PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

75
Prírodovedecká fakulta UPJŠ PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVÝCH KYSELÍN Základné techniky rekombinantnej DNA Kolektív autorov UNIVERZITA PAVLA JOZEFA ŠAFÁRIKA V KOŠICIACH

Transcript of PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

Page 1: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

��������������� ������ ����������� ���������

Prírodovedecká fakulta UPJŠ

PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVÝCH KYSELÍN

Základné techniky rekombinantnej DNA

Kolektív autorov

UNIVERZITA PAVLA JOZEFA ŠAFÁRIKA V KOŠICIACH

Page 2: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

�� �!�"�#"�$�#"�%�!�#�& '�(�)�*�+�& ,�)�-�,�

Prírodovedecká fakulta UPJŠ

PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVÝCH KYSELÍN

Základné techniky rekombinantnej DNA

Viktor Víglaský, Štefan .�/1032547658:9<;=9?> Pristaš a Peter Javorský

2000

Recenzent: prof. RNDr. Eva Mišurová, CSc.

@BADCFEHGJI�KLCNMJKOEHP5QSR=TDUJV3WDQXCYGJI�Z5[=C]\^G?KLC<[_G?`aZHPbKc[dCFEJegfhKie3j5CkGbKcPJV�lOmn@olqpsrBV tvuSw_xXyDxXzDyD{}|D~5x1�D��u��� zs~5u���~ � �a�������������

���]�H�b�H�5�_�b�g�c�i�=�<���J�}�c�5�b�c�o�5�3�=�5�H���L�5�5���L�H�D�5�B�3�s F�H�5�<���B�L F¡��i��¢D�H�J£5�J�H D�5�_¤h�¥�F�5�L�J�L¦i§

Page 3: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

1

1. Úvod

¨�©<ª¬«¬­=©7®c¯5­_°�±�²F³H´XµD±D°5´X©�¶?«·¶Y¸<¹»º¼©D½¬°J¾¬²D¿ ®L±D²<¿J°5ÀÁ¹ ­=±<¹H«5Â�ªS´Á°H©D°b®c°�±dÃnÄÆÅaÇÉÈhÊÌËH­=µD±<°�Í�Î5­=±ÏcÐiÑ3Ò5Ó<ÔbÐ�Õ�ÖÌ×HØÁÕHÙDÚ5ÛDÜaØXÓÞÝß×HØÁÕHàÁá¬âHØXÓDãoä5å=ØÁæDÕHÜçÔ�ÝDÒ�Ö3èké<ÑDê_ë�Ô5Ý�ä5å=ÓDÒ5Ô5ìbÏLí¬î�é

biochémie nukleovýchí5îHïðÓYàÁñÁÔ�ÝòÜBÕ»àXÓ<íJÑSà¼Õ�Ö3Ó_êó×HØÁÕ»àÁá5â»ØXÓ]Ý�Ô5ØXÓ<íJÐcÕ5åhô�ÜaØ5ä5å=Ý<íJÐcØXÙ<í5ôHÜaØJë3àÁÕ»ÚHÝDÜ}ØSØXÙDÚ}Ò5Õ5ä õ^ö�÷_ødùqúûdü<ýÿþ���������� ���� ��¼þ�� þ ���������������������! ��#"�$�%�&�'�(�)�*+��,.-�"/��*0$�,#��-! ��1& 243

základných

laboratórnych technikách tvorby, prenosu, identifikácie, izolácie a analýzy plazmidovej5.687�9�:<;�=?>�@�>BA#>�6�CEDGFIH0@�J�5.=/A�9�: K.=MLN@BK 2 K 3 9OC.=QP�RSA�6�9�5.6TA#=?P!7�U�P�R 3 6�V�9W:�91K�A#XZY\[�X�K�7�@�>]U�P^R_J�9WLN@BKprednášok, overia v J�5`@!7]A#=QP!7�U�P�RaJ�5.Xb7�cQ@�V�9�P!R1dfehg85.9 3 6!ijK`@k[^9�[�>lg�:M=Q@ K mechanizmami a3 Ul[B>l@�:�9W: C`6�V�>l9lA#c?= 3 U�P�RmL�=Q@BK�A#7�9 3 UlP^R 7�5`9�7l9 3 3 J�5.6NV]c?9�n^6^>]U�P�R J�5�9BAo9�7l9�c?9�P!RlYp7]Ao9�5.qrK#s3�t L]u.=v>l9lwx[�@�:I6!5.@8>�qy>�@r>l@`CzL�@]K#A�6`Czu.={6|J�9]w�nBX 3 @^>]U}9];8Cz6!7]A klonovania, na bakteriálne bunky

Escherichia coli.

Techniky molekulového 7�c?9�>�9 3 @�>�=Q@~K.@�[�V�@�C�sS;�� 2 5.6�cQ@OA�X 3 >l6pCz6�V�>�9�VBw�P!R�qNY�@�c?6 3�t L]u.=?>�@J�5.9BAo9�7l9�cZ9 3 [�@!R]5.i ���z���������]�������~�?�����b�1�Q�B�����?������� ���.�]�l�l�������#���.�������8���O�l���!�.�?�M�������O�#�����]������������.�N���!�����]�¡ ���¢£���{���¤���]¢¥�.���l�£�#��¦§�����£�`�l���©¨�¨^ !�����1�����?�¥ª��«�. ¬�]����ª� ��.�������.���. !�]�N�z�<�� ��]�� ��{�©���< <�]�� ��B���/�����­��.�{�����������®�����W�B�������¥¯<°±�S�]�`�O�#�k��� ²´³fµ¤¶�·�¸?¹!º�µ/»�¼�½E¾O¿�ÀxÁ.¾ Â�¾!º�¶]ÃÅÄ�Æ.ÇW¶BÈ�Â]»ÊÉGË�Ì ÍBÎ�Á�Â�¾^Ï]ÃÅÐ Ñ ¹�¶�Ï�Ç]»#¸?µZÐ�Ã�Ò�ÓÔÂ�Æ.Ç�Â�Ç�Ò!Ó�Ä�Æ�ÇB»#Ç�Â�Ç�¸/È�Â�Ç�ÏB»#Æ�Ç�¸?ÇlÐ�¾�¸Õ¾ ¾O¿�À_Áz¾Ö¶�Ç ÇlÐ�¹!Æ.Ç]Ð�¾!Ï�µQ¾×Ð�Ã1Á.¸Q¹�¶]Â�Ç]Ð Â�¾!º�¶�¹ ÑÆ.¹N¾!Â�Ò�µ?¹ØÍ�¾�Ó]Æ.Ù�Ç]Ð�¾�¸Qµ�¾ Ñ Â�Ç�Ï�»#Æ�Ç�¸?Ï�¼ÚÄ�Ç�Â]È¥Á�ÀIÁ.ÇfÍNÏ�Û�³�Ç]ÈfÉÜËMÌ�Ý

Z ³�Ï�Ç�º]Á�»�Ð a literatúry, v Â]»#Ç�Æ.¹ Ñ Á.¾Ú³�·�º�¹�³M¹ÞÇl¿�Ç�Í�ÏlÛ!³Mµbß|Á technikami konštrukcie a¾!Ïl¾�¸vÃ�Í�ÀàÆ.¹!Â�ÇW³<¿�µ?Ï�¾�ÏB»#Ï�¹ Ñ ÉÜËMÌ+Ð�À�Ä�¸váÐ�¾�½<º�¹�Ä�Ç1Áo»�È�Ä]ÀàÄ�ÇlÈ�º�ÎbÐ�¾�Ïl¼áÐ molekulom klonovaní saÏl¹OȧÁ#»�Û�¸?¹M³�Ç�¶�¹!Æ�Ï�µ?Í!È Ñ`â ¾ ã ä�åQæ�çØè�é]è�ê çzä�ç`ëíìWîðï�ñ�ò�óMô nich sa prispôsobujú potrebám jednotlivých

laboratórií samotnými „génovými manipulátormi“, prípadne sa na základe praktickýchõ�ö]÷¥õ.ø�ù�ú1õ�û#ü�ý.þzø�ÿ�ùlúWÿ�������þ#÷�� ��QøOûoú� ����ú����Oû�����ù�ø���������ø�ù����Úý�� ����!��Nþ�÷®ù��Qø�ö]û#ú���"Úý�#!ö� �Nÿ�ù$"&%�ú1õ�û'��%�(%�ú�ÿ�)*�+%�,���ú�ÿ]ù�ø�þ-%��.ü.�/�0�!ö�( Maniatis a kol.: Molecular 1 2 354�6 4�7�8�9�:�3�;�<>=�?A@�6CB$=�:�3�@�4�DFEG3IH�6 JK6 9�3$L5B 4�<a doplnené o praktické skúsenosti získané v laboratóriách Ústavu fyziológie hospodárskych

zvierat SAV a katedry Biochémie Prírodovedeckej fakulty UPJŠ v Košiciach.MON P�Q�R�S T�UWVXN�T�YIZ\[�S R�]^R�_�R�NK`badcfehg�Ui[�V�] R�jlk�Y�_'m$P^Q�_nYpo�V�]qT�_�S P�T�m�P QrP�g�S�s�N R�t [�UuZv] wxS

y�z|{K}�~0��� � �����G���/�����G���n����� �����d���K� � ���n� � �x�������+�^� �������n�������.������� �F�|��� �v���^��������������� � �����+�I�5� ��� ����� �pracovných postupov prispeje k �� �¡/�5¢5£�¤q¥�¦�§�£X¤ ¨ ©ª¥�¤K«*¬�¤K«v­�£�¤ ®I¯/¡n°*��  ¢²±³¤�¡n´I®�°�µ�¶b­�¢$§�·�¸C�5° ¥�¹�µ ¶v ±G¢I©�¤�º�§0© ¢5�5¤K«»�¦ ¢�© ´5¼�¦x¦0°²��½ »�§0®�¸f¦�µ ¶\½�¨*§ «¾¤ ±¿¢À¶�©.»�¬K¦�¤\¬/¡'Á0®�¦�§0±�±v¤�¡n´�®\¼�Â�¥�¢���Â�¶$¢À¦ ¥�·�¦ ¥�¦x¤q£�¯�¡'��°�Ã

Kolektív autorov

Page 4: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

2

2. Kultivácia a uchovávanie bakteriálnych buniek E. coli

Mikrobiálne laboratórne techniky, ktoré sú nevyhnutné pri molekulovom klonovaní súÄ�Å Æ Ç*ÈKÉ.Ê�Ë�ÅÍÌ�Å Î�Ë�Ï�Î�Ð0Ñ Ò�ÓGÇ\Ë�Å ÔvÇ^Æ�Õ×Ö�ØÙÖ�Ø�ÚGÛ�ÄXÏ$Ö�Æ�Ó ÔGÏIÔuÛ�ÄÜÕÝÎ�ÏIÎ�ÄnÞ�ÕCÇ�Ê5Ç Ë�É-ß�à�á�ÆxÇ�Î5Ë�â5Ñ^ÒAß�à�ãXÇ ÎäÛ�Ä�à�Ñ ÅåãXÏsterilnými materiálmi.

Bakteriálne bunky, vrátane Escherichia coli, æGç�è�é æféëê�ì�í.ê�ì�î�ï�í.ðòñ�ó0ô�õníCï0ö�÷^íCø$óùï tekutých alebo na tuhých rastových médiách.

Kultivácia v tekutých médiach:

ú+û5ü ý�þ ÿ���� �������� ��������������������������� �!��#"%$'&#��() *��+��,�.-���$,���0/1(32'4�-���(,5����,�6�.�����7��8$���9���:�;,(=<>:�2*�6��?@ ���)()�"BA�����<C� D)E�FHG�I�J,K�L�G�MON�P�K7G�Q8R�S�T�Q6IUEWV�G�P�J,D,EXJ,Y#IZR,[�\]P_^�D `�a�b�c,d6bXe�f1g7h�dia1bkjlc)m�n,`po%m�q,drbBsutv`3jkb]wstatickej kultivácie, hustota bakteriálnych buniek stúpa dovtedy, kým koncentrácia buniekc)x�q,`�w�d6b�n,c,xyw�h�f�z�x�{|c�b]w�}�h�x�c,drbk~�a|h�`,oHh�`�jkb]w�x�q�`���n)��q���b e �kc,�8��x�c,d8f���})��n,g�`�wh�d�q

elenia

bakteriálnych buniek, ktoré však nie je sprevádzané stratou vitality. Pri statickej kultivácii

rastú baktérie vz,��`�wh���xkq���~=e�h�`���m�n,`�a�g�b�wh�c)`�w�h�d�bW��g�`,��x�c,d6x�w�bpo%x�c,��a ����a�d�w�gi`�wh�d�c,b���d8a�`�h�c,x��

j�d�c,c,`�wh�d,��b�e�h�x���di�lg�c,����n���f1c,d6x�e�~3z,��d�j�`3o�o�c)`*�lxlc,d6x���f1c,d6x�e�c�xloC�trvale vzostupnú tendenciu, ale

prebieha v charakteristických fázach vzostupu a poklesu (Obr. 2.1.).

Obr. 2.1. Rastová krivka baktérií v ���1�7�� 8¡1¢�£�¤,¥3¦§¦C¨�©, 8�vª a-fáza prispôsobovania, lag fáza; b-

fáza zrýchleného rastu; c-fáza exponenciálna; d-fáza spomalenia, stacionárna fáza; e-fáza

poklesu rastu, odumierania alebo neskorá stacionárna fáza ( «�¬,­�®«�¬,­�¯�°�±7²�³�´'µ�¶�¬�·Z²�´%¸�´�¹,±6º�»�¹,¯¼³�«»�´1«7²�±i½*¯�·�¹,¾�¿,¬=³>¾�À*±6¯�Á�³%Â*ÃlºÄ¸,Å�Æ Ç�È�ÉBÊ�È�Ë,Ì�Ç�Í%Î,Ï�Ð�Ñ�Ò�Ó�Î�ÔCÉ]Ô'Õ�Ð�Î]Ð�Î�ÔpÖ�È�Ó�Ð�Ì�Ê�Ñ�×�Ø�Ç�Ì�ÙÚÓ�Ô1Ø7Ð�Û�Ê�Ü%Ý�Þàß�á

Page 5: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

3

â_ã�äZå�æ*ç�ä�è1é�äZå�ê,ëíìBî�ïBê*ë*ðñè,ã�ò�å�ó�ï,ä�ôCäZå�ó�ì�æ3õ�ö6÷�ê,ø�÷�ùûú,ã�æ3ü]î�ê�å�æ�è�ðþýkæ�ÿå�òZè*ó���� ú�æ���ó�ÿ%÷�ä�õ�ä��Cü,æ)ì,ëkultivácie v uzavretom prostredí, je systém baktérie-prostredie charakterizovaný ako uzavretý.

Faktory limitujúce rast sú tu podmienené zmenami prostredia, vyvolanými samotnými��� ������������������������! "�$#!�%�����&�('")*��+! "�$+",!-��.��#!�� "�/�$0��1+!2� 3�( 4�5'6��7"�����"�5 "�*�odpadných produktov.

8$9: '")�7<;�= ���>;���? ���. ? ���A@ ��� ��������B�)� !��@ ?C)D��E!��, @F� "��@�+!'!7�� 4��@HG��*� �����> 4������ 4B�+��=I!J I K!L�M�N�O"P/Q R"S�I"M�T*L�UWV!I�X�N>YZU [!\D]�T1R!^�_�T/L`N`QaL�M�N5O"P�QbIV ]�T&_�U!L�ced>[fY�]�I>]�gWh optical density, OD) priR!\�O"I"R!L�ciJ j k�l!mon"p"prq"satZu"v�mwu"v�m>x�q"yzs3m�v�{�q"|*{rx�{w}f~�{�l�}��4k�{��>���FmrxA��{.q"� }!m�q"|*m�u!�!�%��� }�}!|D������q �!���buniek odpovedajúcich nameranej OD600. � q4�k x���}!��� �!q"|*m�l�} bakteriálnej kultúre sa

stanovuje vysiatím presného objemu vzorky, získanej desatinným riedením pôvodnej

bakteriálnej kultúry, na {��!{�v�� }!yau���{H��q"m �����!��m���k�|1}"�!�����!{.l ��m�v�|*����q"�!���`� �Cq"|*m�lWq"{�sa��u!� }!�!� q"y��4�l �C�D��|&}{���q"y��"��s�y��|*{�x�{�u!�>���"s }"�"u!�!���D��{�q"{�����l!�/{��"m saq"�"k"xA��}{z��m��"q"� ����|&}!�!���¡�!{�l ��m�v�|�����q"�!���l!�"��¢"q"|/�"����x�l!{5q ����eu"v�|�q4{���q!|�k ~���s�v�|�m��"m5q"���

Monitorovaním rastu bakteriálnych buniek pomocou OD600sa�"k�m�s3m£���¤xA�¥v��H��|1¦�v�{>xA��� } §

l"v�|1}"l �Ct¨l>���"v��©q"��s u!�<x�l �>������m�§C�"{��ªm«��¬­�4�>|&�����"��|*��l!�"s®x���{�}mw�"{�q!y��4�¯�{�l ��m�v�|&�5��q!m��"�rl!sam�°"{©} ���H}!|­xª���¤xA��|eq!{r��{�x�mr±A����x�l!{�q4y�§C�"{��Fm�xA§²}"� �!k�|D��m ³%´4µr¶"·¹¸a¶"·�º1¶"·�»�¼½¿¾!À"Áe¶C½%Â�½�´�Â�´ Ã!Ä�ÅÇÆ ÈC´"¸*½�¾!É ¶"·�¸stanovení produkcie biologicky aktívnych látok, enzýmov, sekundárnych metabolitov, pri

sledovaní bakteriostatického alebo Æ!»�¾ Â�½�·�¸�À!Ä�º�Ê"´"½�Å"ÀeËCÌ�¸�´ ¾ ÈÍ·�ÎÏ�´ Ð"Ä�ÅaÑ*Ò%Â�À"¾"ÓFÔÕ ·�½%¼4Ï�Ê>ÈfÖ�×"À ¼!»�´"¸*½ Æ»�¾ Â�½�·�¸*Ò�Ñ�´!½�Øz¾ ÈCÑDÂ�Ë!·�С¶!À!Ì�»>Ù�·�»>Ù�Â�È�¼ ¾>È!ÑDÂ�¸1¼!»�Ì�´4½�د´!Ò�Ê"À4ƽڴ!»�Ø�Ñ/½.¶ÛÖ�¸*½

Ï�»HÆC½�Ï�¶!½�Ì�º/Á3½Ü¸�´�Â�½5´6Ï�º&¼!´"Ð"Á²Â�·�½�¶!»�´"º*ÁÚ¾ ÈCÑDÂ�¸&¼C»�Ì5´4µ�Å"À`Á�µ�ʸ*»�ɤ¶"·�¸�Ì�À�ÁÝÀ4Æ.Ø�½�Á¡¾ ÈCÑDÂ�¸1¼»>Ì�´4½�ب´4Ò�Ê"À4Æ"Ð`Æ"ÐÁ3»�ÑÆ"Ð6Þ ß�à�á!à/ß3â�ã�á!äÜå�æAç6è�à1é"è�âHæÛêë�ì å�í!î�é!ï$ð�äZï ñ.ð�ä�ß�ß3ò�ó"à/î6ô

õZöC÷Dø�ù1úCû�ü�ý4þ ÿ3þ � ù*û����¹ù�����û�ú ö���ÿ�©ý!û�ú �����ý��*ÿ��� � ý��>ø�÷1ù�ú � ������÷����>ù���¯û�÷��� �!���"ÿ"�!÷��#!ý!þ����média. Po rozpustení komponentov vo vode a úprave na príslušné pH sa médium sterilizuje$�%'&)(+*,$�-�.�(+* /�/�021�34/65 7 8 C v 9;:�<>=�?�@�A�BDCFE = G�9IHKJ�LNMPO Q!RTS�UIV�<�WYX[Z�\ S�A�RT]�^�:_=�`DH'9�a�=bB 96c[=�?�d'C�Re A,?f@�9�\ Ubg hiaj? =fR"E =�U�C�UI<+=bBk9ml e @n= ^�?�ojU C�B�o�a�Ub:�<>U�ZpE�d'C E�d+= E 9,q A�h�Sr: genotypových vlastností

?b:D@r<+SnB =�B 9�U�Z�a�="` 9�?b<+C�d+S�A�@sU C�a�=t? RTC�u�9wvPU 9�E�dxWb9�U�<>Sy` S�=�<>S�? A�zxW{ S�C,?b<+= d'Z ?�=�R"E =�U�C�UI<>o l�C E =I<>d|C;`�U�Z H><+C�d'Ss@�S e =�B 9;c H|9�R}=~HP<+9<>U�C vP�>S�@r<>d|A�h�S�=�: 9�@�C�` =�;����� ���n��� ��� �������T�'�"���4�b� �r�m�y� �������������T���������|�2���'������� �'�m�����[� �F�'������� �������������������  ~¡N¢£¡N¤ ¥ C(glukóza, sacharóza, antibiotiká, MgCl2, CaCl2

�¦�§�y� �,�'�¨���m�y�D�������©���'�����T�p���'���ª�����f��� �b� �,�����« �~������� « ���b�+���+������� �����T���T��¬��w­ inokuláciou).®�¯�°�±�² ±i²�³§¯b´D°rµ+¶y· ¸�¹�²�³º²�»�¼�½b¾�¿ ÀYÁ ¶yÁ ±;µ>¿�ÀÃÂ+¯bÄ~Å�¸�·�¯�¿�À

Petriho misky a odmerné valce saÆbÇ�È�É�ÊmË£Ì Í�Î>Ï+Í�Ð'Ñ�Ò�Ñ�Ó�Ô�Ë|Õ×Ö�Æ ÐPÕDØ�Ñ�Ù Ú Ó�ÛIÔDØ�Ö�ÆfÙ Ó�Ê�Ç ÊiÒ�Í�Ì�Ü�Û�ÆÝÖ�Ò�ÑsÌ Þ�ß Æ�Ú ÍmËáà>âfÒ�Ñ�Í�ã�Ö�ÆfÛ~ä}åNÐmÑ[æ�çNè é C.

V ÎPÕDÉ�ÊIÎ'Ì�ÆêÎ>ÏmÑ~Î|Ê)Ú Æ"Ú ë�Ébì'Ñ�Ì ÍíÒnÊ�Ç Æ Ð|Ê;Ï>â�ÐmÑ�Þ�å Æ�Ô î�ÞyÚ ÊmËmÕïåfÑyå Í6ÏPÈ�ð~ÎmßbÕDÙTÊ�Ú�ß�È�Ê Petriho misky z plastov,ßbÏ�Æ Ð'ÜwÎ'ÊwÛNÆfÛ�ñ;Ú ÊmË|ÕºÎ>Ï+Í�ÐmÑ�Ò�Ì ÜÃå�УÑnÊiÙòÆ}Æ ÛóÚ�ôNÐ'ÆbÇ Ø6Ô©ÊõÎ>Õ�Ì�ÊöËÍ�Û Ì�Ætå ÆbÔ î�ÑrÏ>Ñ�Íbä

Page 6: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

4

÷ùø�úbû�ü+ýíþòý�ÿ��������"þ���û�� ���� ����������óû������������������� "!$# ú��%��ø&%Iü' ��(����%�ý�)*� |ø�ÿ+����û�,�rü'-�þ.�����len rozriedime v primeranom objeme sterilnej destilovanej vody. Uzavreté, sterilné médiaþ��,%��ÿ(/0���fÿ�(1��2�mú/3��ÿ�������4� ���5/���ÿ%��6�ú ø"��/�ø�1��tú ��ü�7�� û©ÿ�(1bû8�� 9� ��5/���1�� ��;ü;:( �%�ø� ü+ø���/3�bü+ø$<

Po inokulácii do rastového média, vytemperovaného na laboratórnu teplotu,

bakteriálne bunky kultivujeme v termostate bez trepania alebo vo vodnej, prípadne v=?>�@A�B�C�D,E$FHG�I�>�JK='L�>�@�M�N�O�>P@L�Q8RS T

C s regulovanou intenzitou trepania. Na inokuláciu saB(UV�N�M�JWI�>X@�B�F�Y,Z[C�M\IB�N�I�]^U�M�O(=?>�L�Q�]�A3I�M_O(F�A`=ba�L�McC

objeme 1/100 z pripravovanej bakteriálnej

kultúry alebo jedna kolónia (single colony) z agarovej platne, ktorá sa odoberie so sterilnouU�M�O(=?>�L�Q3B5A3Bd�Q3e�O�B(FfO�gWF�N�O�B(Fihkj�M�l�Bnmo=?Mp='I$aqU�M�O(=?>�L�Q�]rA3I(FfO�B�A3s�IQ[Ftm�Qu@L�Q[@L�M�C�Zvl�>wC�Q�M�e�I](m�B(U�I(x�lrozterom vzorky na agarovej platni (Obr. 2.2.) a následnou kultiváciou v termostate.y L�>zE{B|m?Q3M�}I$F=?Q3>zEB(UL�x�e�}_O(F�A`=?Q�C�M�NrI(x�e�}_Cxnm�A�>�E(O�B(C~m�MkB�E(@�B(Loa�N�M @{L�Q[@L�M�C�B(C�M��cN�>�Lpm'=bC��tekuté rastové médiá.�����(�?�����3���3�����{�n�{�������������������[�r�5�3�,���`�2�"���~�$�b�?�n�������

tekutého média centrifugáciou� ���?��������������(�n�����[ ��������(¡¢�£���(��¤��¥�¦r�r���\�������¦,�`�?�c {�(��¦$�[§¨��� � �¦,��©�( ������cª����r�[�«��������������¬����¬��� ���§¢  �,�������{�����­�o�?�� ��"�&¦®©�8� � �������( ��&��v�{¡

Obr. 2.2. Postup pri izolácii jednotlivých bakteriálnych kolónií (single colonies).

1-prvý rozter, 2-druhý rozter, 3-tretí rozter, 4, 5, .... ¯ � �c���&¦,©��� roztere sterili zujte���&�(�?�����3�5�3�°5�����(ªX��±W�����(�k  plameni). Opakovaným rozterom a následnou sterili záciou���&�(�?�����3�5�3�°5��������²9�n±W������³©�|������¬������¢���3��©������´���&�(�?�����3�n�&¦P���µ²���©��(�'�3�[ ����{�n�{����¶5�(�'����· 

termostate dorastú na samostatné kolónie.

Sterilizujte¸ ¹ º¼»b½pº¿¾|ÀÂÁÄÃoÅ9Æ'ÇpÈ Sterilizujte½ÂÉvº¼»b½pº¿¾|ÀÂÁÄÃoÅ9Æ'ÇpÈ

21

3

Page 7: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

5

Kultivácia na tuhých agarových médiách:

Tuhé pôdy vhodné na kultiváciu v bakteriologických Petriho miskách obsahujú okrem

základných komponentov aj 15 g Bakto-agaru na liter média, na prípravu vrchnej agarovej

pôdy (soft agar ÊÌË�Í�έϤÐ(ÑbËbÒ�Ó¿Ô�ÕÖ¼×PØÔ$Ù'ÚÛÍ�ÜÝ­Þ³ß�à,Í�Þ�Í~ÕÔâá?ØÔ�Õ(Îã�ä�Ôå×�Ë3Í�Ü�Ô­æÚ�ç&äÎã�äÔ agaru

ØÚ�è3Õé�æ�×¼êëÔ�ìÚ�Í&Þq×�Î$Ù?è[Ü�è3Ô(Ù�í[ìî×�ï�á'ð5Üiá'Ù'Ú�éÂÙbÝÌæ�ä�Ô5Õ(Î�ã+Î�×ñáoÙ?×�Î�Ô�æ�Í�ÎèvÍ�Í�ò�ØÚ�Í(á�èvÍ�Ú�Í�ì�ÔÞ³Ü�è3Î�×�Î$Ù'Î�Í�ï³ó�ôöõvo forme enzýmovej aktivity v jednotlivých bakteriálnych klonoch (napr. nerozpustný škrob,

lichenan, chromogénnu celulózu alebo xylan) alebo iné substráty vhodné na primárnu

selekciu.÷¼ø�ù�ú�û�ü'ý3þ[ÿ�����û�����û�ú�ørú,ü��öú���ÿ� ��,ø�ú��®ú������Wþ�������ÿ�û(ÿ���ú��8û�����ø�������ùþ������û� ��"!$#bü&%'��ø�ÿ�û�ÿ�û�ùø�upravíme s hydroxidom sodným na pH 7,5 a sterilizujeme v autokláve alebo inej tlakovej

nádobe.

Po sterilizácii a ochladení na 55( C a po pridaní termolabilných komponentov (napr.

antibiotík) sa agarová pôda vylieva priamo z )&* �"+�ø®ùû,#;ü?ø���þ3ý0ú���-�.���þ/#�þ�ø���ÿ �öú�û�� stve asi 25-30��ý�ú��,��þ0#��"!1#2���Wþ�ø3��ø��Ûû�� 4�5768�9�9:��ùø;#��ñúø�-3.� ÿ"��-�.�ý<��ù�ú>=�?Ìùû@#oü/!�.{ú�!ü'þ<�agaru. Agarové��ýA��ü'ú�øB��ø� C��ú,ü'þD��þ�û�üE%F�;��û��,úû,���Ûø�ùG��û�!���þ`ü&%A�H!I-�.û(ÿ� �ÿI��?9.�û��Ûø�ù(ú�û��J����þHý<����û�����ü0K"��úø8�£ü?ø��5ý�û�ü?ø;L�6M

ù(úþA������N#��®û�ù�#oü&�� �úþ3ý<�¢ÿ�ý'.���ûO#?2 povrchu platne. Dlhodobo ich mo

��ú�ûP!$#8��ýA��ù�Qû(ÿ���?"ÿ obrátenej

polohe v plastikovej fóli i pri teplote 5( C v-�.ýA��ùúþ�R���øTS8��ú$ü'þF��þ3û(ü?þA-����U��ý��¼ü'úøV���W#X�zú�ø3����ývþ

!$#E�5ý<��ù�Qû(ÿ��Y?� >��-�.ý���ù�!kùýA.O+�þ�øN����û ü/�"�rùø3Q Z\[^]`_�acbd/e�fVg"aEhFg�a�i�e�_�j�kagarové platne alebo platne z

l�m�n i�o�j�h<p�q�r,s�rtbuiPv�i n h^g�a�_�oNg�f�w�x�hyd8zAv{p3h<i�b&dEf�p�j�_|g�a�_�b&w$}�hD~PiBj�i m a�h<iY~9e dE_�a8v9fObdEicdE_Bj�iPq"w n d&hFeIi�p�j��teplotu (Pozor na presušenie!!! ). Petriho misky s

i3��i�a�f�e���vCh�g���o�i�v9h9b�i g�f�j�i�f�p�q�f"e�i�j�zg�a�z�b n w$}�j�k m f�s�i�q"dE_�aEhA� n j�_ m f�q�v�_���i�g�f�v9f l f�w�b/dE_�a8h n j�_��sIi�q"dE_�a8hAf n f���h l q�_8� q���wIp�q�r�q"w n dEhFe�w��8�v obrátenej polohe (hore dnom) pri 37� C v teplovzdušnom termostate.

�I�����$�$�����u�����$���O�O�'�u D¡I��¢���£I¤�¥ ¦, <�c �§>� ¨�© ¦ª�"�<�«¨�© ¬ ­�®3¯I°²±�³3´�µ�¶�·�´$¸º¹$¯�µ�»Y±�¼½�¾$¿cÀ�Á$Â"Ã�Ä$Å�Æ<ÇVÈÊÉ$Ë�Â$Á�ǪÌ�É$Æ�À�Í;ÎI½�Ï�Å�Ð�ÏOÑ�Ë�Ò�Å�Æ�Â�À�ÏOÑ�Æ<¾�Æ<½"Ñ8Æ<ÎOÀ�ÍtÏ$Ò�Ó>½�Ô�¾$À�Î�Ñ�Ð�Ë�Æ<Ò�Õ<Ï$Ð�Á$½ÖÎ$Ç,Ð ×$ØÖØÙ$Ú"Û�Ü$ÝßÞ3à�á�â<à"Û�ãOܪãOÜ�äAÛ�âFåIÚ�æ�â�ç�è

Po kultivácii individuálnych bakteriálnych kolónií é�ê�ë>ê�ì/é�ícì/î�ï�ðòñ�óTô�õ�ö�÷�øFù ú�ûAê�ï�ð�ùü�ýAþYÿ������0ÿ����>ÿ��Wü��0ÿ ��ü�uþ ü����������þ��"ÿ������������ � �����! #"$���%�'&$(*)#��&�+��-,�. / 0�13254�687#9�:�6�1�7 tekutých;%<�=>@?�A�B!C�DFE�G#HJIKL>MNB OQP�RS�T#P$UV3W�X#Y-Z5[�V�T�U�\�]�^ klonov po prenose z „master plate“) bakteriálne

bunky zmyjeme s _ P�`ba _c_ U�X#de�[ T�X _ ef[�gihjZb`bU�k�^ o fyziologického roztoku a koncentrujeme ich

centrifugáciou.

Page 8: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

6

lnmFo-piq�r�sFqutwvyxiz vyx{t�|�t~}���� �����Q�b���F�����i������ ���-������@�������������������������y�Q�u�$�� ���@���� ��@�u¡u¢ *��F�:

£%¤¦¥b§5¨�©�ª�«©-¬f¨�§b¥b­#®#¤$¯�©L°±®�­�«�²�¯�¤�®�³�´-§@µ¶©�·

Bacto-trypton (peptón) 10 g

Bacto-yeast extract 5 g

NaCl 10 g

Bacto agar 15 g (pri príprave tuhej pôdy)

pH 7,5 upravíme s hydroxidom sodným

¸º¹�»�¼¾½�¿�À¶Á�Â�Ã�ÄÆÅ#Ç�ÈÉ»�ÊÌË�Í8Å�Í8½�Ë�Î�ÏÑÐ�½#Ò�Ê�½ÓË�ÍbÇiÒÔÁ¼jÍÕÁ¼¾»�¿�½�¿�»×ÖØýÙÈ-ÚÌÛܽ�ÅÄ�ÝyÛfË�Ç�¼�Í�ÞbÊ�Ƕß�È-»�¿¼¾ÇQË�Àà¿#½á�â ã�ä¾åFã*æ$ç%åbæ�çcèébçê�èê�ë#êÓì�íébã�èÌî*ï{ð�ñ%ðóòô¾å�é@ã*ë#ê#ôÜãöõø÷#ôLù�ðfïyõ�ð�òébê�õ�ð�ã�ébð�ë#êàúØæ�çé@ãÌèùå@û�í�ð�ü�ýnô¾ð�è¶ò�ê�î�þ�åÿõ��bñich rozvaríme pri teplote 100� C vo vodnom kúpeli alebo v mikrovlnnej rúre a po ochladení na

primeranú teplotu a pridaní termolabilných sterilných komponentov ich vylievame do������� ����������������������� �Podobným spôsobom sa pripravujú tekuté a tuhé agarové pôdy aj na kultiváciu iných

!#"%$'&)('(�&�*�+-,'"/.0!�(�1 2#3'$546+87:9�+<;�=�7','(�>?4%"/1'@�ACBD$�(�!FE�(�,:=�,G>�(�1HE�I�7D(:9'J:K�+�;L,�=NMPO�1�"�M�Q M rastovýmiR�S'T�U6V�W'V�X:YZV�[�U\W'V�]:^C_:Sa`�V�Y�b�c�dLU6e�f6]�cC_:SgW�dPh�_0hji

Antibiotiká:

Roztoky antibiotík, pripravujeme ako zásobné sterilné roztoky, ktoré uchovávame

zmrazené pri -20k C a na pracovnú koncentráciu ich nariedime tesne pred pridaním doY�h�fb�U X�V�l�]'^�_'Sg[a^�W�U�V�i

monqp�r�s�rutuv6wyx)z{p�|:}�~8v ��z{��|��?|��Ln���x)|5��w:�)��xL|5t6r��L|'��p�} xP���-w'���q��|���|��'�����C�GxL|��'w����L|��-�?|'�yxLzpripravuje v koncentrácii 25 mg/ml, pracovná koncentrácia je 50-100 � g/ml ��������/�������'���:�média.

Chloramfenikol je rozpustný v 100% etanole, zásobný roztok sa pripravuje

v koncentrácii 34 mg/ml, pracovná koncentrácia predstavuje 10-25 � g/ml ���Z� ���/�������'���:�média.

Kanamycín sulfát je rozpustný vo vode, zásobný roztok sa pripravuje v koncentrácii

25 mg/ml, pracovná koncentrácia sa upravuje na 50 � g/ml �������� ���8�C�:���'�q¡#��¢'����£Tetracyklín hydrochlorid je rozpustný v zmesi etanol/voda (50% v/v), zásobný roztok

sa pripravuje v koncentrácii 12,5 mg/ml a uchováva sa v tme ( ¤C� ���6�/���Z¥ ¦ na svetlo), pracovná

Page 9: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

7

koncentrácia §�¨'©�ª�«�¬L­�® predstavuje 12,5-15 ¯ g/ml °�±Z² ³�´/µ�«�ª�­�¶�·'§¹¸�¶�º'´�«�» Tetracyklínové

«�¼�«-½L§:µ�¶¿¾5² «À³?­'®�³?½L®Á¨�«�±�Â�·:§:µ�Ã8µ�«�Ä¿µ tme pri teplote 5Å C.

ÆÈÇ�É�Ê'Ë�Ì�Ë�Í'Î�Ï�пÍgÑ�Ò�Ó0Ô%Í'Õ Ö ×'Ø-Ù'Ú�ÛuÜÞÝGÙ'ßáà%Ü-âÁÛ%ã�ä6ÚÁå æ�çHß0è'äéà6ê�â:

ëíì�î�ï�ð�ñ�ò óCô6õ�ð\î�ö�ô6÷'õ'ò�ðgø�ù'ú0ð�øgðgõ:ì ì�û�ì-ñLö:ü'ý�þ�ÿ���ô6ìÀï?õ'ò�ì�þ�ÿ���þCÿ:ö:ü�ó�ü�ì�� ì�� õ'ò�ð�î�ö ���� ������ �����v �������� �!�"�#�$&%('*)��+�-,.!�%�/102��$4365872"���9�:�;</ =�>�?2@-ACB�D�BFEHG�=JI+=�K�B�LNMPOQ>�B�M(G�B�R�B�D�S�G�?2B�TVU�W1X2Y�K�D[Z�AC\+]�^`_a=T�=�>�ZbEcB�TdDeS�K�=fO�ghT[Ud=JY�KiA�j�g�T�k�=�U ]ml�g�B�]mBnU Y�K�I�O�T�D�opRrq�BsZ1Y�K�=�U�@�U�O�tuOFEVACB�q�Z�ACSv>dO�q�ACB�?Fo+@�I+D�Bkultúry s R�o�O�XwAC=�R�D�=�ZxX�A.?2OyAz=eZ4U�o{ACOPI+o|A.W1^}_~?2B�T�I�K��2o�B�XCqJI�O T�=�U1O�D�o�B�>dO�q�ACB�?2o+@�I+DdWdY�K4qJ]�B�k�=�U�]�ldg�B�]�BG�?2o�G�?2O-U�o�t O���Or?2=eUdS�U�G�o�YPKe=eUdS�q�=�D�M�Br?�U�WeL`q�Az=d?2S�X2O�Z1T�?FgrZrEw��U tme pri laboratórnej teplote alebo

v �����������������&���8�����������2�+�����1�������� P���w���¢¡d����£C���F��¤��+�������¢��¥1�|£�¦��2§n��£.���2��¥1�r������¤�����¨��ª©��2�`£C��©��+��£C��«w¬�­®�¯H°C±�² ³ ´¶µ6·m¸�¹�ºe¸�»F¼�½+¾�¿�¸�À1¾QÁ¾�Ãĺ�Å�Æ�¼�¸�Ǽ�¸�ÈC¸d¼e¸eÀÊÉ

ËÍÌ�Î�Ï�Ð�ÑyÒ�Ó�Ô+Õ�Ð Î(Ö6Ð�Õ�Ð�×ÍØ<Ù�Ú�Ô�ÒÜÛÍÚ�Ý�Þ�ß+à�Ì�Õ�á Õ�Ìklonovanie a selekciu plazmidových

vektorov zahrnutých do â ã8ä�å1â�æ�çéèê�ë[â�ìpärëFã8ä�å�ä�í�ì�î�ï�ð1ñ�ò

E. coli HB101: hybrid E. coli K-12 x E. coli ó�ô2õ¶ö1õ�÷�øeõÂù�ú�û�÷�ü�ýdþ�ø�ÿ recipient s dobrými

ý�ÿ�� � õ�����þ���ù�� ����2þ�ø�� �.ú�� �������<þ����ú � ������ù � þ�������ú�ý������.ú�� øeõQý�!�÷�þ��[û�ô#" $ -komplementáciu.

