin
jokaiseen ruukkuun noin 0,5 ml. Koeviikolla 15 tehtiin niitto, jossa kasvillisista ruukuista
poistettiin kaikki kasvit niin, että kasvit leikattiin poikki noin viiden senttimetrin
etäisyydeltä maan pinnasta.
Kuva 7. Näyteruukkujen kosteudensäätäminen vaa´an avulla. Kaikki näyteruukutpunnittiin säännöllisesti ja kasteltiin tarvittaessatavoitepainoon. Kuvan ottanut Anu Mikkonen.
53
Olosuhteiden vaihtelua kasvihuoneen eri osissa tasoitettiin satunnaistamalla ruukkujen
paikkoja pöydällä viikoittain. Kasvihuoneen pöytä oli jaettu poikittaissuunnassa kolmeen
yhtä suureen osaan eli kerranteeseen (kuva 8). Jokaisessa kerranteessa oli yksi kolmesta
rinnakkaisesta ruukusta. Jokaisessa kerranteessa ruukkujen paikat oli numeroitu.
Satunnaistus tehtiin siten, että ruukut pysyivät koko ajan samassa kerranteessa. Ruukkujen
vähentyessä näytteenottojen yhteydessä ruukkujen etäisyyttä toisiinsa kasvatettiin.
Satunnaistus tehtiin Matlab ohjelmasta saatujen satunnaislukujen avulla.
Kuva 8. Kokeen kolmen eri kerranteen sijainnit kasvihuoneessa.
54
5.1.3 Näytteenotto
Näytteitä otettiin 21viikkoisen kasvihuonekokeen aikana kymmenen kertaa.
Näytteenottoviikot olivat: kylvöhetki (viikko 0) ja viikot 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16 ja 21.
Kuvassa 9 on esitetty näytteenottoon viikolla 12 otetut ruukut.
Kuva 9. Koeviikon 12 näytteenottoruukut.Kuvassa ovat peräkkäin kaikki kyseisen käsittelynkerranteet. Käsittelyt vasemmalta oikealle ovat:saastuttamaton maa vuohenherneellä (PKR), öljymaakasvilla (ÖKR), öljymaa (Ö) ja steriloitu öljymaa (ÖS).Kuvan ottanut Anu Mikkonen.
Näytteenoton yhteydessä kyseisen viikon kasvillisista näyteruukuista leikattiin talteen
kasvien maanpinnan yläpuolinen osa, josta määritettiin kasvien kuivapaino (Kondo 2006).
Tämän jälkeen koko näyteruukkujen sisältämä maa seulottiin 4 mm seulan läpi. Seulottu
maa sekoitettiin huolellisesti ja jaettiin näytteiksi. DNAuuttoa varten otettiin jokaisesta
ruukusta neljä yhden gramman näytettä, jotka pakastettiin näytteenottopäivänä 80 ºC:een.
MPNanalyyseihin otettiin viiden gramman näytteet, jotka analysoitiin tuoreina.
5.2 MPNmenetelmä polttoöljynhajottajille
Tutkimuksessa käytetyn MPNmenetelmän lähtökohtana oli MECBIO (Microbial Ecology
and Bioremediation in Cold Climate) verkoston laboratoriokurssilla joulukuussa 2004
käytetty MPNmenetelmä (liite 2). Menetelmä oli kehitetty öljynhajottajien
kokonaislukumäärien määrittämiseen maanäytteistä Hainesin ym. (1996) julkaiseman
menetelmän pohjalta. MPNmenetelmä tehtiin 96kuoppalevyillä ja se perustui hiilettömän
BushnellHaasmineraalialustan (DifcoTM, USA) käyttöön. Tässä tutkimuksessa MPN
näytelevyillä ainoana hiilenlähteenä käytettiin tutkimuksen kohteena olevaa polttoöljyä.
55
Näytelevyille valmistettiin protokollan mukaisesti (liite 2) negatiiviset kontrollilevyt, joille
lisättiin samat maanäytelaimennokset kuin näytelevyille, muttei lainkaan hiilenlähdettä.
Negatiivisten kontrollilevyjen avulla voitiin osoittaa, että positiiviset reaktiot MPN
näytelevyillä olivat seurausta polttoöljyn hyödyntämisestä hiilenlähteenä.
5.2.1 MPNlevyjen valmistus ja inkubointi
Hyvin sekoitettua maanäytettä punnittiin 5,0 grammaa kierrekorkilliseen 100 ml:n
lasipulloon. Pulloon lisättiin 45 ml fosfaattipuskuria (pH 7,0) (liite 2) ja pulloa ravisteltiin
tasoravistelijassa vaakatasossa nopeudella 400 kierrosta minuutissa 10 minuutin ajan.
Ravistelun avulla haluttiin irrottaa mikrobit maapartikkeleista ja siirtää ne
puskuriliuokseen. Ravistelun jälkeen, alkuperäisestä protokollasta poiketen,
maasuspensiopulloa seisotettiin ennen laimennusarjan valmistusta. Seisotuksen
tarkoituksena oli saada MPNlevyjen mittausta mahdollisesti häiritsevät maapartikkelit
vajoamaan pullon pohjalle.
Seisotuksen jälkeen maasuspensiopulloista otettiin varovasti 1 ml supernatanttia, välttäen
pullon pohjalla olevaa maalietettä. Supernatantista valmistettiin 10kertainen
laimennussarja BushnellHaasmineraalialustaan. Laimennussarja pipetoitiin kahdelle
matalalle tasapohjaiselle 96kuoppalevylle (NuncTM, Tanska) niin, että valmiilla levyillä
oli kahdeksan peräkkäistä 10kertaista laimennosta ja jokaisesta laimennoksesta oli
kaksitoista rinnakkaista kaivoa. Näytetilavuus jokaisessa kaivossa oli 200 l. Levyjä
käsiteltäessä vältettiin koskemasta levyjen pohjiin, jottei sinne tarttuisi epäpuhtauksia,
jotka voisivat häiritä myöhemmin levyjen tulosten lukua. Näytelevyille lisättiin lopuksi
jokaiseen kaivoon 2 l:aa tutkimuksen kohteena olevaa polttoöljyä hiilenlähteeksi.
Levyjä inkuboitiin huoneenlämmössä (2124 ºC) ja pimeässä kolme viikkoa. Näytelevyt ja
kontrollilevyt laitettiin erillisiin rasioihin inkuboinnin ajaksi (kuva 10), jotta haihtuvat
öljyn komponentit eivät pääsisi siirtymään näytelevyiltä negatiivisille kontrollilevyille.
56
Kuva 10. MPNlevyjen inkuboinnin aikana käytetyt rasiat.Vasemmalla on negatiivisten kontrollilevyjen säilytysrasia ja oikeallanäytelevyjen säilytysrasia.
5.2.2 MPNlukumäärän määritys
Tutkimuksen aikana testattiin mikrobien kasvun määritystä MPNlevyiltä MECBIO
kurssin työohjeen (liite 2) mukaisesti kahdella tetratsoliumsuoloihin kuuluvilla
värireagensseilla INT:llä (2(piodofenyyli)3(pnitrofenyyli)5fenyylitetratsoliumkloridi)
(Sigma, UK) ja WST1:llä (4[3(4iodofenyyli)2(4nitrofenyyli)2H5tetratsolio]1,3
benseenidisulfonaatti) (Roche, Saksa). Koska tetratsoliumsuolat häiritsevät mikrobien
kasvua, lisättiin ne MPNlevyille vasta inkuboinnin jälkeen.
Käytettäessä INTsoluhengitysindikaattoria lisättiin MPNlevyille INTreagenssista tehtyä
laimennusta niin, että jokaisessa kaivossa INTreagenssin loppukonsentraatio oli 0,6
mg/ml. Tulokset kaivoista, joihin oli lisätty INTreagenssia, luettiin silmämääräisesti
vuorokauden jälkeen reagenssin lisäämisestä. Kaikki kaivot, joissa oli havaittavissa
punaista väriä, laskettiin positiivisiksi.
Käytettäessä WST1soluhengitysindikaattoria lisättiin MPNlevyn kaivoihin 10 l
käyttövalmista WST1liuosta. WST1reagenssin antamat tulokset luettiin ELISA
lukijalla (Labsystems iEMS Reader MF) aallonpituuksilla 450 nm ja 620 nm.
Aallonpituutta 450 nm, jolla pelkistynyt WST1 absorboi voimakkaasti, käytettiin
varsinaisena mittausaallonpituutena. Aallonpituudella 620 nm pelkistynyt WST1
puolestaan absorboi hyvin vähän ja tätä aallonpituutta käytettiin mittauksissa niin
sanottuna referenssiaallonpituutena. Referenssiaallonpituuden avulla oli tarkoitus poistaa
450 nm:llä saaduista mittaustuloksista taustaabsorptio. Taustaabsorptiota mittauksiin
aiheuttivat kaivojen pohjalla olevat solut ja maapartikkelit sekä levyjen pohjissa
mahdollisesti olevat sormenjäljet tai muut epäpuhtaudet.
57
WST1mittaustulokset siirtyivät automaattisesti ELISAlukijalta Ascent Software
tietokoneohjelmaan (versio 2.6). Tämän jälkeen tulokset siirrettiin Excel
taulukkolaskentaohjelmaan, jossa aallonpituudella 620 nm saatu absorptio vähennettiin
aallonpituudella 450 nm saadusta absorptiosta. Positiivisiksi kaivoiksi määritettiin ne
kaivot, joiden absorptioarvo ylitti taustaabsorption vähennyksen jälkeen arvon 0,05 (liite
2).
INT ja WST1 värireagensseihin perustuvan määrityksen lisäksi tutkimuksessa testattiin
absorbanssimittausta ilman tetrasoliumsuolojen lisäystä MPNlevyille. Tällöin
absorbanssimittaus perustui mikrobien kasvun aiheutumaan kasvualustan samentumiseen.
Tässä yhteydessä tutkittiin eri aallonpituuksilla tehtyjen mittausten eroja ja määritettiin
valitulle aallonpituudelle rajaarvo, jonka alapuolelle jäävät arvot luettiin negatiivisiksi ja
sen ylittävät arvot positiivisiksi.
Kun asetettujen rajaarvojen avulla oli määritetty MPNlevyiltä positiivisten kaivojen
lukumäärät kaikissa laimennuksissa, syötettiin neljän peräkkäisen laimennuksen
positiivisten kaivojen lukumäärät Mike Curialen internetissä julkaisemaan MPN –laskuriin
(VB 3 versio) (internetsivu http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/index.html
käyttöpäivä 1.8.2005). MPNlaskuriin syötetyt laimennukset valittiin niin, että
korkeimmassa näistä neljästä peräkkäisestä laimennuksesta ei ollut yhtään positiivista
kaivoa. Tuloksena MPNlaskuri ilmoitti näytteen todennäköisimmän mikrobilukumäärän
sekä 95 prosentin luottamusvälin kyseiselle tulokselle.
5.2.3 MPNkasvatusten toteutus
MECBIOverkoston laboratoriokurssilla käytettyä MPNmenetelmää jouduttiin
tutkimuksen aikana optimoimaan monin tavoin, ennen kuin se soveltui tämän tutkimuksen
näytteiden analysointiin. Esikokeista saatujen tulosten perusteella alkuperäiseen
protokollaan (liite 2) lisättiin maanäytesuspension seisotusvaihe ennen laimennussarjan
valmistamista. Tällä haluttiin estää maapartikkelien kulkeutuminen MPNlevyille, jossa
maapartikkelien mukana siirtyvät hiilenlähteet voisivat aiheuttaa vääriä positiivisia
reaktioita MPNlevyjen matalimmissa laimennuksissa. Näytteenottoviikoilla 0, 1, 3, 6 ja 8
maanäytesuspensiota seisotettiin 5 minuuttia ennen laimennussarjan valmistamista.
58
Näytteenottoviikolla 8 vertailtiin 5, 10 ja 20 minuutin seisotusaikojen vaikutusta saataviin
tuloksiin. Viikoilla 12, 16 ja 21 maanäytesuspension seisotusaikana käytettiin 20 minuuttia.
Näytteenottoviikon 0 eli kylvöhetken näytteistä valmistetuilla MPNlevyillä testattiin
soluhengitysidikaattorien WST1 ja INT soveltuvuutta polttoöljynhajottajien kasvun
havaisemiseen. Kolmen viikon inkuboinnin jälkeen MPNnäyte ja kontrollilevyille
lisättiin kuuteen ensimmäiseen sarakkeeseen WST1soluhengitysindikaattoria ja kuuteen
viimeiseen sarakkeeseen INTsoluhengitysindikaattoria. Kaivot, joihin oli lisätty INT
soluhengitysindikaattoria, luettiin silmämääräisesti yhden vuorokauden jälkeen INT
reagenssin lisäämisestä. Kaivot, joihin oli lisätty WST1reagenssia luettiin yhden, kahden
ja kolmen vuorokauden jälkeen WST1 lisäyksestä. Näytelevyjen inkubointiaika WST1
kanssa haluttiin optimoida siten, että se oli riittävän pitkä, jotta kaikki positiiviset kaivot
ilmestyisivät vaikutusajan kuluessa näytelevyille. Toisaalta vaikutusajan kuluessa ei
haluttu negatiivisille kontrollilevyille ilmestyvän positiivisia kaivoja.
Kokeen alusta lähtien testattiin myös absorbanssilukijalla tapahtuvan sameusmittauksen
soveltuvuutta MPNlukumäärien määritykseen. Sameusmittauksissa rinnakkaisina kaivoina
käytettiin kaikkia MPNlevyn kahtatoista kaivoa. Koska MPNlevyjen tulosten luku
haluttiin automatisoida tehtäväksi ELISAlukijalla, oli tätä varten valittava sopiva
aallonpituus kasvusta johtuvan absorbanssin mittaamiseen. Viikoilla 0 ja 3 MPNlevyt
luettiin sameuden perusteella aallonpituudella 620 nm, joka oli WST1reagenssin
referenssiaallonpituus. Viikolla 3 vertailtiin aallonpituuksilla 620 nm, 540 nm ja 450 nm
saatavia tuloksia. Näytteenottoviikkojen 6, 8, 12, 16 ja 21 näytteistä valmistetut MPNlevyt
luettiin aallonpituudella 450 nm.
MPNanalyysit tehtiin jokaisena näytteenottokertana kahtena rinnakkaisena määrityksenä
niin, että rinnakkaiset näytteet otettiin kasvihuonekokeen eri kerranteista (kuva 8).
59
5.3 DNA:n eristys maanäytteistä
DNAeristykset kasvihuonekokeen näytteistä tehtiin yhdessä tutkimukseen osallistuneen
pro gradu työntekijän Anu Mikkosen kanssa. DNA:n eristys tehtiin pakastetuista
maanäytteistä FastPrep Spin Kit for Soilkitillä (Qbiogene, USA). Jokaista näyteruukkua
kohti tehtiin kaksi rinnakkaista eristystä. Näytemäärä oli 0,5 ± 0,05 g. DNA:n eristys
tehtiin valmistajan ohjeen mukaisesti, muutamaa alla mainittua pientä muutosta lukuun
ottamatta. Valmistajan mukaan FastPrep Spin Kit for Soilkitti soveltuu genomisen
bakteeri, sieni, kasvi tai eläinDNA:n eristämiseen maanäytteistä.
Maanäytteet punnittiin kitin Lysing Matrix E –putkiin, jonka jälkeen putkiin lisättiin
puskuria. DNA vapauttaminen soluista tapahtui ravistelemalla Lysing Matrix E –putkissa
olevia maanäytteitä FastPrepTM FP120 laitteella (BIO 101 Savant, USA) nopeudella 5,5
30 sekunnin ajan. Solujen hajotus perustui Lysing Matrix E –putkissa oleviin pieniin
keraamisiin helmiin, jotka ravistelun aikana jauhoivat maanäytteiden sisältämät solut rikki.
Ravistelun jälkeen rikkonaisten solujen kappaleet ja maapartikkelit poistettiin liuoksesta
sentrifugoimalla 5 minuuttia. Supernatantit siirrettiin puhtaisiin eppendorfputkiin.
DNAuutteisiin lisättiin seuraavaksi proteiinien saostusliuosta, minkä jälkeen saostuneet
proteiinit sentrifugoitiin putkien pohjalle. Supernatantti siirrettiin putkiin, joissa DNA
sitoutui putkissa olevan Binding Matrix:in silikageelipartikkeleihin.
Silikageelipartikkeleihin sitoutunutta DNA:ta huuhdeltiin kitin suolaetanoliliuoksella.
Lopuksi DNA eluoitiin DNAaasi ja pyrogeeni vapaalla vedellä 120 µl tilavuuteen. Eluoitu
DNAuute jaettiin neljäksi noin 25 µl:n osanäytteeksi ja uutteet pakastettiin 80 ºC:een.
60
5.4 DNA:n pitoisuuden määritys
5.4.1 NanoDrop® ND1000 UVVis spektrofotometrimittaus
Mittaus suoritettiin pipetoimalla yksi mikrolitra tutkittavaa DNAuutetta kuvassa 11
esitetyn NanoDrop®laitteen alemman metallilevyn kohouman päälle. Kohoumasta lähtee
laitteen sisäosiin kuituoptinen kaapeli, joka pystyy ottamaan vastaan siihen lähetettyä valoa
(NanoDrop® 2004). Kun näyte oli pipetoitu kohouman päälle, laskettiin ylempi metallilevy
näytteen päälle. Tämän levyn sisällä on valoa lähettävä kuituoptinen kaapeli (NanoDrop®
2004).
Kuva 11. NanoDrop® ND1000 UVVis –spektrofotometri. Kuva NanoDropTechnologies (internetsivu www.nanodrop.com).
