Predanalitički zahtjevi, analitički · 2020-03-02 · Predanalitički zahtjevi u laboratorijskoj...
Transcript of Predanalitički zahtjevi, analitički · 2020-03-02 · Predanalitički zahtjevi u laboratorijskoj...
Predanalitički zahtjevi, analitički
sustavi i interferencije
Koraljka Đurić
Medicinsko biokemijski laboratorij
Specijalna bolnica AGRAM
Predanalitički zahtjevi u laboratorijskoj
dijagnostici bolesti štitnjače
Biološki čimbenici
Kratkotrajni
Dugotrajni
Utjecaj farmakološki aktivnih tvari
Biološki (in vivo)
Metodološki (in vitro)
Heparin
Biotin
Metodološki čimbenici
Vrijeme uzorkovanja
Hemoliza, lipemija, ikterija
Stabilnost i način pohrane uzorka
Biološka
varijabilnost INTRAindividualna varijabilnost
Cirkadijani ritam lučenja, 24hminmax
TSH od 87% do 320%
T3, T4 od 15% do 30%
Individualna prosječna dnevna vrijednost TSH
Promjene iz dana u dan
Sezonske varijacije (temperatura, unos joda, itd)
INTERindividualna varijabilnost je veća od INTRAindividualne
Trudnoća
Postpartum
Može li koncentracija TSH biti promijenjena u eutiroidnih osoba neovisno o povratnoj sprezi i funkciji štitnjače? Neurotransmiteri i lijekovi
Promjena osjetljivosti hipofize u nekim bolestima
Poluživot tj. brzina eliminacije
Pozitivna korelacija između koncentracije TSH i pozitivnih Anti-TPO protutijela (okultni autoimuni hipotireoidizam)
Referentni intervali za TSH
Populacijski referentni intervali Donja granica između 0,2 i 0,4 mIU/L
Gornja granica referentnog intervala
National Academy of Clinical Biochemistry 4 mIU/L
American Association of Clinical Endocrinologists 3 mIU/L
2.5 mIU/L
?
Specifični populacijski referentni intervali (npr. u trudnoći)
Ciljane vrijednosti (npr. praćenje terapije hipotireoze, TSH u donjem dijelu populacijskog referentnog intervala)
Individualni referentni interval (IRI) = homeostatska prosječna individualna vrijednost
Potreban broj određivanja za 95% pouzdanu procjenu IRI:
TSH 85
T3/T4 25
Referentni intervali specifični za
analitičku metodu
95% CI
99% CI 0.5th percentile 99.5th percentile
”Granične gornje vrijednosti TSH za
prvo tromjesečje su 2,5 mIJ/L (3,0 mIJ/L
za drugo i treće tromjesečje), a ne 4,5 do
5,0 mIJ/L što koriste brojni laboratoriji.
Ukupni T4 i T3 u trudnoći su 1,5 puta
viši u odnosu na vrijednosti izvan
trudnoće. Različite su referentne
vrijednosti za FT4.”
Biološki utjecaj farmakološki aktivnih tvari
Učinak Farmakološki aktivna tvar
TSH sekrecija dopamin, glukokortikoidi
sekrecija hormona štitnjače litij, jod, amiodaron
sekrecija hormona štitnjače jod, amiodaron
Transport hormona štitnjače u krvi estrogeni, androgeni, anabolički steroidi, glukokortikoidi,
tamoksifen, heroin, metadon, salicilati
metabolizma hormona štitnjače u jetri fenobarbiton, rifampicin, fenitoin, karbamazepin
aktivnost T4 5 dejonidaze amiodaron, glukokortikoidi, propiltiouracil, antagonisti
adrenergijskih receptora
Vrijeme uzorkovanja odgoditi najmanje 10h nakon zadnje doze heparina
i odmah mjeriti FT4/FT3 (ili mjeriti TSH/T4/T3)
Utjecaj
heparina
Utjecaj biotina
Imunokemijske metode koje koriste interakciju biotina i streptavidina (biotinizirano analitičko antitijelo)