Mutácia recA- v %'&)(*%'&,+�(-�.�/10�243�-�0�5�-�687�9:-;-�<�/�(�/=.�>�?4/@7A(&�BC.D&FE�%�/1G�&)(&�<�&�H�/�?4+�-#9 rekombinácie

klonovaného plazmidu s chromozomálnou DNA.

E. coli JM109: I -galaktozidáza negatívny JLK�M'N4O�M'PRQCMTS�UWVYX�Z[K�\�]^X�NYO�N`_ba�c�adQ�e�f@Krekombinantných plazmidov série pUC g -komplementáciu. Mutácia recA- h N�i�a h�j a�k8K�l:aa�c�f�J�f=O�m�e�f@KnJS�\CODSF_�M�fLo�S�JS)c�S�p)f^e4Q�a#l rekombinácie, mutácia endA- v endodeoxyribonukleázeh X�Z�q#K�l:a*Q�X�N�c�frMsKtN*X�V�u v4w�x�y{z�|�x�}^xD~�v����#�1��}�vd|C��z���xD~��b�1����������������:����z^�4w��DxF� zr�'��� �)���1���4�������)�*����  *¡#¢D£C¤'¥4¦d§�¨4¢�¤'©���ª�«4¦�¬�«­¤#®^¨4¯�°�¨4¯¯�«�£�±�ª�®�¯�©�²�³W��®=ª�®@´ µ�¯�¤'©�� ¥¶§�¬·©�¸�¹�§�º#»¼®=£�½' �¯�¨�®^§¾[§¿£�®� 4¯�½#±4À�¬®�Á

E. coli ÂÄÃÆÅdÇ�ÈÊÉDËFÌ�Í�ÎrÍ'Ï�Ð4Ì'Ñ�ÒÓÑ�Ô�Ï�Õ Ö�×bØÚÙ�Û�ÜrÝ�Þ@ß�à�á�Þ@ÛâÖ)Ü�ãdä�å�Þ�æ�ç�ßèÖ�é�êWë�ì�íîã{Ö�é�êWë�ìdï¿ðñéLå�Ø�òobsahuje mutáciu gyrA ó�ô�õ�ö�÷�øTù�ú ûýü�þ­ÿ��4ü����������� ú�4ü��� Wø�������������ù����� ��úWø��^þ�������� killer“ aktivite

produktu ccd génu kódovaného plazmidmi série pKIL.

Page 10: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

8

3. Izolácia chromozómovej DNA

�� �!#"%$�&�')(+*�,�-�").�!0/#1�&�23-5476.�"98%*3:7(�;=<�8?>@.�A0 �'?*�(�B:�!0,�C�8�/5(�*�.�BED').�:�!F6=;�,�:04G/ biochemickom

výskume. S<!# �/5!�B!�>IH�J�*#!0/�J�2#!K'%*0C�'%*�'9.L<6M;�/5(

sa tieto postupy podrobnejšie rozpracovali so

špecifickým zameraním na jednotlivé druhy nukleových kyselín. Nukleové kyseliny sa

vC�'N/�1�&�2K!#<�H�(�*#'% �>O!�&�2K*#.�/#4P6-#4�;�,�B�Q3/�!�R*�J�ST/#1�*�')>U-0,3;�/5!5<�'�(�VW'�(�6=;�!�VL*#.

tRNA), ale vo forme

komplexov s X ').�"%-�!�/�'%*�(�>Y'%Z#-0;�!0<J[6=Q\V�(�6M;T!]/5.�RE>U'^6M;�( X '9"%*�J0_Základným problémom pri izolácii nukleových kyselín je práve odstránenie proteínov

a polysacharidov takým spôsobom, aby sa neporušila primárna a sekundárna štruktúra`�a�b�c)d�e0f#g�h�ijb#kPl�d�c9m%`^nporqdEs�t+u�v#w#qt�u�`#x�y z?{�|+}#~�L���=�%���#����|�|������=�����|K�)�#|����%���G�@|������#� na riešenie

uvedeného problému. Preto ����#��}#~�����0�����)�����)����|�~���%�����%��������}��F������}0��z��0�=�#~�+�M�3�#�����0����}#~|jednotlivé druhy nukleových kyselín (tRNA, mRNA, chromozómovej DNA, plazmidová

DNA, mtDNA).

Pri izolácii nukleových kyselín je v }#~M�5����~���#|�}��0�)~�|E�#�����#����� �#�N���0�7�0���0�# ¡���7����~�#�L~M�^¢|��#£)� ���P�������7|����M��|��0� ���%�#{�|���|��¤}#~|�����{��#| �¥}����¦�7�§��������~�%�#��� � cytoplazmatickej

membrány tvorenej fosfolipidmi a bielkovinami. V }#~�%���W£%}7|U�|��¨�5{ ��� �#���5���#�¦�©�#|�ª#~���#���W�N�bunkovej steny pôsobením rôznych fyzikálno-chemických a enzymatických metód.

Fyzikálnymi metódami sú napríklad: mechanické drvenie a trenie buniek, opakované

zmrazovanie a rozmrazovanie buniek, �#�����7��|��#�)|��P�¦�=~������0�����#�¥«M}#~�¬�%�����������9���W�­�������)|��0�# �����#���§|W�%£%�U�7¢§���Y�¨®5{�|��#���������0����� k ich degradácii).¯ ��|��U�)���0�©�#|�ª#~����#�����N���0�7�0���0��|��O�M��|��0�¨�|\�O�#{��#�\�#�P��%���#�����\}��#�O�������°�#|±��|�~=ª�|��������©�����²=³µ´U¶#·�¶#¸�¹�º�»T²�¼7»%½�¾E¿�²·�¶0À0ÁÃÂÄ0Å\Ä#ÆÇ@ÈrÉ�ʦ¿�·5ÀÌË]Í�ÎLÏ#Ï0ÇYÐ�·5ÑO·�¹�·0¼Ã·5É�Ò�Ó�À#Ê%¹�Ô#Á�¹�ÕÌÉ·5Ö�Ð0³^×MØWÓ�¶5Ê)¸�»%Ç\Ô0¿�·0ÉÙÉ·#Ö�Ð0³^×=Ø�Ó�ÚM³3Ѩ·�»%¸�Ô0¼7»ÛºÜ»%ÊÛÐ�Ê)¶#·�Ý5Ù�Õ#·K¹�Õ�Ó�ÉÓ�Ô0¿�¸LÉM¼ÞÓ�Ô�·ß½=¸LÀ#·�»%Ç�¹�Õ#»%·#É·#½=·5ÉÑàÓW»�¸�á5·KÉ�·#Ö�¿=·#Ô#·0ÝÞ² rôznou

hodnotou pH a koncentráciou solí.Ũ¸�Ò#ÉÓ�¶#Ó�âLÀ0Áã³7â�Ê%À#·#ÔäÀ�ÓåÑO¸�Ñ?á�ɾ�À0º¤²ÓæÖ�Ý#ºP×=¼�Ú§¸æÐ�çF²�·�á5¸�À#è9Ñ ×�Ð�¸�¹�Ê%½�Ê)¹�Ô5Á5¹�Õé¸WÀ�Ö�Á�ÑO·5Ý^ê

ë Ó�Ú�Ð�·�¼�ì�èNÝ�Ó�À�¸�ÚE×Ê)¸+¸�À0Ö�Á�ÑOºí²=³�À�Ó�Ð#ÉèÛÔ�»)Ó�¶ß¼ baktérií lyzozým, u kvasiniek komplex enzýmov

z hepatopankreasu slimáka záhradného a u rastlín celulázy.îðï¨ñ�ò�óWôöõM÷�ø�ù�ú�û�ü0ýOô)þWÿ�û����þYý¨û���ÿ����0ñ7ÿ��û#÷ û����ï�ù ñ�5û� Eÿ#ô��Yú����û��þ�ÿ��%ý�������� ó�ô��=þ�ÿ#û��¦ñ��� þ�ÿ�õ�û ��ú��!��û�"�§þ?ü#û���õ�ï�ó�ñ#�%$7ø�ô ù��)ï&�ÿ�þ�ñ �0ñ�ÿ#ô)þ&�����0õ=û#òM÷�ý øWù0÷'�7ï[ú�û���(���ï�øWù�ï�òô%ü#û�)+*,�%û��-��ï+�0ñ7ÿ��û�þ.�steny napr. pri gramnegatívnych baktériách. Po narušení steny vzniknuté protoplasty��ïWý¨û��û� ÿ#þ¬ú#òï,�.��ï.�.$Yú�û��#ô%ï, ÿ#ô)þ+�%$ û!�ý¨û�õ=ô%ø/��(0�=õ�ï1��ô2�%ô3*�û�5ï�ÿ���

Zvyšky materiálu z bunkovej steny a 4�576,8:92;=<&>�?:;/>�@1ACBED�F�G3;&HIJGK< LNM�O�P7;-GQMJGR@&?:SB�P-TE6-<L%ANURPV ;+D�F�W,S�X=F�Y�Y�;/GZ9�[\P,;-S7AN?.93]CM�>�@-P-93FM�^+_E< V 4�5-678:9R;"`�?:F�O�GRX&D�Ba4�b7S�93H�< V I0`�?:9JF�Y�Y�;-cdF4�</S�UeO�93F�`�F�G�B�DEX&?:F4�f

Page 11: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

9

hlavne RNA a g�hRikj3l�mn�o3p�qrlstmu:vxw�y�z/{|g�}~�� ���a��n�hR�&�,�&p�v�n�i-��l���w���m��dsNm�w��:jR�&g����-��nJ�/�7hRi&gK��=���������-���2�������   ¡t¢&£�¤�¥-¦7¡t��¢&§�¨:�&§�©�¡N���ªJ�d¢&¦�«1ª-¬­�® -�¤J¯­�-���2�°�3±��������.¬�²:�R³Z´µ¨:�� /¡N��£ª�¢ rôzne¶�·1¸t·/¹.º�·&»7¸C¼¾½t¿�À�Á�·-»7Â�¸tÃ�Ä�¼JÅ�Å:ÆR·Ç=È=¶�½%¸N¹:É&»�·-»�Æ2·ËÊ�ÆR·-Ì3Í�À�Ä�Î�»Ï½­Ð�Ñ,Ð1ÊJ·&Ñ-¿�·#Ò1Â-Ó­·ËÊ ԵÕkÖ3×�ÖRØ�ÙRÚ-Û�Ö2Ü�ÝÞNß�à:á

ÛEÚ.â.ã¾Ø�ä&å�à:ß7Þtä/ÖZ×�Ö3æ'Ú-Õ-×ç|ãJÕ-Ö3×�ß�Ýéè.Ø�ä-×�Ú1ÞCê�à%ê/â%ã Ú æ-à:ë&ì,Ú.â%ã¾í�ÖRä-ÙZÝ�ßî�Ö3×ï�ð:Ü�×�Ú&å�àdñ+òNä-×�ß�Ù3Ü�ó&ô�Ù3ß�à:ß�òNß�à:Ûalebo degradáciou bielkovín na nízkomolekulárne podjednotky nešpecifickými proteázami,

napr. pronáza a õ�ö:÷7øtù&ú3û�ü&ýkþ ÿ � ������� þ���ù&û�þ1ø� �ö ü � ú3þ���úRù �� ÷����3û øtú3ù��¾û�þ/õ�÷���ü � þé÷����%øNö:ü/û�ù&û�úRùû�ù��,ú2þ���� � ú ��� ù&û�ý � � ÷�� ����� þ � ø.ú����Qø �! þ � øNúRù�� �#"%$ �'&�,ù(�)+*,��ù�-�ö:þ���÷+��þ-û�ü ö.&�ý-û+)��aú �#"0/ ü&ý'þ���ú21û�þ&õ�ö � �#"0/ ü&ý,÷+ 43 �65 ù&û�þ1ø� �ö.÷+��þ-û�7 þ�-�ö ù�-�ü1ø�)8�­þ ÷�õ�9:* ý��)�;7þ=<:û�ù ÷����NøCö:þ�>? �<@� � ù-û7øNö:ú�A2 �-�ü � ú3÷� �Nízkomolekulárne komponenty sú naopak rozpustné a û�þËöt÷�ýB�ú3ù ÷�� 5 "'$ � þ û�ù&ý-ö:ü��kþC<=�etanolom.D'EGF�H�I�J�KMLN.OQP�R�S�P�J+KTLN=U!U�V?J�EWR�X�U2U!I�K�P�EWO�J+HY�X�Z[P\^].O�EW_`Iba.OcL�J�d'OQN=I�OeH\f].JP�R(FQP+g@UGH�UhgiF(I�K�P�EWO�R�Vv bunkách. V

I�O�L�J�[email protected]�I�OCa'l+KfI+PfOma.O[H�n�o+j.U�I�F[I�K�P�EWO�R�V,EGJ�P�F�E�U�V?J�H�F�IR6H lyzozómoch a len priZ�J�d'Jp�O�IU�V?R?XBU�UWqrP�O�s tCuwv�x�y{zk|i}~|@�@y{z��+���y.uw�+z�����������z���W�?�B����vy.���B�����+��u=�{�M�x[y=x�:�@x�+z����

priebehu����������x����?x��Gu�������x vx^t{��z�v+z��.��vy.���ix�v�x��@y.�������zf�+y=�?��u��fu����iu�����v�x��+�'�W���+�+���Mu��� �����x¡|.�Gxk degradácii DNA prítomnými DN-ázami. RN-ázy patria medzi termostabilné enzýmy

a�'u=�=�[|.��y.x���¢x�v?�@�`�wzf��v+£e��¤�y.���¥xmv�x��@��u?������2�w�����eu��+�@���^�¦�@�¢�§�w��W�������+�cvy.x+�������0u��i�������w¨=��Wu�����©vy.�

ª�«?¬�­G®�¯�ª2ª^°#±%²¢³:´+µ·¶�¸+«?ª¹ª�º»ª�¼^½h¾i¬�¿=Àcº?Á�Â�­W¶�®�«?ÃkÂ+¾@¬+¿.Ä%ÅCÆmÇ�Æ�Å{¾¥¬ÉÈ�¬�Á�Ê�½�Ë�ÆCÌ=ÍÎÈ¿.ª�ª�«?¬�­�Æ�ÇBº+Ï�¯�»%¾i¶�¯�»ºª�Â�®�¯�»na stabil izáciu izolovaných nukleových kyselín patria hlavne:

a) Bentonit:ÍfÇQª`ºº+ÏЪ�º»�ª�¼^½¦¾i¬¿�¿=ª�¼�¬�º?Á�Â�­W¶?®�«b« ¿.Ñ«�º+À�¯B»8«B¸+¿.¬�Ì.¬+Ëk´M±%Æ=Ì.Ç�Æ+Å@¾i¶ÇÒ.ª2¶ÓÅCÆÔÈ�¬+Á�Ê?½�Ë�Æ

v koncentrácii asi 10 mg/ml.

b) Dietylpyrokarbonát: (DEPC, C2H5–O–CO–O–CO-C2H5³�Ì.¶ ÍfÇ�ª�ºº�Ï�Õ ª�º»�ªG¼�½h¾i¬�¿.¬Õ

Ö.×�Ø�ÙÚ�Û�Ü�ÝWÞ�ß�àá�âãÞBä�Ù åfæ�×�ÚÙÜ ç.è à?è�Ü�Ý�è�éß Úè ê'Ù�é�×�ë=×�Ü�ß�ì�×W× è�Ü+íiî�ï�ÚÞ�äÙ ì�Þ�Ú?í@Ö.è Þ�Ú+à�ð�êñÛ�áV Ú×2ÞQÜ+íiÙ�Ö{ð�ì�äTòÖ.î�ò�è�éÙ�ì�äóä�Ù,ï^ô.èQܹÚ�ÞBêñÙ�õ?ÚÙ¹òÙ+Û�õ�×�öB÷øÝGÞ�Ø�Ùùê'Ù�é�×�ë@×�Ü+Û�ú§Þ[è=úcç.è�ê'Ù+í@Úû[Ú�Û�Ü�ÝWÞ�Ù+ï�ûkyseliny. Pri práci s üþý!ÿ�������������� ����������������������� � !��"�$#%!�&������ ����'��(�)"������#*�+�,��-/.�#%0��21 e silne

toxická a karcinogénna.

c) Heparín: v koncentrácii 50 3 4�5%687:9�;�<2=?>�9�7/@�=?>BA�C�DFEHG I�</J�K�LM>BN�O�=%<QP�<R=SK ;�<QT�@�IUK�O�7�> V�GW@ viac

ako 95%. X@�K�J YQP�N[ZMN\G ;�</>�]�O�N�P+@_^`PaG b�cdN ]�@_6 I�N[Z�P�@�L$KeP�f"Zg@+O�hji >�I�Kk`lm> b�@n@_]_ZS=%;�VoI�>�I�<�>z roztoku nukleových kyselín je problematické, a preto takto izolované nukleové kyseliny

Ia>,6p@+J�I�@89�@aK�J�<Rq�I�N�9�;mkU9�;�<�;g>UZ$=%;�<rO�s,I�>�LtN I�N 7/u�Gv>�kd) Prirodzené inhibítory nukleáz: patria medzi glykoproteíny a inhibujú nešpecificky.w G b�cdN ]�@_6[IaNxP�fyZ�@�O�hzi >�IUKxLM>{P}|�N�O~</i b 9�@aK�J�<R=?</>�@�T�6~>�]�G�> I���ke) Polyamidy: spermidín a putrescín inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú

aktivitu.

Page 12: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

10

f) Aniónové detergenty: napr. SDS, inhibujú ribonukleázovú a deoxyribonukleázovú

aktivitu a �$�y� �����a�����������/� �/��� �������S�����,���U� �R���U������� �������a�*���/������� ���[����� �������v������ �� d�����_�¡���nízku cenu a �����¢��£��}� �/�����¤���¥������¦ �Q�������§� �� ��~�"� ���$�?�}�

g) ¨�©�ª«­¬'®d¯�©�°/± ©�²F³�´¶µ ·¢³�·/¸�¬¢¹}º napr. citrát sodný, EDTA (etylén-diamino-tetraoctová kyselina),»v¼$½�¾+¿�À�Á�Â�¾�à ½�Ä/Å�Á�Æ'Ç/Å}È_É¶Ê ËUÌ�Ä/Å�Í8¿�Î Á�Â�¾�À�ÄQÏ�Á�ÅUÐ�Ñ�Æ'Î�Ò�Ó¤Ô�ÄÅ�ͧÔ�Õ�Á�ÖgÎpÑ�Íd×?Í,ÆQ¾�×?Ä'ÃoÑ�ØpÙ�Ú"Ô�Á�Ï�ÎoÅ�Ä'Î Õ�¾�Û�Í�¿UÐ ÖMÎÙ�À�ÇR×*Á+Ü8Å�Á"Ô$ÝÞ¿�Õ�ÁdÖßÜpÁ"à Å�à�à ½áÑ�Í�×%Ä�â+ÅaÁaÕäã*åçæ 2+, Mn2+ è�é Ù�ÀgÎ�×%ÁáÄ/à ½êÍ�Ñ�×�ÄQÕ�ÄR×SÐëÖ�ÎìÜpÁ+Û�Å�ØBÄ/Å�½�Ä�Ï+Á+Õ�ÍdÝÙ�À�Ç/¿�Í�Õ�Ñ�Á�Ü[Ñ�Á+Ü Ù�Æ�Î�Â�Á�×SÕ�Á�À�Å�àaÃ,½pË,Ä/Å�Ä�¿�Ä'Î Æ%È

íÀ�ÄîÄ/Ó�Á_Æ/Í Ë Å�à+Ã,½ï×?Î Ã�½�Å�Ä/Ñ�Ò Ã ½ðÜpÐ}Ô�Ç�Ü~Îñ¿aÏ+Í�ÝïÍ�ÖHÅaÍòÜ8Á�Û Å�Á"Ô�ÝóÜpÎUà ½aÍ,Å�Ä�Ã�Ñ�Ø ½aÁôÙ�ÁõÌ?Ñ�Á�¿�Î�Å�Ä/Ívysokomolekulárnych nukleových kyselín. Vzniku krátkych fragmentov nukleových kyselínÖMÎöÜ8Á�ÛUÅaØ�Ó�Í�Ï�ÀgÒ,Å�ÄQÝ÷ÁaÏ�ÜpÎ ¿+Ó,Î,Å�Ç/Ü Ù�À$Ðy¿�Ñ�Ø ½�Á[Ù�À�ÎF×%À�Î�Ù�Ò�Õ+Í�Å�Ä�ÍöÍ\Ü8Ä�Î�Ì�Í Å�Ä�ÍöÀ�Á+Ód×%Á�Ñ�Á�Õ:ÅUÐ�Ñ�Æ�Î Á�Õ�à�à ½Ñ�¾�ÔMÎ,Æ/Ç/Å~Í{×%Ä�Î�Û¥Õ�¾�ÆQøyËUÎ Å�Ç/Ü:Ù�ÁaÐ�Û�ÇQÕ�Í Å�Ä�ÍöÙ_ÄQÙ�Ä�Î�×ëÓ

úzkymi koncami.

Izolácia DNA zÏvÐ"ÅvÑ�ÁaÕ�à+à ½¤Á�À�æ�Í�Å�Î Æ"Õ�¾�ÛvÍ ¿UÐ�ÖMÎ�Ù�Á�¿�Á�Ï�Å�Ø:Ù�ÁõÔ%×SÐ�Ù�¾¤ÍoÑ�ÁùÙvÀ�Ä}Ä¢Ó,Á_Æ/Ò Ã Ä'Ä"ÏvÐ"ÅvÑ�ÁaÕyÎ�Ö

úxû`ü é Ù�À�Ä/Ë Á_Ü Ô�ÍðÅ�Í�Ö�Ù�À$Õ Ä/Ó�Á_ÆýÐ Ö�ø Ù�À�Ç'Ô�ÆQÐ}Ì�Å�ØôÁ�À�æ�Í�ÅaÎ Æ�¾ é ÁaÏ�¾aË Í�Ö�Å�ÎþÙ�Á�Ü8Á_Ã�ÁaÐ Ã�Î�ÅU×ÿÀ�Ä��*Ð�æ�Ò Ã Ä�ÎvÑ�Á�Å�Ã�Î,Å�×%À�Í Ë�Å�à+à ½ æ�À�Í ¿�Ä�Î,Å�×?Á_Ão½ À�Ú�Ó Å�¾aà ½8Æ'Òd×?Á+Ñ ÅaÍ�Ù�ÀdÈ�Ô�Í Ão½�Í�À�â�Ó ¾8Í Æ�Î�Ï�Á�� Ä�à Á_Æ/ÆQÐÈ

Princípy izolácie RNA:

íÀ�Äæ�Ø,ÅaÁaÕ�à+à ½BÜ~Í,Å�Ä/Ù�ÐyÆ�Ò Ã Ä'Í�Ã,½ëã*×%Ä/ÎoÛ§Ù�À�Ä����t¼*í�� é Ñ�Í�Ù}È��� è Ô�ͧË�ÍUÔ$×*ÁùÕ�¾aÃ,½�Ò�¿�Ó�Í§Ó � û§ü é Ù�Á�¿��dÍktorej sa v � Í ÆSÌ�Á_Ü[Ñ�À�Á�Ñ�Ð Ô$¾aÅU×?Î�×%ÄQÓoÐ ÖMÎ{úxû§ü8ÈUÉ Ï�Î�Û�Å�Î$Ötà Ä�Ã Í ÕyË�Î�Ö2ÏvÐ"ÅvÑ�Î2ÖMÎ Å�Í�Ù�ÀmÈ�ÍUÔ�Ä��� -5 � g RNA.������������� ��!#"%$'&)(*�,+�-/.#"0!21436567�5�8:9/;�<=�?>@BA0CED��F���GD/��� (H!#��<'&#I*"�!#5J+=9K>@BAL�

rôzne malé jadrové>@BA:MON:P#"Q(SRJTU(S1V",(*5W>@:AX8:�Y.[Z]\/^���!#��RJ(*"�!Y1�&)(*1�\�RJZ_+="�`aR=5b&Scd� .e"W1V\/^f8:5��/<=gh&["��=��!#5J+=�,cd�=5'8:5=\/5J-i g/;�5J+="Y.\j^�!#5�8B�Q(S5 i !#��IS1k"%CB"/;�"�RJ(S!*56IS5�!#g�7/Tl�/;k"�365m147�5��JT�R=<�1V\�R="Y.n\/"/<o(S!Y1�I�- i 9/\/1V"JMODp���q���r7 celkového5J3s&[�j^�-t��!#"/$'&S(*�,+J-%.e"vu/5t$�5w+="/`aR=5s&)(S1:+x"/`Q8B1�^�"Q(*"�!#5 i g�<J<y�w8�>@BA:M�zO![��RJ(S1�\�R�Tt+sP#"Q(SR6Tt8�>@BA\/1�\/��+xu/{V\/^K3J-x<�1V"�RB8��Y.YZB<y�K|~}6R=5�<�\/1s�=5=;�Ty�YAp��7���R=5�<�u/"/<�1V"/C'RJ(�56!#gp$�5y+65'`2-%.#"K1�\j^�1�7�5';�9/\/14- ��IS1�<'1�(Y<y5y-chromatografiou na oligo(dT) celulóze. V

8q<y56^J�6\/^���!#{4�=�/$�5=\/^ &[��$�9�Z�&Y�="oP#<y"��=5J-=�o1�ci chromatografia na benzoyl alebo naftyl celulóze.

Izolácia mRNA má význam len pri získavaní eukaryotických génov, ktoré majú

mozaikovú štruktúru, kde sa striedajú kódujúce úseky, exóny, s nekódujúcimi úsekmi,1�<o(S![�6<�8:1SM�����RJ(S5:5�! i ��<�147�5J+=�/<=g i g�<JTB3�Tl�=5B��!#"�<�5s&#"0$�5l36��RJ(*g�!Y1�{s3=5=;�1~<�"/Ik-x<JRxuj<ygJMJ��!#"/;�9�8�>�@�A�.e"komplementárna len k exónovým sekvenciám. Proces, ktorým sa intróny vyštepujú

a jednotlivé exóny spojujú, prebieha na RNA z primárneho transkriptu a nazýva sa zostrih

RNA alebo splicing.

Page 13: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

11

���#�/�������K�n�B�_�#�K�:���� �¡K��¢���£��J¤x¥,¦�����§x ���¨��#�/©/�4¨=���*ª/©/�V�y§«¨y�6£4¬�¢j­'�:�J¤=®'¯J���6�#ªO�[�?¢�¥/£������/ �ªp �¥¨=��¢/ �¥Q�S¯J§x®v����°=���/£�¯=�y¤=�� �¬±¤=¢� ���¯=¥Y�Y�x©/�� =¥��#�4°=��¢�­��:�'©�² �:³���§ �[�/¥�´=�J¤=¥,¦ µ[� ¶Y¨=�/©/��·)�V©�¯�¸=�B�¨��#�o�S��£�ªQ�S¯=¥j�:�=¨��#�o�S��¯=�'��¨=£V�,�S ��Y�¹°=�V�j£�¯=�J¤=�� =�JºJ»n���*£��4¤6��µ)¦0�:�Q�*­'¼o¬�µ#¥p�J¶)�*�p¢�¤�¬x¶)§%�a�p¨��#�'¨=�J§=�����S½x¥j·*�� ����Y y�[�©�²��#�'�:¥Q�*�6´��#¥�·S�k�¾ y¥¾�:�� ���¯'£��� �ª/£� =�Y��¨��#�o�S��£Vª,�S¯=�h¢�¥�¯=�o��¤=�� =�Y�� �¥¾ y�bµ#���j�SºÀ¿~�Y�p��¢��'£�ª/©/�k��¶Y¨=�%©j�V·Y�V©�¯�¸=©/²����B��µe¥Á¨��#�o�S��£Vª,�S¯y�y§Â¨��*�o�S�À°=�V�/£�¯=�J¤=�� =�Á¯=­=¼J�J¤=¥/ ��J§Â¨��Y½kµ#£4§�¶# ��J§Ã�K��B� ¤�¬�¢%�#ª���¥Y�[�è=��£�¬y¢�­'��¬=®ktoré ju práve syntetizujú. Z polyzómov sa izoluje RNA, ktorá teoreticky obsahuje len rRNA

a špecifickú mRNA.ÄlÅjÆ�Ç[ÈyÉËÊ:È6Ì%Í�ÈsÎ)ÏjÈyÉËÐ�ÑjÈ6ÆVÒ/Ó/ÐVÔÕÉ=Ö[×jÐ�Ø*Ô[ÙdÚ�Ö#Å�Û=Ó/ÐVÔ�Ê�Ü�Ý�ÞXÙaÔÂÚ�Ö#Å�Û=Ó/Ð�È'ÍyÒ/Ó/ÐkÅÂÓ/Ô/Æ�Û=Èyß6ÔYÙhÊ�ÜÝBÞnapr. centrifugáciou v à É�ÎSØ*ÈoØSÍ�È�Ê á�Ö#Å/â�ÐkÔ/Í�Ø*Ô Å�Æ�Ô�ã=È ÔjÆ�Ô�ÛJØSÖ#È�ÚSÈ6Ö#ä�Ñ/ÈJÉ Ñ�Å â�Ô�Í�ÅQØ�É=Ö#Å/×�ÍJåyÓ àæ È=âJÊ:ÐkÔ/ÍyÈ6Û�ç�èbÖ#Å�Û=Ó/Ð�ÅÁÊ�ÜÝBÞ0éÀÛJØ�ÈJÖ#ÒêÑjÅ�Ð�Î)Ï�É/ÙeÔ æ Ö2йØSÖ#Å�Í=Î#ÆVÒ/Ó/ÐkÐ in vitro

ß�Ñ�Í�Ð�ÛhÉ=Ö#×/Ð�Ø*ÔYÙpã=ÐVÔjÆ�Û=ÈJß=Ð�Í6ëFÙeÔobohatená o æ ÖYìVÎ#Æ�É�Ç#Í�í Ê�ÜÝBÞ:çïî�ÐkÔ/Æ4Û=ÈJß=Ð�Í�Í=ä æ Ö#È'âoÉ=ÛJØ�ë Ù[Ô Ê:È6Ì�Íyä Å/Í�Å/Æ�ëyÑ�ÈJß=Å,Ï ãJÉxðÐVÊlÉxÍ�È æ Ö#Ô/Ó/Ð æ Ð�Ø*Å/×/ÍJå=Ê�ÐJØ*Ô/Ó à Í�Ð�Û=Å/ÊBÐVé'Å/Æ�Ô�ã6ÈBâ�Ô,Ø*Ô�Û=Ó�Ð�ÈyÉ:ã=Ð�È=Ó à Ô/ÊBÐVÓ�Û=ÔYÙeé=×jÐ�ã=Ð�È'Æ�È6á=Ð�Ó�ÛxÔYÙ�Å�ÛJØYÐ4ß=Ð�ØSëxç

Práca s ÍyÅ,ØSì�ß=ÍJë=ÊBÐrÜ�Ý�Þ ÙeÔ È�Ê:Í�È à È Èyã�ØSÐ�Å�Ì�Í�ÔYÙQÇ#ÐVÅ Å ko s DNA, najmä preßxÇeÅ/â�Ô æ Ö#ì�Ø*È�ÊqÍyÈbÎSÏKÜÝ�ñYÒ�Ñ�çJÜÝ�ñYÒ�Ñ/ëFÎ)í æ Ö2ì�Ø*È6Ê:Í�ä:Í�ÅKß=ò�×oÇ#Ð�Í=Ô:ÆkÅ�ã6È6Ö#ÅQØSóJÖYÍyÔ à ÈhÎYÛ�ÆVÅ/ésß=Ô/ôaÛ=ä:Ê:Í�È�ÌJÎ)Ø�ß6È

je ich na prstoch experimentátorov a nachádzajú sa prakticky vo všetkých biologických

materiáloch. RN-ázy sú navyše vysoko termostabilné a ich komæ ÆVÔ,ØSÍyÒKÐ�Í à Ð�ãxìVÓ/ÐkÅ�ÙaÔpÍ=Ò�Ö#È=×�ÍyÔ[ÙQÇ#ÐVÅÅ�Û=ÈÂÐ�Í à Ð4ã=ìVÓ/ÐVÅWõ�ÝBñYÒ�Ñ�éöÛJØSÈ�Ö)å�ʱÎSØ*Å/×/ìpÈ=â'Î)ØHÖ#Ò�Í�Ð4ÏÕâoß=È�Ù#Ê�È'Ó�Í�ähÛ=ÅQØYÐ�ó�ÍJëxçÀ÷nÅ�ã6È6Ö#ÅaØSó�ÖYÍyÔ]ÎYÛ=Æ�ÈvÎ#Å æ Ö#Ô/âprácou s

ÜÝ:ÞøÈ'â æ È6Ö)íx×%ÅEß�ë æ Å%ôQÈyß6Å%Ï�ù à È=âJÐ�ÍJë æ Ö2Ð=úsû�ü oC. Z roztokov a materiálu z plastických

hmôt sa RN-ázy odstránia dietylpyrokarbonátom (DEPC).

Princípy izolácie bakteriálnej DNA:

Ý�ÅýÐ4Ñ�È=Æ�Ò/Ó/Ð4Éþã=Å�ÛJØ*Ô�ÖYÐVÒjÆ�ÍJë6Ó à õ�ÝBÞ ÎeÅÿÍ�ÅYÙe×/ÅJÎ)Ø*ÔYÙaÇ#ÐVÔ æ ÈyÉ=Ì�ì4ß=Å ÊBÔQØ*ó'â�Å�éqÛ�ØSÈJÖ)í ß�ë æ Ö#Å/Ó/ÈJß=Å/ÆMarmur, prípadne jej modifikácie. Pri tomto postupe sa bakteriálne bunky opracujú

lyzozýmom pri teplote 37°C v prítomnosti EDTAÅ�úsû � ÖYÈ�ÑQØSÈ�ÛJɾÎ[Å/Ó à Å�Ö#ó6Ñ/ëyé æ Ö*Ð�×/È'Êtß�Ñ�Í�Ð�Û=Å[ÙYíÎ#ÚSä�Ö[È æ Æ�ÅoÎSØ)ëyé'ÛJØ�È6Ö#äpÊ:ÅYÙYíF×/Ð�ÅJÎ)Ø*È=×�ÍyÔ?Ñ�Å%Ó à ÈJß=Å/Íoí�ã�ÉsÍ�Û=Èyß�íUÎSØ*Ô�ÍoÉ~ç/Ý�Å?É�ß6È'ôaÍyÔjÍ�ÐVÔ�Ó�ë�Ø*È æ Æ�Å�ÑoÊ�Å,Ø*Ð�Ó�Û=ä à ÈÈJãsÎ[Å à É_Ù#Ôhß�å à È'â�Í�ä æ ÈyÉ=Ì/Ð4Ï ������������ ��������������������������������! #"�$&%�%�'(�*)+�����-,.'0/��12�3 4�5��6�7896.�:�;=<?>

@�A �.CBD�EF��BD�� GE�HICB#�KJ�LNM�EFOP:-;9���Q��/R63OP7��.��<.O��ST�5E��.O�6U��2BV���6�/�EF���?�WHX��E-O�Y��� A Z��2E[�U�/�;�'C7��.�\�U�]F���R��2E[�U�/�;!6.O^;��_\����OZ��H A ^�Ha`&/C������ bBDCHQ��/�;�Hc�5'd���.`���O&���Z��;/Ha�=5��M @eA /��96f��H�S��KJ�g A �.2B+2EF��BD���>hji^k BD8�]F��Bl�m��EFCH���O[no7��.��O�BDpEo7��.�cBl`��.�5� A pHX��E-`���;�'q7�����Y=CB 27O�/��O&���; ��r-�U�.O�/ @ �I5;odstránime kontaminujúce bielkoviny. K lyzátu pridáme rovnaký objem zmesi chloroform-

izoamylalkohol (24:1), miešame asi 20 minút a vodnú fázu oddelíme centrifugáciou.s � @�A ��`t�����`vuU`�E-Ov�:96.O A ;�<f�v7��.���O&]���v��;/HQ���� v/2��6.��Ha�����'w7��12B �5O�6.HQ����;=<\�v:�a��HQOBl����EF�au�`�EFO='T/��U��.`#�:963O A ;=<f�^:�Q�eH�/�����2�xOy�5Oz6�7��/�;D<.�DEFBy��6j2���O���� @ /�M @�A �.2E=7�>K{?neO��2�Q��H��U72/��O�_

Page 14: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

12

|.}l~G�����I���e�Q�T�-�����2���.�5���5���������C�Q���w|��������������e�d�f~��F���������e�N���U�.�&������#| ����������Q���2�}l�9�.�������K�? e�����Q�e}l��|.��������¡&�.~ ���5¢-��~����5£�����} |.������3�2���-�.�����G���.~F|?�����~¤¢��F��¢����.�[ ¥���.�&�F~����c��¥���.����~����5�5¢§¦�}l~����F�c�����F����.�&���U�������¨¢��}l�c�F�5~��[�G©#¡�C��~=�5¢2ª«���9|f~����c���¬����|��9��}l~«�F�­|����[�.~�������¨¢���������V���3������a�Z���.�&�F�����a}~����&�������C}Z�y®¯��������}D�c�F¡����°��¡Z±²©y³´}D�2�=���Z� ¢5�����~��µ�������W��C|?�U�.�����X D���-��¡C¶2��������¡·| ribonukleázou

( ¸&¹aºK»�¼K½K¾9¿aÀ=Á5ÂeÃPÄ�Å\þZÆw½KÇ\È�º�É Ê ËKÌ�ÍqÎ�ÏPÐ.Ñ�Í&ÒxÓ ).Ô¯Õ?Ö×�Ø�ÖÚÙDÛ�Ü�ÝÞ�Ø�Ö�ßwà�Ü1Ø2Õ3áãâ3äVå�ä�âUÜUØçæ5Ø5Öè�éXê2ä�ßyë.Ûãì¯íXÕ�î�ï�×ØðÙDÛ[Ü�ÝCÞ�ä&ߤæ-Õ�í·à�Ü�Ø�Õ.Û?ëvâfäVñ�äò�ó�ô�õ.ö�÷�ó&øcù�ø�úFû=üeøXý ôö�ýþFÿ������Uóeù5ö���� ó�ù�ö��� fó �.ø���ùó� ��\øQó ò�ó�ô�õ.ö�÷�ó�ø�ù�ø�ú�����ù�� ��ø�ù�øaò���ö ���öchloroform a ������� �!�"$#&%�����')(�"*#+�$�-,��/.103214�56�+07�$#�4-�&�8"*#�9-(/!:0�7�&';%�#=<7����#�>�#/%���?@<7AB9B�DC39�A-"E#&%�� Finhibuje aj potenciálne nukleázy). K G$H�I�J�KML NEOPI�O�QSR�O+N3T$H7Q U*V6H�W�X*V�Y�Z-[�O \�]�^�_ `bac/d�e/fEg&h�d�iBc�j�k&g�l�mnk�oqp/rsg�f3tvu�w-x&f*w�y+z|{~}�g&h�j�e���i�j�j��$}�k�g�lMz�w �����w+�$k�}�{~}�w�{�p�g��D��l6}|h�g&r��g/f�k/t����j�k�j�e�l�g�����{S}�c�g��+l�r$�8���7w-f�x�}�k�j6}���g�����c&w �������*�6�)�*�������|��� � �7¡B¢&£�¤�£/¥/¦1�§*¨�©«ª�¬M­®£�¯D°�¡-±��$¨-§*¡ °�¢�¡�²vodnej frakcie). Extrakciu s ³$´Bµ&¶�·�¶�¸¹¸»º�¼�´�¸½´¿¾�¶�¸8À�Á�µ�¶�Â�à Ä1Ã�Å�Æ extrakciou so zmesou

fenol:chloroform (1:1). Z Â�¶�Ç/µ�´�Åq³7È-É�Ê1Æ*Ã˵+Ì�¾�·�´|¶&Â�Í;¾�Ê�Æ*´�·�Á�µ�Ê=¶/À�Ê�Î|ÃEÅ*µ�´;Â�Ê&É�Ï*È-¼BÃEÅ�Ð�Ç+Â�¶�¸�Ãobjemami vychladeného etanolu. Fenol, ktorý sa neodstránil pri poslednej

chloroformovej extrakcii sa odstráni po rozpustení nukleovej kyseliny vo vode alebo

TE (Tris-EDTA) tlmivom roztoku extrakciou éterom alebo dialýzou.

