Přenos jader
description
Transcript of Přenos jader
Přenos jaderPřenos jaderNe příliš úspěšné, přesto popsány intra- a interdruhové přenosy
19851985 získány důkazy o funkci genů přeneseného jádra
Přenos mikrojaderPřenos mikrojader jádra obsahující jen část jaderného materiáluZískání: synchronizovaná kultura + mitotický jed, který ovlivňuje funkci vřeténka --- neorganizovaný přechod chromozomů do dceřiných buněk – část obsahuje jen např. 1-2 chromozomy
Přenos chromozomůPřenos chromozomů Izolace chromozomů - po synchronizaci - nejlépe v metafáziPřímá vazba na protoplasty pomocí fuzogenů (PEG – nízká frekvence přenosu)
Mikroinjekce – vyšší frekvence – lepší regenerace při mikroinjekci do celistvých buněk?? Osud přeneseného chromozomu, doba trvání v cytoplazmě, fáze buněčného cyklu recipientní buňky
Přenos chloroplastůPřenos chloroplastů 1969 - přenos špenátových chloroplastů do živočišných buněk1971 – přenos do slepičích vajíček - přežívání, metabolická aktivita, dělení1973 – komplementace protoplastů – fúze zelených protoplastů a mutantních s nevyvinutými plastidy – zelenání deficientních chloroplastů
Přenos mitochondriíPřenos mitochondriípřímá vazba nebyla popsánapřenos pomocí fúze protoplastů cytoplazmatičtí hybridi - znuvuuspořádání mt DNA – rekombinace
Přenos částí buněk
Přenos izolované DNA (direct gene transfer)
19771977 mnoho pokusů, chyběl důkaz integrace do recipientního chromozomu
Množství způsobů přenosu DNA:
Nevýhoda : vyšší frekvence přeorganizování transgenu a vyšší počet kopií
Elektroporací
Přenos pomocí působení PEG
Mikroinjekcí
Mikrobombardováním
Chemický „helper“Chemický „helper“
Poly L- ornitin – zpomaluje degradaci plazmidové DNA DNázami, stimuluje vazbu (neutralizací povrchového náboje) a expresi DNA v protoplastech
PEG, Ca 2+ zvyšuje vazbu DNA na povrch protoplastu
Krystalky fosforečnanu vápenatého- + fuzogen + pH – endocytóza krystalků
LipozomyLipozomy- fosfolipidy dispergované ve vodní fázi, podle podmínek a typu
fosfolipidu různé uspořádání i náboj. Chrání DNA, nejlepší fosfatidylserin
Přenos pomocí působení PEG
Elektroporace Elektroporace
250-350 V, ms, 2000 V, µs
– narušení buněčné membrány, vytvoření pórů umožňujících vstup DNA do buňky (narušení membrány laserem) - buňky, pletiva, SE
• lépe mikroinjekce do jádra (karyoplasty) – degradace
• Koncentrace DNA - vyšší koncentrace zvýšení frekvence transformace, ale pozor !! koncentrace toxické
• Forma DNA – lineární x nadšrobovicové (supercoil): lineární – vyšší frekvence transformace
• DNA lze přenášet mikroinjekcí i do mikrospor, celých buněk, semen lepší přežívání a regenerace
DNA
MikroinjekceMikroinjekce
Imobilizace buněk: skelný povrch pokrytý polylyzinem, přidržovací pipeta
Biolistická metodaBiolistická metoda (particle gun, particle bombardment) (1987)
ostřelování rostlinné buňky projektily: DNA navázaná na inertní kov (wolfram, zlato)
• Co ovlivňuje výsledek ?
• Frekvence přežití buněk po transformačním působení
• Frekvence rekombinace + frekvence exprese
• Frekvence regenerace buněk za daných podmínek
Vektorový přenos DNA
Virové vektoryVirové vektory
Dochází k rozšíření, zmnožení a expresi vloženého genu. Kromě patogenicity (např. nahrazení genu pro plášťový protein genem X) rekombinantní virus napodobuje svůj přirozený protějšek v ostatních aspektech
možnost koexistence mnohočetných genů, je-li zachována schopnost autonomní replikace
Řešení otázek :
Mechanismu infekce
Vliv na expresi jaderných genů
Interakce mezi různými viry
Rezistence k virům
Lze použít k přenosu cizorodé DNA, neintegrující
• virové vektoryvirové vektory
• systém systém AgrobacteriaAgrobacteria
Systém Agrobacteria
Agrobacterium běžná půdní bakterie
Dvouděložné po poranění a infekci – proliferační schopnost --- tvorba dediferencovaného tumorového pletiva nebo modifikovaných kořenů
• Agrobacterium tumefaciens – cown gall- halka
• Agrobacterium rhizogenes - hairy roots
Izolace tumorových pletiv a přenesení do podmínek in vitro
• růst na médiu bez růstových regulátorů
• produkce nových látek – opinů a agropinů
Čeleď Rhizobiaceae – všichni příslušníci ovlivňují morfologii rostlin, ale jen
Agrobacterium mění genetickou výbavu rostlinných buněk
• 19741974 objeven plazmid, prokázána souvislost s virulencí
Dělení podle produkovaných látek na jednotlivé typy:
oktopinový nopalinový manopinový agropinový agrocinopinový leucopinový
• 19771977 důkaz vnášení části genetické informace plazmidu do
rostlinného genomu.