IFT (interference treshold) = koncentracija egzogenog biotina u uzorku koja izaziva razliku u izmjerenoj koncentraciji analita +/- 10% ili više TSH (25 ng/ml), FT4 (100 ng/ml), FT3 (70 ng/ml), T3 (10 ng/ml), T4 (100 ng/ml)
Vrsta imunokemijske metode koja koristi biotin: Imunometrijska (npr TSH) – lažno vrijednosti
Kompetitivna (npr hormoni štitnjače) – lažno vrijednosti
Farmakokinetika biotina Doza i vrsta lijeka:
multivitaminski pripravci (30-60 g/d) – vjerojatnost interferencije
Dodatak prehrani (2-10 mg/d) – vjerojatnost interferencije / (značajno ovisi o IFT)
Lijekovi (100-300 mg/d) – vjerojatnost interferencije
Vrijeme uzorkovanja u odnosu na T-max (1-3 h) i T-1/2 (8-19 h)
Predanalitička napomena: osobe koje uzimaju biotin u visokim dozama (>1 mg/d) trebaju odgoditi uzorkovanje najmanje 8h nakon zadnje uzete doze
Metodološki čimbenici
Vrijeme
uzorkovanja
Trajanje
podveze
Vrsta
uzorka
Vrsta
spremnika Stabilnost
2-8 C
Ikterija,
hemoliza,
lipemija
TSH +++ ++
serum,
plazma
(heparin,
EDTA)
plastika,
separator
gel 7 dana
Bil < 600 mol/L
Hb < 0,2 g/L
TG < 15 mmol/L
FT3,
FT4 + +
serum,
plazma
(heparin,
EDTA)
plastika,
separator
gel 7 dana
Bil < 600 mol/L
Hb < 0,2 g/L
TG < 15 mmol/L *
T3,
T4 + ++
serum,
plazma
(heparin,
EDTA)
plastika,
separator
gel
7 dana
Bil < 600 mol/L
Hb < 0,2 g/L
TG < 15 mmol/L
Analitički sustavi - TSH
Imunokemijske metode s monoklonskim antitijelima
Imunometrijske s neradioaktivnim obilježivačima
Automatizirane, III ili IV generacije
Analitička osjetljivost između 0,01 mIU/L (III gen) i
0,001 mIU/L (IV gen) zadovoljava za pouzdanost
dijagnoze hipertireoze
Analitička specifičnost:
zadovoljava spram rizika križne reakcije s hCG, FSH,
LH (< 0,01 ili 0,001%)
spram makro-TSH, različitim glikoformama TSH ???
Referentni mjerni sustav i standardizacija - ne
zadovoljava
Harmonizacija – ne zadovoljava
Analitička varijabilnost - TSH
INTRA - analitička varijabilnost
Značajno manja od biološke varijabilnosti
Ciljane vrijednosti (analitička varijabilnost <1/2 biološke) su zadovoljene
INTER – analitička varijabilnost (međulaboratorijske usporedbe)
Nezadovoljavajuća
Standardizacija (IFCC)
Rezultat mjerenja TSH značajno ovisi o analitičkoj metodi koju laboratorij koristi !
Referentni intervali ne ovise samo o populaciji u kojoj su istraženi već su specifični i za analitičku metodu kojom su određeni
Granične vrijednosti za TSH preporučene u literaturi i od strane strukovnih udruženja također ovise o analitičkoj metodi kojom je mjeren TSH
Međulaboratorijske usporedbe i referentni intervali -
TSH
Donja granica RI Gornja granica RI
Percentila mIU/L Percentila mIU/L
Abbott
CMIA 0,5 0,35 99,5 4,94
Roche
ECLIA 0,5 0,13 99,5 6,33
Abbott
CMIA 2,5 0,47 97,5 3,67
Roche
ECLIA 2,5 0,27 97,5 4,2
Analitički sustavi – ukupni T3 i T4
Imunokemijske metode s poliklonskim antitijelima
Kompetitivne s neradioaktivnim obilježivačima
Oslobađanje hormona s proteinskog nosača
Inaktivacija proteinskog nosača
Automatizirane
Analitička osjetljivost (0,3 nmol/L za T3 i 5,4 nmol/L za
T4) zadovoljava
Analitička specifičnost zadovoljava, međutim, križna
reaktivnost s L-T3, D-T3, L-T4, D-T4 je bitna!