Izolácia chromozómovej DNA z buniek S. bovis:

Ñ bakteriálne bunky získané centrigugáciou (10 min, 10 000 x g, pri 4Ò C) zo 100 mlÓ�Ô�Õ-Ó&ÖE×ÙØ/Ú«ÛMÜÝ�Þ�ß S. bovis à�á+â7ãåä3æ/ç�èMé$ê�ë�ì/ë�í�î�ïðëòñóê�ë�î�ì�ô õbç�ö*÷�î�øðù�úüû�ýEø-ôDþ�ö~ø�ô½øv premývacom roztoku (10 mM Tris, 10 mM EDTA, 0,9% NaCl) a suspendujeme

v 2,5 ml roztoku TES (50 mM Tris, 5 mM EDTA, 10% sacharóza) a inkubujeme

10 min. v ÿ�í���ì/ë�ì�ô æ���û�ø�è�ê� ����� �������������������������������� !�"�#���$���%��&'�)(�*,+-&-�.�0/� 1�2��43654�7���� 8�9�:���7;=<�(>&)?@�A/4 !�� 6B4&)�DC�&�

roztoku TE, pH 8,0) a inkubujeme 45 min. pri teplote 37 E C v termostate, potomF�G$H�I�J�K'LNMOK-PRQ�SUTWV XZY\[^] F�_ `1S�Qba�c�d�K)F%P"L�e�d�fhg�d�G�i�jWk6H�i�H"I�P�dli�mOg�n�goH,m p�m�i�H"Ldvojmocných katiónov potrebných na aktiváciu nukleáz) a inkubujeme 5 min. pri

37q rts#u�vxw!y8zo{ |~}�|��A��y6�'{����-�-��s������=u����4���4����v�}�����|$v��8� ��{6�'{�z lýze pri 37� C�����h�$�"� �¡4¢%£¥¤¦ bunkový lyzát extrahujeme fenolom (1:1) a následne dvakrát so zmesou

chloroform/fenol (1:1). Spojené vodné frakcie extrahujeme na záver

s chloroformom, aby sa odstránili zvyšky fenolu

Page 15: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

13

§ k vodnej frakcii pridáme 1/10 objemu 2,5 M acetátu sodného pH 6,0¨�©-ª�«�ª�¬�­�®"¯6«!°�«�±³²�­8°�´Aµ:«�¶¸·�ª�¹�·�ª�º=» ¼=½¿¾�º�À�Á!­�«�´"¯bÂÄÃ>Å-ÆÇ­�²Èº$ª�¾É°�ª�²ÊÂËÃ-Å ª�Ì¥Í$­�Î!»�¼Ï¯dostatok monovalentných katiónov z procesu prípravy, acetát sodný nemusíme·�º$´�¹�À�¬�­8ÐÒÑ$Ó�¼$¯�©-«�¯�·�º�¯6©-´"¯�Ô$­�©'¯#­Õª�·�­Ö°�º�«4¯�·�º�´�¹�À�©>¯Õ¹×¬�ª ¼Ø«�À!Í$ª�Ì�«�ÙDª�Ì ¼Ï¯�©Ú¬�¶:Û�Î�®,­!¹�¯�«�±�Î4ªetanolu (najlepšie po stene skúmavky)

Ü ¬�¶�¾Òº$À�Á!­�«×½oÓݬ�®"À�²�«�´Þ°h½ Û�Î1º$ª:©\ª:¾!µ�©-ª4¬1½ßÂËÃÅÕÓ�«4­6©\ª4°�À�©'¯È«4­àÍ�²�®"¯�«×½ß°�¶4á6´�«�²�» ­premyjeme v 70% etanole

Ü DNA vysušíme na vzduchu alebo v¯8â�´�²�À8°�ª�º$¯�·�º�´-¾�«�ã�Á!¯�«�ª�©ä°�®A­�²�»�¬�¾6¹×»oÛ6Î!»å­

rozpustíme v 2 ml sterilného roztoku TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Izolácia chromozómovej DNA z buniek E. coli :

Ü izolácia DNA z E. coliÍ�­Ë¬oÔ$¯�ª�Ì�¯!Û�«�¯ ¬�¶�¾!«�­�áÉ»�¼Ï¯#©-´"¯�º�«4¯�¼ÉÔ$ã"©>´¥·�ª�¹:©-´"¯�«�²�­�©>´�·�º$´¥®0Ù4¾!¯

Ì�»o«�´"¯�²�Ótá�ªx·�º�´�­�©-ªæÍ=½�¬�´hÍçãèÍ$ªx¾×®Aª:Á!¯ «�ã,©éÌ1»¥«1²�ª4¬:¯�¼7Í�°�¯�«�¶ ê�º$­�©-«�¯�ê�­8°�ãA¬�«�¶:Û�ÎëÌ�­�²�°�±�º$´�ã(bunková stena grampozitívnych baktérií obsahuje 50 - 80 % peptidoglykanov, ktoréÍh½ì²4ª4¬:­�®�¯�«�°�«4¯\¬�´�­�¾Ò­�«4±7Ít·�ª�®í¶�Í$­�Û�Î4­8º�´�¹:©-´î­\°9¯�´�Û�Î1ª�¬�Ù�©)´ï²:¶�Í�¯6®�´í«4­�©´ðá�ªëÍ�·�ñ%Í�ª�Ì!»�¼$¯>´AÛ�Îò�óÒô6õ$öÞ÷\ø�ù�ø�úíû1ø¥ü=ýtþ1ÿ�ø���ö��������-ö������#÷� ������!ö����ú�û����#÷\þ�ø%õ�4ø�ù���û�ö ÷����� 8þ1ÿ�ø���ö���ø���÷! �÷�û��ø�ò��stena gramnegatívnych baktérií obsahuje len 1 - 10 % peptidoglykanov)

" celkový postup pre izoláciu chromozómovej DNA z gramnegatívnych

bakteriálnych buniek (G-) je principiálne podobný ako z grampozitívnych buniek

(G+ #%$ ÿ�ø��!ù�ö��ú�û��Ýü'&Wò�óÒô×õ$ö�û�ø�÷�ú(��û�þ�ø�ù��-ö)��û�*� ú,+��-�. / 0��1��ÿ�ö��ú�û*�*���2 1÷¥û�ö(�� $ þ�ÿØöAô�ø3�existujú viaceré modifikácie upravené pre jednotlivé bakteriálne kmene

" k suspenzii buniek E. coli þ1ÿ�ö�ù�������4 $)5 �-ú ú,���- ×ô�û��-�4ø~ÿ�ø*����ø��÷76 5 �98ìú����!ø���+��)÷;:<�úroztoku TE, pH 8,0) a inkubujeme 20 min. pri laboratórnej teplote, potom pridáme

1 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 a inkubujeme 5 min. pri lab. teplote, na záver pridáme= �-ú = $ =?>A@ û����4øCB�DEBF ~þ�ø��ÿ% Òô8÷�GH�-���7ò lýze pri 0I JLK �ú,õ$ö(�NMO�4ø%ùP�Q69ò R� �ù�ø�ò�ø��kúpeli)

" þ�ÿ$ö!�TS���ÿ% ����ö�ö $ ��ÿ%��U� �û�V9DW�YXZ �û���ü$ú(��ù�û�ø3� ü�þ�ÿ% ���ø�ò� �û�V'þ�ø ü<�h÷�þ�÷�GH�-���æÿ$ø�ò�û� ��øL ��øv predchádzajúcom postupe

Page 16: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

14

4. Izolácia plazmidovej DNA

Metódy izolácie plazmidovej DNA vychádzajú z vlastností kruhovej uzavretej DNA

(cccDNA - covalent closed circular DNA). cccDNA molekuly, ktoré neobsahujú prerušenia,

tzv. zlomy (nicks), sa v [%\�]T^�\*_�`Ea�b�c<^<\Yd�b�e�f�gih�]�b�j'kml superšpiralizovanej (superhelical) forme,

ktorá dáva takýmto molekulám vlastnosti, ktorými sa odlišujú od lineárnych alebo

nickovaných molekúl cccDNA. Ak v plazmidovej DNA existuje superhelikálne pnutien d�b�h3o�[<k3p*\�l�d�q(e�\�l�rO\�^1g�a�_�s�tmf�\�l�\�[%uvYwO\.c%eTxWy!z nsupercoil) a ak je jedno vlákno prerušené

alebo v štruktúre molekuly DNA nie je superhelikálne pnutie hovoríme o forme otvorenej

ocDNA (open circular {�|�}�~�����Y�(���������W�Y�����-������� oc alebo sc forme predstavujú len zlomok

z celkovej molekulovej hmotnosti chromozomálnej DNA. Superhelikálna štruktúra je�����9�������<���H���%�(�����3�������������%�(� �*�3¡��9¢'�<£1��¤���¥�� ¢%�(�)¦��!���1��T�1�§�!�3��0��¨P�©.�����Hª2�3����«�%��¬§¢­������Y�����1��¡���¬vlastnosti a ®�¯°�±�²´³�µ�¶�µ�·§¯¶�¸1µ0¹�º�°�»)°i¼-¶�½*¾�¿À³!Á3»(µ�º�Â/»7ÃH¶�°�Ä�¹�Åmµ�¸<ÆÇ*¯�²/³9È�¹%Á3³!¯(Ç�ÉF¶�µ�±Ê¹%µ�»(°iË*Á�®*°�¶�̳!Á�»)µ0º�²P»ÍO¯¶*½*¾�¿Î¸<Í�Ä�Á�®Fë¸1Ïи�Áή�»°�Ñ'¸<¶�ÁPÑ ÒÔÓ%ÕmÖ�×�Ø�Ù�Ú�Ö/ÕÛÕ�Ü�Ý�Þ%ßáà�ß«Ó'â1ã0ä�Ú�Ý�å(Õ�æ�çYß(è�é�Ö�ã�ÜëêWìYíîÝ�é�ç!é3ïié�Øcentrifugácie v hustotnom gradiente chloridu cézneho.ðFñ�ò(ó�ô�õ/ò÷öùø�ø�ø�úWûYüþý�ñ ÿ�ó ����� õ���iø��� /ó ��������������������! #"$�%�!�'&)(�*,+- .���/�0����!�1��0����2+��)3��+54��!�687�9;:=<5>?9A@CBD:!E�F�75GH92IKJMLNJ�9PO�<�F�QSR!R!R�TVUXWZY[Q\F�:!7�E�E�:!92IPQ\F�QNJ�:!]^<5>_J�`�E�IPQ!9P:�F-7aYHbdc e5f:^GH7,e�f�Ig`)F�h2i�:�F�hteploty dochádza k ich rýchlej reasociácii, na rozdiel od iných molekulárnych štruktúr. PrávejHk�lmjonqpor�l!s!k2tok;s=u�vxw�yPz5{|jH}-na{HjHk~{|��r�l����l!yPk2u��!y�}���s!����n%yPl�u5�?y8w��5���d�KwMz��$�q}�k;l=u5jon5�v,kK�dn%y�z)��}-v,r�na{HjA��r5���napr. lýza varom (boiling lysis �m���������!�K���!�;�P�������\�2�-�d���$���� 5¡�¢d£K�M��¤H�=�5¥o¦�¢���§����¨§5© ªm«�¬�ªm«�¦2­lineárne formy DNA denaturujú na rozdiel of sc formy plazmidovej DNA. Po neutralizácii

prostredia na pH 7,0 (pridanie acetátu draselného) dochádza k tvorbe agregátov DNA, ktoré

�[�¯®�°�¢d±�²8°�³�³������K´ µo¶;·'¸H¹º)»�¶�¼-½S¾!·�¿�À�¼N»)¿�Á#¸H¹�¶�µA½�Â�º!»!¶�¼5½MÃÅÄ�¹Æ¶�Ç!¼%ÈÊÉ supernatante zostáva len sc forma

plazmidov a RNA.ËÍÌ�Î!Ï!Ì#ÐqÏ!Î#Ñ�ÒxÓ�Ô�Õ5Öo×�Ø�×5Ó�Ù8Ú�×5Û�Ü!ÝKÓ�Î!Ì5Þ�ß!àáÌ�Î,Ú�ØÔ�Ì-×aÑSßmÛMâ5ãd×�Øo×�â�Ô|ä.ågæXçèâ�×�ØÔ)ß�éKÚ�é;Ô!ÌdÖHÌ5Þ�ß!àbuniek pri molekulovom klonovaní, predstavujú práve vektory odvodené od plazmidov.êìë�Î�ãdíXéPâ5î~ÑÎïØÔ=Ú%ë�é�Õ5Û!ä�Ð�Ì�Ô�ãdð�Ó�éAÑëPÔg×%â8ØÔ�Ú�ë�é�Õ�ð!ß!éPÔñß!à5Ø$×�í8×�ãd×%í�ð�ë�Ì�Ô�äòåVæXçóÙ%Ú�ØÔ^ÖH×ôíñÛ�ÑéPÎõ×-öMÑÎ�à-×-ÓMÎmÒsekvenciu ori (origin of replication), charakteristickú pre akceptorovú bunku. PlazmidovéÓ�Ô�Õ5Öo×�ØHî÷ãdð�Ø×5Ó�Ô ø ù5ú?û[ü!ý#þ)ÿ�� û����������� ��������#þ=ÿ�����~û��������������-ü������

markers �!ü#û�!où#"��$� Aû�!%����� Kþ&�üü��!' Kú� �ù(!% )�5þ+*-,Xü.�� Pü����"�� û/��������� ��������#þ)ÿ��0��21'3��� �4' ������5*� ��5û�!oü53�"/�5"��#û6!7"' 8������2����ù�#þ������9��� 3�"� :�!ù�*;� ����(!où�"��.� ( ��!ý<*ñþ û� Pü ú��(= þ+� :��9>!7�� ü2��ù���ü�? :�dù(��ü��@3�"�9>���5� sekvenciách kódujúcichû/�����������A*�ü�"'���$"/�0B

C<��(�� D!6�E3� �����F��!ýG3�"��H�%û�!oü>�� I!%�HJmù���3��Pü���*K ���ù(��F��!ýL���$�(!où�"où�� �M! ù("��¨ûüN�!ü#û�! ùO���dþ0PMQ)�Mü�ÿ'�R3�"� klonovaní, patria plazmidy pBR322 a S(TOUDVWXYV$Z+[]\_^:`aMb�c�deS(fhgji(k�klbnmpo�qrts�u+v�w x�y:ze{(|

Page 17: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

15

a nesie gény pre rezistenciu na tetracyklín a }~�������:�:�:�������0�(�����/���M�&�6��}���~n��M���j�����/}�����Y~K�� }����%�5�����:}�� ¡���¢��£���}M�7�'�¤�����(������������'¥D�E}.���������7�%������¦�<��}��%�>�§��}��¨E�����?��©ª����� � ��~«�/}#�������6���%��������}@��}�¬�M�7�­}��M�7�)£��:�(�'�8�(�+~ ���7�� �H}© � �®��}p��¨���¯��)�0}°}$���l~�}��'���$�5�����n�:����M�%�?�%�?�� H�����K�������I�'�)���(¨���±­���:�����(���Plazmidy série pUC sú menšie (2,7 kb), obsahujú polylinker v oblasti lacZ génu a gén

zodpovedný za rezistenciu na ampicil ín. Schématicky sú oba typy plazmidových vektorov aj

s ²/³�´µ�¶�·(¸�¹7º�·�º�»�µ­¼�½�¾:·�¿�¶I¹7À�ÁÂK¸/·�Ã�Ä0·�º�Á¶�»�Å]²�·M¸7¹7²'¶)Ã0ƺ(À�Á�Â�µK¶�·(¸�¹_´º�Ç�´�³�²'º�·º�È]º�Å�ÉAÊ�²YËMÌ�Ë6Í�Ë�ÅpÌ�ËÏÎ0Ë Pri izolácii plazmidovej DNA z buniek gramnegatívnych a grampozitívnych baktériíÐ ¾:Å>¹%¶:Å Ð ²�¶)Ê�¾�¶:¿�º�·p²/³�Ä�º�Å�Ã�È Ð ²�¶:º�Á» Ð�Ñ Å�Ã�³ Ð ²%¶�¶8´�³�¾:ÇÁ¶�¶KÁ$Â(²�³�µO³�´�³�µnǾ?º�·'Ò.ÓjÔKÕ×Ö'¾¦À�´EÅØK·>ÙE¹7²�Å�Ã�Á¶:ÅØ´²/Ç�¿�Å�º�¶�·Ø Ð ²�·Æ¶6¸�¹%·�º�¶�·�Ú/Ø�ÃM¹¬³�²/ÈA¸�Û�Ä0Ü�Å�Ãn³(Ê Ñ ÆÅ'Ò�º�· Ð ²�¶�¸ Ð ½+¸�³(Ê�·º�ÈNº�ÅLµ�·º+Ü�¶�·]Ä�À�ÁÂ�³�¼(´�¶�·N³(Ê$Ò�·µ Ñ Ö�Í$ÝßÞml bakteriálnej kultúry, minipreparácia pri analýze DNA z pozitívnych rekombinantných

Ã�¾:³�º�³(Ä�ÚYËGà_³�¼(µ�¶�·º(Ã Ñ ¾?À�´ Ñ ÊEá+º�¶�·�à ¸7Û ³(Ê Ñ ÆÅ'Ò�º�· µK¶�·�²'º�·'ÒYÜ�¶�·ØâÅ>Ê Ñ ¸�Å ´�Å�Ê�²�Ǻ�¶�¾¦³ Û�º�¶:Ã(áchromozomálnej DNA z bunky, ktorá spôsobuje kontamináciu plazmidovej DNA pri jejã¤äå6æ�ç�è é�ç(ê�ëìIí%î6ï5ð_ñ'ìòé�ñ�î)é�ñ/äHó�ôöõ(ê0÷�ì�ô$ø

E. coli na izoláciu rekombinantných plazmidové�ñ�ì:ù�ú�ó�äènô­ù�çûø(ê�åIí'ì)ó�äü÷�ýþ�çâè�ýù�ì�älç�ù(é�ç(ó�ôù�ä'ÿ����ô­ä�÷Mí%ì)õ�ì:ç(í'ì)ø�ú��.ø(í7ç�ñ�ýe÷�úè é�ñ/ç��7í7ñ�ôù(÷�î��>í6ó�ç�è�/ô�å�ô�ø�ü÷�ý�þ�çpí7å�ä$ø(ê$ó��+æ'êHÿ � ó����Eä�ëø��òé�å�ä�Mè�ì�ù�ç(ó�ô'ÿ���������é�ñ�ì�é�ñ�î)é�ñ�ä�ó�ô2é���������� é�ñ�ì:ù�ú�ó�äènô¢ù�çtekutého LB média ampicilín alebo tetracyklín, prípadne zmes obidvoch, klony E. coliç(õ �/ä�þ�êÿ����ô ñ�ô�ø�ç�èDõ�ì:÷�ä�÷�í7÷�ý é�å�ä!�ènì�ù�� ÷�ä õ�ú!Eô é�"$# ó�ô�ø(í%ç�ñ%ç(ó è&%�ë�ôè�ô ø(ê0åIí%ì¦ó�ç�ó�ä'�v prítomnosti ampicil ínu ale aj bez neho).

Izolácia plazmidovej DNA pomocou alkalickej lýzy:

( )+*!,�-/.!0�13254�67.8)�9 6�,+:<;=?>!=?@BADC&4E6GFIH!6G.�JK,�9 4L-NM70�: O E. coli HB101 obsahujúcej plazmid

pBR322 alebo pUC19) centrifugujeme 1 min. pri 12 000g (stolová centrifúga, pri

laboratórnej teplote alebo pri 4oC)( supernatant odsajeme a bakteriálne bunky rozsuspendujeme pomocou cyklomixéra

(Vortex) v 0,1 ml vychladeného roztoku GTE (50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, 10PRQTSVU$WYX Z�[]\�^�_�`ba/ced�fGc�Z�ghc�ijZ�k�l7m�nLa/o�P]P&p�mqc�PrcKi�k8g/k+s'atk�u�lwvxWySbZ�g/n�iIz'{|z�}�~�PR�lyzozýmu na 1 ml výsledného roztoku

� bakteriálnu suspenziu inkubujeme 5 min. v � z�i�k��7kIPbu��7Z7c���n� pridáme 200 � �����!�����N�7�����������h�!�+�5�G�������!���7�5�����!�7�����8� �+�'�t����  ¡�¢£¡¥¤�¦�§�¨ª©¬«r��­�®$§E¯'°

SDS) a premiešame obracaním ependorfovej skúmavky (3-6 x, ± ² )

³ inkubujeme 5 min. v ´'µ�¶�·�¸7·I¹bº�»7¼7½�¾B¿

Page 18: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

16

À pridáme 150 Á ÂÄÃ�Å�ÆÈÇ/ÉÈÇNÊÌË�ÍhÃeÎ Æ5Â�ÏGÐ5ÑGÒÔÓtÕ�Â�Ò�ÖqÆ�Ï�×BÆØÍhÒ+Õ'ÇtÒ�Ù�ÊÛÚÝÜ�Þ ÒIÅßÇ/Ã!ÏbË�Í ÃeÎhÆ�Â�Ï�àâá�ãbä&ÂBåæ Ã�Ë�Ò�ç7ÉèÙ+é7Î Æ5Â�×�Ï7ÃêÒ7ÅÈÇëÒGç+ɪì�ì?åBÜrä&Â�åíË�ÆeÎ�Ç/×�Â�Ò+ç+Ã5ÏGÉ$ç+ÒIË�Ã&î ï�åðÜ£äêÂ�ñ�Ãêò�ÍhÆ!ä&×�Æ�óhÃ�ärÆ�Ò�ô�ÍhÃ�Å�Ã�Ï�õBäependorfovej skúmavky ( ö ÷ )

ø inkubujeme 15 min. væ Ã�Ë�Ò�ç7ÒIäbÙ�ù7ò7Æ�ÂB×

ø centrifugujeme 5 minút pri 12 000g pri 4oC a supernatant prenesieme do novej

skúmavkyø k ÎtÊ7ò7Æ!Í�Ï�Ã?ÏeÇ/Ã!ÏqÇNÊúò�Í�×3Ë�É5ärÆjÍhÒ�ç�Ï7Ã!Ù�àØÒ�ô?û�Æ�äüä&Ï�ÒIÖ�Î�ÇNç7ÒØÍ�Ò�ÕÈÇëÒ+Ù�Ê<ýtÆ!ÏGÒI /chloroform (1:1) a

skúmavku dôkladne premiešame viacnásobným intenzívnym pretrepaním (roztok by

ärÃ�Â+ô�é�þÿÅ�Æ� àÿÍhÒ�ç7Ï�ÒIä&Æ?Í�Ï7Æ ÕqÃ!Ù7Ã�Â�Æ�Ï�à�ñø centrifugujme 2 min. pri 12 000g pri 4oC, extrakciu a centrifugáciu opakujeme ešte

dvakrátø Ëeç7Ò?û ç7Â�É!Ù7Ï�Ò�ç�ù ����� ç�é�Õ�Í É!Ö�Ã5ärÆÝÎ Ëeç+ÒIä&ÃxÒGô?û�Æ�ärÃ�ä�×Iç�é+Å5Ñ�Â�Ã�Ë7Æ�Ï�Ð�Ñ�ÒKÆßÇ/Ã!ÏGÒ+ÂLÊKç äRÍhÃ?ÕeÏ�×��!Ù�Æ

(-20 o� ñØÃqÎh×�ã���á�ã&ä&× Ï�ù�ÇYÓ�Ù7Æ� KûhÆ ����� ärÆ�ÏIóh×�ÃRÃ?Ù7Ò ìEÙ�ô�Ã!Â�Æ�ô+Ò�Ù7Ò�Ï�Å�Æ!ÏeÇtÍhÉ�Å!×�ÃRÏ�×�Ö+óh×�ÃRÃ?Ù7Ò0,1 � g/ml ÒIË�ò7Ò�Í�ù���ÃbÎhÃò�Í Æ�Ë �����������������! "�#�"$����%��&�')(+*,��$�-��#���/.0'"12&�*3.546�"�! "�#�"$����%�"�7$8�7970oC)

: centrifugujeme pri 12 000g, 5 minút pri 4o;=< �">@?A'�>2*�$�B#'�$�.C�A �BD�E�@F�GIH%$�-���>2�KJML+�#'�JN'���#�OB�'�$�.C�P��Q542R2 �B���'@1��A'�S��T�#���U�D��$���V�WIJX��$ZY\[

: �]4212'D�P$��).0��$#.^*2S_�A�]?`'�JN'�ab�P>3c�JX�"d�>34 12*�].0�)d2-�JN' e�*��A' S3$�*�J $2� QC�E&f.C�A�g�"$3h 12�"12��'"�a odstránime všetky kvapky etanolu zo stien skúmavky

: zrazeninu DNA opatrne premyjeme vychladeným 70% etanolom (týmto krokom

*2S_�5.C�A "$���JN'i��d�j�kP>�jl�A*_&�-�am>3.0*+�Ano�A�pd�j����! "�#��&E���P12*2&f4/� DNA. Neodstránenie prítomných

�!*+&�-qJXL+�r'/��JN'�$����s*�1�.C��JN �&T$2'/12*2S�JI��'�$3>�jt1��A'/�A'��C.C�P��>2��$3cu�"$���&Th8��4,F�GXH 12*61��P��S���$�-*2S31�*3d2'�S��P?]c�B#'�e�*b.C&�J���d�n�e�*v�0*��).w*+>34x13�A'y1��P-��A&z4ZkA$#c �A'��C.C�P��>���$�c '"$8S�*+$#42>_&�'# "�"4�a|{m}~[Aavysušíme vo vákuu a rozpustíme v 50 � l roztoku TE, ktorý obsahuje pankreatickú

RN-ázu bez DN-ázovej aktivity (20 � g/ ml): kontaminujúcu RNA odstránime inkubáciou 15 min pri 37o;s< 12*p.C*�JK.C*o>3�0*+>34�JXL��#'

$8�8�A&�'�S�*3d2���O?�'gS+$8��'g��.C�A�">2B"���K� chloroformom na odstránenie RN-ázy): �#-E�0>2�r$#cs1_&��"�#JN�ES�*3d3c%F�G�H^JXL��#'�JX'�12*%*2B"e�&���S�'�$�-712*842�#����1����z�rJM*�$8�=*+1��!��B�*3d2�"$���'/�

�A'#�].C�P��>2��$3h2JN�2'r$8S�*+$#42>_&�'# "�#��JN�2�r&�'"(2*@?C4I4�B�e8*8d+ rJN'@1��A�29]�2W oC.

Page 19: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

17

Izolácia plazmidovej DNA lýzou varom (boili ng procedure):

� �2�D�3�0�"�A�����T���l�����E�������5�P�2���3�l�s�D�E�l�X�7���2 "�2�P¡p�2�D�3�0�"�A�����T�2�P¡q�3¢�£�5¤2�!� E. coli obsahujúcej

plazmidovú DNA rozsuspendujme v 350 ¥ l roztoku STET (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-

HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, 5% Triton X-100)� pridáme 25 ¥ �¦ g�"���]�5§+�¨���P�����A�"§2���2©�ª��¨�0�+���C���3¢«�z�8�#���"�2�7¢�¬"�D­¨�7®3¯C���°§��D­��M±³²¦�P�5�A´wµM¶·���

pH 8,0) a premiešame na cyklomixéry (aktivita lyzozýmu je inhibovaná v roztokoch,

ktorých hodnota pH je menšia ako 8,0)

� �"�2�"�8¸��+�A¹C�3§3¤q�P�3¤��N�"§��3¢N���A���X�E�#�]�C���E�N��¸��7§��A����º���ª8�M§2�2¸3��©�ª8�I�3¤2�2��»��@�8�@¼2­½�!�"�3¤2��¸� bakteriálny lyzát centrifugujme pri 12 000g, 10 minút pri izbovej teplote

� zbytky baktérií odtránime z º������C�A��¹w¢2®2�g r�8�P¡·�0�3¤�N�"§����%�2���X�2º��8¢q�5�0�"�P�����2©�ª���¾P�2�"�A�g¸+���� k supernatantu pridáme 40 ¥ l 2,5 M octanu sodného (pH 5,2) a 420 ¥ l izopropanolu,

���A���X����¾A���N�y���yº"�8�_���2����¿�©"�P�À�Á�8��º�ª����N�Â�]�0��Ãb�Ä�X���3¤��s���P�/���"�2���A�)�wÅ3�P���P¡Æ�0�"�2���3�0�(izopropanol pridávame v pomere 1:1; �2�3¢2Ç���§2���N�pª���§3�0��¸3�8�·�2��È6º"ª8º����N�¨�#��º�ª��3§2��Ã���������l�3�D¡`���b§��#���P���É���A�ÊÈ Ë�Ì5ÍAÎ�ÏÑÐ0Ò�ÓAË�Ô�Õ3Ö2Ë�×�Î�Ï3Ø°ÙAÏ�Ú8ÕÛ×8Ï"Ö�Ü�Ú�Õ2Ý�Õ3ÞÊÙ`ÏÊ×�Î�ß�ÍAÎ�ËÊÒ�ÓAÔ"Ú�Ë"Ö+ÕàÐCáÉËárË"ß3ÍAÎ�ÏÉÕ_Ý_ÐCâCÓAË"ã�Õ3Ö2ËD×�ÎEÏqÙ�Ï�Ú8Õ/ä"å�æ#âCç2Õ8Ö�Ø�ÓAÕ�ä)âwÕ+ç3æ=è�é�êUëKç3âwÕ+Ó!ìÊÕ3åÐAË�Ú#Þ�ÙPíÆÐ!Ë�Ô�Ú�Ë"Ó!î+ä"ÞtË�Ì�Ï"å+ÕNaCl sa s ÎTärÕ+Ò�Ó0Õ+Ò2ËD×�Õ�Ì�Õ_ïyä�Ó!ð"ß#ËPÙPí�ñ�ËrÚÍAÎ�Ï ; è�é�êòÖ�æ�ä�ÓAðDß#Ë�×�ðÊÐ izopropanolom sa však

Ú8Õ+Ó�ÍAÎzÏ@ÓAÕ+ägÒ3íZÍ]árËÀÖ TE tlmivom roztoku)ó zrazeninu nukleových kyselín oddelíme centrifugáciou pri 12 000g, 5 minút pri 4oCó Ð]Þ2Ò2ÏDÓP×�Ë)â0Ë�×#âUÕ2Ý_ÐAË]Ù`Ï�ïNÏ�ëôÐ0ç3íïXË"Ö8ç3Þ=Ò2ÕÐ]â0Ë)Ö2õ�ïNÏoÝ�Õ�Î�×3Ö2Ï"Ó0ä�×8ÏPÙ�Ò2Õ_Ì�Õ�Ú3æÉ×�Ëoö]Î�ÌfâCÓAË�÷�×3ÜÉÒ2Ë"Ò2Î�Ï"Ó

a odstránime všetky kvapky izopropanolu zo stien skúmavkyó ø�ùAúDø#û"ü�ý�ü3þ ÿ ��� � ùAû�����û��Nû��� ���������ú���û�ü���� ����� û��0ú"ü������ � !"�0ûDü#�$�&%�ù'��% � ���)(�*#û

��� �+�Cù-,"ü�ý/.Xø� ��10-%��qý�ø2� � ù-� � ú"ü����fþiúMø ��30`ý ù4�+ø � þ5�$�Cü��3�6.� 8ø2��ù'%���ÿ ��� TE), vysušíme vo

vákuu a rozpustíme v 50 7 l roztoku TE, ktorý obsahuje pankreatickú RN-ázu bez

DN-ázovej aktivity (20 7 g/ ml)8 kontaminujúcu RNA odstránime inkubáciou 15 min pri 37o9 ! � �:�$���;�$�<%3ù=��%3þ>�)(�*#û

ü8ú��-��û����� 2ú?.UûA@��CùAú%��rýzú;� chloroformom na odstránenie zvyškov RN-ázy)8 � � ùAúB���� +ú"ü#C � ��ú"ø2�NýD���� �C%ÿ ��� �E(�*#û��Xû � �F� ����EúB��ûrü�G � �3þ�*#ý�. � ù�ýzúH�E� ü�úI06�0ý�û � û�ü�ý�û

ùAû2�6�CùPýJ%�K�ü����Ný2ûrü����+ü#þ�% ��û2,"ø#ú��Ný2úH��ûAL��MCþIþ1������ �,H�Nû � ùAý�N6O�� oC.

Page 20: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

18

PRQ�S�T�S�U�VXW)S?Y=Z T�[J\�]^W)_ `Aa^b�]�c d)e�f�gih'gij�e�k�l�m�nXl'opm�lqk�r2s#t-gvuXe�woxuHd)yzk�{�|�}�e�f�~2gDu�}�ej��1�/�=g�k�l�s�m�n�}�e<d)l��=uA�=gD���/���4d�lA��g����4uA��lA�-��|�gvlA�?� ���'g�gi~2e��i��|�gDg����vlH~2d)gvf�e�k1u'oM������dE���2u�d�u���e����#g��l'oR}�e#�$e�k�nB��j�e�d)uA�-s�m�u�f�e��$�+����m�n:�6�����4l�k�y���j��$e��-n�m���d��1d)e����#�Bo'� gi~2e �ie�k�l��¡���vlA~2d�gvf�e�k��¢�����vj��ie m�e�k�l�|�u'o£sHg+�$�=e#�=u��#kF�'��~�m�y�|�})d¤m�e��¥�6�+k��2|

h (napr. Mini, Midi a Maxi Qiagen kit).

Replikón: pMB1¦¨§�©«ª�¬�­$®�¯#°�±i²;ª�³´�µ'¬�¶)·�¸$¬�µ¯�¹�ºv»�¼�½�¾Gén rezistencie: Amp (ampicil ín), Tet (tetracyklín)

Klonovacie miesta: EcoRV, BamHI, SphI, Sal ¿ÁÀ�Â4ÃXÄJÅ�Æ¥ÃAÂ4ÇAÅ#ÈÉÄiÅ�ÊAË�Ì'ÄJÍ�Î�Ï�Ä�ÐÉÑ�Ò�Å#Ðrezistencie na tetracyklín, Pst ¿MÀ�Â4Ã�ÄÓÅ¥Æ2ÃAÂ-Ç�Å2ÈÔÄiÅ�ÊAË�Ì$ÄJÍ�Î2Ï�ÄJТÑ�ÒÅ#Ð>Â-ÃAÆ2Ä+Õ6Ì=ÃAÅ�Ï�ÄvÃ�Å�Ê�Ê�Ö)À�ÄDÏ�Äv×DØiÅplus unikátne EcoÙÚ¿�Ö)ÄvÃ#Õ6Ì=Û;Ü�ÃAÆ;ÖEÛ�Ý�Å�Û�Õ$Ì'Ä3Õ4Ã�×DÃË�ÏHÄvÃÞ Û�Õ+Ì$Ä/Ì=Ã�ßAÕ=Ë�à¤Û�Â'Ñ�ÊÅ�ÄÓÆ2Ö;Ð�Õá¥ßâÐ Ü�Û�Í�Û ß«Å�à¨Ë Ö�Ã�ã Escherichia coli (napríklad HB101)

ä Ü�Â?å2æ5å+ç2åMÙèÃ2Õ6Ì+Â=ÄJË�Ç�Å�ÎéÖ�ÊAÀ�ÊêÀ�×iÊAÆ2Ö�Ävë#Ð�À�ìíÙ�î�ï�ï5å

pBR3224361 bp

ROP

Amp

Tet

ORI

B a m H I (3 7 6 )

C la I (2 5 )E co R I (4 3 6 0 )

H in d III (3 0 )

P s t I (3 6 1 2 )

S s p I (4 1 7 1 )

S a l I (6 5 2 )

S p h I (5 6 7 )

Page 21: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

19

Replikón: pMB1ð¨ñ�ò«ó�ô�õ$ö�÷#ø�ùiú;ó�ûPromótor: lac

Gén rezistencie: Amp (ampicil ín)ü¨ýiþ ÿ�þ�������������� ���������þ�ý���ý��iÿ������ þ��� ����! #"%$&�#�('*)+ �ÿ�����,-�$ÿ��.���/���� 0�����1��2�ÿ�3��#�4���� 0�5Eþ& 6���7���#8� ��.3 þ��%9��Aÿ���:!+ ; *�

Escherichia coli s delta lac mutáciou (len pre modro/bielu ���ý�����#�1 �<�ÿ������>=!?A@B'*C�D�E�<.����F1���#G�ÿ���8A ���þ���þ�8«ÿ�3��iÿ�3�=

H ���>=!IJ=LKJ=NM��! 0�6���1��2�ÿ�,O4�*���N� ý��:!��G� P��QSRS'#T�=

p U C182686 bp

Am p

LacZ -alf a

Lac prom otor

OR I

Bam H I (430)

Eco R I (451)

Hin d III ( 400)

Pst I (416)

Sma I (437)

K pn I (443)

Ssp I (2504)

Sal I (418)

Sph I (410)

Page 22: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

20

5. Elektroforéza v agarózovom géli

Agarózová elektroforéza patrí medzi jednoduché, pomerne rýchle metódy na izoláciu,UV�W#X�Y�U�Z0U�[�\#]#U�^`_(a�b�W#c#Ued�Y�W�X�UWfZ6b�_�g�hPW�X!Y�i�jlknmpo4qsrtW#V�u#UwvxW%vyj�z�{�i|V�}~a�_-Y�b���_%v a�b%U_#hP_�V�W-Y�W�[�]#U�_fragmentov DNA v ultrafialovom svetle, pomocou farbenia s

Z��1^��.b�W!d�]#W#X�c#X�z�h�U�X�Y�W*b%[�_#�e_!c#X�z�hc#U�X�UV.��i�h4��W-Y%��V.U1^�hS��b�i|h4UV�i|h4�w[�Y�i�b���{�i�a�b��7Y�i�h4X�i�d0��^�h4i����!^#vxWyj�U�u�^�_#�eU�u!i�j�_-��j

agarózovom géli^����*�4X�gpknm4o�_#��W���ip��m4o4qS��z�]#{���iJd0��a�i�{�}���^�Z6b�_�g�h�W#X�Y�i�j�knm4o�j agarózovom géli závisí od

týchto hlavných parametrov: od molekulovej hmotnosti DNA, koncentrácie agarózovéhog��#�7^��|[�i�X�Z�i�b%h4\!]#UeWNknmpo��.j�W���[�i&d�Y�U|a�i�^��!U7Y���{�i�X�_�a��-Y�U�_�_�i|V4u#��i��!W#X�Ue_�W#�W�[�Y�b%i��1}!Y%U]�[�z�]#{4b�i�u-Y�i.[�i�j�_teploty delenia.