Näyte pysyy kahden metallilevyissä olevan kohouman välissä nestejännitteen avulla (kuva
12). Laite lähettää valoa yläpuolella olevan kuituoptisen kaapelin kautta nestepylvääseen
(NanoDrop® 2004). Kun valo on läpäissyt nestepylvään, alapuolinen kuituoptinen kaapeli
kerää valon ja laite analysoi näytteeseen imeytyneen valon määrän valitulla
aallonpituusalueella. Tuloksena laite antaa näytteen spektrin, DNApitoisuuden (260 nm
absorption perusteella) sekä arvot DNA:n puhtaudesta kertoville suhdeluvuille
A260nm/A280nm ja A260nm/A230nm.
61
Kuva 12. Näyte NanoDrop® ND1000 UVVis –spektrofotometrissä. Kuva NanoDropTechnologies (internetsivu www.nanodrop.com).
5.4.2 PicoGreen®mittaus
Mittaus tehtiin PicoGreen®dsDNA Quantitation Reagent kitin (Molecular Probes, USA)
ohjeen mukaisesti käyttäen kitin reagensseja. Kitti sisälsi 200kertaista PicoGreen®
värireagenssia, 20kertaista TEpuskuria ja 1kertaiseen TEpuskuriin liuotettua DNA:ta,
jonka pitoisuus oli 100 µg/ml. Kitin 200kertaisesta PicoGreen®värireagenssista ja 20
kertaisesta TEpuskurista valmistettiin ennen mittauksen aloittamista 1kertaiset
käyttöliuokset. Koska PicoGreen® hajoaa herkästi valossa, PicoGreen®reagenssin
pipetointi tehtiin ilman kohdevalaistusta ja kaikki PicoGreen®väriliuosta sisältävät putket
suojattiin huolellisesti foliolla.
DNApitoisuuden määritys tehtiin matalilla tasapohjaisilla 96kuoppalevyillä (NuncTM,
Tanska) 200 µl:n reaktiotilavuudessa. DNApitoisuusstandardit, 200 ng, 100 ng, 40 ng, 20
ng ja 4 ng, valmistettiin kitin DNA:sta ja pipetoitiin kahtena rinnakkaisena näytelevyille.
MaaDNAuutteiden näytemääränä käytettiin yhtä mikrolitraa. Vaikka näin pieni
näytemäärä on hyvin altis pipetoinneista johtuville epätarkkuuksille, ei suurempaa
näytemäärää haluttu käyttää DNAuutteiden vähyyden vuoksi. Jokaiseen näytekaivoon
pipetoitiin ensin 100 µl 1kertaista TEpuskuria. Tämän jälkeen lisättiin 1 µl maaDNA
uutetta ja lopuksi kaikkiin kaivoihin lisättiin 100 µl 1kertaista PicoGreen®väriliuosta.
Jokaiselle näytelevylle jätettiin kaksi sokeaa näytettä, johon ei lisätty lainkaan DNA
uutetta. PicoGreen®väriliuoksen altistumista valolle vältettiin pitämällä näytelevy folioon
käärittynä mittauslaitteelle kuljetuksen ajan.
Mittaus tehtiin Fluoroscan Ascentlaitteella (Labsystems) hyödyntäen Ascent Software
tietokonenohjelmaa (versio 2.4.2). Mittausohjelma koostui kahdesta ravistelusta,
62
inkuboinnista ja mittauksesta. Laite ravisteli aluksi levyä vaakatasossa 10 sekuntia
nopeudella 1200 kierrosta minuutissa. Tämän jälkeen laite inkuboi levyä 2 minuuttia + 45
ºC:ssa. Inkubointia seurasi vielä toinen 10 sekunnin ravistelu nopeudella 1200 kierrosta
minuutissa. Tämän jälkeen levy luettiin käyttäen eksitaatioaallonpituutta 485 nm ja
emissioaallonpituutta 538 nm.
Mittaustulokset siirrettiin Exceltaulukkolaskentaohjelmaan. Excelohjelmassa kaikista
mittaustuloksista vähennettiin sokean näytteen antama taustafluoresenssi.
Fluoresenssiarvot muutettiin standardisarjan avulla DNApitoisuuksiksi.
5.5 NahAcgeenin monistaminen QRTmPCR:llä
5.5.1 PCRalukkeet
Taulukossa 7 on esitetty QRTmPCR:ssä käytetyt alukkeet. Alukkeet on suunnitellut ja
julkaissut Baldwin ym. (2003).
Taulukko 7. QRTmPCR:ssä käytetyt NAHalukkeet.
Alukkeennimi Sekvenssi 5´3´ Pituus
(nt)5 ´pään sijainti
nahAcgeenissä
NAH_F CAAAA(A/G)CACCTGATT(C/T)ATGG 20 46
NAH_R A(C/T)(A/G)CG(A/G)G(C/G)GACTTCTTTCAA 20 422
5.5.2 Standardin valmistaminen PCRtuotteestaStandardina kvantitatiivisessa reaaliaikaisessa PCR:ssä (QRTmPCR) käytettiin
Pseudomonas putida G7kannasta (HAMBI 9) Baldwinin ym. (2003) NAHalukkeilla
(taulukko 7) monistettua PCRtuotetta. P. putida G7kannalla on 83 kiloemäksen kokoinen
katabolinen plasmidi, jossa tutkittava nahAcgeeni sijaitsee. Ensin varmistettiin
tutkimuksessa käytettävien NAHalukkeiden sitoutuminen oikeisiin kohtiin P. putida G7
kannan nahAcgeenissä. Tätä varten P. putida G7kannan nahAcgeenisekvenssi (AC
numero M83949) haettiin NCBI:n GenBanknukleotiditietokannasta (internetsivu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank.index.html käyttöpäivä 14.4.2005). Haettu
sekvenssi siirrettiin internetissä olevaan Primer3ohjelmaan (internetsivu
63
http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi käyttöpäivä 26.5.2005), jossa
selvitettiin NAHalukkeiden sitoutumiskohdat nahAcgeenissä sekä laskettiin odotettavissa
olevan PCRtuotteen koko.
NahAcgeenifragmentin monistaminen P. putida G7kannasta käyttäen NAHalukkeita
tehtiin pesäkePCR:llä TYmaljoille (liite 3) viljellyistä P. putida G7 pesäkkeistä, joita oli
kasvatettu + 28 ºC:ssa yksi vuorokausi. PCRreaktioliuoksen koostumus sekä käytetty
PCRohjelma on esitetty taulukoissa 8 ja 9. Monistus tehtiin PCT200 Peltier Thermal
Cyclerlaitteella (MJ Research, USA) 100 µl:n reaktiotilavuudessa.
Taulukko 8. PCRreaktioliuoksen koostumus monistettaessa nahAcgeenifragmenttiaP. putida G7kannasta pesäkePCR:llä.
Reagenssi Loppukonsentraatio
Templaatti Soluja P. putida G7pesäkkeestä
NAHF (Oligomer, Suomi) 0,5 µM
NAHR (Oligomer, Suomi) 0,5 µM
dNTP – seos (Finnzymes, Suomi) 0,2 mM jokaista
Reaktiopuskuri (Immunodiagnostic Oy, Espanja) 1x
Polymeraasi (Immunodiagnostic Oy, Espanja) 1 U / reaktio
Steriili MQvesi
Taulukko 9. NahAcgeenifragmentin monistamisessa P. putida G7kannasta käytettypesäkePCRohjelma.
Ohjelman vaihe Kesto (min:s) Lämpötila (ºC) Kierrokset
1. Alkudenaturaatio 15:00 95 1
2. Denaturaatio3. Alukkeiden kiinnittyminen
4. Synteesi
0:301:00
1:00
9447
72
30
5. Jäähdytys 15 1
64
PCR:n onnistuminen ja PCRtuotteen koko tarkistettiin geelielektroforeettisesti 1,5 %
agaroosigeelillä (GellyPhor®, EuroClone, U.K.). Latauspuskurina geelillä käytettiin
Blue/Orange Loading Dye:ta (Promega, USA) ja PCRtuotteen molekyylikoon
määrittämiseen pGEM® DNA markkeria (Promega, USA). Tarkistuksen jälkeen PCR
tuotteet puhdistettiin MinElute PCR Purification kitillä (Qiagen, USA) valmistajan ohjeen
mukaisesti. Puhdistettu PCRtuote eluoitiin EBpuskuriin 50 l:n tilavuuteen ja tarkistettiin
1,5 % agaroosigeelillä kuten edellä.
Jotta standardiPCRtuotteen DNApitoisuus saatiin määritettyä mahdollisimman tarkasti,
PCRtuotteen DNApitoisuus määritettiin seitsemänä rinnakkaisena mittauksena kolmesta
eri laimennuksesta NanoDrop®laitteella. DNApitoisuuden ja PCRfragmentin pituuden
perusteella laskettiin liuoksen sisältämien DNAfragmenttien lukumäärä eli geenin
kopioluku alla olevan kaavan avulla.
DNApitoisuus (g/ l)— — — — — — — — — • Avogadron vakio
PCRpalan pituus (bp) • 660
5.5.3 Näytelevyjen valmistus ja ajo ABI 7300laitteella
QRTmPCR:ssä käytetty SYBR®Green PCR Master mix (Applied Biosystems, USA)
sisälsi alukkeita ja tutkittavaa näytettä lukuun ottamatta kaikki muut PCRreaktioon
tarvittavat komponentit. QRTmPCRreaktiot tehtiin 30 l reaktiotilavuudessa, niin että
jokaisessa reaktiossa oli 15 l kaksinkertaista SYBR®Green Master mix:iä, 2,5 l
molempia alukkeita (300 nM), ja 10 l tutkittavaa DNAnäytettä tai sen laimennosta.
PCRreaktiot tehtiin 96kuoppalevyillä (96Well Optical Reaction Plate, Applied
Biosystems, USA). Näytelevyille pipetoitiin ensin alukkeista ja SYBR®Green Master
mix:istä tehty seos. Tämän jälkeen levy siirrettiin toiseen tilaan, jossa standardit ja DNA
näytteet lisättiin levyille. Lopuksi näytelevy suljettiin ohuella läpinäkyvällä tarrakannella
(Optical Adhesive Cover Starter Kit, Applied Biosystems, USA). Näytelevyä pidettiin
koko sen käsittelyn ajan 96kuoppalevytelineessä (Applied Biosystems), jotta se pysyisi
puhtaana ulkopinnoiltaan. Näytelevyjen ajo tehtiin 7300 Real Time PCR Systemlaitteella
(Applied Biosystems), josta tulokset siirtyivät automaattisesti tietokoneelle Sequence
Detection Software ohjelmaan (versio 1.2.3).
65
Ensin QRTmPCR:n avulla selvitettiin, millä laimennustasolla tutkittavat maaDNA
uutteet monistuivat tehokkaimmin. MaaDNAuutelaimennukset, joita tutkimuksessa
vertailtiin, olivat 101, 102, 103 ja 104. Kaikista laimennoksista tehtiin PCRnäytelevylle
kolme rinnakkaista reaktiota. Käytetty PCRohjelma on esitetty taulukossa 10.
Taulukko 10. MaaDNAuutteiden sopivan laimennustason määrittämiseenkäytetty QRTmPCRohjelma.
Ohjelman vaihe Kesto (min:s) Lämpötila (ºC) Kierrokset
1. Alkudenaturaatio 15:00 95 1
2. Denaturaatio
3. Alukkeiden kiinnittyminen4. Synteesi
0:15
0:300:30
95
4772
45
5. Sulamiskäyräanalyysi0:150:30
0:15
9560
95
1
Vertailtaessa nahAcgeenikopiolukuja eri näytteenottoviikkojen välillä tehtiin QRTm
PCRajo muuten taulukon 10 mukaisella PCRohjelmalla, mutta sekä alukkeiden
kiinnittymis että synteesiaikaa pidennettiin 30 sekunnista 45 sekuntiin.
5.5.4 Standardiplasmidin valmistus
PCRtuotteesta valmistetun standardin lisäksi valmistettiin plasmidistandardi QRTm
PCR:ää varten. Plasmidistandardi valmistettiin kloonaamalla P. putida G7kannasta
monistettu nahAcgeenifragmentti osaksi pCR®2.1TOPO®plasmidivektoria (Invitrogen,
USA).
Kloonausta varten suunniteltiin uudet alukkeet, koska kloonauksen yhteydessä voi tapahtua
muutamien nukleotidien deleetioita kloonattavan palan päistä. Uusien alukkeiden
sitoutumiskohdat olivat nahAcgeenissä noin 20 nukleotidiä Baldwinin ym. (2003) NAH
alukkeiden ulkopuolella. Alukkeet suunniteltiin alukkeiden suunnittelusta annettujen
ohjeiden mukaisesti (Suominen ja Ollikka 1999). Lopuksi alukkeiden sekvenssit syötettiin
Primer3ohjelmaan (internetsivu http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi
käyttöpäivä 20.6.2005), joka laski suunniteluille alukkeille mm. sulamislämpötilan, sekä
66
arvioi alukkeiden toimivuutta PCRreaktioissa, ilmoittaen alukkeen sisäisten
sekundäärirakenteiden ja alukedimeerien muodostumistodennäköisyyden. Taulukossa 11
on esitetty suunniteltujen alukkeiden sekvenssit sekä ominaisuuksia.
Taulukko 11. Kloonattavan nahAcfragmentin monistamiseen suunnitellut alukkeet.Monistettavan PCRtuotteen koko oli 423 emäsparia. Alukkeiden sijainnit nahAcgeenissä,alukkeiden pituudet sekä niiden GCprosentti on määritetty ilman erillistä ohjelmaa. Alukkeidensulamislämpötilat laskettu Primer3ohjelmalla.
Alukkeennimi
5 ´pään sijaintinahAcgeenissä
Sekvenssi5´3´
Pituus(nt)
Sulamislämpö(º C)
GCprosentti(%)
nah_pitkä_F 25GTGAGTGAATCTGGGCTGAC
20 58 55
nah_pitkä_R 448CATAGATGAAGCCATGGAAGC
21 60 48
Suunnitelluilla nah_pitkäalukkeilla monistettiin pesäkePCR:llä kloonattavaa fragmenttia
P. putida G7kannasta, joka oli kasvanut yhden vuorokauden TYmaljalla + 28 ºC:ssa.
PCRreaktio tehtiin 50 µl tilavuudessa. PCRreaktioliuoksen koostumus oli muuten
taulukon 8 mukainen, mutta alukkeina käytettiin taulukon 11 nah_pitkäalukkeita. Käytetty
PCRohjelma oli taulukon 9 mukainen. PCR:n onnistuminen ja PCRtuotteen koko
tarkistettiin geelielektroforeettisesti kuten edellä.
Nah_pitkäalukkeilla monistetun PCRtuotteen kloonaamiseen pCR®2.1TOPO®
kloonausvektoriin käytettiin TOPO TA Cloning®kittiä (Invitrogen, USA) ja
transformaatio tehtiin kitin kemiallisen transformaation protokollan mukaisesti. Ensin
PCRtuotteesta ja kitin pCR®2.1TOPO®kloonausvektorista valmistettiin ligaatioseos
(taulukko 12) kuuden mikrolitran tilavuuteen. PCRtuotteen ja plasmidivektorin annettiin
ligoitua keskenään viisi minuuttia huoneenlämmössä, minkä jälkeen ligaatioseos siirrettiin
jäille. Kaksi mikrolitraa ligaatioseosta lisättiin putkeen, joka sisälsi kompetentteja One
Shot® E. coli soluja. Tätä seosta seisotettiin jäillä 20 minuuttia. Transformaatio, eli DNA
molekyylien siirtäminen kompetenttien solujen sisälle, tapahtui lyhyen lämpökäsittelyn (30
sekuntia + 42 ºC) avulla. Transformaation jälkeen solujen päälle lisättiin SOCliuosta ja
putkia inkuboitiin 1 tunti ravistelussa +37 ºC:ssa.
67
Taulukko 12. Ligaatioseoksen koostumus
Reagenssi tilavuus/reaktio (µl)
PCRtuote 2
Suolaliuos 1
Vektoriplasmidi 1
steriili MQvesi 2
Inkuboinnin jälkeen seos levitettiin LBmaljoille, jotka sisälsivät 50 µg/ml ampisilliiniä
(Sigma, Saksa) ja 80 µg/ml Xgal:a (Fermentas). Ampisilliinin avulla maljoille valikoitiin
ne solut, jotka olivat ottaneet sisäänsä pCR®2.1TOPO®plasmidivektorin. Selektio
perustui siihen, että ainoastaan pCR®2.1TOPO®plasmidivektorissa oli
ampisilliiniresintenttiyttä koodaava geeni.
Maljoilla olevan laktoosianalogin Xgal:n avulla voitiin maljoilta tunnistaa pesäkkeet,
joiden pCR®2.1TOPO®plasmidivektoriin oli liittynyt insertti. Tunnistus perustui siihen,
että vektorissa insertti liittyy keskelle laktoosia hajottavaa entsyymiä, galaktosidaasia,
koodaavaa geeniä, jolloin geeni muuttuu toimimattomaksi. Koska Xgal:n hajoamistuote
on väriltään kirkkaan sininen, tunnistetaan solut, joissa on toimiva galaktosidaasigeeni,
sinisestä väristä. Pesäkkeet, joiden plasmidiin insertti on liittynyt haluttuun kohtaan eli
keskelle galaktosidaasigeeniä, ovat puolestaan väriltään valkoisia.
Maljoja, joille transformantit oli viljelty, kasvatettiin +37 ºC:ssa yksi vuorokausi.
