Producerea biotehnologică a compușilor antitumorali - poliamine

Îndrumător: Conf. dr. Smaranda Vântu

Masterand: Elena-Alexandra Sicora

Cuprins

• Poliaminele generalități;• Biosinteza poliaminelor;• Funcțiile poliaminelor;• Metode biotehnologice utilizate pentru obținerea de

poliamine;

Poliaminele • Poliaminele sunt un grup de amine alifatice, cationice la un pH neutru care sunt esențiale

pentru creșterea și viabilitatea celulelor.• Datorită sarcinii lor pozitive ele sunt capabile să se lege prin legături electrostatice la mai

multe macromolecule celulare, incluzând ADN, ARN, proteine.• Sunt implicate în reglarea unei game diverse de procese vitale în ambele tipuri de celule

(eucariote și procariote), inclusiv proliferarea celulelor, transducția semnalului și stabilizarea membranei.

• Acestea sunt implicate și în traducerea și reglarea expresiei genelor.• În unele organisme controlează si moartea celulară programată.• În plus, poliaminele sunt considerate ca fiind una din rezervele de carbon și de azot , cel puțin

în țesuturile în cultură.

Biosinteza poliaminelor

Funcțiile poliaminelor în plante• Poliaminele sunt asociate cu creșterea și dezvoltarea plantelor• Au rol în embriogeneza rădăcinilor, participă la înflorirea și dezvoltarea fructelor.• În ultimii ani s-a arătat un interes major pentru rolul jucat de poliamine ca molecule

ce ajută plantele să se protejeze împotriva stresului oxidativ, temperaturilor ridicate, deshidratării.

• Cercetările au demonstrat că poliaminele celulare au fluctuații semnificative atât în compoziției cât și concentrație ca răspuns la condițiile de mediu.

• Este clar rolul lor important în protejarea celulelor plantei dar modul lor de acțiune rămâne încă o chestiune de speculație.

http://www.toyobo-global.com/seihin/cosme/phytopolyamine.htm

Studii efectuate pentru a demonstra efectul lor protector

• Fructele de litchi au fost tratate cu câte 1 mm/L poliamină: putresceină, spermină și spermidină apoi depozitate la 5˚C până la 30 zile. În acest timp ele au fost analizate; s-a comparat nivelul de poliamine între plantele depozitate și cele în care s-a adăugat poliamine. Conținut de apă, producția de etilenă a fost și ea măsurată. Fructul în timpul depozitării s-a înnegrit ca urmare a creșterii nivelul de peroxizi și etilenă și scăderii nivelului de poliamine. Adaosul fiecărei poliamine a determinat creșterea nivelului celorlalte două în aproape fiecare caz și au determinat întârzierea apariției modificărilor caracteristice senescenței. Cea mai eficientă s-a dovedit a fi spermina.

Plante bogate în poliamine

Metode biotehnologice utilizate pentru obținerea de poliamine

• Triticum sp. aparține familiei poaceae și este cultivat în întreaga lume. Este polenizat de plante anuale și este cultura de cereale cea mai răspândită în lume. În acest moment se fac eforturi mari pentru a îmbunătăți productivitatea prin utilizarea biotehnologiei.

• Regenerarea de plante de la calus și selecția in vitro sunt cele mai folosite strategii de îmbunătățire și obținere de linii celulare de grâu regenerate și eficiente pentru manipularea in vitro.

• Abordarea biotehnologică a culturilor de grâu a dus la îmbunătățiri ale soiurilor și producerea unor noi linii celulare.

• Realizarea culturilor de țesut utilizând culturi de embrioni maturi urmată de embriogeneză somatică și selecție de calus cu o capacitate mare de regenerare poate accelera dezvoltarea de noi soiuri prin realizarea rapidă a homozigozității.

• Sursa de explant variază în funcție de capacitatea lor dea genera variație. Țesuturi diferențiate precum: rădăcina, tulpina, frunza produc o variație mai mare decât explantele cu meristeme pre-existente (muguri axilari,).

Embrionii atât maturi cât și imaturi au fost larg utilizați în culturile de țesut dar embrionii maturi s-au dovedit a fi o alegere mai bună în comparație cu embrionii imaturi.

Embrionii imaturi sunt bune surse de explant dar au nevoie de timp și facilități de creștere, în timp ce embrionii maturi sunt disponibili pe tot parcursul anului. Aceștia pot fi disecați sau utilizați direct.

Pentru realizarea de calus au fost utilizate explante precum: embrioni imaturi, frunze imature, inflorescențe imature, embrioni maturi, meristeme apicale

Inducția de calus și regenerarea plantei

A. Calus nodular și friabil din embrioni imaturiB. Formarea embrionului somaticC. Rădăcini și lăstari formași din germinarea embrionului somaticD. Embrioni somaticiE. Plantule regenerate din calusF. Plantula prezintă rădăcini adventive bine definiteG. Aclimatizarea plantulelor în sol

Etapele cultivării in vitro a grâului

• Datorită apariției tehnologiei de ADN recombinant s-a îmbunătăți calitatea nutrițională a grâului, acest fapt se realizează prin identificarea de gene responsabile de o anumită trăsătură și transferată unui noi soi mai bun. Pentru a dezvolta grâu transgenic trebuie ca culturile in vitro să aibă o capacitate mare de regenerare pentru ca planta cu genele utile să se dezvolte.