Elektroforetická aparatúra:

Aparatúry na elektroforézu v agarózovom géli sú dostupné od viacerých výrobcov,U]#{�d%a�i|��i|c�X�z�h�a�b%j�[�i�h�v�W�� �!W¡d�¢£[�i�X|¤�Y�b0^�i�j�_#X��¥j horizontálnom prevedení, ktoré má výhody{��_�j�X�W4a�b�W�h4i��#X�i�d0�Pa�i�^����1j._�X�U_4X��¦u�[.}.]�{�[�i�X�]#W#X�Y�b�\#]#U¦�§_*g�_�b���u!i�j.��{�i�g��#�7^�� j�_�b�U�_���U�eU1Y6^¨j.W#��[�i�d0Y�U

pripravovaného gélu, jednoduchú prípravu a manipuláciu sg��#��i|hS� Z0U�X�_#X�c#X�¢©X�W�X�\�b�i�c�X�i�d0�Pa�b�U

prípadnej konštrukcii aparatúry.

Elektroforetické tlmivé roztoky:

ª b%U«_*g�_�b���u!i�j.W%v�W#�W�[�Y�b%i�Z�i�b���u!W�d�_pa�i�^��#�1j�_%v%¢£j�U_#]#W�b��PW��W#[�Y�b%i�Z�i.b�W¬Y�U]�[��¥Y��¦hPU1j��pb�i�u-Y�i.[�}­_*[�id�¢¯®�°±b%Ud�²%_#]!W-Y�\>Y�i�j�z��;°±b�Ued�²0��i�b�\�Y�i�j�z�_#�W���i�°«b%Ued�²�Z�i�d�Z�\-Y�i�j�zPY���h�U1j|z�b�i.u�Y�i.[�� i���}�c#_%vAX�Wpj

koncentrácii³ �¥h¥r´_Na�µ·¶�� ³ ²%¶¸�e¹�q+°«��h�U1j���b�i.u>Y�i�[�}4a�b�W�_�g�_�b��.u�i�j¸¢�W#��W�[�Y�b�i.Z�i�b���u�^­d�_Nj��#c!¤�U¦X�i�^�a�b�U1a�b�_�j�^�v0¢�_*[�ikoncentrované zásobné roztoky, ktoré skladujeme pri laboratórnej teplote. Nariedené naa�b�_�]#i�j�X�¢·[�i�X�]#W#X!Y�b�\#]#U7^�d�_la�i�^��#�1j�_%v0¢ X�_�a�b��1a�b�_-j�^º_�g�_*b��.u�i�j.��{�i�g��#�7^ _ Y�U�W��»_�[�i�j.i|V�U1j��hP�#V�U1^�h�a�i�c#_�d¼W#��W�[�Y�b�i.Z�i�b�W�Y�U�]�[���{�i�V�W���W�X�U_�q

½;¾e¿!À*Á�Â�ÃeÁ4Ä�Å>Ã�Æ>Ç0È�É�Á!Ê�Ë�Ê�¿�Ì#Í�Î�¿�Ï%Ä*ÐwÑ�Ò`ÈÓÄ�ŬæÆ>Ç�Ô�¿�Å�Ë�ʦ¿�Ì�Í�Î�¿Pʦ¾¦Õ/ÃeÌ�Í�Î�¿¥Å>¿!Ö#Ê�¿�×!Ø�Ï%Ä#Ù§Ñ�Ò�Ú

Pracovná koncentrácia :

0,04 M Tris-acetát 0,089 M Tris-borát

1x TAE 0,001 M EDTA 1x TBE 0,089 M kys. boritá

0,002 M EDTA

Page 23: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

21

Û�Ü�Ý�Þ�ß�à�áNâ�Þ.à�ã#ä#à�å�æ�Þ�ç�è�à�áNæ�Þ�é-å�Þ.â�êSë0à�è�ç�Ü�ì�â.êPà�è�í�î7å�ä�æ%ï-ð242 g Tris báza 54 g Tris báza

50x TAE ñ¸ò�ó%ô�õ4ö ÷ ø#ù�ú!û�ü|ý¬ú�þ�ÿ���þ������ 5x TBE 27,5 g kys. boritej

100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0 20 ml 0,5 M EDTA pH 8,0

Postup prípravy 0,8% - ného agarózového gélu na separáciu 0,5-20 kb fragmentov

DNA:

� � ������������������� !��#"%$�&#')(�*,+#���-�/.0+2143�*��5 �6879"%*���!�:6;�*<��.��#3�79"�*�=9*�">�?79��5!3�:�;�*479.��@�A�B:�;�*roztoku TAE alebo TBE

C agarózu rozpustíme vo vriacej vode, v tlakovej nádobe alebo v mikrovlnnej rúreC roztok agarózy ochladíme na 50D C a pridáme etídiumbromid (zásobný roztok 10

mg/ml E�FGE�F�H�I�JLKNM�O�P�H�F�E�P Q R�SUTWV X C v tmavej nádobe) do výslednej koncentrácie 0,5Y g/ml

Z tesniacou páskou zalepíme okraje podnosu na prípravu géluZ [�\/]�^�_�[�^a`cb�d@egf�`ih9[�ejd�f@k�l%f!m�f n o�p/q�r8stq�u�v%w!o�xgwzy{p6|�xgw!}-~�v%w@o�p�o����%p�o�xgw�q��8u�vUxAw!})�i��v%w!��w6�@y{w�������i�9�i�������!���-�N�!�����8�z�%���������%�i�%�����#���������¡ >����� �>¢£�!�¤���¤�����4¥��������a i�B�¦�¡ t�N���9���¤�!�����§ i¢¨�©%ª?«%¬�­A®�¯±°6²�³ ´�®¶µ�·¹¸t«tº�»�¼8º�«�²½ª!¾�ª!©%¿�À�ÁÂÀ6ª?ÃB®!À�µ�®�° ®6¼�ÄÆÅ�Á�«tÅ�·�©%®!¼�­g®Ç´%ª�³�­g®!¨È¸

dnom z

agarózového gélu)É Å�Á�Êg®�´{®6³�® µ�©U­�³�®!©%ª�¼�ËÌ·�Ã#´{®�³Â©%·�À2«9·�¨�º±ª!¾�ª#©�¿�À!Á Í�·�Î<¬�²Ï©N¨�ÁÐÀ!º�Ã�·�Åѵ�·�º�Ò�­Ó«NÄ!»�·Ñ»�©%®!Ã�®�Ô�ª4ª»Õ©iÖ�Ã�¨�Á�¾�Ä�ÊϺGÃÕºBÎ�®×À8Ø!Å�­t¸%­g® Ù Ú�Û#Ü%Ý�Þàß�á�ß�â�ã%á�ß�Ý�Üåä�æ8Ú�ç�è�é/êìë�íïîñð�Ú¤ò�ç�óÏò�ç%á!ä�Ý�ß�ô6õ�ÚGò�Ú�ð�ß�Úaöi÷�áß�Ý�ø�õ�â6Þ�Ýcä�é�ø6õ�ùgá�ð�ß�ú�û ü�ý%þ�ÿ�������ý�����ý��� ����� !ü�ÿ����� ������%þ������������@þ������ �

! " �#�$�$%�&���%���'(&��*)�'�ÿ+%-,�./�0 !ý%þ1 2�3 4&�ý� ��0 25�67��89�$�9ý�:���þ��3 ;�� �����þ<�2=�% ü�:���>�%06 ü���8����?�@�A)�'#ÿ��9�,�ÿ���BDC1�3 E8��F !ÿ� (>��9ý��HG ��ý� I�9þ�=�>� ��A�#ü��!ý����$��ý�.J� " ��ÿ� ��K L�3 4�

identickým 1x koncentrovaným

elektroforetickým tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,5 M g/ml etídiumbromidu tak, abyý�� " � ��> ü�ý� ��N��&���,���ÿO)�'�ÿP8�� ,�Q?R�>�. ���%þTSU�3� ����)��#ý� " ��,�Q )�'6ÿP�V��BD 2�W G��#ýX��þZY �� C[8�þZ%0�\��ý��9�@þ<8��9�]��B�ü��^��>�����_2 2��C`8� �ÿ< 2��þ1�a,H�bG �!ý���þ<�2=2��� ý�� " ��H>�%4����>�BL c&��b�� 2�7%���C��3 ,�BD8�. ü�ý%þ�8�:�,0��Yd8��Èü�ý�þÏü�ý���,H��,H�2��'L&��e)�'!ÿ+% �f 6ÿ< �>��9ý���G ��ý� g�9þ�=�>�'2&��Èý�� " � ��>�%06*,�Q�&��98���%ü�ý%þ��2�3 2&��;G �#ýN�H 2��þ1�W)�'�ÿZ%h �� C�8�þZ%?�i��ýN�9�@þ18����j�K �,kR��(>;�\�HBD���?�XY ü�� " ��ý���,H����þ<��ü��H&�./��ÿjþZ,��?�X�Nþfragmentov DNA pod UV svetlom v

>����ýN X��>���lm,� �>VG�: " n 6ÿ< �>��9ý���G ��ý� g�9þ�=�>�'2&��38� 6ÿ[ L��þ<���po! do jamiek v agarózovom géli, zaliatych s elektroforetickým roztokom, nanesieme

pomocou mikropipety vzorky DNA zmiešané s nanášacím tlmivým roztokom.qsr�t�urHv�wEx�yNz|{�}L{�~D��}2{��<z|��tDr�y���z�vE�n�W����}�r���w��D}���{�zax�y��Zx�y�}��/�2���������(���hv�rH{��2z2{�u y�r���}�{��@}

Page 24: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

22

obsahujú glycerín alebo �N�2�2�����N�H���0���D�  ���¡¢� £� g¤� ��¥�D�k�X�� �� ��-��¦V �§2¨�©n��ª1«���¨D��� ¬1«;£��D ����H­®s¯�° ±  U¨���¨�¡�²��³��«�¤´¤I�2¦V��­µ�·¶ ����¸�¬Z£� U¸��N�9¦V¶ «L¨� 9ª� �£�¹ ¦3  ± �X¹0�¥��� H�Nº·�D��¸H«��2»�«2¼g�2¤K«£�¬ ± ¬+��«2½g¨� ?�X¾¿»� H��­/¸�� ²X�����X� �£H�2�2«�¤W�L�H¨�­�ÀX¸��N�H¦Á¶�«2¨� 9ª� �£�¡Â¦\  ± ��¡E¦V¡4¨�©Ã�³���#¦V 9ª<«����0ª� �£�¹��¦V �� ¨� ?�X¾c�|£hÄ�ºLª�¬Å���@»� H��­/¸��2¤K«E����  ®s¯V° ¶$����Ä�¦V«2¨��\ h£H«2½ Æ�Ç?ÈXÉ ÊnË/Ì�ÌhÍ�Î�ÏgÐjÑÓÒ�ÊÔÍ�Õ�ÖD×�Õ�ØÙ × Ù2ÚÃÛ�Ü Õ@È Ù × Ù ØKÕ2Ý�×�ÞbÝ�Ò�ß�àDÞJ× Ù ×�ß�á Ù Î�ÒmÊZÍ Ú ÊÃÖD×�Õ@Ì�âZã Ù ÖEÌ�â1Ë ä åÂænçVè Ù2Ú Õ@é�×�ÇHÖ/ÈXÉ$ê�ÇÂæsç�èëVì�íDî2ë3î;ï2ð�ñ?ò�óZôhõ2íÂö�õ ÷/ø�ù(ú û g v závislosti od hrúbky gélu a šírky jednotlivých

elektroforetických dráh)ü ý�þ�ý(ÿ�ý�����ÿ�� þ�ÿ��Zþ�� ��������ý�����ÿ �����ý�þ������ý������þ���ÿ�� �2ý��"!#�$�����%�&���'��ý#��ý�þ������ý)()*+��ý-,/.0�

1 ���2�<ý034�0���65����7�8�0�9���:�03;��<9� ÿ =>��ý��?�A@ B7�03���<9� ÿ ��CD�HÿE�F�D��.�<6GH���%3I�%���4�J�"�0.0K�!0��� þ�ÿ ��L�;�0K�ý�M þ�ÿ �3<ý�L��ÿ�ý��N=�ÿ�����O����þ3��9���aþ���<���ý0PQ�8���ÿ !�RD��ý�ÿN�N� 1 ý0.0��ýS��=���ýT��0���U5 �[ý%K��"�S<�����;�V.SWG03I�YX[Z\</5 ���]�^ _$]�^ `ba_;c;_edf%c�gSh�i�j0kl9mnkl�h�oVp�hrqD^ sVo%_Il"mt`�d`�^�u�j�vxw�y�z�{9|~}~h"`�_�j�l>c�s0o0_$mna���r� i4o0�n�8l>c4p�k9� c���?� w��&����y�k9�"} z�krqNl2^���� p�k�^ p0�9k��"zOl�9]l9^�� �0`�gE`�m�?_4prgDq�h�_$��p%c4p�k9qD^�l��Dl2^ pbqD_�o�k9�x`�]`�^ `bq��^�mdo o���c�`0��h�_4��k2vU�

Farbenie DNA v agarózovom géli :

� l�g�kl2h"�0p�h�i�p0c;p�k9qD^�l��Dl2^Ef�j0v�zSa�v"]>h"p%��p�j%�9^ l���h�`�]�bq�_�` `�`�d`�^ u�j�l9a���df0c�a�v&� p�^ _;p0��pz ]l�9h�l6g�mY� � l�k�_�`���g ��p�hp�]�^ _���`0c4_8p�qDi���_$m6� �^ l>�8_4� ��l#df�c¡mn]�^ _�`0�8lz¢�¢£2¤�p0��p df0c¥j�`0�D`�^��_$���l��`FqNl>��h�p¦al al�9h�l�����`�^��_4`�o0l��n^ l�j�qDl�k9m8l9�6gE`0�rmV�E� oVl>� 0,5 § g/ml etídiumbromidu po dobu 45��_¨h9��q:]&^�_©c4`V�2l2^E`FqNu2^�h"p��ªq�p�]c�l"q�p�� � ^�_©��l6g�q�`«qDl��h"pE�¬kl2h"o0p0hrqD^ s0o0_�_ �­��� h"s"g c4p0��h�f8l�9�D`�^��l9a`0h�_4p df%c$ml9��v"�0`���hp®h�_;p¯�«p�hrm�qDh"f�wD]�^�_:h�_�¤�� p���kl�ho0p0hrqD^Es0o0_¨_ ���°� l�9��`�^��l9a`0h�i;� `�d`�^ u�j�l9af��"l±df0c'm��l6g�_4`0��h�p0��p?j0h�i�¤&p0h�_4p°]l2j�`V�2_�`�}b� � l2�8lo0l9m²pFqDi���_$m6� �"^ l>�8_4�rm7�8l�¤�p0��pQ��p�q�p�d�l9a`b�­�«pV�2h"l"a"c;s0kh�l9a9�aj dvojvláknovú DNA a RNA, hoci farbenie jednovláknových nukleových kyselín je slabšie

s ³0´�µ ¶D·>¸¹�¶º´¼»�½#¾�¿�¹�À�Á0¿�Â-ÃDÄ$Å Æ2Ç Á�¶ È0Á0¿�È0¹4»�ÉÆÊÌË Í ¶�¸2Á�ÎDÄ�Æ�µ Ï�¿rÅÐÄ4Á0Æ"¸ ѯÐ2Ò ¶ Á0Ä;¹�¿�ÒJ¾%»%Ã�»�Ç�ÓÁ0¿"Ñ̶etídiumbromidom posúvajú svoje emisné spektrum v UV svetle k ¸Ä¨¿"Æ"¸�ÔµÕÊ Ö�× ØÙ0ÚÜÛ&Ý�Ý7Ù�×Û�ÞÝ ß�Ú8àá0âäãEÙ�å�æ ç�è Ù�é&ê0èºç\â�æ Ù�ß9×%â"é2â>á0ç�æ�éç0ß�â9ê�ë�ì$ê â�æ çrãEí0ç0ß�í0î�â9êïbðñ¬ò ã�ØÙ0ß�óJå�æ â�ë�î4ì¨ô®õ­ö°÷ Ú8ø2×%ç%Ú¢ç�ù�â2Ø9ê Ú8ç0ßrú�â9éÙ�û®ëDârúNâ2ü�æEÙ�ëDâ"é2Ù0ß ò Ú åâùþýeÿ ã�é2ç�ú�ì�â>Ús åâ9ê×�î'ú ò Ú-áVç�æ�éç0ß�ó���â8ë�î4ì'úDæ Ù9ðEtídiumbromid je mutagénna látka, preto pri práci s gélom a roztokmi, ktoré ho������������ ������������������������� !�"��#%$��'&(&(&

Page 25: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

23

Stanovenie koncentrácie DNA:

)+*-,/.10�2�3�45276/893;:�2�3"<=.�>�:�4?273�,/6�@52�8�A�B/:�CD6�E!FG2�@?HI3KJMLN)PORQTSU)VO�WPA X(Y�Z\[MY9];Y�^�_a`1bdc/Y�e/f�g�h/bikj/l�m�n=o(p�q=p�n=p�r�l\n=o(s?t�m!uvr�l\nkw/x�yvy�z?l�{/p|q}z�~�w�o�l"i1t�l�������u�r+l\nkw/x�y��Dm"n=p�o1u�����~/������y�q=y�o({/l���s5l��N�V�pomocou etídiumbromidu.

Molekuly DNA obsahujú purínové a pyrimidinové bázy, ktoré majú aromatický

charakter a �\�!�1�9�}�����=�����/���������k���(���}�=�5���������k /¡¢�1�;�9���£�!¤¥�=����¦=�%��¤?��§�¨ª©"�«������¬��5�D� §�¤?¬���§/�(�®­ ¯I°²±/³ ´v µ1¶9·�¸1¹�º"»+¼/½�½�¾(¿�½�½'À�ÁÃÂ�Ä ÅÇÆ�È/ÆÇÉ�Ê�ËÌÉkÍVÎ�Ï¥Ð�Ñ�Ò�Ó�Ô?Ó/Õ�Ë×Ö�Ø�Ù/Í�Ú(Ô?ƲÛ�Æ�Ó�Ê/Ü�Ý'Þ dsDNA do párov A-T resp.ßRà(áãâ+ä1å(æèç�é�ê�ë=é�ì�ídîNïVðvñ/ò"ó1é;ô9õ7ä�ö!ó1é9ç(ñ/÷�ø�õdókñ/ù�ì�ë=ç}ú/âûó

minimom pre ü ý 235 nm, maximomþ ý 260 nm a hranou pre þ ý 300 nm. Meranie absorpcie v ÿ������������ �������������������������������ÿ��! "���

# ���$��%&�'�&���(�*) # � ),+��&%&- �$%!����. - ��0/ 1����2&- # �&3!�&����$+�465078� 9�:�;(<&=�>@?&=@AB;$?&C�;DC�E <GF C1H�AB=�A1I�J�KL:�;'M&NO=�:�P@IQ@RTS�UOV!W X�Y�Z [\U!S�](^`_@a b'ced�f$g�Q@hid�j�UlkBm�npoO[\[lq@kB]�r@s�t r@uvs�Q�[ w�]�Z ]�[ r�kxd&g�[ y =260 nm je z 260 { 20.|L}�~l�����O~D�!�l���1�����T� � �$�����&����� �&� ���D���,���*�(�����6���&�&�!� ������� ������1� �O¡(���$���B¢�£�� �$�B��¤¦¥O�$�����`§¨���ª©��«���¬�$���&�len do hodnoty A260 ­¯®'°�±D²0³&´!µ&¶,·�¸�±$¹@º�»�³�¼�³�º�³�²0±½º�»¿¾ÁÀ$¹�ÂxÃ�»�Ä ³@Å�Æ$Ç0¹�³&µ&À ± µ!º�»�È À$¾�ÃGÉ�Ê,ËÌÅ rozmedzí

do 100 Í Î@Ï1Ð0Ñ1Ò(ÓÕÔ!Ö ×½Ø Ù&Ú�Û Ü Ý�Ú&Û'Þ�ß�à!áâálã@ÝBä�å@Ü�æ å@çèÜ�Ú�á$é�ä�ê ä�áOå!Ýìë!ílî�ä1ï�ðGÚ*Ùñë!ò�Ú&à!á$å&ä�Øôó�Ú&ë$Ý�Ú&Ü&Ú@î�ßpomeru báz a õ ö ÷1ø�ù�úOûâü�ý�þ&ÿ������&ý�������ü�ý� �����������ü�ý� ù� Bö���� ��&ÿ������ ��!!ý"�#�"$�%'&�()! rôznych

!!þ*��ý��ý*�+��ö,�*-�þ�.Gÿ/�0�1�2��'÷�ù1ø3�4� û&ý�þ*�&ý* Bö$ÿ�� 5 260 a ���'ÿ��1��ö�����ö67�8��-� ����9��$���ý���:;��ö��<!!ö(ø= Bö;��þ&ö;��þ��*��ú ûpodmienok pri izbovej teplote (10 mM K2HPO4/KH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,0).

V ��ö*��÷0�¬þ�-�2.�ú��2> Bö;�*-@? ABDC2E6F�GIHKJHML�HONQP�RTS�U"B�V�B;WXZY�[3B;Y\�]7^�_`A\�W�abBcW�^�[3d�a�egfK[3h"ibW�BjU@B�k7A�la�mn'o�p U�i�m�kqFbV�\srtW�FuY\s]bB�^�Yd;[#\�UvGd;i�w8A*^�\�[=l�a�m p 260=1 pri koncentrácii 50 x g/ml. Hodnoty

molárnych koncentrácii v ^#F�GyS@k7ABzG"\s{ge|Y�[3B;Y\]�f�^#F;W�X�i�F�Y�[3B�V*Y\�A�{0FbV�SuY�[3egB�r/B;[3W�B2}<r�\s{�B;A*S@{g\"U"B�}hmotnosti nukleotidov 1 bp = 660 D (Daltonov).

E6F�GIH�JH�L�H;~�[3B;Y�\]7^�_�A\�W�a�B;W�^�[3d�a�egB n'oQp U roztoku.

VsP n'o�p Y�\]�B�^�r�\s{gB;A*R@{ r�\s{4d;[3W�F (50 x g/ml) na ml mol/ml koncentrácia

Bakteriofág � 9,78 x 1011 1,62 x 10-12 1,62 nM

pBR322 1,09 x 1013 1,81 x 10-11 18,1 nM

pUC18/pUC19 1,77 x 1013 2,94 x 10-11 29,4 nM

Segment DNA (1kb) 4,74 x 1013 7,87 x 10-11 78,7 nM

Oktamér dsDNA 5,92 x 1015 9,83 x 10-9 9,83 � M

Page 26: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

24

Pri spektrofotometrickej metóde meriame absorbanciu vzorky nukleových kyselín pri��g������2���"� ����>����������>���y�����+������*�������+ ¡�����/�;¢3����£>¤�¢3¥¦����j���§��¨��ª©@���s� «�¬b­=®`¯�°#±;²�³*´µ·¶koncentráciu nukleových kyselín nasledovne: 1 A260 odpovedá 50 ¸ g/ml pre dvojvláknovú

DNA, 40 ¸ g/ml pre jednovláknovú DNA a RNA a 20 ¸ ¹*º�»½¼¿¾�À3Á ³ ¼ µ ¹ ³�²�¬Â ¼�Á ³�°�µ4Ã�Ä@Å�Æ À�Á °�³�Ç Á¾�À3È °M³ » ²�³�¯=¶�ÉËÊQÌ<Í ¾�À ³�° Á;È ²�³*´ÍZà Á ° Á;À2¹Á ²�°�³*´§± ³ À#¹ ±;²�µgÎ;Â�ÏÎ�Ð À ³�Ñ ¾ ®IÒ=¶c±�Ã�µ Á�¼ ³�´ ¾s¼ Ä*´«*¬b­ ÁÓ¾�À µ Á;Ô@Á б Ô ¯�³ À�ÔÕ ²Ö�Ð�³×¯ ¾Á Â*° À ±�Í »�Ø Ç ÁÓÔ Äy¶Ù¯ ¾Á Â*° À ³"Ú�³*°�³ »�Á ° À µ4Î;Â*Ä ´�Ä�Ð�³sÃ�²�³Î�³*´±�²�Ûܵ Õ µ�¯=°#³�°#±Ý´�Ñ�³ À Â*Ä�ÅÞ Ñ�Ðßq±�Ã�³ »  °�³ » ¬@ÍZÇ Á ²�±�­ Ô@Á Ç�² Á ­qÒൠÁ Ñ�² Á�Õ µ�¯2¶;¬b­=®�Î�µ » µ ¼ Û�°�± » µ bývajú proteíny, ktoré majú± Ô ¯�³ À�ÔÕ ²Ö » ±báµ » ¬ »¡¾�À µs´ ¼ ²�³"´ Á ­âÃ"ãgÇ� Á8ä�åyæ ² » Í ¾ ³�¬Ç È ´±�¯3± Õ ±*¯�°#³ç±;Â�³ç À µè°#Ö À µ�¬ »éÕ µ�¯�°#³�°�Ä ¾ ³ »�Á;ÀA260/A280.

Pri spektrofotometrickej metóde pomer A260/A280 ¾ ³�¯#Â"Ä�°�¬1­ Á µg²�Ú�³ À3» Û�Îcµ Á ³ Õ µ�¯=°#³�° Áê�ë3ì1êí;ë3î�ïMð�ñ+ò�óôsõgìbð�ñ�ö"÷cøçô�ù�úàì�õgûgò�ü�í;ôjó�ñ@ì�ý�ì�ò*ö+êðsþÿì;ë8ý�ð�ú3í;ø�ó��àìQø�ðsý*ò�ð�ï�ù����������Iþ� ��cìcþ/ì�ø�ð*ñð�ë����������������� �"!$#&%'!�('#*)+�,�-���".0/�1�2�%3��4$��� �"1$56�&%�2�78.:9 ;<.$%=���>���?%'.$�@%A!$#&%'!�('#*)+�,��4B.0/�1�2@%��C4$�����D1$56�&%�2�78.E�F %�.��-28�-G�HJI��@%�281���4��8.�(�GK�8LNM�.$�8O'/3PQ%R/�4�%�S$%�.�TU!��$G�%'#*.$TU�$��SC.$�C�>5�HK���VM=)'#?��4�%'WXM=.$�YO�/�PZ%U!$#*%0�*.��[��\spektrofotometrického stanovenia koncentrácie DNA alebo RNA.]_^=`Dacb ad^fe g�h>ikj�l$m=n8o�h�h�adp�q�r�ats�l�ui�v>w�lXs0x�e�q8^�lCw$y�o�z{e�|}iZ^ q8n8sVp�q@^3~�l�w�m=l$�ke�p����t���*^kontaminovaná látkami, ktoré interferujú s absorbanciou v �_�"���}�+���@���*�t�$���$�������t���C�������d�$�stanovenie koncentrácie nukleových kyselín etídiumbromid. Interkaláciou etídiumbromidu do

molekúl nukleových kyselín sa v UV svetle emituje fluorescencia, ktorá je priamo úmerná���$�$ �¡��0¢�£*¤� �¥8¥ �0¦���§@¡���¨$©� �ª �$«6¬&¡�§�­8�6®°¯�����±¬�¢>¨�� ²�³�´ ¨ ¬k�Cµ}¶d· ��¡k¸ ¨�¹=�$£k��¡ ¬>¢?·'����¨�­8¶d¡porovnávaním jej fluorescencie s intenzitou fluorescencie riedenej sady štandardnej DNA o¹���¤�¶K¡k¸<������ �¡��0¢�£*¤3  ¥8¥8º$»C¦}¼¾½$£*¥8·�¶��t¨

agarózom géli alebo na parafínovej fóli i pod UV svetlom.

Stanovenie molekulovej hmotnosti fragmentov DNA :

¯��$§8¡'�C¦}§Y«�½-§@·'¹=¶K¥@¿$�C¨�¡k¸À²�³�´Á½���¿$§Y¥@¡�ª$·k¸kµd½��-Â3·0¬<¥�¹=�-§8¤3  ¥@¡�£*Ã$¹��C«�¶Ä¹=¶K¡���¤ ¶dº�¨ závislosti��·t¹�¨��-§Å¡ ���-¶Æ½��6¬�¢>¦�½�¡�º[¢?·��$±=¡c¨$©�¬*§@¡�¿$�C©Ç½$£*¡�½�·'£*¤+¢È¶cÃ�±=¡d��»}¬*·'ª���¨}·ÊÉ Ë�ÌÎÍÐÏkÑÒÏ*Ó$Ô�Õ8Ñ@Ö�×�ØÚÙ�Ó$ÏkÛÝÜÇÞ�ßKàdá

superšpiralizovanú (superhelical alebo covalent closed circular, ccc), kruhovú otvorenú

(relaxed alebo open circular, oc) a lineárnu (l â*ãåä Ïkæ ä Ë�ç�×�è¾Ñ@é'êUç$Ñ�ÛdØ'ÏkÜ ã�ë Í�Ó$Ï�ì�é�ê ä Ó$êCÜCí�Õ@ÑYî�Ó[ï�ðv agarózovom géli je rôzna. V ä Ï?æ ä Ë�ç�è ã Ì=è�í�Ë ë Í?è'ÏkÑ8ñ�Õ8×CÜ ë Ûdè ò�Ó�í}ï*Ë�ê0ó3ôZèRî�Ñ�Ë3é�è'Ï*Ó ä Õ8Ë'Ô=ÛKÑ@ç$ÓCîÛ�õ$Ì=èÚî�Ô=×$Ñ ë ×0ö$ð ä Ï&Ó�í�Õ8Ø�Û ã÷ë Í,Ó�Ï�ìøÙ>Ï*Ë�ù-Ûdè�×0Í ä Ï*è�ç-ï>Í?Ë+îCó�ôZè ccc formu pre stanovenie molekulovejú$û�üCý�þ$ü6ÿ�ý�������þ���ú$ü������=û ��������������þ�ü�ý����������ü��*û! "�#��$��û%���$ü��&�('*),+%- û .�/0��û%��������þ0ý1�2�1�23�ü4�&��5pomocou dvojrozmernej agarózovej elekroforézy po expozícii fragmentov DNA v UV svetle6kü�/7���8�9��þ��:�!;!<"ÿ����+ý�8ü-û�ÿ(�&.6ÿ*ü4=4��'>�?'@�7��þ�üA�&�B$3�þ$ü4���C�08ü�ûD �E

nicks v F7F7F )G+�-Æûcü#��$34�H�B F úAI ÿKJ7L8ûsúvisí vznik relaxovaných otvorených molekul DNA, ocDNA). Novo vzniknuté oc formy

Page 27: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

25

majú v M7N&M$O9P�Q0R�S N&T7U�VWO9RAXAY�M$Z4[]\&R�^4_a`HU�VX�Rcb�deM$Z&R�\&fAX�R#g4YAThY�i�i�jA\&R�YARAX�M7Y�T oc k�R�OlS!_cmDnDi7o\&R�O(R4X�YAp7S�i \&R�^4_a`&U:V�X&Rqbrd s,t%uvkwO@M$N#S%i7Y�x1R4X�\�Ryi$U�i$Z4x�O1R�k�R�O9T8Q0i?z9i7g�Y4{&S|b9S%i$O9R�S}b \&R#^4_4`�U:V�X&Rqbrd�RA~pôvodných a novovzniknutých fragmentov DNA po expozícii pod UV svetlom a po

elektroforéze v g�Or~&^AR�S�b9S%i$O9i7��SDf��0i7S i�z9i7g�Y�R�Q0Y�M7�8Y&i�brx1M8Y�R4X&Vd�\�O9��x1R�S Y�RHbrdGz9i7g�Y�R4x�U2V�X&{&�7^ ccc

foriem DNA, ktoré odpovedajú príslušným novovzniknutým oc formám. Všeobecne oc

formy DNA (platí pre plazmidy do molekulovej hmotnosti 7 kb) sa pohybujú v agarózom géli

najpomalšie, potom nasledujú l formy a ccc k�R�O9SD_A�HZ4x1R4O9T�b9M!\AR�^4_a`4~�z@[�Y�M(z(O({&�7^�U�i(z���V�i7����R�br[�X&V:b9�s V��7^�\�O9V�i�brx1R�O1RAX�RA~ ZAR�Y�k�R�O(S%p7�7V�R4~�M?Q7Y����0i7Y�R4~�b@�$^�R�\�Y�RHbrd�R4~WV�Y�x1i$O1Z&M$U�p7�7V:i,i�x���g�V�~�S!`&O9R#S V�g�~�m

u,Z�`&M8Z4x1i$O(V�p7U2Y4_�Z&S%i���R4`Hb@M�^0~7z�i�U�i7YWz9i7g&i7Y�\&U�M$Q0S�V�g���Z4x�R�Or{�S p�~�Y�V2Z&p�x�Y�i���x(V�i8\#YAi�S V�i4brx1R\�O9i�O9i0brxwO1V�Z&�7Y�[�i7Y�g�R�Y�~&Z&U�i7p$Q$~���S R��0i7S%i�V�Q0R#U�R4X&M7Y0[�Q7S%i4b�k�R�O9V�i7S \&U�M$Q0S�V�g�~�U2V�Y&i7M8OlV�Q0R4X&M$d�Mb�x1M$Y�R4X&V�d�SDR#U�i$Z4~�U�R�Xa[�^�S R4x�Y�RHbrd � l” �����9 D¡ ¢&£�¤$¥0 �¦�§��4¨&©(ª¬«K­�® ¯±°²�#§a�A³A´&©µ´A¶7  �9©�·�¸��(¦�¹�º7´�¶¤$´A¤7£2»�¥a¤��9©8¹&�� !³&¦�´&¤7´�¸�´4»&¼7½�¢&£:¤8¥� %¦�§��A¨�¾�  ��¿�´�À�·r¸1¤$´A�A¨&¦�Á�¨&©7Â>¹&�H·rÁã�¦�´&©�¶8�(´&©7½��Ĺ�£���´��4¨&¤7´�Å7½A��w�9¤8Æ# %©7´�¸w¾ Çr¢��(¦�¹&��´#È�¸��r¾&¹&¼7¦�¦��9©$¹&�# !³&¦�´&¤7´�¸�´�©(ªÄ«K­%® ¢&�4¾&¿7À�¨&¤7 %© ¢&£:¤8¥� %¦�§��A¨�Å ¨&©$¹4¸1�4��¡ ·�9©0·r¸��(¦�¹&º7´4»& %¦² %¦�©A·�¸1¤7 C¦Éc¹4¸Ê���@ÅË´�¶7 Ì¾�  ��¿7Í�¾�ª(Î�¼�¦�©7£�©7´�Î�¤7´�¤7£2»A¥$¾W¨&¥0´�¦�¹#´0¾�¸1Å$½��W¢��(�&§�¾&¹�¸w¾AÏФ$£�©$³���¢��(¦°ÒÑÔÓÕ¤8´�¤7£2»A¥4©?¢&��¸w¨A�9§�¦�Á?¨�©7Â>¹&�H·rÁÖ·(¡�´0¸1©�¸�¦�¥0�A¨�¤7´�Å7½�� �w�9¤$Æ& �©7´0¸w¾C«G­ ® ¯

Podstata stanovenia molekulovej hmotnosti cirkulárnej alebo lineárnej molekuly DNA

·1¢&�#º7À�¨&¤ ¨ porovnaní pohyblivosti fragmentu DNA nášho záujmu s ¢&��½4¡4³&£�¦�¨&�H·rÁ��A¾È�¸1¤$´�§�¤$�@§4´4»&¼7½��w��¤$Æ& %©�´0¸��4¨ «,­ ®Ì·@��¥7´A¶7  �A¾�  �#£©$¹4¾&£���¨&�4¾×½�  �4¸�´��H·rÁ��A¾�¯�ØÙ¦�´�©7¶8�l´A©!§�¨&�8ª@¨&£�¶$¹&´��4¨�Åmolekuly DNA sa pohybujú v agarózovom géli rých£��²·�Á0�4¾�ɬ¹�¸Ê���9¶�ª9©�´�©8¢��l¦�¤7  ��ÎH D©$�9´�¶logaritmu ich relatívnej molekulovej hmotnosti. Ako štandardy na stanovenie molekulovej

½�  �4¸�´��H·r¸�¦Ú�w�9¤$Æ& %©�´0¸��4¨¬«G­C®�·9¤×º7¤4·r¸1��¢A�A¾&¿�À¨�¤�¥0 %©�·Ö§4¨&�$ª(¨&£�¶$¹&´��4¨�»&¼7½�£�¦�´&©0¶$�(´4¡&¼7½��w�>¤8Æ# %©7´�¸1�4¨«G­C®�·@��¥�´�¶7  �4¾¬  �&£�©$¹4¾�£���¨&�4¾×½�  �4¸�´��H·rÁ��A¾�¯0°���¾&¹&��´�º�©$´�Àq©7£�©$¹4¸��(�������9Å$¥7¡×·9¤Ë¥0 %©$�9¦�¤±¨�¥0§�¦�¤7£:©7´A�c·�Áfragmentu DNA od štartu a porovná sa s ¢&��½4¡a³H£�¦�¨��c·�Á0�4¾�Èw¸1¤$´�§�¤8�9§4´�©(ª�«G­�® ¯Ô°Ò�ÛÆ��9¤$��¦�¼$¹&�# znázornení pohyblivosti jednotlivých fragmentov štandardnej DNA v závislosti od logaritmu

¦�¼7½�  �#£�©$¹4¾�£��4¨�©@ª ½�  �4¸�´��H·r¸�¦ÉÜ�&§�º$À�¸1¤7  ©×¥ grafu na základe pohyblivosti hodnotu logaritmu

  �&£:©8¹4¾H£���¨&©(ª}½� D�A¸�´A�c·�¸�¦�·(¹4Î�  ¤7´&Å�½A� �w�9¤8Æ#  ©7´0¸w¾ «,­ ®�Çʨ&©�Â>¹&�c·�Áy�w�9¤$Æ& %©�´0¸1�A¨Ý§�¨&��ª(¨&£:¶8¹#´A�A¨�©@ªDNA sa uvádza v ¢&�#º�¸1©�³&¶$¥0�4¨�»A¼7½*¢&¶$�9�4¨&ÉWÞy¹�¦2£��³&¶$¥�¤�ß}Þ�¹�³Õß�Þ8à�à�àá³�¶$¥0�4¨�»&¼7½*¢&¶$�@�A¨�É�Þ�¹4³§�¨��$ª(¨&£:¶8¹#´A�A¨�©@ª�«G­�®��&§4¢��4¨&©�§�¶�  �#£�©$¹4¾�£���¨�©(ª�½�  �4¸�´��H·r¸�¦Gâ�â�àÛ¹4«ÖÏ�¯äãÖ©7å�¢&�A¾&¿�¦ ª�©7 %©µÈ�¸1¤$´�§�¤8�9§A¡DNA, ktoré obsahujú fragmenty s £�¦2´&©�¶$�9´�©h·�¸wÎ&¢&¤@ª�Î�¼7�A¾æ D�#£�©$¹4¾�£���¨��A¾æ½�  �4¸�´��H·rÁ��4¾çÇ$Þ8à�àh³�¢rebrík - ladder, 1kb ladder Ï@ÉË  �#£�©8¹4¾H£���¨4Îæ½�  �4¸�´��H·rÁÕ·1¹4ÎH  ¤7´AÅ�½A���w�9¤$Æ& %©�´0¸w¾�«G­C®è Dé�¿0©7 %©�&§4½�¤7§4´0Î#Áç¤(ª*¢��9¦�¤7  ��¨ agarózom géli , porovnaním jeho pohyblivosti s ¢&��½4¡a³H£�¦�¨&�H·rÁ��A¾ê�ë1ì$í�î�ì$ï@î4í4ð&ñ7òÛówï�ì$ô&õ%ö7í�ë�÷4ø�ùGúCû�ü1ý±þ�ï�ÿ��&ÿ���ÿ���ÿ��qï9ö��ï9ö�1í4ðÛø�ð��&÷� 7ö�ëËø�ö����&÷��ë��,ówï9ì$ô&õ%ö�í0ë1÷Aø ùGúCûö������ë������æø���ì0ñ7ö$ï����&÷� ��ë1ì� �÷Aø!����ï9÷�ôaï9ì$õ#"%ü��&ì$�qÿ%�&�0ÿ'��ÿ

Page 28: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

26

(�)&*,+.-�+�/0+21�3 4&5�687�9;:<3 =>5@?�A�B ?0C&*DA&E�A&:FEHG�*�IJE A&:F7K6LC�MFE =NG�MFC�O>EDPQ4&68CN9�A&CSR�9�:TM<:UA�E0B *;ANV�3�4fragmentov dvojvláknovej DNA pomocou odhadu z pohyblivosti fragmentov

štandardnej DNA ( W -DNA~Hind XDXDX;Y[Z \$]�\ ^D_&`0aNZ�a&b ]�ced<fg\Kh�a&b8a�i�aNj Z&klh�a�m�n�jz grafického znázornenia pohyblivosti fragmentov DNA v závislosti od molekulovej

hmotnosti fragmentov štandardnej DNA.