Kasvatuksen jälkeen maljoilta poimittiin valkoisia ja vaaleansinisiä pesäkkeitä, joista
tehtiin puhdasviljelmät LBmaljoille, joissa oli ampisilliiniä ja Xgal:a edellä mainituissa
pitoisuuksissa. Kloonauksen onnistuminen tarkistettiin puhdasviljelmistä pesäkePCR:llä
sekä kloonauskitin M13alukkeilla (Invitrogen, USA) että nah_pitkäalukkeilla (taulukko
11). M13alukkeet kiinnittyvät vektoriin kloonauskohdan molemmille puolille, jolloin
kloonattu pala jää monistettavan alueen sisään. M13alukkeilla PCR tehtiin kitin ohjeen
mukaisesti ja nah_pitkäalukkeilla taulukon 8 ja 9 mukaisesti. PCRreaktiot tehtiin 20 µl:n
tilavuudessa ja PCR:n onnistuminen ja PCRtuotteiden koko tarkistettiin
geelieletroforeettisesti.
68
Kloonit, joista monistui oikean kokoista fragmenttia sekä kloonauskitin M13alukkeilla
että nah_pitkäalukkeilla, viljeltiin 3 ml:aan LBlientä, jossa oli 5 g/ml ampisilliiniä.
Putkia inkuboitiin +37 ºC:ssa ja ravistelussa (125 kierrosta minuutissa) yön yli.
Kasvatuksista kerättiin sentrifugoimalla solut 1,5 ml eppendorfputkien pohjalle. Tämän
jälkeen tehtiin plasmidin eristys JETquickplasmidin eristyskitillä (Genomed, Saksa) kitin
ohjeen mukaisesti. Plasmidin eristyksen onnistuminen tarkistettiin geelielektroforeettisesti.
Standardiplasmidia testattiin QRTmPCR:llä käyttäen NAHalukkeita (taulukko 7).
5.6 Kasvihuonekokeesta saatu muu aineisto
Tässä osiossa on esitetty Kondon (2006) kasvihuonekokeen aikana saamia tuloksia, jotka
toimivat taustaaineistona tässä työssä saaduille tuloksille. Kaikki alla olevat tulokset on
julkaistu Kondon pro gradu tutkielmassa. Taulukot ja kuvat on otettu muokkaamattomina
Kondon pro gradu tutkielmasta, ainoastaan muutamia kuvatekstejä hieman muutettu.
Tässä osiossa esitetyt tulokset ovat: 1) öljyhiilivetyjen kokonaispitoisuuden vaihtelu
kasvillisessa (ÖKR), kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljykäsittelyssä
kasvihuonekokeen aikana (kuva 13), 2) öljyllä saastutetun (ÖKR) ja saastuttamattoman
(PKR) kasvikäsittelyn kasvibiomassan tuotto (kuva 14) ja 3) maan typpipitoisuuden
vaihtelu käsittelyissä ÖKR, Ö ja PKR (kuva 15).
Kuvassa 13 on esitetty polttoöljyn hajoaminen kasvihuonekokeen polttoöljyllä
saastutetuissa käsittelyissä eli käsittelyissä ÖKR, Ö ja ÖS. Öljypitoisuus on määritetty
jokaisella näytteenottoviikolla kolmen rinnakkaisen ruukun keskiarvona. Virherajoina
kuvassa 13 on esitetty rinnakkaisten ruukkujen öljypitoisuuksien keskihajonta.
Steriloimattomissa öljykäsittelyissä (ÖKR ja Ö) öljyhajoaminen oli koko kokeen ajan
hyvin yhdenmukaista (kuva 13). Öljypitoisuus laski käsittelyissä ÖKR ja Ö jyrkästi
viikolle 3, minkä jälkeen öljypitoisuuden lasku selvästi hidastui. Viikolta 16 viikolle 21
öljypitoisuuden lasku steriloimattomissa öljykäsittelyissä (ÖKR ja Ö) oli hyvin vähäistä.
Steriilissä öljykäsittelyssä (ÖS) polttoöljyn pitoisuus laski koko kokeen aikana vain hyvin
vähän (kuva 13).
69
0
500
1000
1500
2000
2500
0 5 10 15 20 25
aika viikkoina kokeen alusta
pito
isuu
s m
aass
a (m
g/kg
maa
ta)
ÖKRÖÖS
Kuva 13. Polttoöljyn pitoisuuden (mg/kg) muutokset kasvillisessa (ÖKR),kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa 21viikoisen kasvihuonekokeenaikana. Polttoöljypitoisuus on ilmoitettu kuvassa maan kuivapainoa kohden. (Kondo 2006)
Kuvassa 14 on esitetty kokeen kasvillisten käsittelyiden, eli käsittelyiden PKR ja ÖKR,
kasvibiomassan vaihtelu eri näytteenottoviikoilla. Kasvibiomassa on määritetty jokaisella
näytteenottoviikolla kolmen rinnakkaisen ruukun keskiarvona. Virherajoina kuvassa 14 on
esitetty rinnakkaisten ruukkujen kasvibiomassan keskihajonnat. Näytteenottoviikkojen 12
ja 16 välissä, viikolla 15, kaikki kasvit molemmista käsittelyistä niitettiin. Tästä johtuen
kuvan 14 kuvaajissa on näytteenottoviikkojen 12 ja 16 välillä katko. Viikkojen 6 ja 12
välillä molempien käsittelyiden näyteruukuissa oli viisi kasvia. Viikon 12 jälkeen öljyllä
saastutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) ruukuissa oli jokaisessa viisi kasvia, mutta
saastuttamattoman kasvikäsittelyn (PKR) ruukuissa ainoastaan kolme kasvia.
Kasvibiomassa alkoi saastuttamattomassa käsittelyssä (PKR) nousta voimakkaasti viikon 6
jälkeen ja öljyllä saastutetussa käsittelyssä (ÖKR) viikon 8 jälkeen (kuva 14). Käsittelyssä
PKR kasvibiomassa oli viikkojen 6 ja 12 välillä koko ajan selkeästi korkeampi kuin
käsittelyssä ÖKR. Niiton jälkeen saastutetun käsittelyn kasvibiomassa eli ensin viikolla 16
matalampi kuin saastuttamattoman käsittelyn, mutta saavutti kuitenkin saastuttamattoman
käsittelyn kasvibiomassan kokeen lopussa (kuva 14). Tosin käsittelyssä ÖKR oli tällöin
viisi kasvia ja käsittelyssä PKR vain kolme kasvia.
70
0
1
2
3
4
5
6
7
0 5 10 15 20 25
aika viik koina kokeen alus ta
kasv
ibio
mas
sa (g
kp)
PKR
ÖKR
Kuva 14. Kasvibiomassan tuotto puhtaassa (PKR) ja polttoöljyllä saastutetussa(ÖKR) maassa. Viikolla 12 puhtaan maan ruukuista harvennettiin jokaisesta kaksi kasvia, jolloinviikon 12 jälkeen saastuneen maan ruukuissa oli jokaisessa viisi kasvia ja puhtaan maan ruukuissakolme kasvia. Viikolla 15 molemmista käsittelyistä niitettiin kaikki kasvit. (Kondo 2006)
Kuvassa 15 on esitetty kasvillisen ja kasvittoman polttoöljyllä saastutetun maan, eli
käsittelyjen ÖKR ja Ö, sekä saastuttamattoman kasvillisen maan (PKR) typpipitoisuudet
viikkojen 6 ja 21 välillä. Öljykäsittelyissä (ÖKR ja Ö) maan typpipitoisuus oli viikolla 6
lähes samalla tasolla. Tämän jälkeen kasvittomassa öljykäsittelyssä (Ö) maan
typpipitoisuus laski tasaisesti kokeen kuluessa (kuva 15). Kasvillisessa öljykäsittelyssä
(ÖKR) typpipitoisuus puolestaan ensin nousi selvästi viikon 6 ja 12 välissä ja taas laski
viikkojen 12 ja 21 välissä (kuva 15). Saatuttamattomassa kasvikäsittelyssä (PKR)
typpipitoisuus oli koko kokeen ajan matalampi kuin öljykäsittelyissä (ÖKR ja Ö). PKR
käsittelyssä typpipitoisuus ensin nousi hieman viikkojen 6 ja 12 välillä, mutta laski selvästi
viikolta 12 viikolle 16 (kuva 15).
71
0,05
0,055
0,06
0,065
0,07
0,075
0,08
0,085
0,09
0 5 10 15 20 25
aika viikkoina kokeen alusta
N %
PKR
ÖKR
Ö
Kuva 15. Koemaan typpipitoisuus (% maan kuivapainosta) kasvillisessa (ÖKR),kasvittomassa (Ö) ja steriilissä (ÖS) öljymaassa viikolta 6 viikolle 21. Virhejanatviikoilla 6, 16 ja 21 kuvaavat kolmen ja viikolla 12 kahden rinnakkaisen määrityksen välistäkeskihajontaa. (Kondo 2006)
Kasvihuonekokeen aikana suoritettiin kaikkien tutkimukseen osallistuneiden yhteistyöllä
viikolla 24 kasvillisten käsittelyjen (ÖKR ja PKR) ylimääräisten ruukkujen (taulukko 3)
rehuvuohenherneille asetyleeninpelkistysmittaus. Tehty asetyleeninpelkistysmittaus on
esitetty Kondon pro gradu tutkielmassa. Koska asetyleeninpelkistysmittausta ei tässä
tutkimuksessa suoritettu kvantitatiivisesti, ei eri käsittelyjen typensidontatehokkuutta voitu
vertailla. Asetyleenin pelkistysmittauksen avulla voitiin kuitenkin todeta, että sekä
öljykäsittelyn (ÖKR) että saastuttamattoman käsittelyn (PKR) rehuvuohenherneiden
juurissa havaitut juurinystyrät kykenivät sitomaan aktiivisesti typpeä.
Kondo määritti kokeen kuluessa kaikkien maanäytteiden kuivapainot, joita on hyödynnetty
tämän työn tulosten analysoinnissa.
72
6. Tulokset
6.1 Menetelmien testauksen ja optimoinnin tulokset
Testauksen ja optimoinnin tavoitteena oli
1) kehittää MPNmenetelmä polttoöljynhajottajien lukumäärien määritykseen,
2) selvittää spektrofotometrisen mittauksen ja PicoGreen®väriaineeseen perustuvan
mittauksen soveltuvuutta maaDNAuutteiden DNApitoisuusmittauksiin,
3) kehittää kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR naftaleenin hajotukseen osallistuvan
nahAcgeenin monistamiseen maaDNAuutteista ja
4) valmistaa kvantitatiivissa reaaliaikaisessa PCR:ssä käytettävä standardiplasmidi.
6.1.1 MPNmenetelmän optimointitulokset
MPNmenetelmä optimoinnin yhteydessä testattiin: 1) WST1 ja INT soluhengitys
indikaattorien soveltuvuutta MPNlukumäärien määritykseen 2) absorbanssilukijalla
tehtävän sameusmittauksen soveltuvuutta MPNlukumäärien määritykseen ja 3)
maanäytesuspension seisottamisen vaikutusta saataviin tuloksiin.
WST ja INTreagenssien soveltuvuus polttoöljynhajottajien MPN
määrityksiinINTreagenssin perusteella saatujen positiivisten kaivojen lukumäärät kasvihuonekokeen
kerranteen 1 ruukuista otetuista maanäytteistä tehdyillä MPNnäyte ja kontrollilevyillä on
esitetty kuvassa 16. INTsoluhengitysindikaattorilla saatujen tulosten perusteella öljyllä
saastutetun kasvillisen (ÖKR) ja kasvittoman (Ö) käsittelyn näytelevyillä oli molemmilla
selvästi enemmän positiivisia kaivoja kuin saastuttamattoman kasvillisen käsittelyn (PKR)
näytelevyllä. Tämän perusteella INTsoluhengitysindikaattorin avulla voitiin selvästi
erotella ainakin PKRkäsittely polttoöljyllä saastutetuista käsittelyistä ÖKR ja Ö. Tulosten
lukeminen käytettäessä INTreagenssia ei kuitenkaan ollut yksiselittteistä, koska erot
positiivisten ja negatiivisten kaivojen välillä eivät olleet silmämääräisesti arvioituna
selkeitä. Lisäksi käytettäessä INTreagenssia myös negatiivisilla kontrollilevyillä oli useita
positiivisia kaivoja (kuva 16).
73
Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 näytteistä tehdyilläMPNlevyillä yksi vuorokausi INTlisäyksen jälkeen
0
5
10
15
20
25
Näytelevy Negatiivinenkontrolli
Näytelevy Negatiivinenkontrolli
Näytelevy Negatiivinenkontrolli
ÖKR Ö PKR
Posi
tiivi
sten
kai
voje
n lu
kum
äärä
Kuva 16. INTsoluhengitysindikaattorin avulla saatujen positiivisten kaivojenlukumäärät näytteenottoviikon 0 MPNnäyte ja kontrollilevyillä. ÖKR on öljylläsaastutettu maa kasvilla, Ö öljyllä saastutettu maa ilman kasvia ja PKR saastuttamaton maa kasvilla.
WST1reagenssin perusteella saatujen positiivisten kaivojen lukumäärät kerranteen 1
käsittelyjen ÖKR, Ö ja PKR näyte ja kontrollilevyillä yhden, kahden ja kolmen
vuorokauden jälkeen WSTlisäyksestä on esitetty kuvassa 17. Jokaisen kuluneen
vuorokauden aikana ilmestyi sekä näytelevyille että negatiivisille kontrollilevyille uusia
positiivisia reaktiota (kuva 17).
Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 näytteistätehdyillä MPNlevyillä 1, 2 ja 3 vuorokautta WST1 lisäyksen jälkeen
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Näytelevy Negatiivinenkontrolli
Näytelevy Negatiivinenkontrolli
Näytelevy Negatiivinenkontrolli
ÖKR Ö PKR
Pos
itiiv
iste
n ka
ivoj
en lu
kum
äärä
1 vrk2 vrk3 vrk
Kuva 17. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon 0 MPNnäyte jakontrollilevyillä 1, 2 ja 3 vuorokautta WST1 lisäyksen jälkeen. ÖKR on öljylläsaastutettu maa kasvilla, Ö öljyllä saastutettu maa ilman kasvia ja PKR saastuttamaton maa kasvilla.
74
Käytettäessä WST1soluhengitysindikaattoria ilmestyi negatiivisille kontrollilevyille vielä
enemmän positiivisia kaivoja kuin käytettäessä INTreagenssia (kuvat 16 ja 17). Kun
MPNlevyjen inkubointia soluhengitysindikaattorien lisäämisen jälkeen oli jatkettu yli
viikko, olivat MPNnäytelevyjen kaikki kaivot muuttuneet positiivisiksi, riippumatta siitä
oliko kaivoon lisätty INT vai WST1soluhengitysindikaattoria (kuva 18).
WST1 INT WST1 INT
Kuva 18. Näytelevy kahden vuorokauden jälkeen WST1 ja INTreagenssienlisäämisestä (vasemmalla) ja sama levy viikon päästä WST1 ja INTreagenssienlisäämisestä (oikealla). MPNlevyn kuuteen ensimmäiseen sarakkeeseen on lisätty WST1soluhengitysindikaattoria ja kuuteen viimeiseen sarakkeeseen INTsoluhengitysindikaattoria.WST1:n pelkistynyt muoto on väriltään keltainen ja INT:n pelkistynyt muoto tummanpunainen.
Koska sekä näytelevyille että negatiivisille kontrollilevyille ilmestyi WST1:n ja INT:n
kanssa inkuboitaessa joka vuorokausi uusia positiivisia reaktioita, ei sopivaa tulosten
lukuhetkeä pystytty kummallekaan soluhengitysindikaattorille määrittämään. Menetelmä,
jossa negatiivinen kontrolli tuottaa positiivisia tuloksia ei ole luotettava. Tästä syystä tässä
tutkimuksessa luovuttiin soluhengitysindikaattorien WST1 ja INT käytöstä.
Kasvualustan sameuden absorbanssimittaksen soveltuminen
polttoöljynhajottajien MPNmäärityksiinKasvihuonekokeen aikana saadut MPNtulokset on esitetty kuvissa 19, 20 ja 22.
Öljynhajottajien lukumäärät on esitetty logaritmisella asteikolla ja tulokset on ilmoitettu
yhden maanäytegramman kuivapainoa kohden. Kuviin merkityt virhejanat ilmaisevat 95
prosentin luottamusvälin saaduille MPNtuloksille.
Kuvassa 19 on esitetty näytteenviikkojen 0 ja 3 MPNtulokset. Näytteenottoviikoilla 0 ja 3
MPNlevyt luettiin WST1:n referenssiaallonpituudella ei aallonpituudella 620 nm.
75
Saaduista tuloksista havaittiin, että negatiivisilla kontrollilevyillä absorbanssiarvo jäi,
matalinta laimennusta ja satunnaisia kaivoja lukuunottamatta, kaikissa kaivoissa selvästi
alle absorbanssiarvon 0,1 (liite 4). Näytelevyillä rajaarvon 0,1 ylittäviä kaivoja oli
öljykäsittelyistä (ÖKR ja Ö) tehdyillä MPNnäytelevyillä viidessä ensimmäisissä
laimennuksessa ja saastuttamattomassa kasvikäsittelyssä (PKR) kolmessa ensimmäisessä
laimennuksessa (liite 4). Saaduista tuloksista pääteltiin, että absorbanssiarvon 0,1
ylittyminen kaivossa, MPNnäytelevyjen matalinta laimennusta lukuunottamatta, johtui
polttoöljyä hyödyntävien mikrobien kasvun aikaansaamasta kasvualustan samentumisesta.
Mikrobikasvu kuoppalevyillä varmistettiin vielä mikroskopoimalla.
Kaivot, joiden absorbanssi saavutti valitun rajaarvon 0,1 laskettiin positiiviseksi ja kaivot,
joiden absorbanssi oli alle 0,1 laskettiin negatiivisiksi. Valitulla rajaarvolla negatiivisilla
kontrollilevyillä oli muutamia positiivisia kaivoja matalimmissa laimennoksissa (liite 4).
