Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.

JAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJEJAVNA RASPRAVA O TEMI DOKTORSKE DISERTACIJE

Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim Ki-67, p16INK4a i DNA ploidija u cervikalnim prekanceroznim lezijama – usporedba s prekanceroznim lezijama – usporedba s

histološkim nalazom i HPV statusomhistološkim nalazom i HPV statusom

Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med.Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med.

Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.

RAK VRATA MATERNICERAK VRATA MATERNICE

• godišnje 400 000 novooboljelih i 250 000 smrtnih slučajeva

• drugi po učestalosti maligni tumor kod žena

• pojavnost: - razvijene zemlje 10/100 000 (na 10. mjestu kod žena)

- zemlje u razvoju 19/100 000 (najčešći!)

- Hrvatska 13,7/100 000 (na 8. mjestu kod žena)

• poremećaj stanične poremećaj stanične zrelosti i orijentacije i zrelosti i orijentacije i

nuklearne atipijenuklearne atipije

• bojenje H-Ebojenje H-E

• klasifikacija s obzirom na klasifikacija s obzirom na debljinu zahvaćenog epiteladebljinu zahvaćenog epitela

CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA (CIN)(CIN)

CIN 1CIN 1

CIN 2CIN 2

CIN 3CIN 3

NEDOSTACI PATOHISTOLOŠKE KLASIFIKACIJE:NEDOSTACI PATOHISTOLOŠKE KLASIFIKACIJE:

• podložna subjektivnosti patologapodložna subjektivnosti patologa

• ne uzima u obzir dinamiku procesa (progresija, ne uzima u obzir dinamiku procesa (progresija, regresija)regresija)

• razlikovanje reaktivnih promjenarazlikovanje reaktivnih promjena

CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA CERVIKALNA INTRAEPITELNA NEOPLAZIJA (CIN)(CIN)

• preinvazivne promjene i invazivni rak vrata preinvazivne promjene i invazivni rak vrata maternice su rezultat infekcije genitalnim humanim maternice su rezultat infekcije genitalnim humanim

papiloma virusompapiloma virusom

• HPV DNA se nalazi u 99,7% karcinoma vrata HPV DNA se nalazi u 99,7% karcinoma vrata maternice maternice

WalboomersWalboomers et al. et al. Human papillomavirus is a necessary cause of Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide.invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999;189:12–9.J Pathol 1999;189:12–9.

HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)HUMANI PAPILOMA VIRUS (HPV)

• oko 40 različitih tipova humanog papiloma virusa oko 40 različitih tipova humanog papiloma virusa može inficirati spolni sustav žene može inficirati spolni sustav žene

• tipovi visokog onkogenog rizika su značajno tipovi visokog onkogenog rizika su značajno povezani s progresijom u invazivni rak vrata povezani s progresijom u invazivni rak vrata maternicematernice

• u tipove visokog rizika ubrajaju se HPV 16 i 18 i u tipove visokog rizika ubrajaju se HPV 16 i 18 i filogenetski s njima povezani tipovi: 31, 33, 35, 52, filogenetski s njima povezani tipovi: 31, 33, 35, 52, 58, odnosno 39, 45, 59, 6858, odnosno 39, 45, 59, 68

Bosch Bosch et al. et al. Prevalence of human papilPrevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a lomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802.worldwide perspective. J Natl Cancer Inst 1995;87:796–802.

Chan Chan et alet al. Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: . Analysis of genomic sequences of 95 papillomavirus types: uniting typing, phylogeny, and taxonomy. J Virol 1995;69:3074–83.uniting typing, phylogeny, and taxonomy. J Virol 1995;69:3074–83.



• cirkularni dvolančani DNA genom od cirkularni dvolančani DNA genom od 7900 parova baza7900 parova baza



• 3 regije: - rana regija3 regije: - rana regija - kasna regija - kasna regija - regulatorna regija - regulatorna regija




• rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikacijureplikaciju

• E6 i E7 daju šifru za sintezu E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusastaničnog ciklusa




• rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - rana regija: E1, E2, E4, E5, E6 i E7 - transkripcijske jedinice koje kodiraju transkripcijske jedinice koje kodiraju sintezu bjelančevina važnih za virusnu sintezu bjelančevina važnih za virusnu replikacijureplikaciju

• E6 i E7 daju šifru za sintezu E6 i E7 daju šifru za sintezu onkoproteina ključnih za kontrolu onkoproteina ključnih za kontrolu staničnog ciklusa staničnog ciklusa