Page 29: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

27

Pri stanovovaní molekulovej hmotnosti neznámej plazmidovej DNA z prírodnýcho!p qNr;s t�u<v�w<x!y!ze{|u<}0~�w<v�r;~N������p��&~L��t���s x&���&t���r;~!�8x&~S��r�u���~���r��|�&w<p }0��uF�&~N���ccc foriem) dvojrozmernous�w<s qNr�t�~!��~&t�� }J~��>�N��~����0����p�}0�8sN�

ccc foriem plazmidových molekúl izolovaných zq��|se��p

E. coli

V517, ktorý obsahuje osem ccc molekúl DNA vt�~&}N��p�{0���L~�w<s qN�>w<~!�>sD��{&�8~Nr�x&~S��r�u2�$�<�&��p �

35,84 x 106 ����� ~&w<s qN�>w<~!�l �{&�L~�r�x�~���¡ccc

��~!t�u<s��Tx�s��8¢!�ls��|s���r;p x�~��!~��!p�¡|~&�&tD~�r�u¤£�r;p x��&p t��&~��8�ktoré obsahujú

w<u<x�s�v t�x&s¥��t�p ¦���s�x0r�y��§�&}0{�¨,p��&~��¥x&p u<z�{�t�~&}0�!u©sew<xN�ª��~!{Nylo�w<u©�!~§��¡�� agarózovom

géli.

Izolácia (elúcia) fragmentov DNA z agarózového gélu:

«�¬�­$®�¯|°�±�²�³µ´·¶¹¸ º�»�¼;½S­�±&¾¿°eÀF° ½N²�¬;Á&Â�Á!¬�°�²�ÃFÄ ½&Å&¯ Æ&°�ÀÇ°�±&»<¯ ¯LÈ�É0°�¯|°.º agarózového géluº�±�Á�ÊlËÌÃ<º0Á�À©Á�Ê!­�Í�Ê�ÃF­�Ä�° ¬DÅ�¯�äÆ&ÁS¼�²�Ë�Î&±NÅ�¯�Ãϯ|°�²;Ð�Æ&­ ¯8Ã�ѧÒÔÓ ½�ÀF­�Æ!±NÅÕÎ&¬�ÁNÖ�ÀF¾�¯×Î&¬�ÃØÃ<º0Á�À©Ó�Ä�ÃÇÃÏÂ�¬�­ ®&¯|°�±�²;ÁNÊ

´·¶¹¸2¼DÎ�Á�Ù�»©Ê>­�Ê ²;Á�¯8Ú�É0°#¼DÎ�Á&ÀÛËܼ ´�¶|¸.¼�­ÝÁNÖ&³�Ù�­DÞ�±�°ßº gélu extrahujú aj látky (napr. sulfátovanéÎ�Á&À�³S¼à­�Ä�á&­$¬�éÆ�³�â�Ú�½N²�Á&¬�¾�¯8È&É Ë�Î�È�¼;ÁNÖ�éÍã­$½�Á�ÃU±&á&Ã�Ö�»Û²;Á&¬D³|°�±Nº�Å�¯8Á!Ê�ä�¬�°�¼�²�¬DÃå½�Ùe±�¾æ°�±�Æ&Á!±0Ë�½�ÀF°�Ó º�³�ÚSÀÇÃ<®�Ó º�³�Ú

´·¶¹¸çÎ�Á�À�³�¯|° ¬�Ó º�³>Ñ<ÑUÑ'âÝÎ&Á�²�¬�°,Ö&±NÅ�Ä�áÎ&¬�°éèØ­�À�ê�ÃÇ°é¬�°�­ ½�Ä�ÃF°�­ëÉ0°Ü°eÂ�°$½N²D»�Ê�±&ÁS¼�Íì°�íl²�¬�­ ½�Ä�Ã<°#Þà°ëº0Ó Ê�Ã�¼�ÀÇÓÜÁ�Ư8Á�ÀÇ°$½NËSÀ<Á&Ê�°DÞ�á&¯8ÁN²�±&ÁS¼�²�Ãî´·¶�¸QÂ�¬�­ ®�¯|°�±�²;ÁNÊ�ÑÝï&Áðº Ê&³Sê�Ë�ÞDñ>Ä�ÁNËò¯8Á&ÀF° ½NË>À<Á�Ê!Á�Ëóá&¯8ÁN²�±&ÁS¼�ÍeÁNË ½&À<°0¼�Ó°�Â�° ½N²;»�Ê�±&ÁS¼�Í�Ê&ÅNÍ ô õ�öN÷ùø�ú�û�ô ü�ý|þ�ÿ���������� �ÇþÝô ö������#ö�����ô�ÿ&þ�&ô������0ÿ����l÷������;ö�ô�� �éý8ÿ!�&õ��"���!þ#����� �&ýô ö��$���&% �('!)������Nÿ&þ��Ìÿ&ô�ÿ�þ���þ�ÿ&þ��*���&�&ûDö��>ø#+ û�þ �,��þ.-/�0�1�&�2-/34�Çþ5�����6���7-83 ö�ÿ!���!9�4:�;<-1�Uÿ�þ�3 û�ÿ���4:= û�ô$ü�ý|þ�ÿ��>��� ?A@�B ��ô '��N÷�õ&�C��ô���� �'�þ4�83-<ÿ�þ ô ü�ô$û D����; ö��E�NûGF ÿ&þ����,��ô:�÷���� �<ÿ&�;þ û = þ û�÷��"�,4�þkontaminanty.

H þ������Üý�þ6�>D2����;ëö��I�!û FJ��ôK'��N÷�õ�C��ô���� ÿ�ôJ�1�&�2-13�4L��÷0?A@�B � ô ü�ô û D!������FM:!� ü�F-Û÷¥ý��&õ�ÿ���0ô$û�ô�!�N� OQPLR8PMS�TEUGV2PMRXW,YLZC[]\!V_^�TEU"`�Z1a�b�cd\�Z8eRfb�g&eha!ij!Vlk�U PYMS�e�c*m#npoqnsrut�PMv!j!eY&PRN[_eLR8PM`�Vlm npoqnv�eMv�Z1PMUGecwv�V�[�xZXT�Z1PyeMz�eMU {!gb}| a!~1gS!b��l`�V2\!V!��TEV!v�PMa!Z8e�e<k�Z8eYP.U V}v!U�Z1e��b�YjdPM��TEU eMS�h.a���Yj}��P�T>{�\�cS�TIV�U"��Yj�� P\!a!V�TER1Z/k,iqg&R1V!xS!b�|"W�\!V7|"T�[�v!a�i�k�V��EV!U���P�S�V!��v�R�P6TEa���Yj�|"W�v!UGe�k��

Page 30: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

28

6. Konštrukcia génových bánk - príprava rekombinantnej DNA

���M�����1�5����!���������L�!���� 7¡8¢&£������¤!¥&�*¦!§©¨(���� �¥��Xª"«¬���¬­>�1� ��®�¯0­�®�¢¡N in vivo i in vitro

techník. V������°�«�£°�®!� ��± �1��¢�£°��²­ �M®� �¥��6³��I´Eª� ±µ�#�!�G��´���¢�¶!�·E�1�2�8£�8�#����!���!«�£°�����!�1�� 7¡8¢&£�f�E¸!¹º��¶!»6�

najrozšírenejšej definície, akceptovanej legislatívou vo viacerých krajinách západnej Európy,

je génová manipulácia definovaná ako:

¼�½"¾,¿!À.Á²ÂÄÃÅ¿�¾!Æ,Ç�ÈÊÉ,¿!Ë<Á²Ì�òÍ!ÇÌ8ÎqϲÐϲÌ�Ñ�ÃÅÒ�ÈÅ¿ÄË�Â�½ ÐÀ.Ì�Í�Ó8Ô(Õ²¿!Ë<¿!Ç�¿!ÔÊÌ8Ã�ÖLÐ&ÀMÇÌ8Ð×Ë<¿!Ó8Ð�É,ØÅÓÙ ÚÜÛÞݲßÅà.á!â²ã²ä7á�å,æ!ç2è,éê ë�ì²í²î�ï,î!ë ð2ñ,òôóµõÅö!óµ÷!ø²÷2ò�ò�ù�ò�÷�øÅú²ð²û7ú²üþý²÷�ÿ&úÅø²÷��,÷!ÿ&ð����²÷vírusu, bakteriálneho plazmidu alebo iného vektorového systému,����� � �������� ����� ������������������� � ���"!$#%�&#%��' (*),+�-�. .0/21"3"4�576�89�:<; )>=%."/�.>8 (*3prirodzene nevyskytujú, ale v ktorom sú schopné trvalej existencie.”

Nové molekuly DNA, ktoré vznikajú v tomto procese sa nazývajú aj rekombinantné

DNA, preto?A@ sú to molekuly DNA ktoré vznikli kombináciou dvoch rozdielnych molekúl -BDC2E�FHGDIKJLJNMPO�Q�C2IRFTSVUXWYMPCZFHG[FHC�\2]�O"MPE"^`_KJba"I%CcFdGeGDQ�OfJ�gcSihRjkO"M�C�E0C�lf^<JmhnJ2E0GeI%C2E0G"oqp0MPO0J�O�FrOfsNtvuxwtechniky.y�z*{�|D}f~>|����K{2}"{��0~f�D{�|"��}"�����0{�}f~f�D������}"�7�������A����{�}f��� |"~��0~ � ���R���&�A�>�������&���0�D���"�% c¡r��¢f��£úsekov DNA z ich pôvodneho organizmu a ich následné pomno¤ ¥�¦"§�¥©¨mª�«­¬0®�§P¯m§P°0±A²�§´³0µ·¶�§¸³0¹v tom istom alebo aj inom organizme. Táto technika je známa aj pod menom molekulárne

klonovanie alebo len klonovanie. Zavedenie techník molekulárneho klonovania génov zhrubaº"»%¼i½¿¾rÀTÁ"»  ÃRÄdÅDÆHÅ0Ç2ÈPÉ ÊDÅ>ËPÅÍÌ"ÆKÎcÏ0Ð"Ñ2Ì0Å0Ð�Å�Ê"Ò0ÑÔÓ%Ñ�Ð"Ò�Õ0É Ö×ÒfÎmÓØÐ"Ù0ËPÑ�Ú�ÛÜÄHÑKÓZÝ%È�Þ�ßàÎáÒfÎKÓmÏ0Õ"ÖAÒ0Î�É�Ò0ÑKÓZÝ%È�Þ�ßobjavov v â"ã�äHå�æ%çRèZé%åmènê"ëTìRäHí"æmëPë�î$ï�â>ìräTð0çñçñòfåió"ô�ð�ç�õ7ô0ö ìm÷0ø,ì%ã�ó0ã"öù÷"æ%ë�ìm÷�å�õPãeú æHã"û2ð0ãZèRïkî$ï�â>ìmú0ü�êfãpoznania.

Princípom génových manipulácií je teda spájanie fragmentov DNA študovaného

organizmu s vektorovou (plazmidovou alebo fágovou) DNA schopnou autonómnej replikácie

ðDã[û2ðDã>õPå�ò"ã>öýêfãþìrärë´äHå�î ÿ������ùÿ��,ÿ���� �����������������������������! "#�$��%&����'(%��eÿ)�+*�������,*���'�-�� .�/0����1)�2�>ÿ)3��1�� 4�5��&'76��,ÿ8��9����:2ÿ��<;<5�6=��'>���?���A@8����*�1B�(��'>���C�2� Escherichia coli D)EGF�H�I�J�K�LNM�KPO)Q�M�R�Q�OTSVU(RVW<XY R�I�W�R�Q�Z?Q�R[O)Q�M�R�\]H)Q�W�K�L^S�I�R�\�R�_R�`ba�cedfL$K�Z&Q�W�U(Z?\�EgW�_hK<Hi`kj)\l_mUnH)Q2F�Z�IoW�UpOqQr\ Y Xs_ Y K<H�tu_�\�W Y Q�vwW�xy$z�{�|�}8~m�<{ ������zs~����2�<�<��� ���<�����������������(�m�����q�������������?��z�����{�}8~��9~�����}������ �� >z���¡ ���)������¢���£s¤�)�2��{<y^����z�¤�z�~z�¢�¥�¦e§���{¨���p©��w}���¡����ª�V (z��?����«¬�����­}i¤ ®�¯�°�±�²]³i±�´�°�µ�¶�·p²w±V¸u¹»º½¼�º(¾h¿�¯w¿º�À�Á�º<Âô�º�ÀB¿�±bukových delení sa vytvára kolónia - klon identických buniek obsahujúcich identické kópie

rekombinantnej DNA. Súbor klonov nesúcich rôzne fragmenty klonovanej DNA sa nazývaÄ�Å�Æ�Ç�È<É^Ê�Æ�Ë�ÌsÆ�Ë?Í�Î�ÏGÎ�Ð�Ñ�Ò�Ç]Ä�Å�Æ�Ç�È<ÉPÒ�Î�Æ�Ê�Î Ó gene bank, gene library ÔBÕ�Ö Î�È�×�Ø�ÙBÎ�Ú�É�È�Î�Æ�Ë?ÑPÊ�Ð�Ç�ÆsÛ>Ó�Ç�È Ô

Page 31: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

29

Ü�Ý(Þiß�àsá�â�ã>ä�å�à�Üçæ�è?ß�é�ß�ê�ë=ã�Þ)å2ì<íïî!ð ñfå�ò�èhÞómá�âiå�ô�Ü�óÜ�õ,ö)è�÷)Ü�ì�økö�ì�ø�ù�ßrß�ê�ß�ù�í�ó�è?ä�ì�ú�ä�àkó�åpä�à�ê�û�ì�ügê�ß�ô�÷Býþ�ÿ����mþ!ÿ��������� ��� ������ ���������� �"!�� #%$& �')(+*�,���*-�/.�0������1 2/354�6�798�:�;%7<:�=�>?;@=-A-B�="C�D@6":�=�E�;F6"B�2�:�;HG&IKJ�; L�M

a kol., 1995).NPO�QSR�TVU�WYX5RFZ M�[�\^]�_ R�` M ` _&a�b U)c�Q+R _ Z�dSe�f M c ] U�e _�]�_ O b-_ Rhgic�j"R@Z�QY`5k b�M T \ml�noM�]�M�b�p�l�_rq�p�b k

(P) ve�f \ e�f M c�U b UFs q�p�b�_ c�UFstZ b�\�u?b�\�vY\ T�k R�X"`@wx` _�_ O"R M�l-_ c M g ]�_ R�` M ` _�a�b jVe _�a Ux`yZ [�_�b�_ c z�{ _�uYM�]�_ c M�b j

e _�a U|`}Z [�_�b�_ c ~�����W/wxc \ R�X _�] c�U n Z _ R�` \�q U b�� T<k �h`5k ]�_ c M�b�p�l�_ _ f q�M�b�\ WYT�k ~FNP����c�U n Z _ R�` \Z [�_�b�_ c M�b j v�l�� f M�q TVU b ` _ c�~�O�� M T _�u�b-_�l�_ c�Qf�wx` M g �����Y���������������Y���������

ln (1 - P)N =

ln (1 – b/A)

� �������������¡ ¢�������&£h¤@�x�� ¥�¦���@�¨§V���%�/�-�F©ª�+��«|���"£�¤h�r¬�­�������®���¯�°+�����±����£������? ²©%³+�²�´¤@�o°� +«|���µF¶ �x°¸·º¹"·5»Y·½¼i ��������Y�¾���&¿��|¤À���������������?¤h���o°���®���¯������Á�����������������������Y³Â�����x�����Ã���&����°��-�¸£hÄÅ�-�F©|���������ÆYÇ�È�É�È�Ê�Ë�Ì�Í�Î�Ï�Í�Ê?Ð+Ñ�ÒYÓ5ÔFÎ�È�Ê�ËÁÕ�Í�Ð�Æ�ǺÖ@Ó�×ØÖ@Í�Ì-Í?ÖhͪÙ�Ò/Í�Ú�Û²È�ÜPÝ ×�Í&É�ÞÃÏ�Í-Ù�Í&× Õ�Ú�Ó¡Õ�È�É�ÞÅÔßÈàÈ�Î�ÍáÙ�Þ²â|Î�͸Ôhãä�å�æ-ç&è<éVê�ë�é�ì?í�î�ï�ð�ë�ñ�æ�ë�ò@ï<ó�ôöõ�÷�ø�ëtù�å�úYð�û�é�õ�ï�ê�û�í�å�èVå�û�æ�ü�ý�å�þ|ÿ�ë���� õ+ï�ÿ�ò@å�ûFí�ü/î�æ�å�ð�ë�ä�å�æ�ç�è<é��

������ ���������� � �����klonovaných

fragmentov (v kb)

��� ��!"�#�$�� %&��')(&*�!,+-(�*�.�'0/&!�(&� /&� 1�%&� 23"34_______________________________________ 80 90 95 99,99

5

7,5

10

15

35

3218 4604 5998 18 414

2414 3453 4491 13 414

1609 2302 2994 9062

1072 1634 1998 6136

460 657 854 2627

5�687&9;:�9=<�9>�?A@CBED�F GH? I ?KJ�LM?�DON3B87PIKQMR�STL N3BUL N3BCVKL ? F GH6�V 6�I�WXL N36JMV B�LM?AV ?K7 IP?ZYO[\I ]_^`V B�I a�6b aH6�V 6�IMc�S ?�F GH?dI�e�9

Page 32: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

30

fUg hji;k�i=l�im�h_npo h3q8r0qUhtsuMvdwxgMyHzMq�z�{OzPst|~}�����uA�Hv z vKrMq�z nHw�� vU|3s�� z ��� v�h3s���{Oh�ypuM��z ��� v�w,y�sK��{�q;i

Page 33: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

31

���_�����������j�M�K�M��� �����H�M����� �_�����X�K�3��  �3��¡M�d�M¢��O��£M¡M¤��H����¥��P�P� ¦d¤¨§©¡ � �«ª�� ��¤,�O�3�8¬d�­�®�C¯°� �)���3�8�����H�� ���¡M�M±²¡M�´³O�¡K���K�¶µ¸·

i ¹ �=�t��A�3³O� �3�����¨�Pº »0���H� � ����¯E. coli

�3�,�C� �pª£C�²�)�U�M�C±²¡M�Z�O¯��K£¶���A�¼�¡K£��H½´¾À¿�Á M�K£Mª��Â���_���P�Ã�O�3���A�3³O� �Ä�®º�¤��¼£0ÅÆ·

ii ¹ �8¬ ½Ç�3���È���=�_¡M���É�ÆÊ �Z�O���8�O�M��P¥Ë��� � ªK�O�=�M�Ì¡ �H� � �K�T�x£&�3�ͬA½;¯Î�Ï�ЫÑMÒCÓ¨ÔPÕ_Öx×�Ø�Õ�Ù3иÚdÛKÜOÐHØXÝ�ÏHÔMÕÞØ�ÔPÚdßKÙOÜ=àMÚáàMÕâKÜãÚdä�ÚKàMÕ_Ö�åÀæ,ç�è~éTÜ�Ò8ê;ë0ì ídîðï`ñ´ò�ótñtï3ôXõ�öø÷�ñ´ù ótñ�ú ú öHú úüûù ó3ýjþMÿ ñù��Mÿ�����������)þ���3ídî �����������Pþ������ õ������Mõ���� þ í����H÷ ��������ï`ñ)ù ó���í� !�����KþMý���"$#�í%�'&(�3ñí��Kþ�)+*-,� ���.� õüò "��_íMý�� /10!2�03/54�6!2�798�:<;=8�;?>�6A@�2�@�BC@%D�EGF�H�IKJGL�M�0�M�HN0O2�PQ7�RS.T�UWVX>NP @%D�7�R�0�7�/-7<Y�@?L�B�F�H T�ZX[ 7\ R�0!/54�R]2�F^630!_�F�`�2�4 P /57�EaEbF-S.R�F�2�E�c.@�Rd/eI�Jb7fEXL�`�0!2�2�@�Eg h�i j�kdlnm�o�prq 4 kolónií na s g DNA, potomt5uOv�u3t5w�x!v�yftzv�{�|%}.~���{���y��%~.{���������~�{��G��~.��y�������{���|Ku�~z���]u���{�v��~.�������u!uX����v�{%��y]�-����v%������y'���!��� � g

vektora (1,84.104 / 5.104).

Výber klonovacieho vektora:

�e� ��y�� ��xA{�v�{�������u�y���{ ��y��%~.{���� ��y ����u���{�v��~.������ruOu ����v�{%� � ��� ��v�u!| v���� �Gy���v � tz v��G�b�� �xAyQ| u�~dy]���������¡����{���{%�(¢ £a¤!¥�¦�¥%§�¨K©Qª-§�«�¬%­d¥%®�¯�°²±5¨Q¤z¯�°%³C´�¨�µ¶¬�¥¸·º¹ ¥�¤!¥%§�¨»­d«K´�¦%¼½¨¿¾.­d¨»¯�·3¤!¦�¼À§Á ¨�¦�¥�±²µ�¥�¾­.·�­d«�´�¾d¬�¥�±²¥�®]Â�¨�¦�·Ã¹ ±5«�Ä�Å�®�·AÆ ¥�±�Ç�«�µ�¥È¾.­d¨»¯�·!¤!·A­d¨$¯�°^±5¨�¤�¨É¹Q¥Ê¾.­d¨»³Ë¹ ¨�©�µ�¥�§�¨�¦�Ì˨GÇÍÅ�¥^¤O·ºÂ�Ì�©�·�·Î¾klonovanými úsekami DNA. V systéme E. coli ¾�¨X¦�¨]ÇbÆ�¨�¾.­d«GÇ�Ï�·�«XÅ�¥�Ð�Ñ�ªÃ§�¨]Ç]Ò-§�«�¬%­d¥�®.°5¥ Á §�¥ Á «r¦�ÓË¥ ÁÔ%Õ'Ö-×ÙØ�Ú�Ô�ÛOÜ!Ý�Þ�ß�àâá�ãåä�Ý�Û�æ�ç�ß%è�éêæÈß�æGë�ì.ídæ�Ø�î�ï!éðí.ñ¶Ô�ò�éôó�ÚrÝ%ídò�Ø�ærõÍæëXÝ�Ú�ö÷ìídä�Û!Ú^øKæ�ìídòùÔ�ò%à�ú�ïÃó�æ�ß%è�ézõ�ëbÚplazmid pBR322 (Bolivar a kol áûõ$×rü�ý�ý�õ=þ+ÿ�Ø�á���á�× á ��á�� Úrß�í.ò Ô�Û!æ���ézÜ�ç�é5ä1Ø�Ú�Û!æ»ídïÃó�ß�Ú1ó�ñ�ì�ò�Ý�è Ô�ò�ø etÝ�Þ�Ô�Ü!ï æ ß�Ú�ì�Ü�Ú���ß%ñ¸Ø�Ú�� Ü�ìídÚ�ß �QÜ�Ú¡ó�ò�ø�Ü æQézÔ�Ü��QÜ�Û!ïOß%à æ9ídÚ»í.Ødæ���ñ¶Ý�Û!ï!ß%àâá��XÚrÝ�ò�éaÿ�ÜOß�æ�ß íñ é���ú�à ÿ�ñ��ó�ñ ���æ�ç�ä�ó�æQß na základe negatívnej selekcie tj. ìí.ØGæ»í�ñaØGÚ�� Ü3ìídÚ�ß��Ü�Únó�ò�ø�Ü�æ�ß�ídÜAÿ�ÜAò�í.ÜÃÝ%à��Ý�ærÔ(á���á��bá

� Ø�æ»ó�ç�Ú�Ô�ò�ç�ò%ÿ�ß�ÚÉß�æ]ëbø�æ�ì.ídÚ]ë»î�Ü�ÚXÔ�ò�à�úKïAó�æ�ß�ä ë�ÚÉó dnešnej dobe sada pUC vektorov a vektory

z nich odvodené. Sú to malé vysokokópiové vektory, skonštruované na základe plazmidu���! #"�$%$&('�)+*%,�-.'0/21�3�46574�8�4�93�:;'=<74�9*%)�>:@?A�?.BC*�DE? AGFIH�98JA0K%4 lacZ komplementácie (Obr. 4.2. a

kap. 8.).L�M�NPO7Q@R SUT�VWXR YZ\[�SCW�]CW Y�^6[.SPW�]7_a`7Ma` Y%b c%Wd%W efV W eg�Q;Y�Mih2jkV%]mln[W%oXOUSp]pe[qrl@lns_�o%W�Y%bq�ct%u%v@wIu%x�y�z|{U}�~��t��C�%�U�+u ����%�Iv��Cx�~uI��{i�r����ty�v;���i��t�����v@u��u.�pu���yr���#�G�+����}+�p�G~��t��P���p�%z�t��P���7��{7������������Gv@u%�I���p���Et%�@�%u%��~��u%�2���#�G��u%���+ %w��E��%��u ��wIv;¡rz¢�r���0���6�����v@u������p���Et%�@�%u%��~��u%�2�£�#�G�a�r�0�x �¤�i�2}� �¥{p�pv��C��¦�{2t� ����u�t%�§�©¨ª�7v«�� �w�v¬�px�~��t��C�%�2��~­u%�®��%��v��Cx;~%u��¯{i���J�\tyrv;�°�±����±%²+�7��±�ru­�³t%�2v��Cv@y�t%�y��krokov, ktorý je nevyhnutný pri práci so štandardnými vektormi - defosforylácia��v´u�0���7v´�r� ~��ru ���%�µt�@��u � ~���y�v��r� �¶~��t��C���i��z·tI�p�%�7²¸�I�¹�%�i��º »0¼¤½¾¼¤½r¿ ÀÂÁ2ÃĹÅpÆ ½2¼ÈÇ@É@ÊË�Ì�ÉJÉpÍÏΪÐ2Ñ;ÒÇ�Ó�Ô%ÀXÕtakéhoto vektora je plazmid pKIL18 nesúci ccdB kil ler (Bernard a kol., 1994), ktorý budeÃÀ�»Ö�É�Åp×ØÓ2¼¢Ù Å�×Ì�¿.ÅPÀ�Ã%Ð7Ó\Ò.ÅpÉ@Ì�Ò%×Ì�¿Ø̹ÙÉ�Ú�½�Æ%É�ÓIÌ�¿ØÛ2Ü#Ý ÐÞÍ�ß�Íáà�Í�âãÍ

Page 34: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

32

Replikón: pMB1äæå�çãèé�êUë�ì�í%î´ïðè�ñòªóCé�ô+õ�öpé%ó\ì�÷�ø�ù�ú%å�ûGén rezistencie: Amp (ampicil ín)

Klonovacie miesta: polylinker z plazmidu pUC18, celkove 13 unikátnych miest preó7åIêUöpó2ø;èü�û ý�årû ú%é�ûIþèXÿ�å����������� �������������������������

gyrA462 kmene (napríklad B261, len pre prípravu vektora),�! #" �$���&%����'�)(�*�,+���.-$� �! �/+10 " �2��-!3/�104�-,,+ " -!�5�76

8/9!:<;7=>;@?�;�ACBED2F�:HGJI1K�L,MON�P�Q1P/Q1R4P$D#NSGUTEVWQ$XZY2[Z\�]1;

^ :HG4L1_�`aQ Q1b!c�G�F�`ad1L!BHe DfB�RUB�I1_�GUB DHQ1b1K�`ad�Pgd F�b!Nih/jkBld1B�I$F�b!:iQ$XZY2[Z\�]mD#Pon�FHG&B�Q�GZL!GUB�I$F�b!:Hb$V:#BkD2F�:HGaI1K�L,b,VpB�L!T!b!LEV1I1RUB�M�ckb$VqhrIkF�b!:#B2esckMEDfP�t!b$d1u'N�GUBED2F�bvefB'R4b!I1P�RwG4ckb$d1P�L1uvd

ccdB géne (killer gene)PxRwGJy$V�ezB{D|T!b!L!b!:#b$d1b$V~}C�i�i;���B�R4B�Iq_�GUPx:#B�I1b!N91G4L1P�LEF�b$d�e#B�ckP�R4b!j7B�L!M na kil ler aktivite

neporušeného ccd� y1u�LkVqh�IEF�b�:2� �5VqL$y$V�ezB~P�I1b y$�7:#M�ckb$d!��ezB�T!h�F�P�I!jkB~Q,b�F�:#P�L�D#��b!:)NM�_�G5Gt,b�D�F�G�F�B���DHI!�1_�t�97V>L!GUB�I�D2��D#_�t!b!Q!L!u�Q!:fB�jkG�FHG&P�RUB�L�9$VqL$I$��L!B$D2�q_�B�Q�RUP�ckNSGUT�D

prerušeným ccdB

génom.

Page 35: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

33

�q�w�U�5�s���1�U���v� �¢¡£��¤��a¡<�4¥k¦��<§>¨©�>���!ª1«$�1¬$¥k­U��®7¯±°1¨©�2²

³C´Eµ�¶�·H¸a¹qº�»,¼l´�»,½!¾�»k¿1¹�ÀU´kÁ�Â�ÃÅÄHÄ<Ætypu štiepia DNA za optimálnych podmienok v presne

definovaných sekvenciách za vzniku definovaných fragmentov (kapitola 9). ZoznamÇ#ÈkÉ2Ê�ÇHËaÌ1Í�Î$Ï�Ð�ÑÒÈ�Î!Ó!Ô!ÎEÕ1Ì1Ö5È�×�ØÚÙHÙ<Û typu spolu s ÜUÝ�Þàß!áEâ�Ü4ã�ä�å4æ!ç1ãSÜ>èfé�ê�ë1ì�æ$í1ãSÜ�á1ß1î�ãiÜUé�æ$ë1ê�ãSÜ�ï�ðEå&ß�ñké�æ!ÜUéò�ó4ôSõaöq÷�ø!ù�ú�ù�û<ò�ù!ü$ý1þOò�ÿ��!ó4ù,ò������#ÿ ý�ö�ÿ��!ÿ���ö�ü��±ò���ó� ��1ù���ø��!ù����±ö��±ò�ÿ � ���������������! #"�$���%&���('*)+ �,�$.-najznámejších patria firmy New England Biolabs, Boehringer Mannheim, Pharmacia,

Amersham, Gibco BRL a iné.

Štiepenie DNA v 20 / 02143#5�6.7#8�3:9<;>=?3#@BADC

Do ependorfovej skúmavky napipetujeme v uvedenom poradí:

E x F l roztoku DNA (v TE alebo H2O, max. 10 F l)G 2 F H�IKJ2L�M�J�N�O�L�PRQTSVUWOKX�JZY�[�\^]�J�_�UWOK_.`DaRJ�N�P�_�bKX�JcadO.ef`Da�g:]�h�_�b�X�Ji`DHkj^g:NVb�X�J^adJ�IB`DJ�]�lm 18-x-y n l deionizovanej sterilnej H20m y n H*adO�eT`Dadg:]�h�_�OoQ endonukleázy (2 – 5 U, max. 2 n l). p*q.r s t�u(v2w x(t�yoz�{(z#|}x�~

�����R�}���V��� � ���.���������(���2�V�����W���(���(�(�2�}�������o���#�d� � ������¡£¢2¤�¥ ¦V§�¨B©.ª}«�¬V«�­�®°¯(¨#ª²±d³�¯µ´}¶�±d³-20 · · C !

¸ ¹dºW»#¼�½#¾�¿ÁÀ.ÂÁº�ÃÅÄ�¾�¼�Æ2ÇÈÆ�É�º�ÂÁºËÊ�¹�Ä�Ê�Ì�Í.»�Î�Ì�Ï�»�¾�ºRÉÑÐ�º�Ê2Ò�Ì�Ð�º*ÓD¾�»RÉd½�»�ÃTÐ�ºRÉÕÔdÄ}º×ÖÙØ�Ì�εÚ.Ê�¹RÄ�Û�Ü Ý C )Þ reakciu zastavíme pridaním STOP roztoku ( 50 mM EDTA, 0,01% brómfenolová

ß^à�á�âdã�äµåÈæ�çéè�ê:ë�ì�í�âdà2ê�ä�î�ïDà�âTð&ß^ñ�òKí�ódê�ô�ò.õ ö ÷RøÅ÷#ù�ú^û�÷�û�ü�ýo÷�þ�ÿ���������� �dú����fú�ù��� výsledok štiepenia analyzujeme pomocou elektroforézy v agarózovom géli

Ligácia DNA:

���������������! �"$#&%('*),+�)-+/.���02143�) 5 6�798;:�<>=@?A6/BDCE6�C*:FC-GH�IKJMLONQPK<R8TS�UTLVCKW�<YX[Z�7�\�W/]�PK^46�7�W�PK7/Z_�`�acb�d�e�fhgKikjMlOmQnKoQg-p�q�p�q�r�g-p/sFq/tvuxw 2+ a ATP. Za štandardných podmienok katalyzuje T4-DNA

ligáza len spájanie koncov s y�z|{K}K~��Y{-���T�T�Q�K�������;�������-�&~/������������~��K�K� ��������{ ~�����z|{M�-��}K~/���K�y����/� ��{K~������;� ~����/��������{-~/�K���D��� �|�M -¡�¢K£��T¤A¥k¦��k§|¨Y©(¡�ª�£�«K�-£&¬��|­K«K¨� �®c¯±°±²³¦ ª�´&£�ª¶µhª·§F¨� K¸�£&¹�º» T¤§F¼�­O¤V K£�¨Y�½¬�¹�¼/¾�«¿¸À¡�ª�£�«Kª�Á O¤Ã¡�� ÄÆÅÃÇOÈ¿ÉËÊ�ÌTÍÎ�Ï�È4Ï�Ð!Ñ�ÒOÓ�ÔÖÕQ׿Ð�Ï�Ï�Ó·Å�Ø Ù/ÚÜÛÞÝDß-à�á�á�Ù9â;ãÀä�à�å�æKçKàYè2é&æ-ê�à�â|ëDÙ@ìí Ù�á�çKè$ákî�ï|æKçKà�è½ê�Ù@ð ñ/ò�óKôöõ�÷�øúù�û�ñ�óKû/üýü�þ|ÿ��-ù � ñ�ÿ�������ÿ�� ��� û�ñ�ó&ÿ õR÷ ø�����������û��������� "!#�ñ��Fÿ-þ�$

Page 36: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

34

alebo intra-molekulovú ligáciu za vzniku oligomérnych lineárnych alebo cirkulárnych%'&)(�*�+-,/.�021�3 4�5�687�9�:�5/;=< >@?2%A*B:�CD;�, ?E; ./FG*�H29�IKJL?�6�,M5M:�%A&D; .�021ON :�4 7�9/:�P�4�,M?�5�6/%A&�N�,/.�021Q3 4�5�687�9/:R5M;TS�UV;�&�W�&'*od celkovej koncentrácie koncov DNA (i), a od pomeru relatívnej koncentrácie jedného konca

molekuly DNA v bezprostrednom susedstve druhého konca tej istej molekuly (j). (Pre danú

lineárnu molekulu j je konštantné a na rozdiel od i je nezávislé od koncentrácie DNA v%'&)(�*�+-,M?�J�S�XY?8W�&AZB<G[�?25/4\?]:�&'0^9�_`P ;�*-1/I�;�?268PY9a3 4\?26/3�5�9 %b*26 5�X�c�H-?KW�:�7�3�? dYe-fhg�i/jlkbm^g�f)n-o8e2f'p�q�psr t/u�f)vYo2kAw/xy^zO{ |�}�~��=����}b�V�������^�/���L��}A�^z���� ��y2�/�����'yV��}Ay���y����/� �M�M���^��� �2� ��� ��yV�G����z���� � ���= \y^z�����¡�y8�Q�)}A¢��2�2}'��M�-�My/� ��y^�M�/�8£¤�^���/���2¥�� ¦�§M¨2©8¦�ªa« ¬�­�©a¬ ® ¯�°)§G¬�­2±l²�³E´�­^µ�¶A´¸·�°A¹�³º¯�³^»�¨2³2¹�¦�ª¸»�³^¼ ª ´E½�¶A¹�·8¨2¶'³2±�¦�¾ ¿B¾lÀ�¯�ªV¿�³2¹ ¶'­molekuly vektorovej DNA s inzertom je len okolo 20%. V reálnych podmienkach je všakÁ ­�À ¦�ª ¼�·]¦s´�³2¹lÂ�¶'³/¾ÄÃ�½ ®�À�´Y³OÅ ªÆÀ�¶b­-© °'¶Ç´Y­^µ�¶È´Y·2°A¹�³�É�»�³^¼/¬�³2¹�¨2¶'³Ê»�³^¼�ª ´K½�¶A¹�·2¨2¶'³Ê¯�ªMË�²�ÌD¬�­�À\­�Íέ^²�Ï´�ª�°È·�»Ð¹/®Ñ¹M·MÀ\ªM½�ª�¼Ñ¼ ª ¹ ¨2³2¹�¦�»�·2¨^¶'³ÓÒ@Ô�à ¶A¹ Õ�³^» ¦�ËÖ¾ ×KØ^ÙÈÚ�Û/ÜÞÝ�Û�ß�à Ûlá â-ÛMÜÞØ^ãMÛåä�æ ç�Ú�èDâêé�ë�ì^ã æ�ì2àMí-èDÜë�ì�ã�Û�ÝEî�èAà�ï2í2è'ìåðñìòî/Ü�ó ô�Û/Ü�ß�è"õ�èAìòæ�ì^ã/õ�Û/ë�ÛMæ á pozitívnou selekciou rekombinantov, aleboö^÷Gø2ù�ú¸ûBü�ýAþ�ÿ���� ö�����������ù ���2þ2ý'ûÓÿ�� ÷ þ�������ö�ÿ/ü��������ö������������! �"#�$�%� �Èý'&��^ø�û(��)����Lû ü��8ü�ý+* ý-,�û�.0/1�2�31�2�4�5�6'2�7�8:9�2�;�<�=>3@?BADC�5�E�42�F 5 6'2�7 G�HJIK9�2�;�<�L�H�INMPOQ2�R�STIVU�W'H 1�2X31�LYU�Z\[�5^]�_a`bOQc

calf intestinae

alkaline phosphatase, alebo BAP-bacterial alkaline phosphatase) dostaneme DNA, ktorá má;�Ld2�e�2�<\Cf9�2�;�<�2�<\CfC�5�E�42�F 5�6'2�7�8g3�9�R�hiI'; 5�MQjkI'=YU�2l3mLn;�=�E L�obpq[T6rI's�2�7�LYtuj!v�c#w$x%yz6'I's{Z\[T2�RBMQ|}=�~kST=p{��I'; ; 2�3bt U�4mL\;i31�2 4H�Z�<�I�=

E. coli6�I';�=�Z�4�;�5�H�I�H�2i6�=\9�R{6�L�HJIzo�= 7�=���H�I�; W'[�9{L���h�=\4<�=\;�U�2

4=�9�2�H�e�I';�L�;�U�2�7�o=�7 G�4�L\[T; =�7 5����I�=�MkOB4I�h�2�R�S�IVU�W�1�2�31�LYU�Z�[�5�L\6�=\e�2�L\9:; L�9�6'2�;�2�7�L�; Ir=�h�2�R�STI o�=�HJ=

vektor s pozitívnou selekciou je optimálny molárny pomer vektor/inzert rovný 1.OB4�Iah 4mZ�<�I�3m2�[�; Z�H�5�H�Iaw�xJy�1N4L�siHJ=�;�U�L�H�I�H�2iST; 2q1N4=\9�7{=�; <�I-R�4=\9�2 H�e�I';�L�;�U�2�7q7 G�4L\[T;�=

[\7 G{��I-t �bU�I'=\h�=�; WrH 7�=\9�U�2 4L L 9 6'2 ; 2�7�L�;�=�o�w�x�y E�7�2iH�I�4m=�3bU�4I-9���;�G�H�I�=�; E 2 ;ukleázami

produkujúcimi nekompatibilné konce. Pri štiepení plazmidového vektora tak vzniknú dva

fragmenty, z ktorých funkciu vektora plní len jeden aE�4bR�C�G�;�=\h�2�U�4=�e ;�G�3L�2�Ei3bU�4mZ\; I!2�e 5���L�o;�=

preparatívnou elektroforézou (Obr. 6.3.).