Tämä kuitenkin sallittiin, koska niissä laimennoksissa, joiden perusteella öljykäsittelyiden
MPNlukumäärät määritettiin, ei positiivisia kaivoja negatiivisilla kontrollilevyillä ollut.
Näytteenottoviikolla 0, eli kylvöhetkellä, tehtiin MPNlevyt kaikista käsittelyistä ja
näytteenottoviikolla 3 öljyllä saastutetuista käsittelyistä (ÖKR ja Ö). Näytteenottoviikolla 0
eli kolme päivää polttoöljysaastutuksen jälkeen käsittelyjen ÖKR ja Ö
polttoöljynhajotukseen kykeneviä mikrobien MPNlukumäärät olivat jo noin satakertaiset
saastuttamattoman maan käsittelyyn (PKR) verrattuna (kuva 19). Näytteenottoviikkoon 3
mennessä polttoöljynhajotukseen kykenevien mikrobien MPNlukumäärät olivat
molemmissa öljyllä saastutetuissa käsittelyissä (ÖKR ja Ö) selvästi nousseet
näytteenottoviikolta 0 (kuva 19).
76
Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärät näytteenottoviikoilla 0 ja 3
10000
100000
1000000
10000000
100000000
Viikko 0 Viikko 3
Näytteenottoviikko
MPN
/ g
(d. w
.)
PKR kerranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2
Kuva 19. MPNtulokset näytteenottoviikoilta 0 ja 3.
Näytteenottoviikolla 3 MPNlevyjä luettiin aallonpituuden 620 nm lisäksi myös
aallonpituuksilla 500 nm ja 450 nm selkeämmin negatiivisia ja positiivisia kaivoja
erottelevan mittausaallonpituuden löytämiseksi. Tällöin todettiin, että aallonpituudella 450
nm positiivisten ja negatiivisten kaivojen absorbassiarvojen ero oli suurempi kuin käytössä
olevalla aallonpituudella 620 nm (liite 5). Suurempi absorbanssiero positiivisten ja
negatiivisten kaivojen välillä parantaa saatujen tulosten luotettavuutta. Lisäksi todettiin,
että muutamat kaivot MPNnäytelevyillä, jotka aallonpituudella 620 nm mitattuna jäivät
hieman alle valitun rajaarvon 0,1, ylittivät rajaarvon aallonpituudella 450 nm mitattuna
(liite 5). Tämä puolestaan lisää menetelmän herkkyyttä. Koska MPNlevyjen lukeminen
aallonpituudella 450 nm lisäsi tulosten luotettavuutta sekä menetelmän herkkyyttä
siirryttiin viikon 3 jälkeen mittaamaan levyt aallonpituudella 450 nm.
Kuvassa 20 on esitetty näytteenottoviikkojen 6 ja 8 MPNtulokset. Näytteenottoviikolla 6
MPNlevyt tehtiin öljyllä saastutetuista käsittelyistä (ÖKR ja Ö) ja näytteenottoviikolla 8
kaikista käsittelyistä. Näytteenottoviikolla 6 käsittelyiden ÖKR ja Ö MPNlukumäärät
olivat hieman korkeampia kuin näytteenottoviikolla 8. Käsittelyjen ÖKR ja Ö välillä ei
havaita eroja kummallakaan näytteenottoviikolla. Näytteenottoviikolla 8
saastuttamattoman kasvikäsittelyn (PKR) polttoöljynhajotukseen kykenevien mikrobien
MPNlukumäärät olivat yhä noin 100kertaa matalammat kuin käsittelyissä ÖKR ja Ö
(kuva 20).
77
Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärät näytteenottoviikoilla 6 ja 8
10000
100000
1000000
10000000
100000000
1000000000
Viikko 6 Viikko 8
Näytteenottoviikko
MPN
/ g
(d. w
.) PKR keranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2
Kuva 20. MPNtulokset näytteenottoviikoilta 6 ja 8. Näytteenottoviikon 6 kasvittomanöljykäsittelyn (Ö) kerranteen 2 tuloksia ei ole kuvassa.
Kuvassa 21 on esitetty näytteenottoviikolla 8 tehdyn maanäytesuspension seisotusajan
testauksen tulokset. Kuvassa 21 on esitetty positiivisten kaivojen lukumäärät 5, 10 ja 20
minuutin seisotusajan jälkeen tehdyillä MPNlevyillä. Saatujen tulosten perusteella
maasuspension seisotusajalla oli suuri vaikutus positiivisten kaivojen lukumääriin
negatiivisilla kontrollilevyillä. Kun seisotusaikaa pidennettiin 20 minuuttiin, päästiin eroon
kaikista positiivisista kaivoista negatiivisilla kontrollilevyillä. Saatujen tulosten perusteella
maanäytesuspension seisotusajan pidentäminen ei merkittävästi vaikuttanut MPN
näytelevyiltä saataviin tuloksiin. Koska seisotusajan pidentäminen selkeästi vähensi
asetetun absorbanssin rajaarvon 0,1 ylittäviä kaivoja negatiivisilla kontrollilevyillä,
siirryttiin tämän tuloksen perusteella jatkossa käyttämään 20 minuutin seisotusaikaa.
78
Seisotusajan vaikutus positiivisten kaivojenlukumääriin MPNlevyillä
010
2030
40
Näytelevy Negatiivinenkontrollilevy
Posi
tiivi
sten
kai
voje
nlu
kum
äärä 5 min
10 min20 min
Kuva 21. Positiivisten kaivojen lukumäärät näytteenottoviikon8 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) MPNnäytelevyllä ja negatiivisellakontrollilevyllä.
Kuvassa 22 on esitetty kasvihuonekokeen viimeiset MPNtulokset, eli tulokset
näytteenottoviikoilta 12, 16 ja 21. Näitä MPNlevyjä tehtäessä maasuspension
seisotusaikana käytettiin 20 minuuttia.
Näytteenottoviikolla 12 tehtiin MPNlevyt öljyllä saatutetuista käsittelyistä (ÖKR ja Ö) ja
näytteenottoviikoilla 16 ja 21 kaikista käsittelyistä. Saadut tulokset osoittivat, että
näytteenottoviikon 12 jälkeen polttoöljynhajottajien MPNlukumäärät laskivat selvästi
molemmissa öljykäsittelyissä (ÖKR ja Ö) sekä viikolle 16 että viikolle 21 mentäessä. Eroja
käsittelyiden ÖKR ja Ö välillä ei näissä viimeisissäkään MPNtuloksissa nähty. Erot
saastuttamattoman kasvikäsittelyn (PKR) ja öljykäsittelyiden (ÖKR ja Ö) välillä olivat
puolestaan selvästi tasaantuneet kasvihuonekokeen loppua kohden. Viikolla 21 käsittelyjen
ÖKR ja Ö polttoöljynhajottajien MPNlukumäärä oli enää noin kymmenkertainen
verrattuna käsittelyyn PKR (kuva 22).
79
Polttoöljyhajottajien MPNlukumäärät näytteenottoviikoilla 12, 16 ja 21
10000
100000
1000000
10000000
100000000
Viikko 12 Viikko 16 Viikko 21
Näytteenottoviikko
MP
N /
g (d
. w.)
PKR keranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2
Kuva 22. MPNtulokset viikoilta 12, 16 ja 21.
6.1.2 NanoDrop® ja PicoGreen® menetelmien arviointi
NanoDrop®UVVisspektrofotometrin toimivuutta puhtaille DNAuutteille arvoitiin
mittaamalla QRTmPCR:ssä standardina käytetyn PCRtuotteen pitoisuus eri
laimennuksissa (taulukko 13). Lisäksi vertailtiin joidenkin maaDNAuutteen avulla
NanoDrop® ja PicoGreen® menetelmien antamia tuloksia ja arvioitiin molempien
menetelmien soveltuvuutta maaDNAuutteiden DNApitoisuuden mittaukseen (taulukko
14).
Taulukossa 13 on esitetty QRTmPCR:n standardina käytetyn PCRtuotteen
mittaustulokset. DNApitoisuuden lisäksi taulukossa on esitetty NanoDop®laitteen
antamat DNA:n puhtaudesta kertovat suhdeluvut A260nm/A230nm ja A260nm/A280nm. Taulukon
13 tuloksista nähdään, että DNApitoisuudet eri laimennuksissa vastaavat hyvin näytteen
laimennustasoa. Lisäksi NanoDop®:n rinnakkaiset mittaukset olivat hyvin lähellä toisiaan.
Suhdelukujen A260nm/A230nm ja A260nm/A280nm arvot sekä DNAuutteen spektri (kuva 23)
osoittivat PCRtuotteen olevan hyvin puhdasta DNA:ta.
80
Taulukko 13. QRTmPCR:n standardina käytetyn PCRtuotteen NanoDrop® mittaustulokset.
Näyte DNApitoisuus A260nm/A230nm A260nm/A280nm
Laimentamaton PCRtuote 72 ng/ l 1,8 1,9
1/5laimennettu PCRtuote 13 ng/ l 2,1 1,9
1/10laimennettu PCRtuote 7 ng/ l 2,0 1,9
Kaikki taulukossa esitetyt tulokset ovat seitsemän rinnakkaisen mittauksen keskiarvoja. Hajontarinnakkaisten mittausten välillä oli ±1 ng/ l.
Taulukossa 14 on esitetty maaDNAuutteiden NanoDrop® ja PicoGreen® mittaustulokset.
Saaduista tuloksista nähtiin selvästi, että maaDNAuutteet olivat erittäin epäpuhtaita,
koska erityisesti A260nm/A230nmsuhdeluvun arvo oli kaukana puhtaan DNA:n arvosta
(taulukko 13). Taulukon 14 perusteella NanoDrop®:lla saadut mittaustulokset olivat
kaikille mitatuille maaDNAuutteille monikertaiset verrattuna PicoGreen® menetelmällä
saatuihin tuloksiin.
Taulukko 14. MaaDNAuutteiden NanoDrop® ja PicoGreen® mittaustulokset sekäNanoDrop® laitteen antamat puhtausarvot A260nm/A230nm ja A260nm/A280nm maaDNAuutteille.
DNApitoisuusNäyte
NanoDrop® PicoGreen®A260nm/A230nm A260nm/A280nm
PKR_viikko 0 53 ng/ l 11 ng/ l 0,20 1,5
ÖKR_viikko 0 63 ng/ l 13 ng/ l 0,35 1,5
Ö_viikko 0 88 ng/ l 15 ng/ l 0,34 1,5
PKR_viikko 1 130 ng/ l 11 ng/ l 0,34 1,3
ÖKR_viikko 1 86 ng/ l 19 ng/ l 0,30 1,4
Ö_viikko 1 160 ng/ l 23 ng/ l 0,42 1,4
PKR_viikko 21 140 ng/ l 41 ng/ l 0,44 1,5
ÖKR_viikko 21 140 ng/ l 40 ng/ l 0,40 1,5
Ö_viikko 21 98 ng/ l 38 ng/ l 0,38 1,6Mittaustulokset on esitetty taulukossa yhtä mikrolitraa DNAuutetta kohden. ÖKR on öljylläsaastutettu maa kasvilla, Ö öljyllä saastutettu maa ilman kasvia ja PKR saastuttamaton maa kasvilla.Mittaukset on tehty ilman rinnakkaisia määrityksiä.
81
Kuvassa 23 on esitetty NanoDroplaitteen antamat spektrit QRTmPCR:ssä standardina
käytetylle PCRtuotteelle (vasemmalla) ja maaDNAuutteelle (oikealle). QRTmPCR:ssä
käytetyn standardiPCRtuotteen spektrissä nähdään selvä absorptiomaksimi 260 nm:ssä
eli DNA:n absorptiomaksimissa. MaaDNAuutteen absorptiomaksimi on 220 nm:ssä tai
sen alapuolella. Myös proteiinien absorptiomaksimissa 230 nm:ssä on maaDNAuutteen
absorptio paljon suurempaa kuin DNA:n absorptiomaksimissa 260 nm:ssä.
Kuva 23. NanoDrop®laitteen antamat spektrit QRTmPCR:ssä käytetylle PCRtuotteelle(vasemmalla) ja näytteenottoviikon 0 kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) maaDNAuutteelle(oikealla).
6.1.3 NahAcgeenin monistuminen kasvihuonekokeen näytteistä
Reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä haluttiin tässä tutkimuksessa selvittää nahAc
geenikopiolukujen vaihtelua eri käsittelyiden ja eri näytteenottoviikkojen välillä.
Ensimmäiseksi haluttiin määrittää maaDNAuutteista sopiva laimennustaso QRTm
PCR:ää varten. Tutkimuksessa haluttiin lisäksi valmistaa plasmidi, joka sisältäisi QRTm
PCR:ssä monistettavan nahAcgeenifrakmentin. Tätä plasmidia voitaisiin silloin käyttää
PCRtuotteen sijasta standardina QRTmPCR:ssä.
Kun standardiksi valmistetun plasmidin monistumista QRTmPCR:llä testattiin, ei
yhdestäkään standardiplasmidin laimennuksesta saatu PCRtuotetta. Tästä syystä kaikissa
esitetyissä QRTmPCRajoissa on käytetty standardina Pseudomonas putida G7kannasta
Baldwinin ym. (2003) NAHalukkeilla monistettua PCRtuotetta. Standardiplasmidin
valmistus ja sen toimimattomuuden selvittäminen on esitetty osiossa 6.1.4.
82
Kuvassa 24 on esitetty näytteenottoviikon 0 öljyllä saastutetun kasvillisen käsittelyn (ÖKR)
DNAuutelaimennusten 101, 102, 103 ja 104 amplifikaatiokäyrät. Koska kaikki näytteet
saavuttivat fluoresenssin kynnysarvon vasta pienimmän standardin jälkeen, ei
geenikopiolukua näytteille tässä ajossa voitu määrittää. Standardina ajossa käytettiin
standardiPCRtuotteen kuutta peräkkäistä kymmenkertaista laimennusta, joista tehtiin
jokaisesta kolme rinnakkaista reaktiota. StandardiPCRtuotteen tarkkaa kopiolukua ei
ollut vielä tässä vaiheessa määritetty.
Kuvasta 24 nähtiin, että monistuminen oli heikointa näytelaimennuksista 101 ja 102.
Nämä näytteet eivät saavuttaneet fluoresenssin kynnysarvoa lainkaan 45 PCRsyklin
aikana. Näytelaimennus 103 saavutti fluoresenssin kynnysarvon noin syklillä 34 ja
näytelaimennus 104 noin syklillä 37. Paras amplifikaatio saatiin siis näytelaimennoksesta
103. Kuvassa 32 on esitetty selkeyden vuoksi jokaisesta laimennuksesta vain yhden PCR
reaktion amplifikaatio kolmesta rinnakkaisesta. Rinnakkaisten näytteiden kynnyssykli
vaihteli laimennosten 103 ja 104 kohdalla useitakin syklejä. Kuvaan 24 valittiin
molemmista laimennuksista sen reaktion amplifikaatiokäyrä, jonka kynnyssykli oli
kolmesta rinnakkaisesta tuloksesta keskimmäinen.
Kuva 24. Näytteenottoviikon 0 saastutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) DNAuutelaimennusten monistuminen QRTmPCR:llä. Kuvassa on esitetty selkeydenvuoksi jokaisesta laimennuksesta vain yhden PCRreaktion amplifikaatio kolmestarinnakkaisesta.
83
Kuvassa 25 on esitetty yhden negatiivisen kontrollin, yhden standardiPCRtuotteen, sekä
yhden maaDNAnäytteen sulamiskäyräanalyysi. Kuvaan 25 valitut näytteet olivat kuvassa
24 esitetystä ajosta. Kuvassa 25 nähdään yhteensä kolme sulamispiikkiä. Alukedimeerien
sulamispiikki oli noin 72 ºC:n kohdalla. Tämä näkyi ainoana piikkinä negatiivisessa
kontrollissa. Suurin sulamispiikki sulamiskäyräanalyysissä nähtiin noin 87 ºC:n kohdalla.
Se oli suurin piikki sekä standardin että maaDNAuutteen sulamiskäyräanalyysissä.
Lisäksi maaDNAuutteen sulamiskäyräanalyysissä näkyi pieni piikki noin 82 ºC kohdalla.
Kuva 25. NäyteDNA:n 103laimennuksen, negatiivisen kontrollin sekä standardiPCRtuotteen reaktiotuotteiden sulamiskäyrät.
Kuvassa 26 on esitetty viikkojen 0, 3, 8 ja 21 öljyllä saastutetusta kasvillisesta käsittelystä
(ÖKR) eristettyjen DNAuutteiden monistuminen QRTmPCR:llä. Kaikkien näiden
näytteiden maaDNAuutteista tehtiin 103laimennukset, joista tehtiin QRTmPCR:ään
kolme rinnakkaista reaktiota. Kuvaan 26 on merkitty kaikkien standardien kopioluvut.
Kaikki standardien kolme rinnakkaista reaktiota saavuttivat fluoresenssin kynnysarvon
samalla syklillä, lukuunottamatta pienintä standardia, jonka geenikopioluku oli kymmenen
kopiota.
84
Kaikki tutkitut näytteet saavuttivat fluoresenssin kynnysarvon vasta pienimmän standardin
jälkeen (kuva 26). Näin ollen tässäkään ajossa ei pystytty määrittämään näytteiden
kopiolukuja. Kaikista tutkituista näytteistä monistui joko hyvin heikosti tai ei ollenkaan
nahAcgeeniä. Kaikkien näytteiden geenien kopioluvut jäivät alle detektiorajan eli alle
kymmenen geenikopion.
Kuva 26. Näytteenottoviikkojen 0, 3, 8 ja 21 maaDNAuutteiden monistuminen QRTmPCR:llä. Kuvassa ei selvyyden vuoksi ole esitetty kaikkia näytteiden rinnakkaistenreaktioiden tuloksia.