Opiny - deriváty aminokyselin -- zdroj C a N pro bakterie -- konjugace mezi bakteriemi
nejprostudovanější: oktopinový a nopalinový typ (deriváty argininu)
Agropiny - deriváty cukrů -- zdroj C pro bakterie
(stabilní, rostlinou nemetabolizovatelné)
Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens
Ti plazmidTi plazmid (150-200kb)
T-DNAT-DNA - oblast ohraničená specifickými sekvencemi, přenášená do jádra rostlinné buňky
Vir Vir oblastoblast
T-DNA – nopalinový typ :
• geny kontrolující syntézu auxinů
• -“- cytokininů
• geny ovlivňující rychlost růstu tumorů
• geny pro syntézu nopalinů
• geny pro syntézu nosičových proteinů
nopalinový typ T- DNA 1 segment (23kb)
oktopinový typ T-DNA 2 segmenty (13,6; 7kb)
T-DNA – oktopinový typ
TR - syntéza oktopinů
TL - tumorový růst
T-DNAT-DNA
Z infikovaných buněk nelze regenerovat rostlinu
Replikační Replikační počátekpočátek Katabolizmus Katabolizmus
opinůopinů
Konjugativní Konjugativní přenospřenos
Vir-oblastVir-oblast
Funkce nutné pro vystřižení, přenos a integraci T- DNA (vir oblast nopalinového a oktopinového typu mohou komplementovat)
Vir-oblast není přenášena, zahrnuje několik operonů (vir A (1 protein); vir B (11); vir C (2); vir D (4) vir E (2) Vir G (1), (u některých kmenů vir F, vir H, vir J)
ACGD
E
B konstitutivně
Fenolická látka
Poraněná rostlinná buňka
Chv A Chv BPsc A
Syntéza a transport extracelulárních polysacharidů
Vir oblast
Ti plazmid
Agrobacterium tumefaciens připojené k rostlinné buňce
Sled dějů při přenosu T-DNA do rostlinné Sled dějů při přenosu T-DNA do rostlinné buňky buňky
Rozpoznání přítomnosti poraněné rostliny, signál: fenolické látky chemotaxe Připoutání bakteriální buňky k rostlinné b. - produkty chromozomálních genů (chvB tvorba -1,2 glukanu; chvA – transportní protein – doprava do periplazmatického prostoru, pscA produkce sukcinoglykanu Vazba signálních molekul na receptorové proteiny (vir A) změna konformace proteinu vir A aktivace vir G Produkt genu vir G aktivace genů vir oblasti
Vytvoření zlomu pro uvolnění T-DNA , vir D1, vir D2
odvíjení jednovláknové T-DNA vir D1, vir D2, Vir C1
Vytvoření přenosového komplexu
Vir E2
Vir D2
Přenos komplexu přes bakteriální a rostlinné stěny (geny vir B) Vnesení T-DNA do buněčného jádra vir D2 , vir E2
Integrace do jaderné DNA, přenos do náhodných míst rostlinného genomu
Agrobacterium rhizogenes
choroba – „hairy roots“--- zodpovědný Ri plazmidRi plazmid (root inducing)
manopinový typ T DNA … jeden segment T-DNA
agropinový typ T-DNA …. dva segmenty T-DNA
Homologie Ti a Ri plazmidů
Vnesené geny jsou nejaktivnější v dediferencovaných pletivech, z „hairy roots“ tumorů lze regenerovat rostliny, které jsou ovšem abnormální
Téměř všechny kmeny A . rhizogenes mají 3 komponenty plazmidu Ri.
malý plazmid: geny pro utilizaci opinů;
střední plazmid: T-DNA a jiné geny pro utilizaci opinů
velký plazmid: kointegrát obou předchozích
T-DNA : geny pro syntézu auxinu, + rolB a rol C – interferující s metabolizmem r. hormonů citlivost k endogenním auxinům.