�B r¡T¢�£\¤�¥r£� �¥V¦�§�¨\¤�£-©$ªY«}£\¬�¥®­ ¯a°�£� �¥V¦�±�²�¥�³�´T¡�µ�¶�ªY¤�·X²\µ�´T¡�¤�²�¡ ¸N¹iº

DNA (výsledná koncentrácia 200 » g/ml )

30 mM TRIS HCl, pH 7,5

6 mM MgCl

10 mM ditiothreitol

50 mg/ml BSA (bovínny sérový albumín)

0,5 mM ATP

0,05 - 0,1 U T4-DNA ligáza

Page 37: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

35

¼¾½'¿�À�Á�Âu½rÃ'Ä�Å�Æ�Ç È�É�¿gÊm¿�Ë�Ì�¿ Á�ÍfÎ�¿ Á�ÊÏ�ÐÒÑ$Ó�ÔÕÅ�½'Ã�Ä�Ö�Ë�Â�×PØmÅ�Ù ¿�ÊÏ�Å\Á�Ú�Ã'Ï�Û ÊÃ'Ù Ö\Ü�Å�Ý�Þ�Å\Á�¿àß�ádÁ�ÊmÖâÌã�ä å æ�ç�å�è�éä�ê�ë\å�ìgí�î'ï{ë�ð�å�ìdè�í'ñ�î-ê�ì�éä ò\è#ä�ã{ó®ôõç\å�è#ä�é�ä òYè#ä�ã�öçKä�÷ ø�ð�ë�öå�çKù äiù úYê�ë�å�ìqû�ü�äiíþýlû

ligázou aÿ������������ ������������� ����� � ���������! "�$#&%� "'�()�+*,#�-/.0 0' 1 2/3�465�7,8:9<;,=�>�?�@BA�@"A�CED02GF!H�IE2KJ

LNMGO PNMRQTS$QBU�VXWYQ0Z$[0\:]�^E_`\�aEVRPNMbV"c d�[�e�f:MEg�c hiV�V�Wkj$[0d�Si\:]�lQ�[�c6monp q0r�s�t!u�v!u&q�wyx�z�{}|,~���t6�)r��"�oq0��u0����u���v,r|�t�v6�:sT����u���r$�&��u�� �0s"�)riw���u&����u0���E~�|!s0��v���q�r���r$�����&u

postupup v,r|�t�v6�:s0����w�r��&��u�� �0s"��r�w�� ~�|�~���r$� ~$s�t��:qK����r�t!r$�0r��)��u�����r$�&~Gt+�0v,w����)u������)��s��0�0w����)u�� ��¡�¢y�)��£�t

pri 65 ¤ C), alebo extrakciou s chloroformom¥ ¦0§�¨�©!ª�«!ª&¦�¬®­�¯�° ±³²®¦�´�µ�«,¬�¶ ²¸·�«,¹)º�²$¦�¨0ª0» ²�¼:¨0ª�½�ª0¼¿¾À²¸·0ªÁ¦�´0±�¾Ã³§�ÄK¹Å±,²�«,ª�µi·�¾k±�©�¹y¦ÇÆÃÈ

roztokuÉ podobným spôsobom sa pripravia fragmenty chromozómovej DNA. Pri príprave

Ê0Ë$Ì&Í&Î�Ï�Ð�Ñ�Ò0Ì�Ó)ÔÌ�Õ�Ð×Ö,ØyÎ0ÙiÚÛ,Ó)Ì�Í�Ü�Ý0Í&Ü0Ô Õ:Î0Ø6Þ6ß�à�á�ÌâÝ0Ø$ã,Ð�Ó)ä�à�Ì0áåÛ�æ6Óá$Ý0á�Ì�Ó�ØBç�Í�Ì&Í�ã³Í&Î�á³Þéè�ê�ëíìîØiï�ðÖ,ñBáóò Õ+Ö6Ò0Ø�à�Óôç�ÍôÖ�æ!ØbæõÍ"Ú$Ì&á�Î0á ö ÷0ø`ù+ú,û$ü0ýBþ�ÿ�������� û�� ����� ����Ãú�����ú,û��0û�ù+ú,û$ü0ý þ�ÿ����������! "� ������ý# û%$ &('*),+�- ) . /10�2(35476*8:9;6�<�=?>%@�ACB /�8(D13FE10FG 4H2JI�3F4�B 41G*354KD1LM8(9;NO9;P�Q*NR9�S 4UT!V�WYX[Z\>J]*AR3�P�9^0FE_D`3�avhodných fragmentov DNA z agarózového gélu

b B*8(3�B*8(/S ced(/f0g3Fh /1i1G�EjP�Nk4�dlB 9^m*n�/jG*3Fo�2(354pa S 41m*41G�q D1LCB 9 m*N!3541G*9*6b k r*s�t�r*s(uvxw1y*wUz\{gtF| u1}1y*wUzj~��kw��(t���uOr*s(tF�*�R��� �����!��{FtF| ��~�uYuk�1w1{F�Y{gtF| u1}1y�� zmes sa inkubuje

16 hodín pri teplote 16� C� r ��� r*{���y��*�U��tFy*���^�;u1}1y*wUz��*���*����u�r �*��u1����v u1y������%z(w1�C��{gtF| u1}1y�w:z�~��Yw��(tHr ��� ��t zU� y*u

transformáciu kompetentných buniek E. coli ¡��[�l¢�r*s��£���*�Ry�¤¥v"{FtF| u1}1y w:z¦~��kw��(t}1tFu��J��� }�y�wYt§y*¨*t��*�_z�w!��s(u�y^�(©��*s(�R���1t£�xªl��u%�*��w7}_u��J���;�*s(�«�¬z(w�r ���­s(w�*y �®{§tF| u1}1y��¯~��kw��[r*s(w%~1s(����u�°r �*�R� �1���±u�{�� �*¨*�^{²�¬³�¢¬s(u�����t����;�´y*w�v*�*¨*y��*��y��1ª;v�~�¨�µ�u_�*�;��y�u¶v*���:�;�*¤k�����:u`¨��:�^{F�^v�{5t§| u_}`y��^�tlmivom roztoku, je to v rMsU��r u1�*w1ª·u�� r ��� �1t z�w1�kw u%� � ��s(u%y^�(©��*s¸�Ou1}1y�� �kw��¹ ���elektroporáciu).

º¼»F½�¾�¿^À�Á »5Ã�½1Ä*»gÅÇÆ(½[È*ɸ»ÊÈ*É(Å� »�ËÍÌ Î1Ä*¿�Â�Ï�ÐxÅ1Ä�Ñ�Ò¦Á%Ó�É(¿^ÀO¿;Ô�Õ*ÀR¿� ½¶Ö�×YØÙÑ*Àk½1Ú ÅStreptococcus bovis

ÛUÛ�Ü�Ý\Þpß�à:á�â�ãfä nej gény kódujúce rezistenciu na antibiotikum kanamycín.

åÇæç èÇæ«éxê�éìëgí²î�é ï�ð ñ�òfó�ôCñ�õöí«èÇæ�í ÷�ø�ð*ù%ú�æ�û�÷�ü1í5í�îeý�ð ø*ê1ñÊòRþ�é*ð*÷Uÿkó�ø����xþ�ø*ê1í§õ��� do ependorfovej skúmavky pridáme 1,5 � g plazmidovej DNA pKIL18 štiepenej

���� ����������������������������� �!#"��$� HindIII a 4,5 � g chromozómovej DNA Streptococcus

bovis % ��&#'(����)* ,+#�$ ��-#. ���� �����������$� #�����/�����0�1�!#"2��� Hin �$3�3�354��$6��-��7( "��&��.���8 7minimálnom objeme TE tlmivého roztoku alebo vody)

Page 38: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

36

9;:�<>=@?A=CBA=;DE<�F�G�<H#I/H;<J#K�L�MN:�O&P�H�P�Q�P�J�RTSVUXWYK0Z-L0P�L$I�H�P$F1M\[�L][�I�L�^#_�<J�`�Q�<�O�K�a�P$b/^2_cMcO1J$`�Qd=

Page 39: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

37

e f$g�hi�jlki�m#n(o�p�i�hrq�j]i�stvu�f�w�xyp�z1j]i{s H2O do 180 | xv}�jcp�f�~�z�m����,f$k,tvf0u$w�f$k��(o�m�h���� tomto

kroku krátkodobé zahriatie zmesi na 65� C a jej následné rýchle ochladenie v �>m�u�f��/f0jn$��w�i�x&t&��o�fXjc�;q�m#g�i�q�w�i�o�t�� ����1�#���������]���/���#���$���������������$���

� pridáme 20 � �¡ �¢£�c���/��������¤��,���/���������c�y�&¥���¦��������c�����>¤����$�]§©¨«ª­¬¯®°�� ±�²³&´�µ�¶]·¹¸�º�»½¼¾»À¿ Á«ÂÄÃVÅÇÆ È&³&É�µ#Ê�ËÍÌÄÎ�·2ÈCÏÐÈ1³&É�Ì�Ñ�Ò�ÏÓÊ�¶]·$ÔÕ´�Ö/×�È&Ì�´�Ò�·¹±�²·�¶Ç³1·$ØÌ�¶]·

pipetovanímÙ ²·�Ì#×�Ñ#Ò�Ï]Ê�¶]·�Ôv³&Ò�×$Ú0Û@Ú�Üd·�¶]·X»�ÝNÞ�ß0´�±�²�³«»>à]¼;»�Ý á CÙ ±�ßâÚ�±�È�Ë�Ò$Ú�ã,äX³&Ò�×$Ú0Û/Ì�Ñ�Ò�·�Üå´�ß�Û�˹ÔdÌY±�ß/æ2Ì�´$ß$ç�Ì�Ò�èâ¶cÒ�ß/æ$Ô�ãéç�µâÈ&³&É�Ì�Ñ2Ò�·�ÜêÊ�¶]·�Ô³]±�ß�Ú�æ�³ Ü�Ï�Ò�Ì

transformáciu kompetentných buniek E. coli HB101Ù z vybraných transformantov rastúcich na platniach s ampicil ínom izolujeme

±�È&Ì#Ê�¶X³1´�ß$ç$ÏcÃVÅXÆYÒ�Ìrß�ç/·#²·#Ò�³1·ëÏ(Ñ�³&Ò�Ò�ßAÔ�ã,³�²·#×�ß�¶NÛ�³&Ò�µ�Î�³1·Ù všetky ostatné transformanty sterilne zmyjeme malým objemom LB média a

ì�í�î�ï�ð@í�ñ/ï2ò�óõôcò�í/î$ö�÷éñ�øëñ�ù(ödú�ûdú�ô]úõò�ï;ì0ü-ï�÷�ò�úëývþâö kanamycínom (50 ÿ g/ml).

Obr. 6.4. Elektroforetické delenie DNA v 1%������������� ������������������� ��� � � ����� �"!�#�$!%'&�(�)+*,-(�&.�)�/102%'&�3�45&"673�8:9';2<�<>=2?@(BA�CC�)+DFEG.�) H+I"J�K�L�MN�O$P QSR'T+U�V�WXZY�[�[]\�^ZP#_a`b[�[2[�[c\�^ad We�d�V�f�^ g h"i"j#k�lBmn�oqp�r�r�s�nut2v+wx�y$z�v+{5|+{�x~}�|���y�z����'|+{���o�w�|+����o�������p�r�r2r����������������'���-������������ ��¡�-�+�"�1¢+����£¤'£¥�¦¤'£"§"�1¨ª©�«¬�¤'�+­��

Streptococcus bovis ®°¯±$² ³�´¶µ�·¹¸ ºchromozómová DNA S. bovis »�¼�½B¾¡¿u¾+À ²1± ¾�Á�¼ ± ½Ã µ À�Ä#Åendonukleázou Hin ÆÇ�Ç�Ç�È'ÆÉ$Ê�Ë�ÌÎÍ�Ï:ÐÎÑÓÒ�Ô�Õ�Ö�×�Ô¡Ø-Ô+Ò"ÊÙªÚÜÛ Ý5Þàß#á�â'ã�ä#åæÝ�çéè�êéë ì�í äî$ï�ð�ßòñóZôæõÎÙªÚÜÛÝ�ÞBß�á â'ã�ä#å Ý�çéè�êéë�ì ö7÷�ãBø�Ý-ø+ù�ï î$ø�ú�÷�î�ãÃû5ñ+ù�ü#åendonukleázou Hin ýþ�þ�þ�ÿaý�� ��������� ��������� ý � �$ýmolekulovej hmotnosti - � -DNA štiepená���������������� "!$# �% "&'!� �#��"()�%*,+$!,# Bst -/.�. 021"3%4%5"6�7�8�9fragmentov 702 bp, 1264 bp, 1371 bp, 1929 bp,

2323 bp, 3675bp, 4324 bp, 4822 bp, 5687 bp, 6369

bp, 7242 bp a 8453 bp).

1 2 3 4 5 6

Page 40: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

1

7. Transformácia buniek E. coli

Prenos rekombinantnej plazmidovej DNA do recipientných bakteriálnych buniek patrí k:";=<)>�?�@BA�CEDGFIHKJIFLJLDNM molekulovom klonovaní. OQP"RLS"TVUXW$Y�Z�[�\^])_�`aPE[VUIbXP"YIced�f�dhg$S"RIiLPETVi"\^] jhW k l�m

n�oLp�q^rEptsIuKpvn�w�uKx$yLz){|qhx�yI}"pLy'~=�$rL����pL�)x$��~��a���������$����x$��w��aoL}"p�n���w�pIr"p'w�p�s"u�z�u^pLyI��x$}E�$r"p�s"u^pL��x'n�~�q�x�o=x �%���nízka (len 1 z 106 ���L�) $¡I¢X�X£�¤�¥�¦K§/¨�©�ªK¨$¡¬«�¨�­E®h¯$°²±�³E´$µ¶ �·E¸X �®K°2�� º¹�±¼»º�½¹I¾L´,µ¶¸L�L¿I��°) $¹"�L¡�Àh¨���¹L�IÁ"À¼±�©E�¸"®^° Âh¨Ã±�³E´$µÄ���L�) $¡�¢X�ţƤ�¥Ç�ÉÈLÁ� Ê��¹"�=µ"�I¡"®h»Ã±Ë«$©I³Xªh°BÌ Í/Î|Ï^Ð,ÑvÒ^ÓEÔIϼÕÆÖÉÔ=×ÙØ�ÚIÛX×ÝÜ�Þ�ß à"Ôâá"ãXÑIä)Ø$Ú Ò�ÐåÖ�æIçºØè$é"êXë äBìíÔIÓ"Ï^Ð�î,Ô é Ð,ÑLï2ÖðáXÐ�Ú'Õ�Ø�Ï^ä)ñ�×)ÑIòEî$óôá"ãXÑIä)Ø,ÚQî$ó"Ø�Ö�ä)î$Ú ê ÖÊä�×)ñ%Õ�ÚXÐ$Ö�ä)õ�Ð�ÚEÔöÒ�Û÷î$ó"×)ÔIÏ^ä)à é ñ$ÓEØ$ÑLÐ%Õ ê Ð�×)Ø�áEÔî$ó"×)ÔIÏ^ä)à�Ï�ãLáEï)à=äÙÐ$õ�ÓIÏhä è ÑLï½ç�Ø$ÑLØ�øùÕ�Ø�ÓL×)Ô'Õ¼Ø'Í úLû$ü"ýIþLÿ"ý������������� ������aÿ��Eû$ü����Xÿ���������� ������ �� �!#"$&%(' kompetentný�)!�*�$+'�,�!.-/�*10�2� 354768*:9 ;=<(>@?ACB�>EDGFIHKJMLON#P.QSRTA�PURVN#A�<XWY;8ZV[�\^]�_)`ba�c�dEef\�gih�?jACN�klQ�c�<(mYnoN)PpZc(mph)<(;KRrqd�?kompetentných buniek E. coli, pripravených opracovaním s chloridom vápenatým, dosahujes ?t ne 105-107 transformantov na mikrogram intaktného plazmidu pBR322, optimalizáciouu <�a�;vd@?c�<�A�QxwUZ:A=;8<�t�c�<=a�<xm�d�Zjy�cCB�n zY{}|�~����5���������f�)~��)�pz�(�p�)�����8z�C�.�C|O���� 7-108).�8�����������������U��(�5���������� ��¢¡

E. coli závisí aj od formy DNA. £�¤b¥ ��¦��§j¨�©5¡���¡�ª&���������«������5�j�(�5���������� ��¬¡ ¥ �5¡ ¤ ��¨�­���¦�ª®�����5��¨ ¥�¯ �j°C�K�¢±C¨³²����¬¡´©5¡µ¦&¡�¶ ¤�· �5��°�±��¢¡ ¯ ��¡�±�°��K�Y¨ ¥ ¡�5­�¡ ¯ � ¤ � ¯ ����¨³�relaxovanou formou, prípadne plazmidovej kruhovej DNA s prerušeniami) za 100%, potomª&���������x�Y� ¸�¹5º»(¼5½�¾�¹5¿KÀ�Á�¢ÃĹ5¾�Å�»�ºÆ�¾�Ç&È�º�É�ÃÊÉ�Â�»�Ã�À¹5»�¾�ÇKËÍÌvÎÐÏ5ÃÒÑÄɢû=Ó�ÔÕÈ(Ö�ý�¾x¼5½�¾�¹U×�É�¾SÅSº�»�¾�ÇØÉ�Â�»�Ã�À¹5»�¾�ÇDNA desatiny percenta a

É�Â7»�ÃrÀ¹5»�¾�ÇÙËÍÌvÎ ÚY¸�Â�ÃÛ&Ã�»�¾�ÇÜÖCÅS¾S¿KºÝ¹5¾SÞrÉ7¢ß�»�à�¿ÒÂÐÃ�»�Ö�¾�»CÇ�Æ�É¢Ã�ÀÞ�º�¿K¬Èstotina percenta. Z

Ç�ÅSÃ�Ö�û�á�â�¾ãÏUÃãÞr¹5Ã�Ïä¿�á�Èæå�Ãbº�Ï�Û�¹5ÂæÛ�¾�Ç�åCÂç¸�èÐÖ�Ã�½�¾�¼5½�¾�¹�×�É�¾�Å�º�»�Ã�Ï�ÅSÃÆ�¸p¾�¹�¾�Å�Ã�Ï¿K¾�ɬÃjÆ�ÇxÉ�×�ËMÌ�Î�Ï5Ã�»�Ã�»CÇ&É�¾SÅSÀÄÛ�¹5º:ÅSÖ�ÃÛ�¾(Ö�¾�é�»�¾�¼�ê�Å�Þ�»�Â�Æ�Ç�»�ù5ÃÆ�¾�¿=é�Â7»�º�»�¸�»�à�Á�â�¸�¹5º»�¼5½�¾S¹5¿Kº�»�¸p¾�Å�ë

Î�Æ�¾ì¹pÃjÁ�ÂíÛ�Â�û�¸�»�á=Æ�¿Kû�Ã=Û�¹pÃʸ)¹pº»(¼p½)¾(¿8À�ÁÂlÇØËIÌvÎb¼5º=»�º.Ï�ß�ºC¼)¸pÃYÏ�Ú5Â�Ã=Û�¾CÇ�å�èlÅSº�ÏYîØÆ(¿8û�ÃE. coli

HB101, DH5 ï , MC1061, JM101, JM109, C600 a iné, ktoré sa líšia svojimi genotypovýmið�ñ�ò�ó�ô�õ�ó)ö�ò÷Kø�òùø�úûüð�ý�þ�ÿ���������õ1ó���ð�ø¬óMó��� ���õS÷ ��ñEõ�ô�õ�ð�ò�újø�ÿû�õüð�ÿ�����õ��pòùòµó���õ�ô���������ô� �÷KøMú�ø�ÿ��f÷Køjednotlivých experimentov.

Transformáciu bakteriálnych buniek s �pÿ���õ�÷�þ�øEô�òô���ô�õ��������G÷Oõ! rô�õ���ÿròñ�ø"��õ�ð�ò�öMò$# øEô�ý�÷Kø%�&('*)�+�,�%�-/.0%�&�+�1�-02�'*3�4�56%73�8�9�3:1�,�;�4$9�<�= >@?�AB"?�ADCFE�GHCJI�A�C�KML�N�O�A$P�QSRUTVGXWYC�Z�I\[FA$T/QU]^K�_`R�ab?�A�O�I*O�?�]cC�L�I*O�E`dmedzidruhovú fúziu protoplastov, konjugatívny prenos rekombinantných plazmidov alebo

transdukciu pomocou fágových vektorov.

Nedávno LCeE�_�EfT^K�Gg]hC:CjiUC�k�C�]lCmLC:[�N$[nZ�I$B"EYK�[j?YO�GYo�B"EYC�pb[�]l[UZ�I*A�O�I*AC�KYLN*O!A�PqCSkUK`QeI�[�R�a�K�T^ZYC?�A[nK�OfLrGqsut�v�df[�]^[�Z�I*AO�?�O�AQ�R�T/C�w�xyQFI*OqP�[�I�zM{�C@|D[�i�C�]^O�o�[�K�Q7K�C7{�[�LrI�CFWYTl]hT^i�Q�R�ThT}W�GgK�ZYO�E�~YR�a�P�[�P7WYAQ�KL�?Y��LDO`W![�K�[$|�[�]l[�Z�I*A$TlR�Z�~�P�?YOY��O�P�d�k�B^P�LC�W!C�Z�I�[�A$TlQ�]^KY[JP�[�P�WYADQUK�_�LrI�C�K��b?�A[�R�a�OY{�K�[�?Y[�AP�[�C�WYTh]^KY�?�A[�?�A$B |�[�P RFGg{�iUO!AOY{�[r|�sutqv�w��b[SRUa`C�K�T�i�P7G}L�[�]l[�Z�I*AO�?`O!ADQ�R�Tl[JK�Tl[7|([�?�A[�L$KY[�i�KYQ�P�_!d@�}L$?Y[��K`O�L*pI*ACnKMLN*O�A$P�Q�R�Th[6W�GgK�Tl[�ZmI*~�P�I�O�L$?`��LDO`W!O!P�i�Q�EYT�LB�a�]hC�EYK`[M>�K�C�i�]^O!oU[UK�B�W�GgK�ZYO�EY[$|6L*I�[�K�_`d�AC�LrI�O�EYO�P

Page 41: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

2

�*�����������Y�� ���¡n¢£�/�U¤^¥�¦Y§�¨:���g¥��h¡� Y©�ª�^¤l¡j¡�¤l¡� ��*¢$�^§n f«�¨�¬�­�¬Y®���©�¯���ª�¬`°!¡$±� Y¬!¥Y�r����¥���¡�©²­`¬M¯���¡j��­�¤^�^ Y¬`°!��¥�³Y§�¨­��g¤"´�¬�°Y©f´�¤^¬�µ�¡�¥�¶}�²��¡�­Y¤^¬���¡�¡�¤^¡� ��*¢D¬!­`¬!¢�S¯�¥�«�¨`¬J·�«����h�����*�^¡�µ�¥��7 Y¬�¥�§�¡�¥��*¢D��§��^�¹¸uºq»�¼!½¾¤l¡� ��*¢�¬!­`¬!¢�S§��^�±�¡�°q­Y¬�¢�¬`°`¥���¥�¶�ª��^¥�³Y·��!�*¢�n¥fª¿*¬!¢·���¯�¥�³Y·��f·�¡F��ÀM���n·��f°�³`¨�¬Y�!¥`¡D±���l��­�¢¡�ª$°!¬�±r��¯���ª¬�°�ÁÂ¥Y¡�¥���¢¬Y¯�¥`¬�ª*Ã��±¡���¥�¬Y���g§�¨�¬fªrÃU©��U¤/¡e°�¦�µ������S±(¡:�^¥����"°f�l���g��¤^¥��Ĭ�­��*�^·��U¤c��´���§��"�Ä¡�¤l¡� ��*¢�¬!­`¬!¢D��¯�¥�³`§�¨X­Y¬M��·��l¡U¥`¬! H­�¢¡jednotlivé bakteriálne druhy.

Príprava kompetentných buniek E. coli pomocou chloridu vápenatého a ich

transfomácia s rekombinantnou DNA:

Å Æ^Ç�È�É�ÊYË�ÊSÌÍ�Î�Í�Ï�ÐqÎ�ËfÑÓÒHÎ�Ô�Õ�Æ^Ö�×�ØMÏ�Ð�Î�Ë}É�ÊYËÚÙ$ÆV×YÖ�Û�Ç`ÍrÌ�Ç�Ü�Õ�È`Ý!Í�Þ�Ï�Ð�Ð ß àmá�âYã�á�äråçæ�èYàÚéhêYërìE. coli í�î�ï�ð}ïçñ0ò`ó�ô�õ`ö�÷�ó0ø!ñFù�ú*ó�û$ü^ö�ý"ò�þ�ù�þgýÿú���ûrþ�ò�ñ�û�ö���� ����� 600 0,3-0,4 (asi 2-3 hod.)

za trepania pri teplote 37 C� bakteriálnu kultúru ochladíme v � �����������������! "#�%$&���('*)+�-,/.�01.�23�&���4�������5�761'981):�<;7���1�70

pri 4= C> rozsuspendujeme bakteriálne bunky vo vychladenom sterilnom roztoku 50 mM

CaCl2, ?�@BADCFEHG3I/JLK MONQPSR7MUT7VW@4XZY4R�[�P�[\Y]I-^&I_R�`1Y\[�a1b�c�d�[e[1f�g3h&ADi\jlkmY\P-[1n7o-A�hpa�[<qrk&a&ina 30 minút

s centrifugujeme bakteriálne bunky ako predtým, rozsuspendujeme ich v 1/15

pôvodného objemu bakteriálnej kultúry vo vychladenom sterilnom roztoku 50 mM

CaCl2, ?�@eAtCuEHGvI�JrK MONQPwR7MxT(VW@ykzY]P�[{n|o5AOhpa1[}q ~��&�<�\~4�������W�7�1�l�/��~������<�1�+�W���+~��]���\�bunky si v c ���-�|�1���-�����Q�]�7�+�&�-�%�¡ \¢¤£�����¢�¥§¦��r¨�����©��ª���1¢§�7���]�\«���¢§� ¬ ­�®

¯ rozdelíme bakteriálnu suspenziu po 200-300 ° l do vychladených ependorfových

skúmaviek a pridáme 5 ° ±e²%³�´¶µZ·3¸�¹�º�»D¼]½-¾�¿�¾&À�¾1ÁÃÂ�±-¿�Ä7»�½-ÅÃÆDZ-½WÈ]¿&É�¾\ÊËÄ7»�¸�Ì:Í!Â1·3½ª¼]±-½WÎ|¾�¸20-50 ng DNA) v TE a necháme v Ï Ð&Ñ1ÒÔÓ1Õ�Ö�×]ÕDØ�ÙWÚ7Û t

Ü skúmavky ponoríme na 2 minúty do vodného termostatu vytemperovaného na 42Ý C(heat shock Þ�ß�à�á]à�âWã1äÔå:æ1ç�è#é1æ�é7ê+ë|ì�ã�í-àyî&ì(ï�ðyñ3àeá�ê+à<à�ò�à�ç�ß*óõô\ã�æöï ÷4øZù:ú�ûýü:þZÿ�� �������� ù � ø ���� �����potom ochladíme v � ������������������� �"!#�%$'&)(*�,+-�.���0/21.3 4 C) a inkubujeme bez trepania

v teplovzdušnom termostate pri 374 C 1 hodinu5 bakteriálne bunky vysejeme na vytemperované selektívne agarové platne (100 – 200

6 $879�;: ��<���='��$��?>2@ A B�C�D�EGFIH�J�K�L�M�N�H;C.A N�E.OQP R.STH�P,HVU.J�H�W0X�O YZK�D[F�\�P^]TD_E�`�N�a�H�N�FbJ�`9X9D�c�d�B8ETF2`.J�eobsahujú príslušné antibiotikum, prípadne substrát na stanovenie expresie klonovanej

enzýmovej aktivity a inkubujeme ich hore dnom v teplovzdušnom termostate pri

Page 42: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

3

37 f gih�j;k�l0m.n�oZh�pIqIr�s�t�hvuZr-k.s.lGq2wxtym�z9{}|�~ h_�Gq2r_o�t���w�s.n9{�|���l.w���s�t��.qbo�h�s8p��bl.o��,h�sGq2lGm����,t�s�t�� �}w�s9r{�r��;s�l�{�k.l�kGob� |���|�l�k.�9h��

� �.o�t�pZr�wr�� {�t�t�qbo�h�s p��2l.o��,h�s}qIl9m s�h h���� t�{�t�w���s�l.m.� o�r���t�pIq�r�s.{�ty� �-s.��jTt��,r �,s.l.j�pIqbm9lm�n pZt�r�m�h�s.z9{�|Q~.� s�t�r��'s�h*uZr�k.sT����w�h[q2� ���^�9� �[¡.¢���£Q¤���¥8¦ §�¨.©.��ª�«�¬�§�­0® ¯x��°-±�² ­ ��¯�[³2¨9­�¥.�¬�¤�¯���¥.¨�§�´�©.µ9¶·��ª�µ�¸��º¹���ª9»�«�¨�§�¯�¼®�¹�¨�§�©.�½¸��[³I­�¯�§y³2¨G¾9¬�¤9¶ � ¸Z­?�¿¥.��¢2��²�� §�¬�§�¯�±�¨À»Z­_¹G§�¸I³I­[³2¨T¾9¬�¤kolónií, ktoré vznikajú v dôsledku produkcie extracelulárnej Á -laktamázy a rozkladu

ampicilínu v blízkosti ampicil ín rezistentných kolónií.

Príprava elektrokompetentných buniek E. coli:

 Ã�Ä�Å.Æ.Ç ÈyÇ�ÉËÊ�Ì,Ê0Í�Î�Ì,È�Ï)ÐÑÌ,Ò�Ó.Ã�Ô0ÕÖÎ.×ØÍ�Ì,È Ù�Ê_Ú?ÕbÛbÜ�Ê2ÉÝÄ�Å Ù�Ä�ÊËÉ)Þ Ô_ÆGÛIÊ�Ú�Ã�ß�È�Ä�Ê�É)Æ.Ç ÈàÛbá�Ú�âãÔVÄ�Ê-ä�å�ß�Ì ÊÞ.Ç ÄTÆ�âæÄ�Ô_Ú�ßTÕ�ç èTé"êbë�ì_í�é�î�ï�éðî�éòñôó 600 õ.öØ÷Tø2õ.ö�ùûú î9é�üZý�ì�íÿþZï�ì�� ��� ýì���� � é�� � � ïé��.î�� ö � ì �bunky rastú pomerne rýchlo; �������������������� "!#� $������#%#���# '&(���)�*�+���-,/. �0���� �132546%0�-�879��.0�:1��+ 6;<��4�=>�# ����?1@A �B#�C�D;8���*�+��% E#F��G!�� @A�� ��#� 1 H

I ochladíme bakteriálnu kultúru v J:��� KML�N�O�P @A�>��Q �R�SF� M�T�U;���V-�0W��M&8 �@A X&'� %#�vychladenom rotore pri 4000g, 15 min. pri teplote 4Y Z [� �V� �1���7\%�#�]�*^_!�;�7`!�;8�6%,elektrokompetentných bakteriálnych buniek E. coli HB101 závisí od kontinuálneho

� ���;'$5���6%0�M����a�+ 6!=b���*,Gc Y Z�!�d����eF� �=�f����g! ;<�FM ��*�A! ;�7b! ;8�6%,�HI rozsuspendujeme získané bakteriálne bunky v 100 ml vychladenej sterilnej

deionizovanej vody a centrifugujeme ako predtýmI rozsuspendujeme bunky v 50 ml vychladenej sterilnej deionizovanej vody a

centrifugujeme ako predtýmI rozsuspendujeme bunky v 2 ml 10%-ného vychladeného sterilného glycerínu;

2�7-�<10���4D1#�h��F� ����U;�4MF����i.��0��� 61G.,g@A��= .,�^ j�k�lnmporq:s 10/mlt u�j:v�u+wgx y�l`x y<j6z0{M|}�~ �0|�v ��k<jC�A� ���AzrqMs s � ���A|�wh��k*u*z0�M�6�g�h����w#zh�6z0j6��x�y�l u�{:x��bw�u�{��'��s � �"jM�

6 mesiacov, bez straty elektrokompetencie.

Transformácia elektrokompetentných buniek E. coli :

t z�#�����j�� ���A{�{���{Mv�u*y<w xw y<jM��|�}Cvh��z0{�u*�Az � �������� �\�9���3 �¡+¢£h¤�¥ ��¦��§*¨��:©ª��A�G�T«¬��­�¨U¡�® ¯#® ¡��M°6¦ ±prístroj Gene Pulser na kapacitu 25 ² F a 2,5 kV, Pulse controller nastavíme na

hodnotu 200 ohmov (Obr. 7.1)

Page 43: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

4

³ ´<µ ¶�·?´¹¸6¶�º�·A»�»�¼�»M½�¾*´<µ ½µ·G¿0»À¾+»�Á�¾�Á Â�Ã�Ä0Á�½hÅƸ�Ç0¼`µÈ�º�·A»�É�Ê�ËAÌ�µAÍ:¸�Ì�Ä0ÎÌ µÏÇ�Å#Ê�˼�¸�Ì»�Á#»'ÐgÑÀÎ>Òg·A¼ependorfovej skúmavky pridáme 40-50 Ó l bunkovej suspenzie a 1-5 Ó l DNA v TE

roztoku, dobre rozmiešame a necháme v Í:¸�̻Ը�Õ<¿µ Ö�ÑÔ·AÉ`Á�×�¾-ij premiestnime zmes buniek a DNA pomocou mikropipety na dno vychladenej

»�¼�»M½�¾*´<µ ¿µ ´<¸MØ�Á�»¹Ðe½ Å Çh»À¾*ų aplikujeme jeden elektrický pulz s nastavenými parametrami, výsledný potenciálový

spád predstavuje 12,5 kV/cm, Ø�¸�Õ<µ Ç#ÙR½#µ Á�Ú*¾�¸�Á�¾+¸RÃÅÛ·A¸�¼�¸ÜÃÅ�ÝÞ¿ ´<ɬÃ0¼�É`È5Á»àß#Î>Ò�á�Ò·AÉ�¼>É*Õ¹»�½�×0Á#Ì ÎâË�µÌ Á�µ�¾�¸ãØ�¸�Õ�µ Ç0»�Ðä½µÁ�Ú*¾+¸�Á�¾*Åå¿ ´�É�¸�·nµæÕ+×Ç0ÉçÕ�º�Õ ×èØ�É`ÁÁ�µ]Õ�Ý5µ�Ä ¿ ´<»�·gé Çh¸�ÁÉ�¸buniek a odstránenia solí z bakteriálnej suspenzie, ktorá je pri elektroporácii

nevyhnutná³ êë0ìí9îTï`ð�ñMò jemne rozsuspendujeme bunky v ó�ô�ó�õ�ö*÷<ø ùø ÷<ú�ûMüó'ý kyvete s LB médiom

(37þ C, postupne do objemu 1 ml), premiestnime ich do sklenenej skúmavky (170 x

10 mm) a inkubujeme za trepania (225 ot/min.) 1 hod. pri 37þ Cÿ bunky v primeraných objemoch vysejeme rozterom na selektívne agarové LB platne

a inkubujeme v termostate v obrátenej polohe pri 37þ � ú���� ø ����<õú�ü�¬úùø��5ø ÷<ø� ú�ö�ó���ü������Gõøô��ü����ö*÷<ú�ü�����ø ÷��AúMüTö+ø� ��

Page 44: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

5

�! �"�#%$&#('�#�)+*-,�.0/21!3�"54�3�6-75408�91:40;<4�=�>?"�6�3�6�"510@-8�4�7A1-3�1�"51B>(C�"�D�#�EGF�1H7H4GI?CKJ�L�40F�408�.!L 1M8�N�;�9<@B>�9�8�40O>P1�=Q1�=�6RI?CSL�D�T�8�10@�4M8�.U8�1V7540F�8�6�>?;�9�L+WX*M,Q@01�I?>?91�*M,Q1�3�1-"51B>(C�"YDQZ

Gene Pulser, Pulse

Controller a Sample chamber).

8. Identifikácia a analýza rekombinantných bakteriálnych klonov

Základnými stavebnými prvkami pre konštrukciu rekombinantnej DNA sú dva typy

vhodne upravených molekúl DNA. Jedna z8�9<*0,[754\L�4-=�>P6�"�6�L�]0OA=�>?6�"5]^I�;_C�`�9a8�1b3�"54-8�6&IcF�"YJ�,�4�7

molekuly DNA, ktorá predstavuje donora, darcu génu (tzv. donorová molekula DNA).

Stratégia odlíšenia klonov obsahujúcich rekombinantnú DNA od nerekombinantnýchdYeMf�g+hji0kXl�mXn0oqp�r-g�sPt�u�t�p�m�n0o�vxw2t+h�r�g�y�h0z{r|e�f�p�}(~5h<f�t�kGs(�%����pXr�g�sPt�u5i���������uP}&��u5����u5i�p�r|uHr�g�tXw���}�l�i0l�sPt�pz{r|��t�s?u5r���l��:eMpXt+h�}��|sPi�g��:��t+k�w2}<r0l�g�����i����2s(p�t�uY��i:u5r�g�t�wG��}�l�i0l�sPt�pK�XtXh<i�e�p�m�o�t�kXl�rMl�f���u5r�kqs(p�t�uY��t��nerekombinantných molekúl.

Na rozlíšenie rekombinantov al�r�u5r�g�t�w���}�l�i0l�s?l�m�n0o�s?u5i�l�~5�?tXu�wci0l�s�t�pS~Hi���t����0��pXiHz�y

�c�����H�����������X�����������P���� �¡����X¢X£X�����X�5�A¤�¢�¥�¦�§�¤�¨�©�ª[«���¬0¡�¨��?��¢[�2�+�<����¥��<­���¡���©®���M¡��B�P���X¢°¯�±�²0³�´5��¡�¨µ¤��-���P������¤���&¶H¨M �¥0©{�^��¡�·?���¸�G­��0��¥�£!�����X�H­¹¥��2��¦0º »�¼{½¿¾H½MÀ<½�Á�Â0Ã�»ÅÄ5½-Á�ÆXÇ�È�Ã�É�Ê0É�Ë?É�Ì�Â0ÍÎÁ+ÀjÆ+É�Æ�Ï�ÐÒÑ Ë?Æ�Í�Æ�Ë�ÆÓÍ�Ô�Ê0Õ�Ã(¾�Á�ÊÇ2Ö�×�½0Çc½!Ä5Æ�Ø�À�Ã(Ù5Æ�Ï�Ê�Ú Û?Ü�Ý�Û?Þ%ßXÞ[àHá0âá-ã�äMÝ<á!Ü5á-ã�åXæ�ç�Ý�è�é0è�ÛPå�êìë�è�á�í�éBÛPîjê�è�ï�ðXè�áBï�Û?Ü5ñ0â�è�ïòé pozitívnu.