6.1.4 NahAcfragmentin siirtyminen plasmidiin
Tutkimuksessa haluttiin valmistaa QRTmPCR:ssä käytettävä standardiplasmidi, joka
sisältäisi QRTmPCR:ssä monistettavan nahAcgeenifragmentin. Koska plasmidiin
haluttiin siirtää hieman pidempi fragmentti kuin mitä QRTmPCR:llä monistettiin,
suunniteltiin työssä nah_pitkäalukkeet (taulukko 11), jotka kiinnittyivät P. putida G7 –
kannan nahAcgeeniin noin 20 nukleotidiä QRTmPCR:ssä käytettyjen NAHalukkeiden
(taulukko 7) ulkopuolelle. Näiden alukkeiden avulla monistettiin 423 emäsparin pituista
palaa P. putida G7 –kannan nahAcgeenistä pesäkePCR:llä. Monistettu nahAcfragmentti
haluttiin tämän jälkeen liittää pCR®2.1TOPO®kloonausvektoriin.
85
Työssä suunnittellut alukkeet monistivat P. putida G7 –kannan nahAcgeenistä geeliltä
arvioituna oikeankokoista eli 423 emäsparin pituista palaa (kuva 27). Kuvan perusteella
kloonattavaksi valittiin PCRtuote 1.
2045 bp 1605 bp 1198 bp 676 bp517350 bp
Kuva 27. P. putida G7 –kannasta nah_pitkäalukkeilla monistetut PCRtuotteet.
Kloonauksen onnistuminen todettiin ensin tekemällä kloonauskitin M13 –alukkeilla
valituista klooneista pesäkePCR (kuva 28). Monistettavan PCRtuotteen odotettu koko oli
625 emäsparia. Klooneista 6, 7, 9, 12 ja 14, PCR ei saatu lainkaan PCRtuotetta (kuva 28).
Klooneihin 15 ja 16 oli siirtynyt insertti oli pieni. Myös kloonin 1 PCRtuote on silmin
havaittavasti pienempi kuin muista klooneista saadut PCRtuotteet.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
2645 bp
1605 bp1198 bp 676 bp 517 bp
Kuva 28. Kloonauksen onnistumisen tarkistus. Valituista klooneista M13 –alukkeillasaadut PCRtuotteet.
1. pGEM®DNAmarkkeri2. PCRtuote 13. PCRtuote 24. PCRtuote 35. pGEM®DNAmarkkeri6. Negatiivinen kontrolli7. Negatiivinen kontrolli
1. pGEM®molekyylipainomarkkeri 12. pGEM®molekyylipainomarkkeri2. PCRtuote kloonista 1 13. PCRtuote kloonista 113. PCRtuote kloonista 2 14. PCRtuote kloonista 124. PCRtuote kloonista 3 15. PCRtuote kloonista 135. PCRtuote kloonista 4 16. PCRtuote kloonista 146. PCRtuote kloonista 5 17. PCRtuote kloonista 157. PCRtuote kloonista 6 18. PCRtuote kloonista 168. PCRtuote kloonista 7 19. Negatiivinen kontrolli9. PCRtuote kloonista 8 20. Negatiivinen kontrolli10. PCRtuote kloonista 9 21. Negatiivinen kontrolli11. PCRtuote kloonista 10 22. pGEM®molekyylipainomarkkeri
1 2 3 4 5 6 7
86
Koska kuvan 28 molekyylipainomarkkerissa alle 517 emäsparin vyöhykkeet eivät
erottuneet hyvin geeliltä, varmistettiin oikean kokoisen insertin siirtyminen klooneihin 2, 3,
4, 5, 8, 10, 11 ja 13 tekemällä vielä PCR nah_pitkäalukkeilla (kuva 29). Kaikista
klooneista saatiin PCRtuotetta, jonka koko oli geeliltä arvioituna oikea eli noin 423
emäsparia. Plasmidin eristys tehtiin kuvien 29 klooneista 3, 4, 8 ja 10.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2645 bp
1198 bp676 bp
517 bp
Kuva 29. Klooneista nah_pitkäalukkeille saadut PCRtuotteet.
Standardiplasmidin toimimattomuuden selvittäminen
Kun kloonatuista plasmideista ei saatu lainkaan tuotetta QRTmPCR:n NAHalukkeilla,
haluttiin syy tähän selvittää. Tämä tehtiin selvittämällä, onko tutkimuksessa suunnitelluilla
nah_pitkäalukkeilla saatu monistettua P. putida G7kannasta oikeaa tuotetta ja onko tämä
tuote saatu siirrettyä kloonattuihin plasmideihin.
Kun sekä P. putida G7kannasta että klooniplasmideista nah_pitkäalukkeilla monistetut
PCRtuotteet ajettiin rinnakkain hitaasti agaroosigeelille, todettiin, että nah_pitkä
alukkeilla monistui P. putida G7kannasta oikean, 423 emäsparin pituisen, PCRtuotteen
lisäksi myös toista hieman oikeaa tuotetta lyhyempää epäspesifistä PCRtuotetta (kuva 30).
Kun näiden fragmenttien ajautumista agaroosigeelillä verrattiin klooniplasmideista
nah_pitkäalukkeilla monistuneen fragmentin ajautumiseen, todettiin, että
klooniplasmideihin oli kloonauksessa siirtynyt oikean PCRtuotteen sijasta tätä oikeaa
PCRtuotetta hieman lyhyempi epäspesifinen tuote (kuva 30).
1. pGEM®DNAmarkkeri2. PCRtuote kloonista 23. PCRtuote kloonista 34. PCRtuote kloonista 45. PCRtuote kloonista 56. PCRtuote kloonista 87. PCRtuote kloonista 108. PCRtuote kloonista 119. PCRtuote kloonista 1310. Negatiivinen kontrolli11. Negatiivinen kontrolli12. pGEM®DNAmarkkeri
87
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
2645 bp1605 bp1198 bp
676 bp 517 bp 460 bp 396 bp
Kuva 30. Kahdesta kloonatusta plasmidista sekä P. putida G7kannastanah_pitkäalukkeilla monistetut PCRtuotteet ajettuna 2 %:lla agaroosigeelillä.
6.2 Ritsoremediaatioprosessin seuranta
6.2.1 Kasvien kasvu
Rehuvuohenherneiden kasvua ÖKR ja PKRkäsittelyiden näyteruukuissa seurattiin koko
kokeen ajan silmämääräisesti. Lisäksi Kondo (2006) määritti kasvillisista käsittelyistä
(ÖKR ja PKR) kaikkien näytteenottojen yhteydessä kasvibiomassan (kuva 14).
Ensimmäisessä kylvössä istutettujen kahdenkymmenen vuohenherneen siemenen
itämisprosentti oli sekä öljyllä saastutetussa (ÖKR) että saastuttamattomassa (PKR)
kasvillisessa käsittelyssä noin 30 %. Monet näistä ensimmäisessä kylvössä istutuista
siemenistä kuitenkin kuolivat hieman itämisensä jälkeen. Viikolla 1 tehdyssä
paikkauskylvössä 5 cm:n syvyyteen istutetut siemenet itivät huomattavasti paremmin
eivätkä myöskään kuolleet itämisen jälkeen. Vaikka siementen itämistehokkuudessa ei
ollut ÖKR ja PKRkäsittelyiden välillä selkeitä eroja, rehuvuohenherneen taimet
kasvoivat itämisen jälkeen huomattavasti hitaammin ÖKRkäsittelyn ruukuissa kuin PKR
käsittelyn ruukuissa (kuvat 31 ja 32). Vaikka kasvien kasvu ÖKRkäsittelyssä kiihtyi
kokeen edetessä, olivat kasvit ÖKRruukuissa vielä koeviikolla 10 huomattavasti
pienempiä kuin PKRkäsittelyn kasvit (kuvat 14 ja 33).
Viikolla 14 PKRkäsittelyn kasvit alkoivat näyttää huonovointisilta (kuvat 34 ja 35).
Viikolla 14 tehdystä lannoituksesta huolimatta viikolla 15 PKRkäsittelyn kasvit olivat
alkaneet jo lakastua ja myös ÖKRkäsittelyn kasvit alkoivat kellastua. Viikolla 15 tehdyn
niiton jälkeen sekä ÖKR että PKRkäsittelyihin kasvoi muutamassa päivässä uudet
1. pGEM®DNAmarkkeri2. PCRtuote kloonatusta plasmidista3. PCRtuote kloonatusta plasmidista4. PCRtuote P. putida G7 pesäkkeestä5. PCRtuote P. putida G7 pesäkkeestä6. PCRtuote P. putida G7 pesäkkeestä7. PCRtuote P. putida G7 pesäkkeestä8. PCRtuote P. putida G7 pesäkkeestä9. PCRtuote P. putida G7 pesäkkeestä10. Negatiivinen kontrolli11. pGEM®DNAmarkkeri
88
terveen näköiset versot. Niiton jälkeen kasvit ÖKRkäsittelyissä kasvoivat jo lähes yhtä
nopeasti kuin PKRkäsittelyssä (kuvat 14 ja 36).
Viikolla 6 harvennuksen yhteydessä poistettujen kasvien juurissa oli havaittavissa paljon
vaaleanpunaisia juurinystyröitä (kuva 32). Juurinystyröiden määrässä ei havaittu
merkittävää eroa saastuttamattoman maan ja öljymaan kasvien välillä. Jatkossa kaikkien
näytteenottojen yhteydessä havaittiin kaikissa kasveissa runsaasti vaaleanpunaisia
juurinystyröitä. Asetyleeninpelkistysmittausten (Kondo 2006) perusteella voitiin todeta,
että havaitut juurinystyrät sitoivat aktiivisesti typpeä.
89
Rehuvuohenherneiden kasvu kasvihuonekokeen aikana
Kuva 31. Rehuvuohenherneet viikolla 5. Kuva 32. Näytteenottoviikolla 6Vasemmalla kasvit saastuttamattomassa maassa ÖKRruukusta harvennettu kasvi.(PKR) ja oikealla polttoöljyllä saastutetussa Kasvi on kuvassa noin 5 cm pituinen.maassa (ÖKR). Kuvan ottanut Anu Mikkonen.
Kuva 33. Rehuvuohenherneet Kuva 34. Kasvihuonekokeen jäljellä olevatviikolla 10. Vasemmalla PKR ruukut viikolla 13. Kuvan ottanut Anu Mikkonen.käsittely ja oikealla ÖKRkäsittely.Kuvan ottanut Anu Mikkonen.
Kuva 35. Rehuvuohenherneet viikolla Kuva 36. Viikon 21 näytteenottoruukut.14. PKRkäsittelyssä (vasemmalla) Käsittelyt vasemmalta oikealle ovat PKR, Ö,kasvin lehdet ovat jo selvästi kellastuneet. ÖS ja ÖKR.
90
6.2.2 Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärien vaihtelu kokeen aikana
MPNmenetelmän avulla haluttiin tutkia, lisääkö rehuvuohenherne kasvihuonekokeessa
polttoöljynhajotukseen kykenevien mikrobien lukumääriä. Kasvittoman ja kasvillisen
polttoöljyllä saastutetun maan, eli käsittelyiden ÖKR ja Ö, MPNlukumääriä vertailtiin
näytteenottoviikoilla 0, 3, 6, 8, 12, 16 ja 21. Lisäksi käsittelystä PKR määritettiin MPN
lukumäärät viikoilla 0, 6, 8, 16 ja 21. Vertailemalla käsittelyistä ÖKR ja Ö saatuja tuloksia
käsittelyn PKR tuloksiin, voitiin selvittää, lisääkö polttoöljysaastutus polttoöljyn
hajotukseen kykenevien mikrobien lukumääriä maassa.
Kuvaan 37 on koottu kaikki kasvihuonekokeen MPNtulokset. Esitetyt MPNlukumäärät
on määritetty kasvualustan sameuden absorbanssimittauksen perusteella. Käytettyyn MPN
menetelmään tehtiin kaksi muutosta tutkimuksen aikana. Näytteenottoviikon 3 jälkeen
muutettiin mittausaallonpituus 620 nm:stä 450 nm:iin. Näytteenottoviikon 8 jälkeen
siirryttiin käyttämään viiden minuutin sijasta 20 minuutin seisotusaikaa
maanäytesuspensiolle ennen laimennussarjan valmistamista näytteestä. Ajankohdat, jolloin
muutokset tehtiin, on merkitty kuvaan 37 väleinä näytteenottoviikkojen 3 ja 6 sekä 8 ja 12
välissä.
Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärät eri näytteenottoviikoilla
10000
100000
1000000
10000000
100000000
1000000000
Viikko0
Viikko3
Viikko6
Viikko8
Viikko12
Viikko16
Viikko21
Näytteenottoviikko
MP
N / g
(d. w
.)
PKR keranne 1PKR kerranne 2ÖKR kerranne 1ÖKR kerranne 2Ö kerranne 1Ö kerranne 2
Kuva 37. Kasvihuonekokeen MPNtulokset. Viikkojen 3 ja 6 sekä 8 ja 12 välissämenetelmää on hieman muutettu optimoinnin seurauksena.
91
Koska menetelmää on tutkimuksen aikana kaksi kertaa hiukan muutettu, ei kaikkien eri
näytteenottoviikkojen tuloksia voida täysin luotettavasti vertailla keskenään. Tuloksista
voitiin kuitenkin sanoa, että polttoöljynhajottajien todennäköisimmät lukumäärät
öjykäsittelyissä (ÖKR ja Ö) nousivat selvästi näytteenottoviikolta 0 näytteenottoviikolle 3
ja taas puolestaan laskivat selvästi näytteenottoviikkojen 12 ja 21 välillä (kuva 37).
Polttoöljynhajotukseen kykenevien mikrobien MPNlukumäärät saastuttamattomassa
kasvikäsittelyssä (PKR) olivat kaikilla tutkituilla näytteenottoviikoilla huomattavasti
matalammat kuin öljykäsittelyissä (kuva 37). Kasvihuonekokeen lopussa käsittelyn PKR
MPNlukumäärät kuitenkin lähentyivät selvästi öljykäsittelyiden ÖKR ja Ö MPN
lukumääriä.
6.2.3 DNApitoisuuden vaihtelu kasvihuonekokeen aikana
MaaDNAuutteiden DNApitoisuusmittauksiin soveltuvalla PicoGreen®menetelmällä
haluttiin tutkia DNApitoisuuden vaihtelua kasvihuonekokeen eri käsittelyissä kokeen
aikana. DNA:n pitoisuusmittaus tehtiin kaikista DNAuuteista ilman rinnakkaisia
mittauksia.
DNA:n eristykset oli tehty tutkimuksen aikana kaikista näyteruukuista kahtena
rinnakkaisena uuttona. Jokaisen ruukun kahdesta rinnakkaisesta DNAuutteesta on laskettu
ensin DNApitoisuuksien keskiarvo, jonka jälkeen on määritetty kolmen rinakkaisen
ruukun keskiarvo. Tämä keskiarvo on kuvassa 38 esitetty käsittelyiden DNApitoisuutena.
Kuvassa 38 esitetyt virherajat ovat rinakkaisten ruukkujen DNApitoisuuksien
keskihajontoja.
Kaikkien käsittelyiden DNApitoisuus nousi kasvihuonekokeen aikana (kuva 38).
Öljykäsittelyjen ÖKR ja Ö DNApitoisuus nousi nopeasti heti kokeen alusta noin
näytteenottoviikolle 3 asti. Tämän jälkeen kasvillisen öljykäsittelyn (ÖKR) DNApitoisuus
laski jyrkästi viikolle 6, mutta nousi taas viikkojen 6 ja 12 välillä. Kasvittomassa
öljykäsittelyssä (Ö) viikon 3 jälkeen DNApitoisuus nousi hitaasti viikkojen 6 ja 12 välillä.
Viikon 12 jälkeen sekä käsittelyn ÖKR että Ö DNApitoisuus pysyi melko tasaisena
kokeen loppuun eli viikolle 21.
92
Saastuttamaton kasvikäsittely (PKR) erosi DNApitoisuusmittausten perusteelle selkeästi
öljykäsittelyistä ÖKR ja Ö (kuva 38). Käsittelyn PKR DNApitoisuus pysyi hyvin
tasaisena kokeen alusta noin viikolle 8 asti. Viikon 8 jälkeen DNApitoisuus käsittelyssä
PKR nousi ensin hitaasti, mutta kiihtyi kokeen loppua kohden. Viikolla 21
saastuttamttoman kasvikäsittelyn (PKR) DNApitoisuus tavoitti jo öljykäsittelyjen (ÖKR
ja Ö) DNApitoisuudet.
Maanäytteiden DNApitoisuudet kasvihuonekokeen aikana
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0 5 10 15 20 25
Näytteenottoviikko
DNA
pito
isuu
s (n
g / g
)
ÖKRÖPKR
Kuva 38. PicoGreen®mittauksella saadut keskimääräiset DNApitoisuudetkasvihuonekokeen eri käsittelyille kokeen kuluessa. DNApitoisuudet on esitetty kuvassamaanäytteiden kuivapainoja kohden. Virherajoina kuvassa on esitetty mittaustulostenkeskihajonnat.