Vektorový přenos při transgenozi Vektorový přenos při transgenozi
a) onkogenníb) neonkogenní
a) omezené využití, produkce tumorového pletiva u infekce Ti plazmidovou T-DNA
nelze regenerovat dospělé rostliny
T- DNAT- DNA T- DNAT- DNA vnášený vnášený gengen
b) nevytváří se tumor – možná regenerace rostliny
hraniční hraniční sekvence T- DNA sekvence T- DNA vnášený vnášený
gengen
hraniční hraniční sekvence T- DNA sekvence T- DNA
klonovací plazmid: replikační počátek
T-DNA hraniční sekvence přenášený genselektovatelný marker
binární vektor
Ti plazmid zbavený T-DNA
Transformační systémTransformační systém
• Společná kultivace protoplastů s Agrobacteriem
• Infekce listových disků Agrobacteriem
• Infekce rány na rostlině in vivo Agrobacteriem
• Ponoření vyvíjejících se květů do bakteriální kultury – selekce semen
Přenesení vytvořeného kalusu na médium
odstranění Agrobacteria antibiotikem
růst tkáňové kultury regenerace
Přenos a exprese cizorodé DNAPřenos a exprese cizorodé DNA
Možný přenos jakékoli DNA (přeneseny až segmenty o 50kb)
?? Exprese genů - zachování regulátorových sekvencí genů;
nutné iniciační a terminační sekvence funkční v rostlinné buňce Nevýhoda: nehodí se pro všechny rostliny a všechna pletiva (přednostně funguje u
dvouděložných), jednoděložné výběr vhodného kmene, supervirulentní kmeny s více
kopiemi některých Vir genů.
Stabilita genů T-DNA:
• přenosné přes meiosi
• exprese genů se postupně snižuje - specifická vlastnost, která se projevuje jen při zachování T- DNA ( X transgenoze)
• zjištěna závislost mezi metylací a potlačením exprese
Možnost vytvoření stabilních mutantů – využití ke šlechtění rostlin
Budoucnost a rizika
Využití technik biotechnologie rostlinVyužití technik biotechnologie rostlin
pro rozvoj znalostí fyziologie rostlin
k praktickému využití
? Biotech
nologie a životní p
rostředí
Množení rostlin
Komerčně významné rostliny
Ohrožené rostliny
Ozdravování rostlin
? Genetická uniformita
? Somaklonální variabilita
Mutageneze in vitro ? Genetická uniformita ? Somaklonální variabilita
Produkce sekundárních metabolitů, biotransformace
Je snaha vnášet znaky související sJe snaha vnášet znaky související s
1. rezistencí k chorobám (k virům (pouzdrové proteiny); bakteriím; houbám)
2. rezistencí k parazitům (geny pro toxiny působící na škůdce, Bacillus thuringiensis)
3. rezistencí k herbicidům (modifikovaný cílový protein; nadprodukce cílového proteinu; detoxifikace herbicidu)
4. rezistencí k chladu, osmotickému stresu etc. (změny v obsahu osmoticky aktivních látek, stresových proteinů…)
5. zlepšením kvality produktů (změny v zastoupení a obsahu zásobních látek)
6. produkcí látek (farmaka, protilátky, vakcíny, technické látky, „molecular farming“)
? Biotechnologie a životní prostředí
? Transgenní rostliny a životní prostředí
Rizika využívání transgenních rostlinRizika využívání transgenních rostlin
Nebezpečí 1:Nebezpečí 1: transgenní rostlina se stává nekontrolovatelným plevelem (díky ovlivnění
schopnosti přežití)
typy rostlin : na lidech závislé
lidmi dobře kontrolovatelné
na lidech nezávislé
Nebezpečí 2:Nebezpečí 2: přenos genu na divoké příbuzné rostliny
možnost křížení
překryv kvetení
výskyt divokých příbuzných v dané lokalitě
Nebezpečí 3:Nebezpečí 3: přenos genu na nepříbuzné rostliny (? viry, Agrobacterium)
Nebezpečí 4:Nebezpečí 4: zvýšení používání herbicidů
GMO in USA
Nebezpečí 7Nebezpečí 7: porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru
Nutnost
pečlivého výběru genu i recipientní rostliny
testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky)
sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření
! Hodnocení každého
jednotlivého případu
zvlášť !
Nebezpečí 6:Nebezpečí 6: ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem
Nebezpečí 5:Nebezpečí 5: hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky)
Nebezpečí 7Nebezpečí 7: porušení rovnováhy - vliv na divokou faunu, floru
Nutnost
pečlivého výběru genu i recipientní rostliny
testování transgenních rostlin v uzavřených prostorách (skleníky)
sledování v polních pokusech za přísných bezpečnostních opatření
! Hodnocení každého
jednotlivého případu
zvlášť !
Nebezpečí 6:Nebezpečí 6: ovlivnění metabolizmu transgenní rostliny nežádoucím směrem
Nebezpečí 5:Nebezpečí 5: hromadění látek v rostlinách, které mohou být toxické pro lidi nebo zvířata (herbicidy, toxiny, nové látky)
Díky za pozornost