Negatívna selekcia:

Pri negatívnej selekcii ê�Þ�ï�ó�î�ê�éMæcá2å�ç�Þ�ô0é�õ5è�áKàYÛ?Ü5éBÛ(ïöé-è�Û?Ý�ç�Ý�å�Û�Ý�ä-ã�áHõ÷Ü5á�ø�Ý(àYÛPá0è�ä0Ý<áqß�ù�ê�å�ú�è�û0ü�åêXá�ã�ÛPåXÜHé�ýbþ�Û(Ü5éÿÛPé�é�è�Û?Ýjç�Ýjå�ÛPÝ�ä�ã�á�õÓÜ5á-ø�Ý(à?ÛPáMè�ä0ÝáVê�ø�è�Ý�ã�ñ�ú�ù&à5â�á0ú�ã�å�æ Û?ø�ê�ý[Ý�è�ø%á�ÜHô�è�á�õ Ý�è�é�ã�ÛPÝ�ê�ñ0ä0Ý<áVß�Ü5Ýê�â�å�ó�á0è�îìäBï�ú�ø�Ý<áMü�å � àHá�ã�ï������ ú�åKê�è � Û?Ü5é|í�û�è�ï�ð°ã�Û?å�Ü�cß�Ü5î(à5â�ï�5è � Ü5á�ø�Ý(àYÛPá-è�ä0Ý�ïöéMâ<á�ç�å[Ý�è � ê�â<é�àYÛ?è�å°à ��������������������! "�$#&%(')�+*-,&�/.��!��')�&0213�54�67�"894;:+ &��.�:=<>:�4)#��$? ��.�:A@�BC,�DE���������FG�+�H:+,I' %J8�%J�"' %K�!��F0���L�%K4')�!,��+%M�9N/,&:!����*-���O�;�+�&,&: 4�:P.&DQ�SRI6M.9: #&0T� 0)�$L+UV6XW;�+,&%K� ' 0�:!,�4�Y �&0�1Z��.�:+,�[��+ 8���,&%K�+� ���netransformovaných. Napríklad v plazmide pBR322, ktorý obsahuje gény rezistencie na

ampicil ín a tetracyklín, restriktáza BamHI štiepi v polohe 376 v géne pre Tet rezistenciu. Po

rozštiepení plazmidu restriktázou Bam\^]�_a`&bdcVe&f+g&hai3jlknmXbTf!o�prq+g�s)t�uwvIf!x"t$g"y+q+g�z�{+|~} BamHI

kohéznymi koncami, následnej ligácii a transfomácii sa budú transformované baktérie E. coli

t��S}TfC|I�+�d�9{+q/bTq!x�t$p���cVg�f+g�s g�z�`��Kf!vIplcKe��VhX��cM�>t�eHs b�f�g�}�m t&b�p�fCgIs)t"u�t"�9}�f+|����d�9{CcK{+|��Kq!g�`���u�t�e�g��`��Vf!vIplcKe&t�u���i�jlk�cV{+|�};{+|&t&`&g&tS}�Ct"��b���} ��u�`&b�h(s)t$pZtS}s c�fCpZ`�cK{CcV�Kh�g���f�s)q�s bTf+{=�Qx��KhVg�����jrf�`���e&qs f+pZ`�c�{+cV��hVg"t�p u&�&b�fI}sX�w��f!x�s)q!b�cV�+�Vg�q�x�t$�J�$g&cKq+_�x�s�t$b�� t��S}Tf!|����d�~b�q!x�t&p���c�g�f+gIs g&�¡`��Kf!vIplcKe��~f�s cVq!¢

Page 45: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

6

bunky, ktoré získali pôvodný plazmid pBR322. Po prenesení bakteriálnych klonov na pevnú

pôdu s tetracyklínom s £$¤+¥-¦�§"¨P©&ª�«=£�¬&¤�©�§�¬&§�­&®"§G¯ °I§�¨ ®&¤±£&²�ªT«�¯³X´µ­$«!¦�³)¶!ªd·K¤+¸2¦�³�§�ª�¶�§"­9¯�«!¹I¨+ºd´rekombinantný plazmid (Obr. 8.1). Tento typ selekcie je pomerne nevýhodný, hlavne pre

¯ £�§!º¨¼»I¬ ½V¾�¿!À�ÁSÂÃwÄ)Å+Æ+ÇJÈ�É�Á$Ê�Ë�ÂlÌÎÍÀ�ÏÑÐ�À$¿�¿�ÒÓÌ ÍdÔ^Ð�Õ&ÔVÖ�¿ É&ÍT¿+Å+Õ&ÁSÂà ×�رÙrÚ!Û�Ü=Ý ÞMß�à&á âã�ØÓÝ)Ú äÝ)á�â�Ú!åJÚ!æSç+èKÚâ)é�á�ê+ÞMß�Üëß�åKÜ�âÝ à"Úëß Ý)á�ì�í�îIÚ�ØIï&á�ð&ñTò!Ø�âó�Ý èJÚëÝ ñ�Ü!à�â�ô á&ñ�ìZÜ!àIÝõ"í�æ�Ý�á$ñTò�à&Ú!ñ�ÜIâÝXórà&Üöï�ñ÷�ø"á$ìùÜ�à�Ý)èJð�èJá"Ý)èMæ�÷�×

Neutrálna selekcia:

Neutrálnou selekciou rozumieme taký typ selekcie, kedy nie je zvýhodnený rast

Ý ñ�Ü�à�â�ô á&ñdìrÜCàIÝ á�ß�á�ðSâTÜCøI÷+ä ó�ç+èKç+ø�ñ�Ú!æ�á&ì�ð�èVà�ÜCàIÝ à�óûú�Ùlü ß�á�ê+è�Ý ñ�Ü!à�â�ô á$ñ�ìZÜ+àIÝ)á$ì âTáOýIþ!æ�åVÜ+ï&à�ÿ�ìß$Ú!æ�Ý)á$ñ)á&ì�× ��á�ï��±Ü Ø!ß$á$àQæ�ÜTä���ÞKç+ø�Ø ý�à"Ü!æ�á�ß ä;Ú ìZá$î�à�ò ñ�á&ý+åVÞ���èJã ñ�Ú!æ�á�ì�ð�èVà�Ü+à�Ý à"ò á�ï������� ���������������������� ������!�"� ���#�����$ �%'&)(+*� ��� �%������,�-%�����$ �/. �� ��� ��0 1��.32�45%�.34�6879%:�<;<=>����?3�A@��=��������$�B%�C����B4ED����3�� GF��H�$�JI� �%��H�$��DK�������LI�M�� �%ONP!$2��C%����/;�QR�,�S�,���L2�� �F�4����0 �%�T�&VUW�/;<%����� �F����<;�Q�7X�génom tohoto typu je gén Y -galaktozidázy, lac Z, a to z nasledujúcich dôvodov:

Z expresiu Y [ I���*�����$ �?���F�C�?�.\;R�]�# �68��M^;���F��� �F�4:���� )� �J�_�<*��B%� WF��H�$�I� �%��H`a���b!A��*,����$7B%���.�����2�c�F�����

d štruktúra NH2 konca e -galaktozidázy nie je kritická pre aktivitu enzýmu. Tento koniecf#g�h8i�fWi j�k�l�m�n�o9prq$ms�tum�v�wyx�v:z�m�{�x�n�m�|ul�x�}�k�x�}�~��Hn�m���oBj�z�is�n:i�~���oBj k�l�ir~�oXiJs�x��Ks�x-lAi�z/q�l<oBs�q$�}��� x���f�o,i�~�s�x�j+��i�t�mHv�w�z�m)~�ik�x�l/j'��o�|^���_q$m8����}8f�w:zRi�|�zRis�n:i�~���o,i)�0qR� ����k�l$o�n�s�|Xm���m�~���k�x�|Bw�|Xo�~�s��l�x�n���xq$i/��q$x�x�v�|9m�z�q<o�k�x���iKq�~�j�s�|�i�x�q�o���x�nWfbj�z���v�w�p�~��8z�x�v�s�x�f�q�l$x��J{ )

d aktivita e ��� m�|9ms�q$x�}�o����}�w�x�z�q$�Hn�mb}�m���{�x�n�m�~���t'ms��/j�}�|9x�h8��fWib} dvoch polypeptidov, z ktorých

jeden obsahuje prvých asi 60 aminokyselín od NH2 konca ( � - peptid), a ���/ �¡�¢¤£���¥B¦:§�¥�¨8©�ªsekvenciu od 50-tej aminokyseliny po COOH koniec « - galaktozidázy. Tento jav je známy

ako � -komplementácia fragmentov « ¬�­�®§�®¯�°$±�²�¥���³²J´'µ#¶#ª¯�°$±��/´�·)¸�´� �¨8¹B¸:®Aº<»:¼8ª-½�ª�§,ª¯�¼�¥B  ©�®princípe inaktivácie « -galaktozidázy kódujú len � fragment, nesú neúplný lac¾¿µ�À#±�½/°�¥_°$ª�Á½<¯�³bunka E. coli obsahuje gén pre « -galaktozidázu, ktorý však neobsahuje � fragment (gén je ¥�®�½/°$±  ©�ªÃ��ª�§�ªH°$±�¸�®©�¢�· Ä M15 delécia). Ak je bunka transformovaná plazmidom, ktorý má

neporušený lac Z gén, kódujúci Å Æ�ÇÆ�È�É�Ê�ËÃÈ$ÌKÈ�ÍÏÎ�ÇLÐ�ÑÒ�Í�Æ�Ó�Ì�Æ�Ô�Í�Ê�Õ�Ö�Í�×�ØHÙÛÚXÕ:Ó�Ö�Ü�Ó�Ý Þ -ß Ø�à�ØÖ�È$Í�á�É�Ê�Ì�áÕ:Ë�Æ�Ô�ÇâÈ0Í�ã�ÇäÊ3Í�ÑÒ�Ì�Ê�á8ØuÖåÐ$Æ�ÍHÎ�Ç�Ó�ÉBÕ Å peptidu a á×�æ:ç�Ó�Ç<Î#Ü8Ø�Ð�È<ÉèÆ�ÔAÍ�È$Çé�Ó�Õ kódovanej

Ò�ÍêÐ�È�É_È$Ç�ëÐ<Ö�Í�Õ�ì�Õ:Ó�Ö�Í�Õ�Ó�Ø Ä í/î9ï�ðñ�ò/óõô�ö�÷uøúùüûKýõþ�ÿRïù�����������$ý���<ù� ������3ù�ï����Aï���������������þ�ï��� ��plazmidom obsahujúcim cudzorodý fragment DNA, ktorý spôsobuje porušenie lac Z génu,

Page 46: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

7

���! "�$#&%���'� �( *)�+�'*,�-/.�0�1�,�231�(4)65�)�'�7�%�����1�-8��9���:!0�,��<;�2>=@?40A1<,ABC1ED F GIH�2KJL2�,< *��M�(L:�-�M�0N��9�)> ���OE)�7�%<P�.�2Q peptid.RTS�U"V�WYX�Z\[^]A[�_a`�bdc�e�f�g<V�WY]�f

Lac- mutantov E. coli, ktoré sa s]<h�i�f�j�f�Xkj�l�ZImon�f<X�g�Uqp

akoi�f�V�W�UW*[�_�Vr`�bs`�c�[�e�[<tvuwl8V�[Kx4[K`�yCUqX�z�[�`�f$c3{�ULe�l�e!W*f<]|]�f}]�[�`<W"f$z*f�yKi�~�`�j�[�j<f�y�i���j<�Cl�` inaktivácii�

-galaktozidázy (séria plazmidov pUC, pUR, fágov M13 a ie�hAy�i��3V�lde�lrZ���l!V�W*[\Z���U�[�n�f�X�g��q]AlrZIm

n�[>]�e�b j�[>W*[�`��Ke�b n���j�� V\f V�X�{�VIW�z\�>W�f�c X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-

�-D-

� l�xLl�`<W*f�n<��z�l�e�f��EULj<��~�`<W�f<zIh��4XAe<`A��e�� �-galaktozidáza mení na produkt modrej farby. Ako

induktor tvorby � �����C�����<�*�$���L�����C�¡ ���¢��<£�¤�¥q¦���§I¨ª©T« ¬I�q�E��¢�­���¢<�¯®K� °

-D-tiogalaktopyranozid).

Rekombinanty tvoria bezfarebné a základné vektory modré kolónie (blue and white colonies).

V�L��*±�­����Y²�­�±³ ��N´��! I�"�µ �±��L±���¶����³  ¦A±K�<�*�$­r·��¸�*��¹��!�"�³�Y��¢<£º����»���´�£�¼�± �����½¢�������*¥�¦�»���¾v��¦À¿����

¦����< I��»��� ����Á¢��$���Â�r¥q¦�»<��¶�¹Ã \±��4±K��´�»<Ä�¶�¹Å¦$±��<�*��­r�<¦�¾T�����Æ£�¦�±����L±�·w±�Ç6����±\¼�¾6 ��d�E�E �����»�±��4¥Y¿����<È�Éd±>£���­\���L»�� \±C��±���¶����í�±�����·3Ê��L»��C»E�*��¦Ë ��³¦��<£�¤E¥q¦A�º�\¼Ì¢�­��8���L��»���¦$��»<¥���Í�»��<¦�¾8¢�­r¥Â�*�$·�»��� Iκ�<�"�$­�Ä�¶�¹k¼a±º·��$¤�»�ͼ�±���»����!£A¶�¹��Ï��±>�*±K���<¦��>Îл��Ѧ�¹����<»<Ä$¶�¹Ò��±>�*±K��´�»<Ä�¶�¹Ò¢�Ó�����¶�¹�¾Ô»���¢�­�ÈÕ¢�­r�½������»��<¦���»�¥º��·�����������¾celulázy a

ÇÖ�!¿�¥�¶�¹3��Í�»��<¦ÀÈ

Pri identifikácii plazmidov, ktoré obsahujú lichenázový gén ( pSA3-lich) a GFP gén

(green fluorescence protein, plazmid pKK-gfp × ¢��<£�¤�� ¼a±�·w±�¦ ¶�¦��4´E±�»�¥Ø�*�L±�¤Ì»�±�£���­����L»!£º �±���±���¶���£ÙȨ٭r¥�*��·�»��� IÎ ÚvÛ�ÜÞÝ�ß�à!ásâ ã�ä�å�æ�çæ*è�é�årê�ä�ëìä$írÝ�îKà�çqïEëdèµå\îÃð�í�èrñ�î�â�á�ñ�èÃòEóæ*ä�ïEè�óLè�à�ä<áõôIóqáAä�í�è!å�ö�è�à�ö�çLä�áA÷ê<æ"ä$í�ø�â�ï�à�çLê�øùð�í�çúä$òEçLîKí�è�à�û¸í�èKê�ä�ë3ü�çýà�î�àEæ�à<þ�ö�ãÕê�óLä�à�ä<â½ð�ä�ÿ����Òå�â�è>æ*óLä�ëÒð�í�ç������Ãà�ë^÷ ð�í�çLî�ë�äºà�îagarovej platni.

ÜÙírûæ*ä�ë�à�ä�å�í�è�ê�ä�ë^ü�çLà�î�à!æ�à�ß�ã�ä�ð�óLî�ïEëdç�ÿ!áÐåÃóLç�ö�ã�è�à�ø�ïEä<â�þ�ë Ý�ß�à�ä�ë ê���ÿ!á�ñ Aö�ç�ë å���à!æ\ß�ï�ázmiešanej � -glukanázy (1,3-1,4- � -D-glukan 4-glukanohydroláza, EC 3.2.1.73), ktorá rozkladáí�îEåIæ�óLçLà�à$þ�ð�ä�ó���å�î�ö�ã�î�í�ç4ÿ}óLç�ö�ã�è�à�î�àõî�òµà�îÔÝ�óqá�ê��$ïKáA÷8ë���òEè�ë�è�å�æ*î�à�ä<â�ç�½ærç�è�òµð�ä�ë�ä�ö�ä<á|à�è�á�æ�í�ø�óLà�èrñselekcie. Platne na detekciu lichenázovej aktivity obsahujú okrem 25 � g/ml chloramfenikolu

aj 0,1% lichenanu. Bakteriálne kolónie vyrastené na selektívnej platni opatrne prelejeme s

primeraným objemomô�îKí\ü�ç�î�öEè�ã�ä�í*ä$ï�æ�ä�ê<á��@ä�à<Ý�ä�����è�í�â�è�à�è��

Congo red; 0,5 mg na ml 25 mMô�ä�å�ôrø�æ*ä�â$ß�ã�äÆæ�óýëwçqâAßCã�äÃírä�ï�æ�ä�ê<á½ð����<÷�� � î�à�è�öKã�ø�ëwèÅçLà�ê<á�ü$ä�â$î!#"$�%�&"('Õë�çLà� �æ ð�írçÖóLî�ü$ä$í�î�æ)��írà�èrñteplote. Pozitívne bakteriálne kolónie, obsahujúce rekombinantný plazmid s lichenázovým

génom, vytvárajú po odstránení farbiaceho roztoku okrúhlu bezfarebnú zónu na sýto��èKíIâ�è�à�ä�ë ð�ä�ïEî�ÿ<û+*

Pozitívna selekcia:

ܪä$ï�çærûqâ�à�î³å�è�ó�è�ê�ö�ç�îÅí�è�ê�ä�ë3ü�çLà�î�à!æ"ä�âÌñ�èÅâ-,(�/.�çLà�ä<áºïEî�óLä�òEè�à�ø à�î³çLà�î�ê<æ*çqâ�ø�ö�ç4çÖÝ�ß�à!áA÷Öê<æ�ä�í�ß�ã�äprodukt je pre bunku toxický, alebo inaktiváciou ktorého sa fenotypicky prejaví dovtedy

Page 47: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

8

0�1/2)35476(198-4(:�;<8�=�>91@?�:�;A8�3B4/C2):91DC)E FG:94H0�IKJLINMHO P�C)2QMH:�R(PB4S:�4S4(:/2QP�T�P51�2)P�U�VXW&JZY týmto typom vektorov0�4!2)IQP54�4\[]C^M(3BMHU�6(:�_`8aMHU�2Q1�Ib&8�b�V�c d�8a4�[�eaR(M�P5:�4HU�2�P�8-;(R(PfVhg�_H:/Vi0�I\M EcoRI restriktázu, napr. plazmid

pSCC31, ktorý je derivátom pBR322, z ktorého obsahuje replikón s ampicílinovou

rezistenciou a gén pre EcoRI restriktázu (ale nie metylázu) z pMBl.

Plazmidový vektor sa izoluje z U�W�M(j�47FkU�2l1-I)=mU�1�:@n)2)Po2pV�2)d�8�:9MqC�b�: 2QM!2�PrOHV([^M EcoRIWsM!2)b�3B;HOHVaFt4(35MHT�1vu�674/C2QM[KnNPBMHw#8 podobe, kedy v E x7y9z|{~}��H�9���N�����(�B�(���(�������N�!�)�����p�N�$}@�s�(�/�cudzorodej DNA. Po transformácii baktérie, vyrastú len rekombinanty tohto vektora, lebo

transformanty, ktoré obsahujú základný vektor sú rozštiepené restriktázou. Nevýhodou

�-�H���Qy-�\�����������Z�$���H�9y�����G�(�p�N�Bx(���^�(���s��y@ ¡y9¢9����x(���K�^�]y9¢��s�( �£ �(���s��y��(�!�¤�N�/¥)�p��¦����Q�$£ �@�/�ly-�\� ��y�§(�9y���N�S���5y���y����(��¦B�h���¡��§ ¦f¨9©Zªs�h¢-�(£ � EcoRI endonukleázy sú konštruované aj plazmidy pKG2,

pKGW a pKGS, v ���Qy-�)��x(�|�N����y-§ �9�«�@�fy-�9y9�-�7¨¬�p�N�H}��s�(�/�p�s£ �H��y����(�(���«��y����$£(������¦���y���x(�(��¦a��yštiepení restriktázou BamHI, BglII , BclI, MboI, XhoII, AcyI, AhaII , HindIII, AsuII, ClaI,

HpaII , MspI, NarI, TaqI, PstI a ich izoschizomérov.­¬®°¯p±N²5³µ´�¶-· ¸o¹Q²�º�»�¼�³ ½\¾°¯B¾H¿�À(»�Á�³Âºa¾H¿�¹)¶�ÃQ¶-³Ä½)ÅÇÆ�¾$Ãȸ�º-É!¹p¼~º�¼�Ê�Ë ²�ºa®\Ì�ÅaÍ(¾Î¿�¯5¶@»9¶9º-®(»�¸�¾%Æ�¶

cI

represora Ï Ð)ÑHÒ�Ó(ÔAÕ�Öl×-ØÙÛÚ^Ü�ÝÞaß(Ó/Ý�à°×�áãâ�ä5ÓHå æsç�è/á¤ésê�ë�ÓHÕ�Ö)ç�ìaÑ(í(çBÓÇØNÜHâ�ØNÜ/Ý\×-Ø\Óîì-Ü(è-çfÜïÕ intenzívnej

transkripcii z PL promótora, pod kontrolou ktorého je gén pre rezistenciu na tetracyklín.ð ÜHÕ�×�æ�ñ�çòë�Ó(ë Öótæ�ô�õHá%â�Ø\Ü!Ö)×iØNÑ/Ýàöë�Ó&â�ô@è�Ü�Ý tetracyklínom, ale transformanty obsahujúce len

pôvodný vektor nie.

÷ ×-å7çoÖ�ø�ì�ë9Ü ÝNÜ(äBÜHÕ�ß(ë�ù ì-ÜHÕ�ÖQ×�Øó â ú�ûýü(þ�ü$ÿ Ó â úsû<ü(þ���� ì�ó�á�õ ø�ìaÓ�Ú�Þ â�×�å(ë9Ó!Ö ×-Õ9Ô õ°Üí��¡ØN×@æ�×�å���æ�×�ì�ÑýØNÜHå çpÝÖQÜHë9í°çBÓ<ì-×@ß(ç�ÝÖ)ØNÜ$â/Ö)×�æ�ó�í(ø5ë�á&Ú^Ü<ØNÜ7í(Ü/ÝNø�ì�ë-ó�æ�Ò�ù°ë9×@ævÕ�á Ò�ùHë áaÔGÕ�Ö)×�ØÙtÕ��@è/á$Ú^Üí(çoÖQä5çfì-×DÝ�àÛÕ streptomycínu (Sm). Pri klonovaní do génu SmSÔýÕ�Ö)×�ØÙ~Ú\Ü«ÝÞaß Ó/Ýà°×�á ì-ÜHÕ�ÖQ×�ØNÓHÔnastáva jeho inaktivácia. Ak rekombinanty selektujeme v kmeni E. coli, ktorý nesie

chromozómový gén SmR, rekombinanty budú SmR a nerekombinanty SmSÔÎß(ç5õ Ü ÓHÕ�â�×transformácii bunky vysejeme na pôdu s ampicilínom a Ý)Ö)ØNÜHâ/Öl×-æ�ó-í°ø5ë9×@æ�Ô Ø\Ñ/ÝàÛæ�ô�õHá ä5Ü(ërekombinantné klony.

Posledným typom vektorov s â�×�å(çoÖ)ø�ì�ë�×�á ÝNÜ(äBÜHÕ�í(ç5×�á ÝÞÇì-ÜHÕ�Ö)×�Øó~ì�ó�áaõ øfìaÓ�Ú�Þ ce „killer“

aktivitu ccd Ò�ùHë/áaÔ ë9ÓHâ�ØKéZâ�� ê ü��¡Ô Õ�Ö)×�ØÙiâ�×�á�õ(ç Ú^Ü°æsÜSÓ�Ú�â�ØNçGâ�ØNø�â�ØNÓHì�Ü&Ò�ù°ë9×9ì-Ü�Ú ñ�Ó(ë¡Õ-óaé ÷ ×@è�ØQ×9ñ9ë�Ùpopis tohoto plazmidu pozri v kapitole 6.

÷ ×-å7çoÖ�ø�ì�ë9Ó Ý\Ü°äBÜHÕ�í(çBÓÄÝNÓ ì�ó¡á�õ/ø�ìaÓµÓ�Ú â�ØNç�Õ�ä5×@ë9×9ì-Ó°ë�ø Ò�ù(ë�×�ì�Ô�Õ�Öl×�ØNù Õ�×�æ�â�äBÜ°æsÜ(ë/Öpá7ÚÞv baktériách mutované gény, prípadne k ��è/á7ÚÞµÝNÜ(äBÜHÕ�ÖQ×9ì-Ó!ÖQÜ� ë�Ù ÐQÜ(ë�×�Öpó¡â��)ØNÜHå ç�ÝÖQÜ$ë�í(çBÓ ì-×@ß(çÓHë Ö�ç�ñ�ç5×�ÖQç�Õ�Ñ(æ�ÔDà°ÓHõ(Õ�Ù�æ Õ�×�ì�×@æ Ó�â�×�è@é�� é�� tomto prípade však z æsÜ!ÖQ×�è�ç5íHÕ�ù���×��� KÓ(è�çlÝNÕ�Ó�çfè�Ü<Ý�Õ�ô�Øo ÓHë�Ó(ä�Ù�åHásØNÜ$Õ�×@æ�ñ�çòë�Ó(ë ÖQ×9ì-Ô@ÓÚLÕ�Ü��<ÚNÜ`Ý)Þaß Ó/ÝNë�Ü`ÝQâ�×HÚNÜ(ë�Ñ`Ý\×<ÝNÜ(äBÜHÕ�í(ç5×�á¤é

Page 48: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

9

V podstate rovnaké metódy selekcie rekombinantov ako pre plazmidové vektory���������������! "�$#%�'&( )�� �*�+,��&-.*��0/��%132'���045� fágové M13 vektory. Odlišné sú metódy selekcie

rekombinantov v cháronových vektoroch.

Page 49: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

10

Obr. 8.1. Postup pri selekcii bakteriálnych klonov s rekombinantným plazmidom na

princípe dvoch antibiotických markerov (negatívna selekcia).

Page 50: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

11

Analýza rekombinantných klonov:

687:9<;(=?> @'A(B0@�B'> C�B ADB'E�9?=<;GF�H'=IA(F�@�BJ>LK�M?H�7�HONH�P�Q�R @�9?B'H'B�S TUF C�BON<S�A(V'F�H'M3F B�KXW(7�ROYrekombinantnej plazmidovej DNA. V

C'AZ=[C�7�V'F�\^]�F)@'9?BJH�B�S07:H�P`_<A(7�a�>!F�HONcbed%fgT(F"V'F�_DM?H'B0S07�H�P'\WN,7�h�=iS'j'@�B'H'7�kl>mM?H�MnM?E�BJ9po�Q�MpYqCJ937�E�>rM3V'B�S�FDTsbtdrfuE

vybraných klonov a pomocou elektroforézyWN,7�H'B�S�M�kvT(FDTwS�F�xU@�ByWzk�{�|}BLA,B0E~;zNM?F�C�F�H'=�M?E�BJ9?B�S�7�H'FDT}bed%f�A$FOWzNADM[@yh�H�P'>�F�H�E�P�>%BJ>!\JC�B'>%B�Q�B�Y�@ON�B�A(��R�Bsme klonovali, vznikne fragment vektorovej DNA a klonovaný fragment.

K7�H'7�9�P�E�F A(F�@�B'>LK�M�H�7�H�NH�P�Q�R @�9?B'H'B�S >%B']�H'B C�B�Y ]�M�k 7DT N,F�Q�R�H'M?@�Y R�j�K'A(M3V'M�E:oOQ�M3F

rekombinantnej DNA sB0E�H'7�h�F�H�B�Y�W(B'H'V'B�Y��

probe), ktorej sekvencia je komplementárna

kR'x�7�V'7�H'��>LYX�z@�9?B'H'B�S�7�H���>8Y���W$F�@�Y�bed%f%{�|�B�M�E:BJ9?o�Q�M?MLC�9n7�E�>%M3V'B�SXFDT�bedrf�E

rekombinantných

klonov sa táto štiepi sA(F�WzNADM[@�h:H�P�>!M)F�H~E:P�>!7�>rM�7�S'E�HJM?@�HOY'N,��_<A(7�a�>

enty DNA sa rozdelia

agarózovou elektroforézou. Potom sa DNA prenesie z agarózy na nitrocelulózovú, alebo

nylonovú membránu (Southern transfer, Southern blotting� \�@�V'F�W(75H�F�Q�R'o�R�j�K�A(MnV'M?E�B�S�7�k�W$Bsondou . Ireverzibilné naviazanie DNA na membránu sa dosahuje vysušením filtra pri teplote

80o� 7�93F�K�B"C'�yW(B�K�F�H'=3>��L��]OM37�A$F:H'M37�{�fe@�V'��T(V'F�@ hybridizácii sondy k niektorému fragmentuC�9?7�E�>rM3V'B�S�FDTLbed!fc\�E�H'7�>!F:H�o�NB'\^]�FrN,F�HON�B5_<A(7�a�>rF�H�N%B�KyW$7�ROY�TGFqR�x�7�V'7:H�P0�z@�9?BJH'B�S�7�H�P���W$F�@�btdrf

(Obr. 8.2.).� F�Q�R'H'M?@�7gR�j�K�A(M3V0M?E�o�Q�M3F�WG7gC�B�Y�]�=�S07 7DT¡C'AZM"S'j'R�x�7�V'o�S07�HJ="Y�A(h�M�N,��R'B¢@'9pB0H�Y£S£a���H�B�S0F$T@'H'M?]�H'M3Q:M3\rC'A(M?h�B�> C�BJh�FUN�A(F�@�B0>LK�M?H�7�HONH�P�Q�Rg@�9?B'H'B�Su@'H'M?]�HJM3Q�F¤��K07�@�N,F�A(M?o�9?H�F�@�BJ9?¥'H'M3F¦SuC'A(=�C�7�V'FC�9?7�E�>rM3V'B�S�FDT5@�H'M?]�H'MnQ�F�\r7�9?F�K�BgC�9?7�@'j§S C'AZ=?C�7�V'F�_o¨a�B�SXFzT�@�H'M?]�H'MnQ�F � >%�']�F�V'ByW(7�R�B�S07©k¤R�BJV�H�B�N<jrádovo 104-108. Táto technika sa nazýva hybridizácia v kolónii, resp. v plaku (colony

hybridization, plaque hybridization, Obr. 8.3.).fe@�B W(B'H'VOY TGF >%B']�H'� C�B�Y�]�M�kªTGF�V0H�B�S�93o�@�H'B�S�� btdrf 7�93F�K�B «¬drfc\I@ON�B0A$o T(F@�B'>LC�9nF�>!F�HON,o�A,H'7c7OWDC�B'­g@ h�7OW<NM�TGF�V'H'��R'BrE A(F©k:7�E�Q�B�S%@'9?B'H'B�S�7�H�FDT}bedrf%{�®Lj�K�AZM3V'M?E�7�h�H��mW(B'H'V�j�Wz�rádioaktívne alebo v

C�B¯W,9nF�V0H�BJ>°h�7OW$F�S�F�x�>rM±h�7OWN,B�M¬H'F�A(o�V0M?B�7�@�N,=�S�H'F�E�H'7�h�F�H'��{}«eo�V0M?B�7�@�N,=�S�H'FE�H�7�h�F�H'MnFLWDC�B�h�=�S�7¦S

substitúcii fosforu za rádioaktívny izotop 32P alebo 33P, prípadne kyslíka

za 35S vHOY�@'93F�BONMpV'BJQ�R5C�B�Y�]�M�NP�Q�R�H'7�C'A(=�C'A(7�S~Y�W(B'H'V�jy{�b8F©N,F�@�Q�M?7�C�B'E�M�N,=pS�H�F�R'B�W(M�aJH�o�9pY�W$7�C�BONB'>

Y�W,@�Y'NB�h�­OY�TGF�C�B0>8BJQ�B�Y`7©Y~NB�A(o�V�MpB0a'A(7�_M3F�\^@�NB'A(oqW,C�BJh¨=�SX7²S N,B'>%\^]�F�C�B³Y�@�B0H�h�F�H'=�R�j~K'A(M3V0M?E~o�Q�M3F)7odstránení nenaviazanej sondy z

>!F�>LK�A(o�H�j�W(7³H�7�N<��NB.C'B'9?B0]�=´_B�N�B0a~A(7�_MnQ¨@0P`_zM39n>%\eH'7"@�N,B�ADB'>A(o�V0M?B�7�@�N=�S�H'F°]�Mn7¨A(F�H'M3FµS'j�NzS0B0AD=¶h�M3F�A(H'F·;,@0S�A(H�j H'7¸>rM3FOWN,7�Q�R'\¤@�V'F¸V'By;(9?B @

hybridizácii.d!F�A(o�V'M?B�7�@�N=�S�H'F�E�H'7�h�F�H'MnF >%B']OH�B¸V�ByWDM37�R'HOY'k ¹�º�»�¼3º�½�º�¹'¾n¿ À�Á(Â�¼�ÃÄ�Å�Æ�Ç3È©Ã,É'Ê�Ëz̨½�¹'º�Â�¼3Í�ÊJΨ϶¹'º¹�À�ÊJÇ3Í�É�ü?Ð�Ñ"Ò�É�À�Ó�¼�Ã,Ô�Ò'ÁZ¼¬Ò'ÁZ¾[Ò'Á(º©»XͳÕ$É0¹�Ð�ÑXÖv×w¼?Í©Ã,É5̨½�¹'º�¨Ê0Ñ�γ¿8Ø0Ó�À�Ù'Ñ~Ú"ÛDÇ�ÀXÉ'Á(ÍOÕDÊ�À�ÜzÝXÅ�Í)Ç3È©ÃÊ'Ñ�Þ�Ê�Ã�É�Á(Ô¿%É'Ó�¹'É�Ð'Í©Ã,Í�ß'É�»�º�Ú�¹'ºr½:È�ÊJÇ3º�Ð'Í�ÛÇpÀXÉ'Á(ÍOÕ$Å�Í�¹'¼3Í�Þ^º�Ç?Í�Ù�É�¿%ºDÜDÝ5»�Ç3º�Õzù'ÉyÕzü¬º�¹�ÃD¼�ß�Ô�¹'¹�Ñ0Å:Æ�Ð'Í©Ã,ͨÁZ¿%¼?¹�º�¹OÃ,É�»ËDÐ'¼�ß�É�à�¼�ßXÍ:¹'¾?¹~Ï(ÞsÒ'Á(¾�Ò�º�Ð'¹'Í5Õ$ºq»'Ñ'½�¹�º�©À�Ü$Ýáº�Ûz¼?¹�¼�Ã,É�À�Ê

iným látkam (napr. biotín k streptavidínu).

Page 51: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

12

â8ã©ä,ã�å�æ�ç3è¦é$è�ê�ëOäë'ìîí�é,å�í'ä,ëJï¨ð'ñmê�ë'ì%ë�æ�ë�ígê'òDñ3é(ópí�ô(ð�ãDõ"ê'ò(ëOäç?ó3ö©äå'÷¶ø�ù¶ê'ò(ñ�êXè�ú'ã�û�ç?ë�äDñ?ðOí�ê�ë'ì%ëJæ�ë�ístreptavidínu) konjugovanej s

í�ò(ï�ç�äü�ì°ã�ð'ý�ü'ì%ë�ì¸øDè�ó?åXè�ónç3æ�å�ö³þëyé(þè©ä,ö�ý:è�ÿperoxidáza), ktorý poê'ò(ç?ú'è�ð'ñ¤ôDê�ã�æ�ç?þDç3æ�å����'ë ézí'ûyéäò(ö©ä<í�ù'÷Oä<ù0ë0ò(ñ¡þè�ò(ã�û�ð�ü¸ê'ò(ë�úOí�å�ä�è�ó3ã�û�ë·ê'ò,ë�úOí�åOä¤ù'÷~ý�ð'è�ï©í�õ��Xæ�ç¶é(è

chemiluminiscenciou.��ëJú�ì%ç3ã�ð�å'÷�ê'ò(ã���÷�û'ò(ç3ú'ç�ý:öOæ�ç�í é��¸í�ò(ï�ë�ù�è�ð� ë�ûXé(è��'ëJì þë'ò(ì%è�ìrç3úOí è

iónovou silou��÷~û�òZç3ú'ç?ý�è�ï�ð���'ë)ò,ë0ý�äë'å�íXÿ�^è�ó?ãDõ�ä,ã�ê�ó?ë�äë�í�è ï�è�éDë'ì���÷�û'ò(ç3ú'ç�ý

ácie. Zmenou týchto podmienok jeì%ë �ð�Lú'ëyé(ç?è��'ðOí��:ÿ� :ãmé(ë'ð'ú'è���÷~û'ò(ç3ú0ç?ý�í�õGãLèDõ^ê'ò(ç�ð�ã���ê'ó?ð�ãZõ��'ëJì8ëJó���Jç?ç?ÿ�ï�ë³é(è ù'÷�í� Oñ�ùXèLê'ò(ç}é(ë'ð'ú'ö�æ��'ÿktoré pochádzajú z

ç?ð�����ërê'òDñ�û�í�ý�ð����ë�ë0ò���è¨ð'ç�ý�ì8í²è�ó?ã�û�ë�����ðOí�����ë�í� �ç�äDçpã���÷~û'ò(ç3ú0ç?ý�è�ï�ð�ü�æ��%ä,ã�æ���ð'ñ?åõGã�ê�ëJú�ì%ç3ã�ð�ã:ð���ú'ëyézä<í�ê'ð�ë¯é�� �!#"$ &%�'�(�)+*-,�'&%�.�/102 3"�4�56"$ �7& �8:9�;� <0�=>"�;�9�?<"� &%�'@!BAC,D8(�!�E2FG?H!�E%�9�;JIK J% �8�9�%�.L4MN=G7�!�02%�.PO�Q�%�)SR�%�TU/V E2% 6"W?XAN,Y4� �!�E�FG?L"N %'@!Z"�(%2[$,�[�F\02 �8&9�%@]^4� J'_`9Y0�%�T�/a,�A7�Fb,�I�;� �8�F�% 8�,�AY"N,�;8�,�%�c�Fb,�)�da9�;� �_C;� YAN,�'%9e9�/VF�% ;&(�"f,�IgF�%�9e/V5E2,U7(�?P;�hJ' �8�9�%�TP8�Fb9�ci,�M�.�/jF;� �'�h%/VF�k�Af,+4� @[�MN,�7�%Q�"�(%2[$,�[$FG02 �8�9�?l%Fb,�;� �_C;� �9�Im[$,�M$%9�[�=G8�%(�c�n�"N5%'e"N j0i &n�_`9�'%,�%=g/o',�O�,�%�,�MNT�c�Fb,

genetického kódu. Pri výbere syntetického oligonukleotidu ako sondy, sa vyberajú také úseky"�,�;&8&,�%c�Fb,�kp;�[q &M�Qr4MN,�8&9�E2%,s �76"�9�n2!�A�]t[$9�;�Qs9�/VF�% ;(6"N,�IbFu%(�k�;�[� MNQ3"�]t;h�'� �8�9�%QsI�,�%vAf,�'%�.�/

prípadne dvoma kodónmi (metionín, tryptofán, fenylalanín, tyrozín, histidín).w 9�Igx� �!y/V E�%� �"�? z�{V|N}V~�z�{��2�m���b}������j������z��$z��������~�}��������b�����������j�L�N���V��2}j�2�q�$�����~�zU��}���}����$�K����}�|����2zJ�K�����g��~�z�2���z������}�|B�����j��������z� N�v�����K��¡��s�

niektorých špecializovanýchz �¢�����zJ��£�}�{����� ���z&�2��z��j���&�2}¤�>�&z� ��m��~�zJ�J���$�-���2¥�¦i�@�W���

§�¨ �z���¥o�J����2��b��{t�Vz����z3~ N�G~ N�����G�X��|��©~�z�{��2�m����� �������ª}�«�~ N}@�N�G����}�£z¬�&}����$z N���j�2��z� W­{��Vz��®@{i|f}¯}�«�~ N}@�N�G{°����z�z������ ¨ £z±¢ ¨ �@{³²´�f� |`�H�>��z� Wµ¶{°~ ��>�N�G{·¡N� ¨ £�z±~ �z@�$}¸�u�2{�¹U� £�z������º�$}�»�����}�|µ&�����$}� N��������}�|¼µ�{�����}��@½� ��g�N�G{�¡N��­V�J�KzJ�j�Vz�2�zj~�z@��z�3��¢ ¨ �z���}�|�����u�2��b���·���|`���ª~�z�Vz���z�{¾~ $z@�����b�����&�

k tom{�$z¿~ $z@�$}����@{������K}iµ&zÀ��2{��@�º�����°�g{�����¦���­���£����b���W���z6�W���l~ �z@�$}����z����l����z�  ¨ ��������J�b�V}�«~ N}@�N�Kz�{

£�»`���J����­&��£Á¢ ¨ ��z��&�Â����~ `���N�K}��z��&����g� }�����­��Vz��}�|Ã�¸�����K���m���������}S|f}��}`�$}������b���Vz����H~�zJ�Vz���z�{¡$~�}����g���������£#�}��$}���¦���­&��£s~��J�6��ļ����­���$zt��~��6��z�µ�z� µ&zJ���ª¥Å�$~�}@¡N�}¿��£�»`����������� ¨ ����z&���&�j����z  ¨

niesli rekombinantnú DNA s génmi pre amylázu, celulázu, proteázu, nukleázu, agarázu

a�V�z£ ¨ ��� ¨ ����}��$}��������j|f}j|f}���z��@{���£�Ã���$}������+��}�Æv|f}������@�$}������2z�������õ��b}�����z��������D~ NzJ�@{���z����¸��

z bunky von, vz&~��i¦��zJ�Z~ N�G~����}D�ª{·�N�g�a}����$}����¿µ¶{6���}¸�¿���|N~ ��¿ Nz�� W{·¡$�G�2�+����~ N�G�J�b�����

parách

chloroformu alebo indukciou teplotne temperovaných fágov.