93
7. Tulosten tarkastelu ja johtopäätökset
7.1 Kasvihuonekokeen ritsoremediaatioprosessin tarkastelu eri
menetelmillä
7.1.1 Kasvien kasvu
Vaikka polttoöljypitoisuuden 3000 ppm havaittiin tässä tutkimuksessa selvästi hidastavan
rehuvuohenherneiden kasvua (kuvat 31 ja 33), ei se estänyt rehuvuohenherneen itämistä ja
kasvamista. Kasvien itämistehokkuus ja biomassan tuotto mainitaan monissa lähteissä
hyvinä indikaattoreina öljyllä saastuneiden maiden toksisuudesta (Juvonen ym. 2000 ja
Fernandez ym. 2005). Tässä tutkimuksessa saatujen tulosten perusteella
rehuvuohenherneen itämistehokkuutta ei kuitenkaan voida pitää hyvänä
toksisuusindikaattorina, koska öljyllä saastutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) ja
saastuttamattoman kasvikäsittelyn (PKR) välillä ei havaittu merkittäviä eroja kasvien
itämistehokkuudessa. Myös Smith ym. (2006) havaitsivat tutkimuksessaan, etteivät PAH
yhdisteet estäneet merkittävästi tutkittujen ruoho ja hernekasvien itämistä, mutta
hidastivat selvästi tutkittujen kasvien kasvua itämisen jälkeen. Myös tässä tutkimuksessa
saatujen tulosten perusteella vuohenherneen biomassan tuotto oli hyvä indikaattori
polttoöljyllä saastuneen maan toksisuudesta (kuva 14). Kun maan polttöljypitoisuus
kokeen kuluessa laski, kiihtyi saastutetussa kasvikäsittelyssä (kuva 13) kasvien
kasvuvauhti selvästi (kuvat 14 ja 36).
Pitkäjärvi ym. (2003) eivät havainneet kenttäkokeissaan 3000 ppm dieselöljysaastutuksen
merkittävästi hidastavan vuohenherneiden kasvua verrattuna saastuttamattomaan
kontrolliin. Myös Suominen ym. (2000) totesivat kasvihuonekokeessaan, ettei ikääntyneen
öljyllä saastuneen maan noin 23 prosentin kokonaisöljyhiilivetypitoisuus vaikuttanut
merkittävästi rehuvuohenherneiden kasvuun. Kuitenkin Suominen ym. (2000) totesivat
samassa tutkimuksessa aromaattisten öljyhiilivetyjen malliyhdisteenä käytetyn meta
toluaatin hidastavan rehuvuohenherneen kasvua selvästi jo pitoisuudessa 1000 ppm.
Eroavia tuloksia voi selittää esimerkiksi erot öljyn levittäytymisessä koemaihin.
Kenttäkokeessa öljysaastutusta voi olla hankalampi saada levittäytymään koko
maamassaan tasaisesti. Tällöin rehuvuohenherneen juuristolle jää maassa puhtaampia
kohtia, joihin juuret voivat levittäytyä.
94
Kun polttoöljynpitoisuus biologisen hajotuksen seurauksena laski (kuva 13), myös
rehuvuohenherneen kasvuvauhti kiihtyi (kuvat 14 ja 21). Näytteenottoviikolla 15 tehdyn
niiton jälkeen ei rehuvuohenherneiden kasvussa kasvillisten käsittelyiden välillä havaittu
enää selkeää eroa (kuva 14 ja 21). Polttoöljypitoisuus oli öljyllä saastutetussa
kasvikäsittelyssä tällöin noin 500 ppm (kuva 13).
7.1.2 Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärien vaihtelu
Koska polttoöljynhajottajien lukumäärissä tapahtuvien muutosten seuraamiseen käytettyä
MPNmenetelmää jouduttiin kasvihuonekokeen aikana optimoimaan, ei MPN
menetelmällä saatu yhtenäistä aikasarjaa (kuva 37). Saaduista tuloksista voi silti tehdä
päätelmiä öljynhajottajien lukumäärien vaihtelusta kasvihuonekokeen kuluessa. MPN
tulosten perusteella öljynhajottajien lukumäärät sekä kasvillisessa (ÖKR) että
kasvittomassa (Ö) öljykäsittelyssä nousivat vain aivan kokeen alussa, korkeintaan
näytteenottoviikolle 6 tai 7, jonka jälkeen öljynhajottajien MPNlukumäärät alkoivat
molemmissa käsittelyissä selvästi laskea (kuva 37). Tämä tulos sopii hyvin yhteen Kondon
(2006) polttoöljyn hajoamisesta saamien tulosten kanssa (kuva 13). Kondo (2006) havaitsi,
että polttoöljyn hajoaminen oli kiivainta aivan kasvihuonekokeen alussa ja hidastui jo
viikolla 3 merkittävästi. Polttoöljynhajottajien MPNlukumäärän nousu öljykäsittelyissä
(ÖKR ja Ö) oli näin ollen voimakkainta silloin kun polttoöljyn pitoisuus maassa laski
nopeimmin (kuvat 13 ja 37).
Täysin vastaavanlaista tutkimusta, jossa öljynhajottajien MPNlukumäärien määritystä
olisi hyödynnetty, ei kirjallisuudesta löydy. Bachoon ym. (2001b) vertasivat
tutkimuksessaan Sheen Screen MPNmenetelmällä raakaöljyn hajottajien lukumääriä
raakaöljyllä saastutetussa maassa ja saastuttamattomassa kontrollimaassa kuukauden ja
kolmen kuukauden jälkeen raakaöljysaastutuksesta. He totesivat tutkimuksessaan
öljynhajottajien MPNlukumäärien nousevan saastutetussa käsittelyssä yhden kuukauden
kuluessa 100kertaiseksi verrattuna saastuttamattomaan käsittelyyn, mutta laskevan
kolmen kuukauden kuluessa ainoastaan kymmenkertaisiksi saastuttamattomaan maahan
verrattuna. Myös tässä tutkimuksessa todettiin, että 21viikkoisen kasvihuonekokeen
aikana polttoöljynhajottajien MPNlukumäärät nousivat öljyllä saastutetuissa käsittelyissä
(ÖKR ja Ö) vain ensimmäisen kuukauden aikana, jonka jälkeen ne alkoivat laskea. Myös
Bachoon ym. (2001b) päättelivät tutkimuksessaan, että kolmen kuukauden kuluessa
95
raakaöljyn helpommin hajotettavat yhdisteet on hajotettu, jonka seurauksena
öljynhajottajien lukumäärät maassa laskevat.
Eroja polttoöljyllä saastutettujen käsittelyiden (ÖKR ja Ö) välillä ei tässä tutkimuksessa
MPNmenetelmällä havaittu yhdelläkään näytteenottoviikolla. Tätä tulosta tukee Kondon
(2006) gradutyössään saamat tulokset siitä, että polttoöljyn hajoaminen kasvillisessa (ÖKR)
ja kasvittomassa (Ö) öljykäsittelyissä eteni koko kokeen ajan hyvin samalla tavalla (kuva
13). Näin ollen oli odotettavaa, että myös öljynhajottajien lukumäärien vaihtelut kokeen
aikana vastasivat toisiaan näissä käsittelyissä. Saastuttamaton kasvikäsittely (PKR)
puolestaan erosi MPNmenetelmän perusteella koko kokeen ajan selkeästi öljyllä
saastutetuista käsittelyistä (kuva 37). Tämän perusteella tässä tutkimuksessa käytetty
kohtuullisen lievä polttoöljysaastutus sai aikaan suuria muutoksia koemaan
mikrobipopulaatioissa, mikä näkyi polttoöljynhajotukseen kykenevien mikrobien
lukumäärien voimakkaana nousuna. Käytetyllä MPNmenetelmällä polttoöljysaastutuksen
vaikutus nähtiin selvästi vielä 21 viikon jälkeen polttoöljysaastutuksesta verrattaessa
saastutetuista käsittelyistä (ÖKR ja Ö) saatuja tuloksia saastuttamattoman kasvikäsittelyn
(PKR) tuloksiin (kuva 37).
Saastuttamattomassa kasvikäsittelyssä polttoöljynhajotukseen kykenevien mikrobien
MPNlukumäärien havaittiin kuitenkin nousevan kasvihuonekokeen aikana. Tämä johtui
todennäköisimmin niin kutsutusta ritsosfääriefektistä eli siitä, että juuriston lähellä
bakteerien kokonaislukumäärä voi nousta jopa tuhatkertaiseksi verrattuna ympäröivään
maahan (Kuiper ym. 2004). Näin ollen rehuvuohenherneiden kasvaessa juuriston vaikutus
nostaa PKRkäsittelyssä kokeen lopussa kokonaisbakteerilukumääriä ruukuissa. Koska on
tiedossa, että monet saastuttamattomassa maassa elävistä mikrobeista kykenevät
öljynhajotukseen (Laurie ja LloydJones 2000), noussee saastuttamattomassa
kasvikäsittelyssä kokonaisbakteerilukumäärien noustessa myös öljynhajotukseen
kykenevien mikrobien lukumäärä.
96
7.1.3 Bakteeribiomassan muutokset DNA:n pitoisuuden perusteella
Bachoon ym. (2001b) vertasivat tutkimuksessaan MPNmenetelmällä määritettyjen
heterotrofisten bakteerien lukumäärien vaihtelua bioremediaation aikana maanäytteiden
DNApitoisuuden vaihteluun. He totesivat, että maanäytteiden DNApitoisuudet vastasivat
erittäin hyvin MPNmenetelmällä määritettyjä heterotrofisten bakteerien lukumäärissä
tapahtuvia muutoksia. Bachoon ym. (2001b) toteavat artikkelissaan DNA
pitoisuusmittauksen olevan jopa tarkempi ja herkempi menetelmä
kokonaisbakteerilukumäärän määrittämiseen kuin heterotrofisten mikrobien määrittäminen
joko maljaamalla tai MPNmenetelmällä. Lisäksi he korostavat, että DNA
pitoisuusmittauksiin perustuva bakteeribiomassan määritys ei kärsi viljelystä johtuvista
vääristymistä, kuten maljaaminen ja erilaiset MPNmenetelmät. Koska tässä tutkimuksessa
ei kasvihuonekokeen näytteistä määritetty heterotrofisten bakteerien lukumääriä, voidaan
DNApitoisuuden vaihtelua kasvihuonekokeen aikana (kuva 38) verrata ainoastaan
polttoöljynhajottajien MPNlukumäärissä tapahtuviin muutoksiin (kuva 37). Saaduista
tuloksista havaitaan, että DNApitoisuuden vaihtelu kokeen aikana (kuva 38) vastasi hyvin
öljynhajottajien MPNlukumäärissä tapahtuvia muutoksia (kuva 37).
DNApitoisuus kasvillisessa (ÖKR) ja kasvittomassa (Ö) öljykäsittelyissä nousi
voimakkaasti kasvihuonekokeen kolmen ensimmäisen viikon aikana. Tällöin myös
polttoöljynhajottajien MPNlukumäärät nousivat voimakkaasti (kuva 37) ja polttoöljyn
hajoaminen oli kiivainta (kuva 13). DNApitoisuus nousi öljykäsittelyissä (ÖKR ja Ö)
ensimmäisen kolmen viikon aikana lähes kaksinkertaiseksi. Kolmen viikon jälkeen, kun
helpoimmin hajoavat öljynyhdisteet oli hajotettu, sekä maanäytteiden DNApitoisuuden
kasvu (kuva 38) että öljynhajoaminen (kuva 13) hidastuivat huomattavasti. Kokeen lopussa,
jolloin polttoöljynhajottajien MPNlukumäärät laskivat selvästi öljykäsittelyissä (ÖKR ja
Ö), kääntyi myös maanäytteistä uuttuvan DNA:n määrä ainakin kasvittomassa
öljykäsittelyssä (Ö) loivaan laskuun (kuva 38).
Ensimmäisten 8 viikon ajan saastuttamattomasta kasvikäsittelystä (PKR) uuttuvan DNA:n
määrä pysyi öljykäsittelyihin (ÖKR ja Ö) verrattuna hyvin alhaisena ja tasaisena (kuva 38).
Kuitenkin viikon 8 jälkeen saastuttamattomasta kasvikäsittelystä uuttuvan DNA:n määrä
alkoi nousta selvästi. Hieman tätä ennen, noin viikolla 6, käsittelyssä PKR
rehuvuohenherneet olivat alkaneet kasvaa voimakkaasti (kuva 14). Koska
97
saastuttamattomasta kasvikäsittelystä uuttuvan DNAmäärän voimakas nousu ajoittuu
samaan hetkeen kuin rehuvuohenherneiden voimakas kasvu (kuva 14), voidaan olettaa, että
viikon 8 jälkeen saastuttamattomassa kasvikäsittelyssä (PKR) tapahtuva DNApitoisuuden
nousu johtuu rehuvuohenherneen juuriston vaikutuksesta eli ns. ritsosfääriefektistä. Osa
DNApitoisuuden noususta saastuttamattomassa kasvikäsittelyssä voidaan mahdollisesti
selittää myös sillä, että tutkittaviin näytteisiin on jäänyt vielä seulonnan jälkeen pieniä
juuren kappaleita, joista DNAuuton yhteydessä uuttuu myös DNA:ta. Koska öljyllä
saatutetun kasvikäsittelyn (ÖKR) DNApitoisuus ei kuitenkaan selvästi nouse kokeen
lopussa verrattuna kasvittomaan öljykäsittelyyn, tämä ei vahvista kasvisoluista eristyvän
merkittäviä määriä DNA:ta.
Kasvillisessa öljykäsittelyssä (ÖKR) viikkojen 4 ja 6 välillä uuttuvan DNA:n määrä laski
selvästi (kuva 38). Tätä laskua voi mahdollisesti selittää helposti hajotettavien
öljynyhdisteiden loppuminen viikolla 4 ja lyhyt sopeutumisaika hankalammin hajotettavien
yhdisteiden hajotukseen. Toisaalta vastaavanlaista uuttuvan DNAmäärän laskua ei
kasvittomassa öljykäsittelyssä (Ö) viikolla 6 nähty. Viikkojen 6 ja 12 välillä DNA
pitoisuus nousi kasvillisessa öljykäsittelyssä (ÖKR) kasvittoman öljykäsittelyn (Ö) tasolle.
Osittain tätä nousua viikkojen 6 ja 12 välillä voi selittää rehuvuohenherneiden juuriston
vaikutus eli ns. ritsosfääriefekti kasvillisessa öljykäsittelyssä. Toisaalta ainakin viikolla 8
rehuvuohenherneet olivat käsittelyssä ÖKR vielä hyvin pieniä (kuva 14).
Todennäköisimmin viikolla 6 tapahtuva lasku kasvillisen öljykäsittelyn DNA
pitoisuuksissa johtuukin joko näytteiden suuresta hajonnasta tai jonkinlaisesta
mittausvirheestä.
Kokeen loppupuolella, jolloin saastuttamattomassa kasvikäsittelyssä (PKR) näkyy juurien
vaikutus selvänä DNApitoisuuden nousuna maanäytteissä, kasvillisessa öljykäsittelyssä
(ÖKR) ritsosfääriefekti näkyy yllättävän vähän. Tosin pientä DNApitoisuuden laskua
viikkojen 12 ja 21 välillä, joka nähdään kasvittomassa öljykäsittelyssä, ei havaita
kasvillisessa öljykäsittelyssä.
98
7.1.4 NahAcgeenin monistuminen
Monistettaessa naftaleenin hajotukseen osallistuvaa nahAcgeeniä kvantitatiivisella
reaaliaikaisella PCR:llä maaDNAuutteista ei yhdenkään tutkitun näytteen geenikopioluku
saavuttanut edes kymmenen geenikopion detektiorajaa. Näin ollen valittu menetelmä ei
riittänyt osoittamaan naftaleenin hajottajien lukumäärien vaihtelua eri käsittelyissä
kasvihuonekokeen aikana.
7.2 Käytettyjen menetelmien arviointi
7.2.1 MPNmenetelmä
Koska tutkimuksen kuluessa havaittiin, ettei valittu MPNmenetelmä soveltunut
sellaisenaan tämän tutkimuksen näytteiden analysointiin, yksi tärkeä tavoite tutkimuksessa
oli toimivan MPNmenetelmän kehittäminen öljynhajottajien lukumäärien määrittämiseen.
Suurimpia ongelmia alkuperäisessä MPNmenetelmässä (liite 2) aiheuttivat
tetrasoliumsuolat, joita alkuperäisessä MPNmenetelmässä käytettiin kasvun
havaitsemiseen MPNlevyillä. Syytä havaittuun ongelmaan eli tetrasoliumsuolojen liian
suureen reaktiivisuuteen MPNlevyillä (kuva 18) ei tässä tutkimuksessa pystytty
selvittämään. Yhdeksi syyksi epäiltiin tetrasoliumsuolojen reagoimista MPNnäytelevyillä
joidenkin öljynyhdisteiden kanssa. Mosher ym. (2003) mainitsevat artikkelissaan, että
tetrasoliumsuolojen on todettu reagoivan ainakin joidenkin liuottimien kanssa epätoivotulla
tavalla. Toisaalta käytettäessä tetrasoliumsuoloja havaittiin myös negatiivisilla
kontrollilevyillä useita positiivisia reaktioita, tosin yleensä vain matalimmissa
laimennuksissa. Nämä negatiivisten kontrollilevyjen matalimmissa laimennuksissa olevan
positiiviset reaktiot voivat toisaalta selittyä sillä, että matalimmat laimennukset ovat
voineet sisältää vielä pieniä määriä maapartikkeleita. Näiden maapartikkelien mukana on
puolestaan voinut siirtyä MPNlevyille mikrobeille soveltuvia hiilenlähteitä. Nämä pienet
määrät hiilenlähteitä ovat voineet saada aikaan MPNlevyjen negatiivisten kontrollilevyjen
matalimmissa laimennuksissa heikkoa kasvua. Koska tetrasoliumsuoloja käytetään juuri
silloin kun halutaan havaita heikkoakin kasvua, on tämä vähäinen kasvu voinut saada
aikaan positiivisen reaktion.
99
Mikrobien kasvun aiheuttaman sameuden absorbanssimittaukseen perustuva MPN
menetelmä kehitettiin ja saatiin optimoitua toimivaksi tämän tutkimuksen kuluessa.
Merkittävin muutos alkuperäiseen ohjeeseen, tulosten lukutavan muuttamisen lisäksi, oli
maanäytesuspension ravistelun jälkeisen seisotusajan lisääminen menetelmään sekä
seisotusajan pidentäminen viidestä minuutista kahteenkymmeneen minuuttiin.