• kasna regija: L1 i L2 - daju kod za kasna regija: L1 i L2 - daju kod za bjelančevine virusne kapsidebjelančevine virusne kapside


• HPV stimulira proliferaciju oslobađanjem E6 i E7 onkoproteina, koji se vezuju na p53 i pRb

• vezanjem E7 bjelančevine za pRb oslobađa se transkripcijski faktor E2F i ubrzava stanična replikacija


• HPV stimulira proliferaciju oslobađanjem E6 i E7 onkoproteina, koji se vezuju na p53 i pRb

• vezanjem E7 bjelančevine za pRb oslobađa se transkripcijski faktor E2F i ubrzava stanična replikacija

• hipofosforilirani pRb vezujući E2F ne dozvoljava prijelaz stanice iz G1 u S fazu i staničnu replikaciju• hiperfosforilirani pRb oslobađa E2F

HPV HPV p16 p16 INK4aINK4a

fosforilacija se događa tako da se na pRb veže kompleks ciklina i ciklin ovisnih kinaza

• aktivnost ciklin ovisnih kinaza (CDK) reguliraju njihovi inhibitori – CDK inhibitori

• p16INK4a - ekspresija je regulirana negativnom povratnom spregom od strane pRb

• inaktivacija pRb preko HPV E7 negativnom povratnom spregom dovodi do pojačanja djelovanja p16INK4a biomarker ekspresije HPV onkogena u stanicama

Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73.Wang et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2004;13:1355-60.

CIN CIN Ki-67 Ki-67

• životni vijek normalnih stanica cervikalnog epitela: četiri do pet dana

• u displastičnom epitelu je izmjena stanica ubrzana (CIN 3 - 12 sati)

• Ki-67 antigen je biomarker stanične proliferacije

• stupanj proliferacije cervikalnog epitela određen imunohistokemijskim bojanjem s Ki-67 protutijelom korelira sa stupnjem cervikalne displazije

Kruse et al. J Pathol 2001;193:48-54. Agoff et al. Mod Pathol. 2003;16:665-73.

Zanotti et al. Gynecol Oncol 2003;89:376-84.

HPV HPV DNA DNA

onkogeni HPV tipovi

regulatorne i replikatorne promjene staničnog ciklusa

+genetska nestabilnost

DNA oštećenja aneuploidija

Hanselaar et al. DNA changes in progressive cervical intraepithelial neoplasia. Anal Cell Pathol 1992;4:315-24.

CIN CIN aneuploidija aneuploidija

• aneuploidije su povezane sa skvamoznim intraepitelnim lezijama (SIL) visokog stupnja i s integracijom HPV genoma

Rihet et al. J Clin Pathol 1996;49:892-6.

• aneuploidija se javlja u visokorizičnih HPV pozitivnih skvamoznih intraepitelnih lezija, dok se u niskorizičnih HPV pozitivnih SIL i u HPV negativnih SIL ne javlja

Bollmann et al. Cancer 2003;99:57-62.

• aneuploidija je rizični čimbenik za progresiju CIN-a 1 i 2 u CIN 3

Melsheimer et al. Cytometry 2001;46:166-71.

2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA

• patohistološka analiza cervikalne biopsije ovisi o subjektivnoj procjeni patologa i zbog toga je podložna greškama

• različiti imunohistokemijski biljezi bili su istraživani s obzirom na njihovu specifičnost da označe displastične ili neoplastične stanice

- proliferacijski antigen Ki-67 - inhibitor ciklin ovisnih kinaza p16INK4a

• aneuploidija se povezuje sa CIN-om visokog stupnja i progresijom intraepitelne lezije


• u nijednom dosadašnjem istraživanju nije istražena moguća korist od istovremenog određivanja Ki-67, p16INK4a i DNA aneuploidije

• u većini dosadašnjih istraživanja registrirana je samo prisutnost Ki-67 pozitivnih stanica u gornje 2/3 epitela točnije je kvantitativno određivanje tih stanica u odnosu na visinu epitela

Kruse et al. Ki-67 immunoquantitation in cervical intraepithelial neoplasia (CIN): a sensitive marker for grading. J Pathol 2001;193:48-54.