Referentni mjerni sustav i standardizacija - zadovoljava
Harmonizacija - zadovoljava
Analitički sustavi – slobodni T3 i T4
Direktne imunokemijske metode
Kompetitivne s neradioaktivnim obilježivačima
koncentracija detekcijskog antitijela
Metode u 2 koraka odvojena ispiranjem ili metode u
jednom koraku
Automatizirane
Analitička osjetljivost (0,4 do 0,6 pmol/L) zadovoljava
Gornja granica linearnosti (50 pmol/L za FT3 i 100
pmol/L za FT4)
Analitička specifičnost zadovoljava
Referentni mjerni sustav i standardizacija - zadovoljava
Harmonizacija - zadovoljava
HORMONI ŠTITNJAČE
Kompetitivne imunokemijske
metode
Predanalitički čimbenici
Vezujući proteini
Antihormon autoantitijela
TSH
NEkompetitivne imunokemijske
metode
Predanalitički čimbenici
Nespecifičnost antitijela
Heterofilna antitijela i
HAAA
Prozonski učinak
Hormoni štitnjače
Anti-T3 i Anti-T4 autoantitijela (THAAb)
Učestalost Zdravi 1:2500
Autoimune bolesti štitnjače do 40% (istovremeno Anti-TPO i/ili Anti-TG)
Svojstva Poliklonalna At, klasa IgG
specifičnost
potentnost, titar
Interferencija ovisi o Obilježavanje hormona ili analoga
Broju analitičkih At
Broju inkubacija odvojenih ispiranjem u analitičkoj metodi
Mjerenju ukupnih ili slobodnih hormona
Pojava lažno i lažno rezultata
FT4 uz uredan TSH u probiranju bolesti štitnjače
Vezujući protein - TBG
In vivo
TBG u trudnoći ( T3 i T4)
lijekovi koji mijenjaju TBG-hormon interakciju lažno FT3 i FT4
In vitro
(Anti-TG na određivanje TG)
Nepotpuno oslobađanje T3 i T4 s TBG lažno T3 i T4
Nepotpuna inaktivacija TBG lažno ili T3 i T4
Heparin u kombinaciji s triglicerida FT3 i FT4
TSH
Nespecifičnost analitičkih antitijela
Makro-TSH
Glikoforme TSH
Heterofilna antitijela i HAAA
Prozonski učina
Prepoznavanje i težina posljedica interferencija ovisi o:
kliničkoj značajnosti određivanja hormona (težina kliničke odluke koja se
donosi temeljem izmjerene koncentracije hormona)
uporabi graničnih vrijednosti u donošenju kliničke odluke
preporukama medicine temeljene na dokazima da se pri kliničkom
rasuđivanju razmatra koncentracija samo jednog hormona)
organizaciji laboratorijske dijagnostike i zdravstvenog sustava
Makro-TSH
Kompleks TSH i anti-TSH antitijela Autoimuna
IgG klase
>150kDa
Učestalost 0,6 do 1,6%
Biološki neaktivan
Pozitivna interferencija u imunokemijskim testovima
Kada posumnjati na makro-TSH ?
TSH > 10mIU/L uz normalne FT4 i FT3
Metode probiranja i dokazivanja makro-TSH Dilucija uzorka
PEG precipitacija Radna otopina: 25% PEG200 u
fiziološkoj otopini
Makro-TSH (%) = (Makro-TSH (mIU/L)/TSH u nativnom uzorku) x 100
Granična vrijednost < 20% ili 25% ?
Koprecipitacija do 25% bioaktivnog TSH
Svojstva imunokemijskih metoda
Gel filtracijska kromatografija (GFC) Preporučena metoda
Ne razlikuje interferencije zbog makro-TSH i HAMA
Heterofilna antitijela i
HAAA
Heterofilna antitijela
Nespecifična, polivalentna At
Učestalost interferencije na
mjerenje TSH je 0,4%
Reumatoidni faktor
klasa IgM
Specifičnost prema Fc
fragmentu humanog IgG
Heterofilno At, križna
reakcija s Fc fragmentom
animalnih IgG
Imunoglobulini u biološkoj
terapiji
HAAA i HAMA
Visoko specifična At
Animalni Ig u dijagnostičke i
terapijske svrhe
Najčešće HAMA
Pozitivna interferencija, TSH
Analitička antitijela (vrsta, podrijetlo, Fab fragment, monoklonalnost)
Metode probiranja i eliminacije
Druga analitička metoda
Dilucija uzorka
HBT, blokirajući reagens
Probiranje interferencija
Laboratorij proizvođača analitičke metode
Specijalistički/subspecijalistički laboratorij (neimunokemijske
metode)
Specijalistički MBL (imunokemijske metode)
I. Provjeriti predanalitičke čimbenike i analitički sustav –
PONOVITI MJERENJE
II. Odrediti sve testove unutar algoritma
III. Uzastopna ravnomjerna dilucija uzorka (1:2; 1:4; 1:8)
Referentne vrijednosti iskorištenja (%) za svaku diluciju
Otopina za razrjeđivanje? (npr. za FT3 i FT4, albumin?, FO)
IV. Predobrada uzorka s blokirajućim antitijelima
HBT (Scandibodies Laboratories)
V. Precipitacija proteina prema veličini
npr. PEG-om
Testiranje precipitacijske i analitičke metode s kontrolnim uzorcima
Redefinicija referentnog intervala
VI. Mjerenje drugom imunokemijskom metodom
Laboratorijski nalaz u slučaju dokazane sumnje
na interferenciju