Pidentämällä seisotusaikaa päästiin kokonaan eroon positiivisista kaivoista
kontrollilevyillä. Tämä johtui luultavasti siitä, että pidennettäessä seisotusaikaa
pienimmätkin maapartikkelit ehtivät vajoamaan maasuspensiopullon pohjalle, jolloin
laimennussarjaa tehtäessä mukana ei siirtynyt matalimpiinkaan laimennuksiin enää
maapartikkeleita eikä hiilenlähteitä, jotka voisivat aiheuttaa mikrobikasvua.
Koska MPNmenetelmä on hyvin epätarkka menetelmä, jolla pienien erojen havaitseminen
on mahdotonta (RiserRoberts 1998), ei ole yllättävää, ettei MPNmenetelmän avulla
onnistuttu havaitsemaan eroja öljynhajottajien MPNlukumäärissä kasvillisen (ÖKR) ja
kasvittoman (Ö) öljykäsittelyn välillä.
Erilaisilla MPNmenetelmillä määritettyjen öljynhajottajien kokonaislukumäärät yhdessä
grammassa öljyllä saastunutta maata vaihtelevat kirjallisuuden perusteella 103 (Bachoon
ym. 2001b) ja 1010 (Kirk ym. 2005) välillä, riippuen muun muassa öljysaasteen laadusta ja
määrästä sekä maatyypistä. Tässä tutkimuksessa saadut kokonaisöljynhajottajien MPN
lukumäärät (106108) ovat kirjallisuuden perusteella hyvin korkeita. Tässä tutkimuksessa
olosuhteet öljynhajottajien rikastumiseen olivatkin optimaaliset, koska öljysaastutus oli
tuore, maa oli hyvin lannoitettua ja lämpötila kasvihuoneella oli korkea (noin + 20 Cº).
Viljelyyn perustuvan MPNmenetelmän ongelmaksi tutkimuksen aikana osoittautui, että se
joudutaan tekemään aina tuoreista näytteistä. Näin ollen ensimmäisten
näytteenottoviikkojen näytteitä, jotka oli analysoitu hieman eri menetelmällä kuin
viimeisten näytteenottoviikkojen näytteet, ei voitu kokeen lopussa enää uusia. Lisäksi
MPNmenetelmä oli hyvin työläs ja tuloksia jouduttiin odottamaan kolme viikkoa kestävän
inkuboinnin ajan. Toisaalta MPNmenetelmällä saatiin koko kokeen ajalta tuloksia, jotka
sopivat hyvin yhteen muilla menetelmillä saatujen tulosten kanssa.
Tässä tutkimuksessa kehitettyä MPNmenetelmää voidaan jatkossa hyödyntää sellaisenaan
polttoöljyn biologisen hajoamisen seurantaan. Tässä tutkimuksessa käytettyä MPN
100
menetelmää voitaisiin kehittää edelleen muun muassa yksittäisten öljynyhdisteiden
hajottajien lukumäärien seuraamiseen.
7.2.2 DNApitoisuuden mittaus NanoDrop®:illa
Spektrofotometrisen NanoDrop®mittauksen todettiin tässä tutkimuksessa antavan
moninkertaisesti suuremman arvion maaDNAuutteiden DNApitoisuudesta kuin maa
DNAuutteille kehitetty PicoGreen®menetelmä (taulukko 14). Syynä tähän ovat maa
DNAuutteiden sisältämät epäpuhtaudet, jotka absorboivat DNA:n absorptiomaksimissa
(Kabir ym. 2003). Kabir ym. (2003) toteavat artikkelissaan yksiselitteisesti
spektrofometristen mittausten yliarvioivan maaDNAuutteiden DNApitoisuuksia ja
olevan näin ollen käyttökelvottomia maasta eristetyille DNAuutteille. Tästä huolimatta
spektrofotometristä mittausta käytetään usein maaDNAuutteiden DNApitoisuuksien
määrittämiseen.
Etuna NanoDrop®laitteessa perinteiseen spektrofotometriseen mittaukseen on pienen
näytetilavuuden lisäksi se, että laite näyttää jokaiselle mittaamalleen näytteelle
absorptiospektrin. Tällöin voidaan, vertaamalla näytteen spektriä puhtaan DNA:n spektriin,
päätellä yhdellä silmäyksellä soveltuuko spektrofotometrinen mittaus tutkittavalle
näytteelle (kuva 23).
Puhtaille DNAnäytteille NanoDrop® oli saatujen tulosten (taulukko 13) perusteella
luotettava ja tarkka menetelmä. Saman näytteen rinnakkaisten mittausten välillä oli hyvin
vähän vaihtelua (taulukko 13). Myös eri laimennustasojen perusteella saadut arviot DNA
pitoisuudesta olivat hyvin samansuuntaisia (taulukko 13).
7.2.3 PicoGreen®mittaus
PicoGreen®mittauksen avulla saatiin tässä tutkimuksessa helposti käsitys biomassan
vaihtelusta maanäytteissä. Toisaalta on muistettava, että DNApitoisuusmittauksen avulla
määritettiin samalla maanäytteistä myös sieni, eläin ja kasviDNA:n määrää. DNA
pitoisuusmittauksen avulla voidaan näin ollen saada ainoastaan suurpiirteinen käsitys
maanäytteen kokonaisbiomassan vaihteluista, eikä sitä voida käyttää lainkaan spesifisten
ryhmien seurantaan.
101
PicoGreen®mittauksen virherajoja olisi mahdollisesti pystytty pienentämään käyttämällä
yhden mikrolitran sijasta isompaa näytetilavuutta. Toisaalta suurta vaihtelua
mittaustuloksiin aiheutti myös se, että rinnakkaiset DNAuutteet oli eristetty kolmen eri
kerranteen näyteruukusta, joihin on mahdollisesti vaikuttanut muun muassa sijainti
kasvihuoneen pöydällä (kuva 11). Myös samasta näyteruukusta eristettyjen DNAuutteiden
DNApitoisuuksissa oli vaihtelua, tosin se oli vähäisempää kuin näyteruukkujen välinen
vaihtelu. Mittauksesta johtuva vaihtelu näytteiden välillä oli todennäköisesti hyvin pientä,
koska rinnakkaisista standardikaivoista tehdyissä mittauksissa vaihtelua havaittiin hyvin
vähän.
PicoGreen® DNApitoisuusmittaukset oli DNA:n eristyksen jälkeen helppo suorittaa ja
mittaus voitaisiin tarvittaessa myös uusia pakastetuista DNAuutteista. PicoGreen®:llä
tehtyjen DNApitoisuusmittausten avulla saatiin muiden tutkimuksessa saatujen tulosten
kanssa hyvin yhteensopivia tuloksia. Tosin DNApitoisuusmittauksen perusteella arvioituja
bakteerimäärien vaihteluja kokeen kuluessa ei voida pitää kovin tarkkoina.
7.2.4 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR
Syitä siihen, että naftaleenin hajotukseen osallistuvaa nahAcgeeniä ei kasvihuonekokeen
näytteistä onnistuttu monistamaan, voi olla monia. Ensinnäkin maanäytteistä eristetyissä
DNAuutteissa oli paljon PCR:ää inhiboivia tekijöitä ja maaDNAuutteita jouduttiin
laimentamaan aina laimennukseen 103 asti ennen QRTmPCR:ää. Laimentamalla näytettä
näin paljon laimennettiin mahdollisesti myös näytteen sisältämät nahAcgeenit pois
tutkittavista näytteistä. Lisäksi laimennus 103 sisälsi luultavasti vielä runsaasti PCR
inhibitiota, jolloin näytteiden monistuminen ei ole lainkaan niin tehokasta kuin puhtaasta
DNA:sta.
Bach ym. (2002) vertailivat myös omassa tutkimuksessaan FastDNA Spin Kit for Soil
kitillä (Bio 101, USA) eristetyistä maaDNAuutteista tehtyjen eri laimennusten
monistumista QRTmPCR:llä. He vertailivat tutkimuksessaan 16SRNAgeenin
monistumista laimennuksista 1:10, 1:20, 1:100, 1:500, 1:1000 ja 1:5000. Tehokkaimmin
Bach ym. (2002) totesivat 16SRNAgeenin monistuvan laimennuksesta 1:100. Tässä
tutkimuksessa eristettyjen DNAuutteiden monistuminen oli puolestaan tehokkainta
laimennuksesta 1:1000. Tätä voi osittain selittää se, että tässä tutkimuksessa tutkittiin aivan
102
eri tyyppistä geeniä kuin 16SrRNAgeeni. Toisaalta eri tyyppisistä maanäytteistä uuttuu
eri tavalla esimerkiksi humushappoja ja muita PCR:ää inhiboivia tekijöitä.
Toinen syy QRTmPCR:ssä saatuun tulokseen voi olla se, että polttoöljy sisältää suuren
määrän erilaisia öljynyhdisteitä, joista suurin osa on huomattavasti naftaleenia helpommin
hajoavia. Näin ollen voi olla mahdollista, että 21viikkoisen kasvihuonekokeen aikana
hajosi polttoöljystä vasta naftaleenia helpommin hajoavia yhdisteitä eikä naftaleenin
hajotus 21viikkoisen kokeen aikana ehtinyt vielä alkamaan.
Lisäksi polttoöljy kuluu kevyisiin polttoöljyihin ja sisältää melko vähän painavia
öljynyhdisteitä. Vaikka tutkimuksessa käytetyssä polttoöljyssä oli 4,8 painoprosenttia di
aromaatteja (liite 1), on se kuitenkin melko pieni osuus kaikista polttoöljyn yhdisteistä.
Näin ollen on myös mahdollista, ettei naftaleeni ole lainkaan merkittävä substraatti
öljynhajottajille polttoöljyllä saastutetussa maassa.
Maaperän mikrobeilta on löydetty monia vaihtoehtoisia reittejä myös naftaleenin
hajotukseen (Bosch ym. 1999). Näin ollen on myös mahdollista, että tässä tutkimuksessa
naftaleeninhajotus on tapahtunut ainakin osittain jotain toista metaboliareittiä, joka ei
välttämättä sisällä lainkaan nahAcgeeniä tai siinä oleva nahAcgeenin sekvenssi poikkeaa
merkittävästi tällä hetkellä tunnetuista nahAcgeenisekvensseistä.
Jatkossa QRTmPCR:llä voitaisiin kokeilla jokin toisen öljynhajotukseen osallistuvan
geenin monistamista kasvihuonekokeen näytteistä. Tämä geeni voisi olla esimerkiksi
suoraketjuisten öljyhiilivetyjen eli alkaanien hajotukseen osallistuva alkBgeeni. Lisäksi
maaDNAuutteiden epäpuhtaudesta johtuvat ongelmat QRTmPCR:ssä todennäköisesti
vähenisivät puhdistamalla DNAuutteita edelleen. Näin maaDNAuutteiden PCRinhibitio
vähenisi, eikä maaDNAuutteita tarvitsisi laimentaa niin paljon ennen QRTmPCR:ää.
103
8. LoppupäätelmätViljelymenetelmien, kuten MPN, etuna bioremediaation seurannassa on niiden
helppokäyttöisyys ja edullisuus. Toisaalta viljelymenetelmien avulla voidaan tutkia vain
hyvin pientä joukkoa maan koko mikrobistosta ja tämä heikentää merkittävästi niiden
käyttökelpoisuutta. DNApohjaisten menetelmien soveltaminen maanäytteille vaatii
puolestaan syvällistä perehtymistä ja laajaa menetelmien optimointia. DNApohjaisilla
menetelmillä, kuten kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä, voidaan kuitenkin
todennäköisesti saada tietoa huomattavasti pienemmistä muutoksista maanperän
mikrobistossa sekä tutkia myös hyvin spesifisten ryhmien sisällä tapahtuvia muutoksia.
104
9. LähdeluetteloAatelo, M. (toim.) 1995a. Öljyn historia. Teoksessa: Aatelo, M. Lähteiltä tuotteiksi – öljyntie. TammerPaino Oy. Tampere. Sivut 1118.
Aatelo, M. (toim.) 1995b. Öljynjalostus. Teoksessa: Aatelo, M. Lähteiltä tuotteiksi – öljyntie. TammerPaino Oy. Tampere. Sivut 3980.
Alkorta, I. ja Garbisu, C. 2001. Phytoremediation of organic contaminants in soil.Bioresource Tecnology, vol. 79, sivut 273276.
Atlas, R.M. ja Bartha R. 1998. Microbial ecology – Fundamentals and application. Neljäspainos. Benjamin/Cummings Publishing Company Inc. USA. Sivut 523531.
Atlas, R.M. ja Cerniglia, C.E. 1995. Bioremediation of petroleum pollutants; diversityand environmental aspects of hydrocarbon biodegradation. BioScience, vol. 45, sivut 332338.
Bach, H.J., Tomanova, J., Schloter, M. ja Munch, J.C. 2002. Enumeration of totalbacteria and bacteria with genes for proteolytic activity in pure cultures and inenvironmental samples by quatitative PCR mediated amplification. Journal of Microbialmethods, vol. 49, sivut 235245.
Bachoon, D.S., Araujo, R., Molina, M. ja Hodson, R.E. 2001a. Microbial communitydynamics and evaluation of bioremediation strategies in oilimpacted salt marsh sedimentmicrocosms. Journal of Industrial Microbiology and Biotecnology, vol. 27, sivut 7279.
Bachoon, D.S., Hodson, R.E. ja Araujo, R. 2001b. Microbial community assessment inoilimpacted salt marsh sediment microcosms by traditional and nucleic acidbased indices.Journal of Microbiological Methods, vol. 46, sivut 3749.
Baker, G.C., Smith, J.J. ja Cowan, D.A. 2003. Review and reanalysis of domainspesific 16S primers. Journal of Microbiological Methods, vol. 55, sivut 541555.
Baldwin, B.R., Nakatsu, C.H. ja Nies, L. 2003. Detection and enumeration of aromaticoxygenase genes by multiplex and realtime PCR. Applied and EnvironmentalMicrobiology, vol. 69, sivut 33503358.
Barbeau, C., Deschenes, L., Karamanev, D., Comeau, Y. ja Samson, R. 1997.Bioremediation of pentachlorophenolcontaminated soil by bioaugmentation usingactivated soil. Applied Microbiology and Biotecnology, vol. 48, sivut 745752.
Bosch, R., GarcíaValdés, E. ja Moore, E.R.B. 1999. Genetic characterization andevolutionary implications of a chromosomally encoded naphtalenedegradation upperpathway from Pseudomonas tutzeri AN10. Gene, vol. 236, sivut 149157.
Brakstad, O.G. ja Lodeng, A.G.G. 2005. Microbial diversity during biodegradation ofcrude oil in seawater from the North sea. Microbial Ecology, vol 49, sivut 94103.
105
Brown, E.J. ja Braddock, J.F. 1990. Sheen screen, a miniaturized mostprobablenumbermethod for enumeration of oildegrading microorganisms. Applied and EnvironmentalMicrobiology, vol. 56, sivut 38953896.
Bushnell, L.D. ja Haas H.F. 1941. The utilization of certain hydrocarbons bymicroorganisms. Journal of Bacteriology, vol. 41, sivut 653673.
Cernilia, C.E. 1997. Fungal metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons: past,present and future applications in bioremediation. Journal of Industrial Microbiology &Biotecnology, vol. 19, sivut 324333.
Chen, Y.C., Banks, M.K, ja Schwab, A.P. 2003. Pyrene degradation in the rhizosphereof Tall Fescue (Festuca arundinacea) ja Switchgrass (Panicum virgatum L.).Environmental Science & Tecnology, vol. 37, sivut 57785782.
Dua, M., Singh, A., Sethunathan, N. ja Johri, A.K. 2002. Biotecnology andbioremediation: successes and limitations. Applied Microbiology and Biotecnology, vol.59, sivut 143152.
Duteau, N.M., Rogers, J.D., Bartholomay, C.T. ja Reardon, K.F. 1998. Speciesspecific oligonucleotides for enumeration of Pseudomonas putida F1, Burkholderia sp.strain JS150, and Bacillus subtilis ATCC 7003 in biodegradation experiments. Applied andEnvironmental Microbiology, vol. 64, sivut 49944999.
Edmonds, P. ja Cooney, J.J. 1966. Identification of microorganisms isolated from jet fuelsystems. Applied Microbiology, vol. 15, sivut 411416.
Fernandez, M.D., Cagigal, E., Vega, M.M., Urzelai, A., Babin, M., Pro, J. ja Tarazona,J.V. 2005. Ecological risk assessment of contaminated soil through direct toxicityassessment. Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 62, sivut 174184.
Filion, M., StArnaud, M. ja JabajiHare, S.H. 2003. Direct quatification of fungalDNA from soil substrate using realtime PCR. Journal of Microbiological Methods, vol. 53,sivut 6776.
Frostegård, Å., Courtois, S., Ramisse, V., Clerc, S., Bernillon, D., Le Gall, F., Jeannin,P., Nesme, X. ja Simonet, P. 1999. Quantification of bias related to the extraction of DNAdirectly from soils. Applied and Environmental Microbiology, vol. 65, sivut 54095420.
GenBanknukleotiditietokanta internersivu http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank.index.html
Gentry, T.E., Josephson, K.L. ja Pepper I.L. 2004. Functional establishment ofintroduced chlorobenzoate degraders following bioaugmentation with newly activated soil.Biodegradation, vol. 15, sivut 6775.
Hadwin, A.K.M., Del Rio, L.F., Pinto, L.J., Painter, M., Routledge, R. ja Moore, M.M.2006. Microbial communities in wetlands of the Athabasca oil sands: genetic andmetabolic characterization. FEMS Microbiology Ecology, vol. 55, sivut 6878.