Preliminarni rezultati našeg istraživanja:

- značajne razlike u broju Ki-67 pozitivnih stanica izmeđurazličitih stupnjeva cervikalne displazije

0

10

20

30

40

50

60

70

UKUPNO/100 mikrometara

normalniCIN 1CIN 2CIN 3


Preliminarni rezultati našeg istraživanja:

- značajne razlike u učestalosti Ki-67 pozitivnih stanica u pojedinim trećinama cervikalnog epitela kod različitih stupnjeva displazije

0102030405060708090

100

% donja trećina % srednja trećina % gornja trećina

normalniCIN 1CIN 2CIN 3

2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA2. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJAMorfologija:

- normalno tkivo cerviksa- cervikalna intraepitelna neoplazija

- invazivni karcinom cerviksa

DNA ploidija

Humani papiloma virus:- niskog onkogenog rizika- visokog onkogenog rizika

Imunohistokemija:- Ki-67

- p16INK4a

3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA3. CILJEVI ISTRAŽIVANJA

1. U ispitivanom materijalu utvrditi: a) prisutnost HPV-a visokog i niskog rizikab) imunohistokemijsku ekspresiju Ki-67 i p16INK4a proteinac) DNA ploidiju



2. Utvrditi postoji li povezanost ekspresije Ki-67 i p16INK4a proteina i DNA ploidije s prisutnošću HPV-a, posebno za HPV visokog i niskog rizika




3. Usporediti dijagnostičku vrijednost navedenih parametara u otkrivanju cervikalne intraepitelne neoplazije.





4. Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja.

3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA3.CILJEVI ISTRAŽIVANJA




4. Utvrditi koji je nabolji pokazatelj prisustva CIN-a visokog stupnja.

5. Utvrditi da li se istovremenim određivanjem i kombinacijom različitih biljega mogu postići točniji rezultati u dijagnostici cervikalne intraepitelne neoplazije, odnosno u razdvajanju CIN-a 1 od CIN-a 2 i CIN-a 3

4. HIPOTEZA4. HIPOTEZA

očekujemo značajno veću učestalost HPV-a visokog rizika u umjerenih i teških displazija (CIN 2 i CIN 3) i u karcinomu cerviksa u odnosu na normalno tkivo i CIN 1



imunohistokemijska ekspresija Ki-67 i p16INK4a proteina bi trebala biti u korelaciji s prisutnošću HPV-a visokog rizika, a posljedično i sa visokim stupnjem displazije, odnosno karcinomom cerviksa




u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a




u aneuploidnim i tetraploidnim uzorcima očekujemo nalaz HPV-a visokog rizika i morfološku dijagnozu CIN-a

kombinacija više parametara (Ki-67, p16INK4a, DNA ploidija) bi trebala imati veću osjetljivost i specifičnost u odvajanju kako cervikalnih intraepitelnih neoplazija od normalnog nalaza, tako i unutar skupine CIN-a na CIN 1, CIN 2 i CIN 3

5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA

Uzorci tkiva s potvrđenom patohistološkom dijagnozom:

- CIN 1 - normalno tkivo- CIN 2- CIN 3 - karcinom cerviksa

Postupci:- grupna tipizacija na HPV visokog i niskog rizika lančanom reakcijom

polimeraze- imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na antigen Ki-67- imunohistokemijska analiza upotrebom protutijela na protein p16INK4a - protočna citometrija i određivanje DNA ploidije

Patolog koji vrši analizu nije upoznat kojoj skupini pripada pojedini uzorak

5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA5. SADRŽAJ ISTRAŽIVANJA

Analizom uzoraka bojanih na Ki-67 antigen odrediti će se:- ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne

membrane- postotak Ki-67 pozitivnih jezgara u svakoj trećini epitela

Analizom na p16INK4a smatrati će se pozitivnima uzorci sa više od 5% nuklearno ili citoplazmatski obojanih stanica

Protočnom citometrijom uzorci će se razvrstati u 3 skupine: 1.diploidni 2. aneuploidni3. poliploidni

6. METODE ISTRAŽIVANJA6. METODE ISTRAŽIVANJA

6.1. ISPITANICI

30 uzoraka tkiva cerviksa za svaku dijagnostičku skupinu CIN-a

Kontrolne skupine:- normalno tkivo cerviksa pacijentica operiranih zbog drugih

bolesti- uzorci tkiva invazivnog karcinoma cerviksa

Kriterij uključenja u istraživanje: patohistološka dijagnoza jasno definirana od strane patologa eksperta za ginekološku patologiju


6.2. POSTUPCI

6.2.1. HISTOLOŠKA ANALIZA

fiksacija tkiva 24 h u 4% puferiranom formalinu uklapanje u parafin rezovi debljine 4 m bojanje hemalaun-eozinom