• Frecvența de regenerare a grâului in culturi in vitro este un factor de limitare pentru crearea de grâu transgenic.

• Transformarea genetică permite introducerea de gene noi adaptate la nivel local pentru a crea noi soiuri modificate genetic, utilizând protocoale de cultură de țesut ca linia lor de bază. Aceste proceduri presupun ca întreaga plantă să fie regenerată din celule izolate sau țesuturi. Multe protocoale au fost dezvoltate, dar în grâu ele sunt foarte mult dependente din punct de vedere genotipic.

Triticum spelta Triticum emmer

Agrobacterium rhizogenes – transformări mediate și transformări asociate în metabolismul PA.

• Plantele transgenice au fost obținute prin adoptarea de diferite strategii cum ar fi formarea de rădăcini noi la planta de tutun prin transferul plasmidului Ri de la Agrobacterium rhizogenes.

• Materialul genetic transferat (T-ADN) are potențial mutagen în celulele de plante și totodată identifica gene ce specifică fenotipuri noi. Plamidul Ri cuprinde aproximativ 18 gene potențiale dintre care patru au fost studiate mai în detaliu: Rol A, RolB RolC, RolD. Mai multe studii indică faptul că RolA și RolC alterează metabolismul poliaminelor și fenotipul plantei. Gene Rol afectează înflorirea, fertilitatea și morfologia frunzelor de tutun.

planta Vectorul Modificări fenotipice/biochimice

Nicotiana tabacum Ri T ADN Acumulare de poliamine. Ri T ADN Creșterea și înflorirea plantelor

a fost inhibată. Rol genes / Ri T ADN Plantele transformate au arătat

un nivel scăzut de poliamine și un nivel ridicat de stres oxidativ în rădăcini și plantule.

Rol C genă sălbatică Apare o scădere în dimensiune a florilor și a capsulei și totodată o scădere a fertilității plantelor.

Rol A genă sălbatică La plantele transformate a apărut sterilitatea, o morfologie anormală a florilor, frunze încrețite și internoduri scurte. Inhibă formarea polenului sau determină dezvoltarea anormală a acestora.

Rol A, RolB, RolC Plantele transformate cu cele trei gene au crescut mult mai repede decât plantele netransformate.

Determinarea conținutului de poliamine prin HPLC

Conținutul de poliamine prin HPLC clasic Conținutul de poliamine în HPLC rapid

1 putresceina3 spermidina4 spermina

Concluzii • Plantele cu un conținut ridicat de poliamine sunt considerate a avea o

valoare nutritivă mare. Joacă un rol important în procesele de creștere la plante și nu numai.

• Abordări transgenice au fost folosite pentru a modifica conținutul de poliamine din orez și cartof, aceste abordări ar trebui să fie extinse și la alte culturi precum grâu, porumb, legume.

• Mecanismele prin care poliaminele provoacă efecte de creștere și dezvoltare la plante rămân încă neelucidate. Analiza la nivel global a expresiei genice prin tehnici speciale va duce la înțelegerea rolului lor în plante.

• Cercetările viitoare cu plante transgenice ar trebui să ofere o mai mare înțelegere a mecanismului poliaminelor, a precursorilor și produșilor intermediari din calea metabolică a acestor compuși.

Bibliografie

Polyamines of Plant Origin – An Important Dietary Consideration for Human Health

Denise C. Hunter and David J. Burritt

Food & Wellness Group, The New Zealand Institute for Plant & Food Research Limited, Auckland, The Department of Botany, The University of Otago, Dunedin, New Zealand.

A study on polyamine change and browning of fruit during cold storage of litchi (Litchi chinensis Sonn.) Yue-Ming Jiang,  Fang Chen

http://www.pakbs.org/pjbot/PDFs/41(6)/PJB41(6)2869.pdf

In vitro selection and regeneration methods for wheat improvement

Manoj K. Yadav1, Manoj K. Tripathi2, Dinesh Yadav1, Sundeep Kumar3, Nagendra K. Singh4, Anil Kumar1 and Govind Krishna Garg1

High Speed HPLC Analysis of Poliamines in Plant Tissues, Hugo j.P. Walter, Jan M. C. Geuns

Polyamine research in plants – a changing perspective Raj K. Kakkar Vipen K. Sawhney first published online: 17 OCT 2002

http://www.impactaging.com/papers/v3/n8/full/100361.html

Improved Method for HPLC Analysis of Polyamines, Agmatine and Aromatic Monoamines in Plant Tissue , Robert D. Slocum, Hector E. Flores, Arthur W. Galston and Leonard H. Weinstein Polyamines in plants: An overview Ravindar Kaur-Sawhney1, Antonio F. Tiburcio2, Teresa, Altabella2, and Arthur W. Galston1

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Yale University, New Haven, CT,

06520-8103, USA;

2Laboratori de Fisiologia Vegetal, Facultad de Farmacia, Universitat de Barcelona,

Spain

Physiologia Plantarum - De novo formation in the cell layers of tabaccoȘ changes in free and bound polyamines - Patrizia torrigiani, Maria Maddalena Altamura, Francesca Capitani, Donatella Serafini, Nello Bagni, 28 apr 2006

http://www.jstor.org/discover/10.2307/2440606?uid=3738920&uid=2&uid=4&sid=21103918581383

Vă mulțumesc pentru atenție!