106
Haines, J.R., Wrenn, B.A., Holder, E.L., Strohmeier, K.L., Herrington, R.T. jaVenosa, A.D. 1996. Measurement of hydrocarbondegrading microbial populations by 96well plate mostprobablenumber procedure. Journal of Industrial Microbiology, vol. 16,sivut 3641.
Harwood, C.S., Burchhartdt, G., Herrman, H. ja Fuchs, G. 1999. Anaerobicmetabolism of aromatic compounds via the benzoylCoA pathway. FEMS MicrobiologyReviews, vol. 22, sivut 439458.
Heider, J., Spormann, A.M., Beller, H.R., Widdel, F. 1999. Anaerobic bacterialmetabolism of hydrocarbons. FEMS Microbiology Reviews, vol. 22, sivut 459473.
Henry, S., Baudoin, E., LopezGutierrez, J.C., MartinLaurent, F., Brauman, A. jaPhilippot, L. 2004. Quatification of denitrifying bacteria in soils by nirK gene targetedrealtime PCR. Journal of Microbiological Methods, vol. 59, sivut 327235.
Hästbacka, K. (päätoim.) 1992. NESTE – Öljyistä muoveihin. Neste Oy. Espoo. Sivu 60.
IvancevTumbas, I., Trickovic, J., Karlovic, E., Tamas, Z., Roncevic, S., Dalmacija, B.,Petrovic, O. ja Klasnja, M. 2004 GC/MSSCAN to follow the fate of crude oilcomponents in bioreactors set to remediate contaminated soil. International Bioremediation& Biodegradation, vol 54, sivut 311318.
Jjemba, P.K., Kinkle, B.K. ja Shann, J.R. 2006. Insitu enumeration and probing ofpyrenedegrading soil bacteria. FEMS Microbiology Ecology, vol. 55, 287298.
Johnsen, A.R., Bendixen, K. ja Karlson, U. 2002. Detection of microbial growth onpolycyclic aromatic hydrocarbons in microtiter plates by using the respiration indicatorWST1. Applied and Environmental Microbiology,vol. 68, sivut 26832689.
Juvonen, R., Martikainen, E., Schultz, E., Joutti, A., Ahtiainen, J. ja Lehtokari, M.2000. A battery of toxicity test as indicators of decontamination in composting oily waste.Ecotoxicology and Environmental Safety, vol. 47, sivut 156166.
Ka, J.O., Yu, Z. ja Mohn, W.W. 2001. Monitoring the size and metabolic activity of thebacterial community during biostimulation of fuelcontaminated soil using competitivePCR and RTPCR. Microbial Ecology, vol. 42, sivut 267273.
Kabir, S., Rajendran, N., Amemiya, T., Itoh, K. 2003.Realtime quatitative PCR assayon bacterial DNA: in a model soil system and environmental samples. The Journal ofgeneral and applied microbiology, vol. 49, sivut 101109.
Katsivela, E., Moore, E.R., Maroukli D., Strompl, C., Pieper, D. ja Kalogerakis, N.2005. Bacterial community dynamics during insitu bioremediation of petroleum wastesludge in landfarming sites. Biodegradation, vol. 16, sivut 169180.
Kirk, J.L., Beaudette, L.A., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J.N., Lee, H. jaTrevors, J.T. 2004. Methods for studying soil microbial diversity. Journal ofMicrobiological Methods, vol. 58, sivut 169188.
107
Kirk, J.L., Klironomos, J.N., Lee, H. ja Trevors, J.T. 2005. The effects of perennialryegrass and alfalfa on microbial abudance and diversity in petroleum contaminated soil.Environmental Pollution, vol. 133, sivut 455465.
Koizumi, Y., Kelly, J.J., Nakagawa, T., Urakawa, H., ElFantroussi, S., AlMuzaini,S., Fukui, M., Urushigawa, Y. ja Stahl, D.A. 2002. Applied and EnvironmentalMicrobiology, vol. 68, sivut 32153225.
Kondo, E. 2006. Ritsoremediaatio öljyllä saastuneen maan biopuhdistusmenetelmänä. Progradu tutkielma. Pro Terra. No. 27/2006. Helsingin yliopisto Soveltavan kemian jamikrobiologian laitos.
Kuiper, I., Lagendijk, E.L., Bloemberg, G.V. ja Lugtenberg, B.J.J. 2004.Rhizoremediation: A beneficial plantmicrobe interaction. Molecular PlantMicrobeInteractions, vol. 17, sivut 615.
Kurola, J., SalkinojaSalonen, M., Aarnio, T., Hultman, J. ja Romantschuk, M. 2005.Activity, diversity and population size of ammoniaoxidising bacteria in oilcontaminatedlandfarming soil. FEMS Microbiology Letters, vol. 250, sivut 3338.
Labrenz, M., Brettar, I., Cristen, R., Flavier, S., Bötel, J. ja Hölfe, M.G. 2004.Development and application of realtime PCR approach for quantification of unculturedbacteria in the Central Baltic sea. Applied and Environmental Microbiology, vol. 70, sivut49714979.
Lalande, T.L., Skipper, H.D., Wolf, D.C., Reynolds, C.M., Freedman, D.L., Pinkerton,B.W., Hartel, P.G. ja Grimes L.W. 2003. Phytoremediation of pyrene in a cecil soilunder field conditions. International Journal of Phytoremediation, vol. 5, sivut 112.
Laurie, A.D. ja LloydJones, G. 2000. Quatification of phnAc and nahAc in contaminatedNew Zealand soils by competitive PCR. Applied and Environmental Microbiology, vol. 66,sivut 18141817.
Lindstrom, J.E., Prince, R.C., Clark, J.C., Grossman, M.J., Yeager, T.R., Braddock,J.F. ja Brown, E.J. 1991. Microbial populations and hydrocarbon biodegradationpotentials in fertilized shoreline sediments affected by the T/V Exxon Valdez oil spill.Applied and Environmental Microbiology, vol. 57, sivut 25142522.
Lueders, T., Manefield, M. ja Friedrich, M.W. 2004. Enhanced sensitivity of DNA andrRNAbased stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnicsentrifugation gradients. Environmental Microbiology, vol. 6, sivut 7378.
Mackay, I.M., Arden, K.E. ja Nitsche, A. 2002. Realtime PCR in virology. NucleicAcids Reseach, vol. 30, sivut 12921305.
Maier, R.M. 2000. Microorganisms and organic pollutants. Teoksessa: Maier, R.M.,Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental microbiology. Academic Press. USA. Sivut 363402.
108
Maila, P.M., Randima, P. ja Cloete, T.E. 2005. Multispecies and monoculturerhizoremediation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) from the soil. InternationalJournal of Phytoremediation, vol. 7, sivut 8798.
MarquezRocha, F.J., HernandezRodriguez, V. ja Lamela, MA.T. 2001.Biodegradation of diesel oil in soil by a microbial consortium. Water, Air and SoilPollution, vol. 128, sivut 313320.
Meckenstock, R.U. 1999. Fermentative toluene degradation in anaerobic defined syntroficcocultures. FEMS Microbiology Letters, vol. 177, sivut 6773.
Mikkonen, A. 2007. Pro gradu tutkielma. Helsingin yliopisto Soveltavan kemian jamikrobiologian laitos. Julkaisematon.
Mills, A.L., Breuil, C. ja Colwell R.R. 1978. Enumeration of petroleumdegrading marineand estuarine microorganisms by the most probable number method. Canadian Journal ofMicrobiology, vol 24, sivut 552557.
Mills, D.K., Fitzgerald, K., Litchfield, C.D. ja Gillevet, P.M. 2003. A comparison ofDNA profiling techniques for monitoring nutrient impact on microbial communitycomposition during bioremediation of petroleumcontaminated soils. Journal ofMicrobiological methods, vol, 54, sivut 5774.
Miya, R.K. ja Firestone M.K. 2001. Enhanced phenanthrene biodegradation in soil byslender oat root exudates and root debris. Journal of Environmental Quality, vol. 30, sivut19111918.
Molecular Probes®, PicoGreen®dsDNA Quantitation Reagent and Kits, ProductInformation, Tarkistettu: 28.1.2003.
Mosher, J.J., Levison, B.S. ja Johnston, C.G. 2003. A simplified dehydrogenase enzymeassay in contaminated sediment using 2(piodophenyl)3(pnitrophenyl)5phenyltetrazolium cloride. Journal of Microbiological Methods, vol. 53, sivut 411415.
MPNlaskuri internetsivu http://www.i2workout.com/mcuriale/mpn/index.html
Mummey, D.L. ja Stahl P.D. 2004. Analysis of soil whole and innermicroaggregatebacterial communities. Microbial Ecology, vol. 48, sivut 4150.
NanoDrop® Technologies. 2004. NanoDrop® ND1000 Spectrophotometer V3.1 User´smanual. NanoDrop Technologies Inc. Tarkistettu 2004.
Newman, L.A. ja Reynolds, C.M. 2004. Phytodegradation of organic compounds.Current Opinion in Biotechnology, vol. 15, sivut 225230.
Palmroth, M.R.T., Pichtel, J. ja Puhakka J.A. 2002. Phytoremediation of subarctic soilcontaminated with diesel fuel. Bioresource Technology, vol. 84, sivut 221228.
109
Parrish, Z.D., Banks, M.K. ja Schwab, A.P. 2005. Effect of root death and decay ondissipation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the rhizosphere of yellow sweet cloverand tall fescue. Journal of Environmental Quality, vol. 34, sivut 207216.
Penet, S., Vendeuvre, C., Bertoncini, F., Marchal, R. ja Monot, F. 2006.Characterisation of biodegradation capacities of environmental microflorae for diesel oilby comprehensive twodimensional gas chromatography. Biodegradation, vol. 17, sivut577585.
Pitkäjärvi, J., Räsänen, L., Langenskjölt, J., Wallenius, K., Niemi, M. ja Lindström,K. 2003. Persistance, population dynamics and competitiveness for nodulation of markergenetagged Rhizobium galegae strains in field lysimeters in the boreal climatic zone.FEMS Microbiology Ecology, vol. 46, sivut 91104.
Powell, S.M., Ferguson, S.H., Bowman, J.P. ja Snape, I. 2006. Using realtime PCR toassess changes in the hydrocarbondegrading microbial community in antarctic soil duringbioremediation. Microbial Ecology, vol. 52, sivut 523532.
Primer3ohjelma internetsivu http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi
Prosser, J.I. 2002. Molecular and functional diversity in soil microorganisms. Plant andSoil, vol. 244, sivut 917.
Puolanne, J., Pyy, O. ja Jeltsch, U. (toim.) 1994. Saastuneet maaalueet ja niidenkäsittely Suomessa – saastuneiden maaalueiden selvitys ja kunnostusprojekti;loppuraportti. Ympäristöministeriö Muistio 5. Painatuskeskus Oy. Helsinki.
RiserRoberts, E. 1998. Remediation of petroleum contaminated soils – Biological,Physical, and Chemical Processes. CRC Press LLC. USA. Sivut 115160 ja 389391.
Salo, T. 2003. Pilaantunut maaalue. Teoksessa: Savelainen K. (toim.) Pilaantuneet maaalueet – Uudenmaan ympäristökeskuksen neuvottelupäivä Helsingissä 5.3.2003.Uudenmaan ympäristökeskuksen Monisteita nro. 128, sivut 1318.
Sandaa, R.A., Enger, Ø., ja Torsvik, V. Rapid method for fluorometric quantification ofDNA in soil. Soil Biology & Biochemistry, vol. 30, sivut 265268.
Scragg, A. 2005a. Bioremediation. Teoksessa: Scragg, A. Environmental Biotecnology.Toinen painos. Oxford University Press Inc. New York. Sivut. 173229.
Scragg, A. 2005b. Specific topics. Teoksessa: Scragg A. Environmental Biotecnology.Toinen painos. Oxford University Press Inc. New York. Sivut. 401418.
Sharma, S., Aneja, M.K., Mayer, J., Munch, J.C. ja Schloter, M. 2005.Characterization of bacterial community structure in rhizosphere soil of grain legumes.Microbial Ecology, vol. 49, sivut 407415.
Singelton, D.R., Powell, S.N., Sangaiah, R., Gold, A., Ball, L.M. ja Aitken, M.D. 2005.Stableisotope probing of bacteria capable of degrading salicylate, naphtalene, or
110
phenanthrene in a bioreactor treating contaminated soil. Applied and EnvironmentalMicrobiology, vol. 71, sivut 12021209.
Singer, V.L, Jones, L.J., Yue, S.T. ja Haugland, R.P. 1997. Characterization ofPicoGreen reagent and development of a fluorescencebased solution assay for doublestranded DNA quantitation. Analytic Biochemistry, vol. 249, sivut 228238.
Smith, M.R. 1990. The biodegradation of aromatic hybrocarbons by bacteria.Biodegradation, vol. 1, sivut 191206.
Smith, M.J., Flowers, T.H., Duncan, H.J. ja Alder, J. 2006. Effects of polycyclicaromatic hydrocarbons on germination and subsequent growth of grasses and legumes infreshly contaminated soil and soil with aged PAHs residues. Environmental Pollution, vol.141, sivut 519525.
So, C.M., Phelps, C.D. ja Young, L.Y. 2003. Anaerobic transformation of alkanes to fattyacids by a sulfatereducing bacterium, strain Hxd3. Applied and EnvironmentalMicrobiology, vol. 69, sivut 38923900.
So, C.M., Young, L.Y. 2001. Anaerobic biodegradation of alkanes by enriched consortiaunder four different reduncing conditions. Environmental Toxicology and Chemistry, vol.20, sivut 473478.
SolanoSerena, F., Marchal, R., Lebeault, JM., Vandecasteele, JP. 2000. Distributionof the environment of degradative capacities for gasoline attenuation. Biodegradation, vol.11, sivut 2935.
Spriggs, T., Banks, M.K. ja Schwab P. 2005. Phytoremediation of polycyclic aromatichydrocarbons in manufactured gas plantimpacted soil. Journal of Environmental Quality,vol. 34, sivut 17551762.
Suominen, I., Ollikka, P. 1999. YhdistelmäDNAtekniikan perusteet. Kolmas painos.Opetushallitus. Hakapaino Oy. Sivut 6768 ja 107112...
Suominen, L., Jussila, M.M., Mäkeläinen, K., Romantschuk, M. ja Lindström, K.2000. Evaluation of the GalegaRhizobium galegae system for the bioremediation of oilcontaminated soil. Environmental Pollution, vol. 107, sivut 239244.
Sylvia, D.M. (toim.), Fuhrmann, J.J., Hartel, P.G. ja Zuberer, D.A. 2005. Principlesand applications of soil microbiology. Toinen painos. Pearson Prentice Hall. USA. Sivut536561.
Takahashi, H., Konuma, H. ja HaraKudo, Y. 2006. Development of quatitative realtime PCR method to enumerate total bacterial counts in readytoeat fruits and vegetables.Journal of Food Protection, vol. 69, sivut 25042508.
Tani, A., Ishige, T., Sakai, Y. ja Kato, N. 2001. Gene structure of the alkane hydroxylaseomplex in Acinetobacter sp. strain M1. Journal of Bacteriology, vol. 183, sivut 18191823.
111
Thompson, I.P., van der Gast, C.J., Ciric, L. ja Singer, A.C. 2005. Bioaugmentation forbioremediation: the challenge of strain selection. Environmental Microbiology, vol. 7,sivut 909915.
Tsuda, M., Tan, H.M., Nishi, A. ja Furukawa K. 1999. Mobile catabolic genes inbacteria. Journal of Biocience and Bioengineering, vol. 87, sivut 401410.
Tuomi, P.M., Salminen, J., Jørgensen, K.S. 2004. The abundance of nahAc genescorrelates with the 14Cnaphthalene mineralization potential in petroleum hydrocarboncontaminated oxic soil layers. FEMS Microbiology Ecology, vol.51, sivut 99107.
Van Beilen, J.B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A.G., Röthlisberger, M. jaBernard Witholt, B. 2001. Analysis of Pseudomonas putida alkanedegradation geneclusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of alk genes.Microbiology, vol. 147, sivut 16211630.
Van Beilen, J.B., Wubbolts, M.G. ja Witholt, B. 1994. Genetics of alkane oxidation byPseudomonas oleovorans. Biodegradation, vol. 5, sivut 161174.
Van Hamme, J.D., Singh, A. ja Ward, O.P. 2003. Recent advances in petroleummicrobiology. Microbiology and Molecular Biology Reviews, vol. 67, sivut 503549.
Walker, J.D. ja Colwell, R.R. 1976. Enumeration of petroleumdegradingmicroorganisms. Applied and Environmental Microbiology, vol. 31, sivut 198207.
Wilkes, H., Rabus, R., Fischer, T., Armstroff, A., Behrends, A. ja Widdel, F. 2002.Anaerobic degradation of nhexane in a denitrifying bacterium: Further degradation of theinitial intermediate (1metylpentyl)succinate via Cskeleton rearrangement. Archives ofMicrobiology, vol. 177, sivut 235243.
Whyte, L.G., Bourbonniere, L., Greer, C.W. 1997. Biodegradation of petroleumhydrocarbons by psychrotrophic Pseudomonas strains possessing both alkane (alk) andnaphtalene (nah) catabolic pathways. Applied and Environmental Microbiology, vol. 63,sivut 37193723.
Wrenn, B.A. ja Venosa, A.D. 1996. Selective enumeration of aromatic and aliphatichydrocarbon degrading bacteria by mostprobablenumber procedure. Canadian Journal ofMicrobiology, vol. 42, sivut 252258.
Zhang, C. ja Bennett, G.N. 2005. Biodegradation of xenobiotics by anaerobic bacteria.Applied Microbiology and Biotecnology, vol. 67, sivut 600618.
Zhang, T. ja Fang, H.H.P. 2006. Applications of realtime polymerase chain reaction forquatification of microorganisms in environmental samples. Applied Microbiology andBiotecnology, vol. 70, sivut 281289.
112
Liitteet