6.2. POSTUPCI

6.2.2. IMUNOHISTOKEMIJSKA ANALIZA

6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen

protutijela na ljudski Ki-67 (mišje protutijelo M7240, DAKO, Glostrup, Danska)

obojanost staničnih jezgara Ki-67 antigenom kvantitativno će se odrediti koristeći Analysis Soft Imaging System, GmbH, Muenster, Germany

u svakom uzorku izabrati će se najreprezentivnije područje (s najvećim stupnjem CIN-a) izbjegavajući tangencijalno rezana područja


6.2. POSTUPCI


6.2.2.1. Bojanje na Ki-67 antigen

Kvantitativna analiza: - ukupan broj Ki-67 pozitivnih jezgara na 100 m bazalne membrane - postotak Ki-67 pozitivnih jezgara posebno u donjoj, srednjoj i gornjoj trećini epitela


6.2. POSTUPCI


6.2.2.2. Bojanje na protein p16INK4a

monoklonsko protutijelo za protein p16INK4a (CINtecTM p16INK4a citology kit, DAKO, Glostrup, Danska)

imunoreaktivnost na p16INK4a:- nalaz smeđe obojanosti jezgara

i/ili citoplazmi, pri čemu će se pozitivnim nalazom smatra obojanost u više od 5% epitelnih stanica


6.2. POSTUPCI

6.2.3. HPV TIPIZACIJA LANČANOM REAKCIJOM POLIMERAZE

deparafinizacija tkivnih blokova - trostepeni postupak sa ksilolom i apsolutnim etanolom

izolacija DNA iz tkivnih blokova koristeći Nucleo Spin Tissue reagense (Machery-Nagel, Düren, Njemačka)

grupna tipizacija HPV-a u dvije posebne reakcije s dva para početnica, koristeći PCR Human Papilloma Virus Typing Set (TaKaRa, Shiga, Japan)

tipizacija na slijedeće genotipove: - 6, 11 - 16, 18, 31, 33, 52, 58


6.2. POSTUPCI

6.2.4. PROTOČNA CITOMETRIJA

suspenzija stanica tumorskog tkiva za DNA analizu protočnom citometrijom pripremiti će se modificiranom metodom Hedley-a i sur.

DNA histogrami se analiziraju u računalnom programu Modfit 3.0 (Verity Software House, Inc.).

tumori s jednim G0/G1 vrškom se klasificiraju kao diploidni tumori koji imaju i dodatni odvojeni G0/G1 vršak (s više od 10% jezgara) kao

aneuplodni tumori s tri ili više odvojena G0/G1 vrška su multiploidni


6.2. POSTUPCI

6.2.4. PROTOČNA CITOMETRIJA

stupanj aneuploidije se izražava DNA indeksom koji predstavlja omjer relativnog G0/G1 DNA sadržaja populacije uzorka i referentnih diploidnih stanica

DNA indeks diploidnih stanica iznosi 0,95-1,05

kod multiploidnih tumora koristit će se aneuploidna subpopulacija sa najvećim DNA indeksom

tetraploidni tumori su oni čiji DNA indeks iznosi 1,9-2,1


6.2. POSTUPCI

6.2.5. STATISTIČKI POSTUPCI

Statistica 7.1 (StatSoft, Inc., Tulsa, USA)

χ2 test za nominalne podatke

Kolmogorov-Smirnov test za provjeru normalnosti raspodjele intervalnih vrijednosti

za intervalna mjerenja: - t-test i analiza varijance- neparametrijski testovi (Mann-Whitney U-test i Kruskal-Wallis test)


6.2. POSTUPCI

6.2.5. STATISTIČKI POSTUPCI

prognostička vrijednost pojedinih varijabli u odnosu na patohistološku dijagnozu ispitati će se logističkom regresijom

značajnom će se smatrati P < 0,050

30 uzoraka tkiva u svakoj ispitivanoj skupini (CIN 1, CIN 2 i CIN 3):- razina značajnosti od 0,050 - snaga istraživanja od 90%

7. ZNANSTVENI DOPRINOS7. ZNANSTVENI DOPRINOS

razlikovanje reaktivnih atipija cervikalnog epitela od cervikalnih intraepitelnih neoplazija

preciznije svrstavanje u podgrupe unutar skupine cervikalnih intraepitelnih neoplazija

8. KLINIČKI DOPRINOS8. KLINIČKI DOPRINOS

definiranje promjena s većim rizikom progresije

u invazivni karcinom

razdvajanje blage od umjerene i

teške displazije

• klinički nadzor• kirurško liječenje

Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.

Documents

Transcript of Pristupnik: mr. sc. Marko Dražen Mimica, dr. med. Mentor: prof. dr. sc. Snježana Tomić, dr. med.