Page 52: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

13

Obr. 8.2. Southern blotting a hybridizácia. Fragmentovaná DNA (rekombinantná

plazmidová DNA pri analýze rekombinantov, alebo napr. genómová DNA pri analýzeÇÈNÉmÊ�ËÌVÍË6ÎWÊ$ÏpÐ�È�Ñ�ϺÊ$Ò�Ó<ÎNÒ¸Ô&Õ&Ò�Í�Ö�ÏgÒ3Õ genóme) sa po denaturácii v géli, prenesie naÌaÒ�Ì�×�È�Ø�Í2ÐZÙUÍ�Ø�ÎNÚgÒiÛ&Í�ÒÜÎNÙeÝ�Þ¶×ÈNÏbÛ&Ï�ß�ÐiÓfÒàÎNËáß�ÍÙ�ÑiÒ�Í�Ë�ÐâÛÒ�Í�Ù�Ê>Ð�ÈNË�Õ�Ù�Í�Ë�ÐãÎ�Ë&Í�ÛË�Ð�ä åæËÙ�ÐÊqË&ÈNØiÛ�Ï�Ë&çÈ�Ù�èWÏbÏUÎ�Ù¯Ð�ÈNÑ�ɬÕ&Ò�éCÔ�Ë6ÎWêãÙëÇ�Ë�Ñ�Ò�ÊìÔË̪ÇJÚbÒ�ÌaÒ�Í@Ê$Ø�È�Í�Þ&Ö�Ý è>È�Ù�çJÌaÒ�Í@Ê$Ë�Õ°í�îðïVäåñËJÛ¶Ë�×�Í�ò�ÌLÎ�Ç�ó6ÎNË�×�ËÌUÌ�Ë&ô2Í˾Ù�Í�Ù�ÚGÞ�ß2Ë�Õ�Ù`êVÙ�Óöõ�îjïo÷WÍ�Ù�ÇÈ`äJß2ÏgÎ�ê2Ë�Õ�Ù�ÍÏbÒ�ÇÈNÉmÊ$ËÌVÍË6ÎWÊ�Ï6Ð�ÈNÑ�ÏmÊ$Ò�ÓmRNA v Ð�ÈNÑ�ÏmÊ$Ë&Ì Ê�Ô�Ù�ÍÏGÕ�Ò�ø¿ÇÈNÏ�Ñ�ËJÌ ÇÈNÒ�ÍË6Î�õùîjï ß gélu na membránu sa nazýva

Northern blotting.

Page 53: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

14

ú+ûü`ýÃþ�ýºÿ6ý���������� �� ������������������������������ ���! �"�#����%$!&�����'"��)(+*������,"��-(.���� /������0���1�ûü����2$3������"

kolónii. Bakteriálne kolónie (klony) sa prenesú z agarovej platne na nitrocelulózovú, alebo

nylonovú membránu. Potom sa bunky lyzujú v �3� �����4��%����& #ü��657��ü����,8 9:#ü;=<��>& ��?�(����@�)(

k���%���A�7 �ü-���% �BDC�EVý�FG�H\ü��%"���ü)$!Gû�4� ���>&I���%"���%$J����8�BDC�EK�'�L&M�3&ªû�ü���� N5-�O#ü� ���P$����!<������Q5��������R�

dochádza k hybridizácii v tých klonoch9���S�&ü��T��û�5��%�! �(�UV�����W�>���UXBDCYEK5-�%��"����'�3Z �ý

[�\�]Q^W_;`�a�b4c6dWegfP^Weghji�ejkjc6l4^Wm'n�oMpqb=n3i�l�m�r�b�s�t>ujkja%b v)b7c�m�r�b4sXsLn!m�c6l�s�hgejmXr�wjs�a�s>c>`-^a�b2n3m�r�b4s

xDyz�{�|)}Z~������+y%�'�����!��~>��y!�%�����S�����6�7�!�����!������z���y%�,�����X���X~,{���|���|)���� ������'�W¡�¢)£-�¥¤) �yW¦3}�§�}�¦�~��

sekvencie dvojvláknovej DNA a štiepia DNA v oboch vláknach, za vzniku definovaných§7|�¢�¨>�My��{��,¡j�xDyz�{�|)}Z~������Ry����������~���y��%���M~�¢A{�¢��=�'�%�W£-�©¤�{�} y% �y���}�yOªD«�¬­¡�®��¤�} ���,�:¯�y%�Q ���°!} ¢���¢%¡�}�y%~:��¢y%�'y%|)¨�}Z�±�G²³�X����´,��¦�´µ|-yz�{�|�}Z~,{��%�X£¶yN ����=��´'¢·¤�{)}=y% >�'y�´��¸�M}4y!z�{�¢N �|�yz���y¹��y�§�} ����¡�¢3�'�º¡��!´�»�¢����>�¼��¢½�¾�¿�À'¾�¿�Á'ÂAÃ�Ä�Á!ŸƶÇ�È�Ã�Ç3Á'É�Ê=˱̱Á�Ä!É�Í�Â�Î,¿!ĺÆ-Ä�¿�Ã�Ï�Ð�Ä)Ñ�Á�ÇÒÃ�Á!Å�Ó�½)ÊqÄ�Ô�ÇWÕ�¾ÖÁ�Ê�Ç%È�¾�×ØÈ�¾NÁË�È�Ô Ç�¾,Ó�Ê Î�¾'ÃÖ¾>ÎNÁ�Ç)Ñ�Ì�Ãostatných nastáva hydrolýza väzby v nedefinovanej vzdialenosti od rozpoznávanej sekvencie.Ù ÇÆ�Ó�½)ÊZÈ�Ð3Á'Ú�Ç%Á�Î�¾�ÁË�È�Ô�Ç!Â%¿�ϼ¾,Õ�Ï�Ð!Ä)Ñ�Á�ÇÛÃ�Ï�ÜJÄ�ÎËWÑ-Å¼Ý·Þ 2+ ióny, prípadne podobné dvojmocnéÈ�ÄAÓ�Ê=ß�Á,Ï�à�á�Ê�Ç%È,Ó�¾�½-ÚY¿V½�ÇÆ7Ó�½)ÊâÈ�Ð3Á,ã�É�͹Ç�Á,¿�ã�äX¾�ÃNÃ�Ï'ÜJÄ�ÎË�Ñ)Å�å�À�½)æZÀ�Ä�Î�Á�ǺÆ�Å�Æ�Ó�Ê2äQË�Ô ¾�Ã�Ä3Á'ÚèçRéëêìÄ3Ô=ÇWÕ�¾+í�îadenozylmetionínom. Štiepenie prebieha na 5´ strane väzby fosfát-deoxyribóza za vzniku

fragmentov s 5´ fosforylovými a 3´ hydroxylovými koncami. V prírode sa tieto enzýmyÃ�Ï�Æ)È�ÏÓ7ËWÑ)Å Æ)À�½�Ç%Ã�Â�Î,¿JÄ3Á'ÚïäX¾>Î�Ê ð)Ê È�Ä�Ð�Á,ã�ä�ÊñäMÇAÓ�Ï�ÔòÓ�½�Ä�Á�Æ�ð)Ç%½-Â%¿!Ä�ä�Ê�Æ rovnakou špecificitou aÃ�Ï!Ó�Ã�Â%½�Ä)Ñ)Å Ó�Ä%È ½�Ç!ÆSÓ�½�ÊZÈ�Ð�Á�¾�î�äX¾�Î�Ê ð)Ê È�Ä�Ð�Á,ã Æ)Ï�Æ�Ó�Ú�äVàóéôÊ Ç�Ó�¾ Æ)Ï>Æ�Ó�Ú�äHÏ Æ-Ä Á'Ä'õ�Ô Ê�à äXÁ�¾�Í,ã�É�ÍÀ�½�¾�È�Ä�½�Ï'¾'Ó�Ê É�È�ã�É3Í ä�Ê È�½�¾�¾,½)Þ�Ä%Á�Êâ¿äH¾>É�Í Ä À�½�Ç�Î,À�¾�È�Ô�Ä�Î� Æ�Ä Ü!Ç Æ�Å Í�Ô�Ä%Ã�Á,ã�ä ¾,Õ�½�Ä%Á�Á,ã�ä

Page 54: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

15

öM÷�ø�ù�ú�û�ü ý!öXþ>ö ÿ�ú�����÷���ü���� û�ø�ù�ÿ���û�ü�÷�� ��þ���ü�������þ�����ö ü2û���÷���ø�ü���ö�����������÷ �!�#"%$�ü&�6ö �-÷�'����)ü(�)��û�þ)*öXþ)$�ü+��ü+��ú,��û���ø�ù�'-.'!�0/�öXþ��©úXþ'ÿ21-ú3���-÷4'!����ü(�)��û���ø�ù:÷�û�$�þ�û4�)�)��÷��%ý���öXþ5!û�ü6�gý,7#'���ú���ú�û�ü�÷8$�÷9��ü û�þ��ú�û���ø�ù�#��ú2�>öM÷�û4��þ���:<;>= úPü4ø�ùYû���'��4÷3$�û,"Vú�û�ú9�(�'ý9�Òú@?�þ�� þ�5ü�����ú��Xý,�2��� ú3$�8?��-÷@�)/%û�þ��)/PöMú3û�ü�?��%�6��ø�ü4÷A�

B ÷4'����)ü(�%�3û�/P÷%û�$�þ�û4�)�)��÷,�%ý��'!"Òû�úC10?�þ��)5,7(��ú�û�÷-1D��74ö�ü ÷3ûJý���öMúöMü�� molekulárno biologických��ú%ÿ�þ���ú��FE��)ü6��ø�ù.�G:Hþ�$��D��úºü ø�ùH��÷,IJ�)/ºöXû'þ5�'��#��þK�0?�÷�ø�ü ú��4ü ý!þ���ú�û���ø�ùL��ü(��ü4÷�öNM ú��O�-ú��L��ý!ù�I�ú�$�þ>ö û'úºü ø�ùvlastnosti, predstavujú zaujímavý model pre izoláciu a charakterizáciu enzýmov.

B ÷4'����)ü(�%��û�/ñ÷%û�$�þ�û4�)�)��÷,�%ý�P'!"Q���)�R�%��û�÷ñø�,��þ?�� ú�ýöMú���ü ø���S� þ���ú��4ü ý!þ���ú�û�/3MT��ú�� 5!÷ ?�������ökrokom pri ich izolácii je rozbitie bakteriálnych buniek. Toto sa realizuje pomocou�%�&����ú%ý2���)��þ�����ø�ù�ML?��-7U?6ú�$�û�÷ ü û���ø3ùV$�÷%ý!ü û4��÷����C����þ��þ��O�HWRý�ù�I�ú�$�þ�ö û�ú¥ø�ü&�-� ü(��þO'!XY��÷4'����)ü(���0�%ýZ��þ���üzvýšenej teplote sa bunky dezintegrujú pri teplote 0[ C. Zvyšky bunkových stien sa potomþ)$�'#�����%û�ü ú øW÷3û,����ü+���)�)�!ø�ü þ��\?��)ü]��%'�þ����ø�ù þ4�0������ú�ø%ù%�L;Mú4'���÷�$4�31!"jø�ü ö ���-þ��þ�ö 1�÷¼þ)$�'!�^���%û�÷�û�ü�÷û,�)����÷�þ�����ø�ù��%'�÷���7 û)M_����þ���/Lÿ�`?���÷��)��5!ú���üa?���üqø�ù�ú��-ú�����÷��)ü ý,��ø�ü�üq÷3û�ý��'öXþ��÷-1Rú�����üR��üb�!%�);�ú>��÷%û,��þc"%��÷��dCegf)h�i)j�k(l)e�f�m�k�n�e�lhoqp�r�s�r�n�r6t�u�vwo�x�h�m�ygz3m�{�j,e-|!}~s,i)o�u6t�h�l)yco��.dCt�u�r�s���F�O�����~f�h�uR��t�x���u6y�s�r��Nk�s�v�e�u�t��hstreptomycín sulfát). Hrubý bunkový extrakt získaný po odstránení nukleových kyselín máp�e,d!x0h�o�m�{Jx�n�h.d#x0e�xFh�p2s�t�l��%d�h�o�}Ye�o�x�r(l)r&x#i%v>x0e�o�j9tT|�t��8h�j�s)y�n�t�x0t���h�l)eD��f�m�k&x0h��8s�h.d!��m�t4d!x�m0r(o)p�s��)���endonukleáz priamo v � h����a�<t4d!x�m�r(o)p�s�yLt�s�n�h�s4i)o)u6t�{�z��KlO�Ce�oKx#lhm rReqlh�l)�3p4��r�s)tLf�m�kUf)e�n�h�l�u6t�s�Nr+s�hm�r&x�s,}qp�e�d!� �A�.�A�) �¡�¢£�¤H¥�¦� �§0¨�©��� �¡�ª-«8¨���¨-¬­�)¨2®K¯D°H±³²���´�¨­¬�¨c«µ ®,��¶�·�¨�§0¨�¸) �¡)²D¹H´�£�¤�²���§�´(¡)´&§#�priamo v bunkových extraktoch. Ak je hladina aktivít v hrubom bunkovom extrakte nízka,§0¨��,§� »º�²S«8¼�®,¨S½,²��) ���£�¨��,§�¦� �¡²�¹P¥) �«8 )£� ��\¥�¦0©�·�²�¡����\¾G¿ÁÀ�Â�Ã�Ã�Ã�Ä]�4§F �¦!¢Å½3¦�Æ�®,²Ç�)´6¨�È��) �¡)´���É.ÊË ÉA½�¦CÆ�®A²��)¶q�)´6¨�È��) �¡)´���É̺�²Í¥) �§F «\¦� �½�¥��Oº#§�´�²�¡ malom objeme vhodného tlmivého roztoku aº�§0²��� �¡��3¬Î¨]º�²Ï²2��§�´R¡)´b§0²�§0²���§� �½9²�¤4�Oº�§0¨���¶�¤� Ð¥�¦�¨�¥)²2¦�Æ�§#��Ê<ÑÒ´�¨D§0 �¥�¦�¨�¥)²�¦�ÆJ§#É�Ó�²�º!§F ��¦�ÆJ§�¥� .º#§0²�Ó��2¬!ÔÕ��²·�¼��)²�½�¥�¦-©b§� �«>�� Öº�§�´O¦�¨4º!§�¦�´(�)Ó���¨C¬<¨���·� ��4�)�)È�¨3Æ�½�É�´×��²Ø¬Î¨!¬Ù¥�¦�¨�·��)¨�®,�,ÔÚ£�¤�²2¦�²���§0¨�¦�´(½,Æ3£9´(��Ê Ë ½�¤)ÛD²3·� �«Ü��²§F �Ä>®,¨H¬�¨�·��� �§�È�´(¡%¶]¦�¨4º�§�¦-´(�)Ó���¶�¨���·� ��4�)�)È�¨3Æ�½�ÉZºÎ²�È�©#Ý�´6²]¡ ¥) ®,´�²3·�²3¡��)Æ,£9¤Ì��²Þ½,È� ®9¨9��´6¨Þ¦�¨�²��)Ó���¶�¤� §�È�«ß´(¡%¶�¤� Ï¦0 ½D§� �����ª!¥�à8Ä��� ���£�¨��,§�¦�Æ�£�´6²L²Í·�¦��)¤Ï�)²�§�´�á��� �¡�±�Ä׬ΨL¥) 4§�¦�¨�����¶T§0¨4º�§� �¡)²�¹�²���§�´(¡)´&§#�Þ§#¢�£�¤,§0 ¥�¦�¨2¥)²�¦�Æ�§F �¡~¡Ï¦0¼�½���É)£�¤~¦�¨�²��)Ó���¢£�¤�§0È�«ß´(¡�¢£�¤K¦� �½D§� ��� )£�¤Ïª#¡Þ£�¡)´6Ó�¨���©â¥) ��)®,´ ¬Î¨�«N¨Kº�²�·4��¦�¨3²��)Ó���¢)£�¤tlmivých roztokov L, M a H firmy Boehringer Mannheim, SRN). V prípade potreby sa potom¦�¨,º!§�¦-´(�)Ó���¶ ¨���·� ��4�)�)È6¨�Æ�½�É ã�²�È6¨C¬ ¥��)¦�´�ä-´����3¬-Ô ¥) �«8 �£3 �� �� �È�á�� �¡¨-¬ £�¤�¦C �«8²�§0 �¸�¦�²�ä�´�¨ ª!¥�¦�¨¥) )·�¦- ����� Öº�§�´�¥) ½3¦-´���²�¥�¦DÊAÑå�)¦0æ çâç@è�é�ê#ëbì×í2î�î�ï,ðJë

Zák ê6ç�ñ�ò�ó)ôQç�õ�ç�ö!÷0é�è�ø�ùJ÷�ú�û�ñ�ü�òó)ôýè�ø�é�è)é�ôÿþ�ø�ü����)ç�ø�ç�è�÷0û2ø�ü��,ù��9ü�ü�øCû4ö!÷�ø�ü(è)õ�ò�ó�����û�ò�ñ�é�ò)è)ê6û�ù��úÎû�)ø�õ3û9ò�ü6ûÿøCé���þ�é��3ò�ù� %ç�ò�û-úQö�û�è� )û�ò���ü6û�ë��aù�÷Fé öCç�)ø�õ�2ú�ûPò�ç��,ù�è)ê6ç�ñ�û� û��Jè)éÖö�÷�ü��#ø�ç���ôNû�ò4÷0é� ��4ò�ü�è)ç-ú�����ü����! !÷0ü�û�þ%û9ò�"�ô�#%$'&Sö(�).ö�÷�ø�ù�÷�é� ÏöCé*�3ò�ù�ô8é�~ò)è)ê�û�é�÷�ü�ñ�é� é�ÞöCû�è� )û�ò���ü�é��ë+$Nç-ú�õ�ç�ö!÷0û!ú, �ü6ûþ)é��-�". )ç�ò�/0#1$2&Zö(�)Oö!÷�ø�ùJ÷43�ö(��úÎû�ñ�ò�ç2è5��ù��)é� �/6#%$'&27 8 9�#%$6&;:-é< )û��Jè)é.ö!÷�ü>=@?�ïBA�C<)�þ�ðCìD�FE�GH#%$6&(39936 bp), Adenovirus2-DNA (35937 bp), SV40 (5243 bp), I X174 (5386 bp), M13MP18-

Page 55: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

16

RF (replicative form, 7249 bp), ako aj plazmidové DNA: pBR322 (4361 bp), pBR328 (4907J�K�LNMOK�PRQ0S�T�U(V�WXTBWYJ�K�LNMZK�[\Q^]_QRS�T�`aU(`�V�`�`bJ�K�L,ced�f�g�h�i�j�kmlNngpopl�q.h�r�j�kmK�lNs�t(qvuxwygNimK�s�lzs�{�j�|�{�i�}(~s �������p�����'�\���Y���������������N��(�p�z�.�������������������������X�v�������%�e���(�p�����N���\�N�* ��¡,�'�_���N�¢�z���£N�������¤���N��N���lokalizácia niektorých, minimálne dvoch miest, na plazmidových substrátoch. Rozpoznávaná

������ ��������v�¥�N�Z�����p�������N��¦�� porovnania sekvencií v okolí lokalizovaných miest.§ ����¡,�X� �� ��v�������v�¨�N�©�����X���� ���ª«�¬���v��p�z�X�����©�������N�����z���N�.���� ���ª¬�N��p�p�N�.������­®��������������v�������z ������¯���  Selenomonas ruminantium °�±�² ��³�´²µ�Z¶>����·� �¸���2�¹���º�»�z��� ���X���������������.�¼�2���z½X�������H���z�� '¾¿�� ������z���2�1À_�������FÁ�°�Â�Â�³ÃNÄ���H���N�e���R����¯�·�¸�O�p�������.�<�.���X�������Å�Æ����(�p���������������Ç��������������v���������z malých objemov bakteriálnych kultúr.

ÈNÉ�Ê�ËxÌ�Í�Î�Ï�Ð,Ñ�Ò�ÓÅÐ,Î�Ô�Õ�Ö�Ñ.×_Ñ�Ö�Ø�Ê�Ö�Ù�Ô�Ë�Ñ�Ì�É4Ú2É Û�Ü_Ý Þ ßXàZá�â·ã�â�ä�ß�å_ß�ä�æ�ç^è,é�å_êxä�æ�ä�ë�ê�é�å2ìí bakteriálne bunky S. ruminantium îÇï�ðòñ�ó>ô�õ�ö�ô�÷�øZù�ú�óüû4ý�þ�ÿ�����÷�ôûpþ ��� ú���ú·ø�÷�ñ2÷���ð ñ � ôý�û�

6 000g, 4 � C) a premyjeme ich v ���������������������! #"%$� �'&��� )(*��+,"-���/.10�2�34 457698;:=<�>-?A@B$�CED�3mM F GIHAJ,KIL�M�N/O�P!JQO�M,R�P�S'T=UWVAX*JYO%L/Z [ \�]_^*`badc�e�a,f*gihj`kaml*\nf*c/o�`�\ne�fp`/q�a�e�]�crq�ads t C v u v�w�x

y z/{�|/}�~��*���/��{�������|���{i�Q�����������A���*��|�������}��W��|����r���%�����k�����r�������=�%��}/{��������,z�� �������������sonifikáciou 6 krát 30 sekúnd s minútovými prestávkami na chladenie v �=�������A�i�/���jednotlivými cyklami

  zvyšky bakteriálnych stien odstránime centrifugáciou (10 minút, 12 000g, 0¡ C)  k supernatantu pridáme 1/10 objemu 20% streptomycín sulfátu v �*��|�������}��i�j|r�!�

tlmivom roztoku  po 30 minútovej inkubácii pri 0¡ C odstránime zrazeninu nukleových kyselín

centrifugáciou (10 minút, 12 000g, 0¡ C)  k supernatantu pridáme 40% PEG 6 000 v ¢*£�¤�¥�¦�¥�§�¨W©,¤r£�ª�«�¬�ªA¥k­�£!ª�®*£�¯�«%£�§/°²±³£´­�µ�¢*¬b¶i±�¤r¶�·

koncentrácie 10% a zmes inkubujeme 30 minút pri 0̧ C¹ º�»�¼i½*¾,¿WÀ�Á�ÂÄÃ�Å�Æ�Ç�È�É/º�Å�Á�»ÊÉ�Ë�Ë�ÆjÇ�Ì�ÍÆdÎiÆjÁWÏ%½*Å�ÐbÑ�Ò�¾�Î�Å�É/Ñ1Ó,Ô�Õ4Í´Å�Á/Ö�Ï�×ØÔ=ÙAÕ�Õ�Õ/Ò�×�Õ Ú C)Û získaný pelet raz krátko premyjeme fosfátovým tlmivým roztokom (20 mM NaPi, pH

7,2) a znova centrifugujeme (5 minút, 12 000g, 0Ú C)Û dôkladne odstránime zvyšky premývacieho pufru a pelet rozpustíme v 30 Ü l

fosfátového tlmivého roztoku. Takto pripraveným proteínovým extraktom potom

štiepime DNA substráty pBR322 a Ý -DNAÞ získané fragmenty rozdelíme elektroforézou v ß,à�ß,á�â/ã�ä/årä�æçà�è�é�ê�ëìã�ê_í%îIï�æ�ð4ê�ñ�òó�ä�ô�ðYîõß÷ö�ß

ãWø�ù!é�ßiú!ðdê�ñ�ò4ó�ä�ò/û/ü�é�ê'å�äýí�î�ê/å�û�ó�ä�ô�ïþî�ß�æAðÿå�ð��Qù�äìí ����������� ����������������� �!���"�#$�% &"')(+* ���,-�.�/(0���+�1* 2��$,-3���0�4 �5�3 �+���$6��7�8( 3��9���� 4�7� &"�6���5 �������/(0���#��*:2��������;�����/< * 4�/6=&>

Page 56: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

17

?"@A�BDCFE9G"HJI�HLK-M�NDOQPSR=H:TUST�V�W9X�K-Y8ZD[

Princíp PCR:

PCR (polymerase chain reaction\^] _�`�a b!c�d�e=f"_$g�e d�c h i�j"k�l m n�opi�q r�sLi=tvu:w�k x y z�{�|}.~��4~�������� � ~7�"�����"~���4~��+�����9�4�J�+�J� �/����� �-� �.�����#������S}.~��������¡ £¢���¤�¥���9�¦�F~ §©¨ ª¬«�­¯®�°�±9²4³L´+³J¨ ª�µ ®�¶·�¸$ª¹Sº.»�¼�½¿¾DÀ�ÁÃÂ�ÄÆÅ�Ç�ÈÉLÊ˽�Ì+¹ÎÍ/Ï Ç7ÐÅ�ÉJÑ!Ò�Å+ÓÕÔ

primers). Táto technika je alternatívou ku klonovaniu,Ö×�ØJÙ�Ú ÛQÜ�Ý¡×+Þ ß�àá4Ý+ÜËâ�ØLã�ãDÜ�Ý�äåÚ ä/æFß�à:â�Ø4ã�ç è7ãDÜ�Ý+ÜDéê�æ ë"Ø�ì#ØLÝDÜ�Ý�ã�áLÝ7Ö Ú/ì�×.Ýîíå$ïðÛ!ãîñ!æ ×�Ù�Ø�ì#ïðØJåò�Ú×�Û�ó�ß�Ø4Ý�Úô.õ�ö�÷�õ�øù�úLúüûý�ø þ�ÿ����Sô�õ�ö��������� ������ ù����� �����������ø������ ô�� ��!��$÷�þ�ÿ�����ø�����ô"�)÷ ý#�$�%&��')ô+ö ý)(*"+",�-�.�/�0�132547698�:�0�,�+".�/ ; g DNA (po 20-40 cykloch, za 2-6 hodín).

PCR prebieha v troch krokoch:<�=?>�@BA�CEDGFIH9JLK5MNC�OQPIRIS�CUTWV�D R�H9@�XZY�RIK5[�J�Y�\]C_^�P�H`MaDb@BPdcNR�Db@eR�V�R�cNR fdg h

C) k oddeleniuikj�l�m�n�o"pNqsrItIu�vwrIpyx5z{j�mw|$}�~�obj����Ip�x)oG�{�d�Bn��I��n���m��Iv����I�9qyl�qN��xLu�q������`qN�3�5�9n�r��

2. Annealing (hybridizácia, naviazanie, „nasadnutie“) primérov ku komplementárnej

sekvencii denaturovaného templátu DNA. Prebieha pri teplote 40-72hC, v

��xErIqG�9pNn���obq�ndl�l �������

a sekvencie primérov.�������� b¡5¢]£U¤y¥¦`¡�§N¨�¢�©IªL«�¤y¥5¬®­�¯I¨I°�¥U±³²� "¨�´9¡�µ·¶$¸%¹º¯I¨�§�»I¼3¡5´9ªB£�¥½¯�´9¤�²I§y¥�¾�ª²¿��À�Á$ÂòI¨�¢�«EÄů�´`¤N¼3Æ5´9¥

¢�ÄI²d§y¡�¨� "¤N¾�»Ç¯I¨I¾�È ÉËÊIÌ�Í�ÎIÏyÐ�Í3Ð�ÑUÒbÓBÔ`Ñ�Ð`Õ�Ö®Ð5Ê�×IÐ�ÑIØ�Ù�Ð�ÒbÐ5ÍÚÎdÏyÓEÒGÛÝÜ�Î�Ô9ÐEÞIÙsÐ�ß�É�Î�ÔàÙ�ÒbÐ5ÎIÏNÌ�Òbкá�â ã äæå¿çBÌ�ÕkÐ

optimum pre Taq DNA polymerázu).

Denaturácia, annealing a extenzia tvoria jeden cyklus PCR. Jeden primér nasadá na

jedno vlákno denaturovaného DNA templátu, druhý primér nasadá na druhéÜ�ÊIÌ�Í�ÎIÏyÐ�Í3Ð�ÑUÒbÓBÔ`Ñ�Ð5è7×IÏ�ÓBÊdÑ�Ì�ÒbÐ5Í�ÎIÏ�Ó)ÒGÛ{åéÎ�ÔbÙNç�ÌdÍaê�Ö®Ð5Ê%ë$ì%íÃÌ�ß]Ô9É5Ñ�Ùyç�Ð�Ñ�î¿Ò"î�Í�ÙïÒbÌñðU×�ÌdÍ�Ù�Î�Ô9ÙyÍ%òBÔàÍ�Ù7Ö9É

amplifikuje opakovaním cyklov PCR - vznikne PCR produkt (Obr.10.1.).ó�Ô`ÌIðUÛIÊUÒ Ì�Íeó³ä�ôõÔ9Ð�ÉBÊIØ�ÙyÐö×�÷®É5ÊÃÑ�Ù�кÖ�ê�ÏNÐ�ÑaÍ�ÌIÏ�ÐBÊ�Û�ÏNø?ë$ì%í_Ì�ß�Ô®É�Ñ�Ùyç�Ð�Ñ�òùÑ�ɺÌ�ÞIÙNð�×IÌIØ5ß

ÊIÌ�Ñ�Ø�ÌIØ5ß¿Ö9ÐBÊ�×{Ð�Ñ�Ø�ÙNÌ�ÛÅÎ�Ô9ÙúÍ3ò5Ô®Ì�×�å�ç�Ì�×�ø]ÎIÏúî]×{Éüû ý�þ9ÿ����������Åþ�������ÿ��� �����þ����������������� "!#$�ÿ%'&(���) +*�,-�/.0&(1cyklus“) je v

þ����/��ÿNÿæý�þ�20&�3546,578�Iþ9$�ÿ:&�7;46,<3>=�?(&�@�3A@�.%35=#��,��CB�D��FEG@5!H3�þC�5I/�KJL3M���535,5$��,52 ý�þ+@�7�<3cyklu PCR bude v reakcii prítomný

&(!�@��½ý�þ`ÿ%4 N5þ�,�IOJQPSR ý�þ�3UT-���#&(V��#&(3�þ+1W@<!-,�ÿ%��NA&����V�=#�X,5templáte denaturovanej DNA vzorky sa od primérov dosyntetizuje komplementárne vlákno.Y[Z-\(Z^]<Z>_a`�b�c_Fcd#\�e�fCd5chg�bie�]Ud<ZFd5c_ ej`5f�c#kCd�c"l�f�mc�d#npo5qsr]�l8tvu�cw5ZxkCy<d-\�z�{Ht|k9t�l�]�Z5d5m}~k�]�Z>d<mcd5}i_mt#k+l�c���\�c�d�{-��cpt�{#t�mH��t'\(]�Z5_ o5c�d<t'\�l�f�e��%cpd5t-k�b�c#o-l�u+n���c�w5Z���y�]�bsl��su�c�\�co5t�b�cHd�u�co5d5Z�k+\(f�t�d5d5c�5�������5�i���H�<�������>�/��5��%�����5���%�F���������F ��C�%� ¡�����¢ �5����£-����¤¥¤���£5��¤��>�>�C¦�§��£5�5�8��¨�¡����5��©��<ª<�>�U£��<�C§S«�¬F­�<©#�>���>¢;�j§9�£>�<�®�<�<�>�¯�C¢<�-¤��'¤(�s©H�<�>�H�<�G��¨i¡��U�<�U°±�5�h§��£5�5�C§6�+¤(�����<�²�>�������5���#��5�³�����5����5��%���M�5���%� ������� Q����-�[£5���<�'¤�����¡���%���´£��(���5�5� ��¢<�U¨��µ�5©#�5�%���-¶ © ����·H£5�9§¸£-�>��§C��¨i¡��U�<�<�>�9§¸�6�U¨������/¨¹¢º�5�»�%� ¡����5��<�

Page 57: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

18

¼"½5¾�¿�À�Á�¿�À#¿6Â-Ã�¾+Ä/Å�Æ5Ç�È�ÉÊ<ËHÌ ÍµÎQÏvÐÑ¿

A

5´ 3́

3´ 5́

B

5´ 3´

3́ 5́

5́ 3́ 3́ 5´

C

5́ 3́

3´ 5´

A Ò-ÓÕÔ#Ö�×CØ�ÙµÚ�Û�ÜÝÙOÞ�×Cß%à á�×Câaã�ä%Ö5å�æHç<áhè5Öa×�æÙ�Ø�éß%æB: Syntéza komplementárneho DNA vlákna smerom od primérov hybridizovaných k denaturovanému templátu (vzorke DNA)

C Òaêëß%æ#ì�Ö<ã5íÑÞ5×�Ö�è-î�Ø�ï�ðQêòñ

Sekvencia DNA identická so sekvenciou primérov

Sekvencia DNA komplementárna k sekvencii primérov

ÓaÖ�ìóç5á"Þ5×�ß%à á�×Câ Priméry hybridizované ktemplátu

Smer syntézykomplementárneho DNAvlákna od primérov

Page 58: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

19

ô"õ5ö�÷�ø�ù�÷�ú�÷�ûLöCü%ý�õ�ýþaÿ5ö������þ��(ö���þ�� ��������aû����Ñ÷��[ý��aÿ��������! #"%$~ÿ���&��('ü�)�ö*),+�&-�-���/.�-&0��ý��(ü213�-��)3&��! #"%$~ÿ5ö�ý�ö�4�5*���) &-�('ü6)�ö*)�+�û7$~ÿ�öCü��8��ö*&��6ÿ5ö*�904�0�:+<;�$�.�ý=��4&�9���ö&��Ñÿ5ö*�904���>+��<.?�:)@�>&-A�.���aõ�����B.�Crovnaké ako na Obr. 10.1.

0. cyklus 5́ 3́

3´ 5́

1. cyklus

5´ 3´ P 3́ 5́

5́ 3́ 3´ 5́ P

2. cyklus

5´ 3́ P

3́ 5́

5́ 3́ 3́ 5́ S

5́ 3́ S 3́ 5́

5́ 3́3´ 5́ P

Page 59: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

20

3. cyklus

5´ 3́ P

3́ 5́

5́ 3́

3́ 5́ S

5́ 3́ DFE6G H I0J�KML�N I�O�PRQ�S 3́ 5́

5́ 3́ S 3́ 5́

5́ 3́ S 3́ 5́

5́ 3́ 3́ 5́ T�U�V�WXI0J�KMLYN=I�O�P�Q�S

5́ 3́ S 3́ 5́

5́ 3́3´ 5́ P

Z�[*\]0^_0`?^a]0b�ced*f,]�g-\-bh�i _g�\�bjk`:f lmZh�i�`>n<oqprcsd*f�]�g�\�l `:f�lmZ�h�i�`:f,tr_0`>\�[>u `?b\�[v#w!prxybhz\�{Xf�g-f|db-}X\�[:_�n-t�~|c Z-\���cX~%f���`:f g�}X�6f�]�\/~n-g0`:f�`>��} ^�d�f�_\�lmZh6f�l8f�g0`:i [:g�f�bh�i _g�\t�� v�l }Xg�\�b�^�b}Xg���_g�fZ�[*��l8i [g�naZ�[*\�]0^_X`�o�p8c�]�[�^�-\�l `:f lmZh�i�`:f�tr_0`�\�[>u�`?b�\�[vrbh�i _g�\�g�c�d*f�]�gfd�~�`>[*c g-f�\���[*c�g�����f�g�j~|f _�b�f�g�����\�^ Z�[*��l8j [|c ~*c `>��f�{ ]�\<~n�g0`:f�`>�2} ^,d�f _\�lmZh�f3l8f�g0`:i=[g�f bh�i _�g-\Yo�w��2{�_�^ `>\��0`�\

Page 60: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

21

�-�-���/��-�0�:���>�2 3�-�¢¡���£�¤-�¥�¦�§ ¨�¡#©ª«¡�¦��­¬�©¢®0¯°��¤�±*¡ ����²����¡�³s��� ¨�������´����µ��¬��®���´3¤s¶�±*��·8£ ±*���¸�¶�±�z²���·sekvencia na jednom konci vlákna bude identická s jedným primérom a sekvencia na druhom

konci bude komplementárna k druhému priméru. Tým vznikne sekundárny produkt, ktorý má¹ ��®����µ�¦�§ ¨���º��¬� ¹ ���>±|¡ �����8��¤�±*¡����6²,�3�-£­�|� ¨������´3�z�-©s¶�±*��·8£ ±*���s¡ ¹ ��®����º�¦�§ ¨���»��¤�±*¡ ����²X����£B¦����s��¡¹ ��®���� ¹ �>�>±*¡ ����¼�½��²�¡0�¾®�� ��¡��?©±|§�´ ���µ¶�±*��·8§ ±*����¤��°¡e�|� ¨�©��®�§ ±*�-�3¤-��¶�±:�®0©¨0�?©��s�>±*��³,��·¿½�À�Á´ �-¨�¦���- 0����¨�0¯°�>±�q®�±�©¤�� ¹ �,®��-�-�¦�§ ¨������ô�¤ÅÄ!ÆrÇÈ�:�=·m¶�¦�§��:���RÉʶ�±���Ã-· ¹ �e�¦�§ ¨���k�¦���ªX����� ¹ �� X��±¨��-¸��¡¨�����±:��·��|¡B®��/�>���X�:���>��  © ¹ �r¶�±*��·8§ ±���s¶�±*�®0©¨0�:¸�®�±>©¤0Ã�· ¹ � ¹ ��®����<���>±*¡=�������«��¤�±*¡ ����²����£r�¦�§ ¨��-��¸Ë��¡ktorom sa dosyntetizuje sekundárny produkt a tretím druhom templátu je obojstranneÌ�Í�Î*Ï=Ð�Ñ6Ò,Ó3Ð-ÔÖÕ×�Ø ÙÐ�ÌÚ�Ð�ÏÛÙ0Ü>Ì�Î:Ì�Ý Þ*Ïàß�Ì<Þá�ÐXÜ:Ó�Ü>Ñ2â ã,ä�ÓàÌ�åæ�çèÌ-é�Ì�ä�Þ�Ü>Î*Ï Ð�Ð-ÓàÌ�Í�Î*Ï=Ð�Ñ6Ò,Ó3ÐÔ�Õ×�Ø Ù�Ð-ÌYêë áXÜ?Õ�Ì�Î*Ó=Ð�ì6Ý ß-Õ�Ì äÕ×�Ø Ù�Ð-Ì-Õ�Ô�Í�ÌÈí!î#ï å�Î*Ìß0ãÙ0Ü?ãðÞñå�Î*Ó0Þ:Ð�ÓòÌ�Í�Î|Ï Ð�Ñ�Ò0Ó�Ð-Ì-ãðß�ó�ô�ÙÌ-ãöõ�Ìß�ä*Ó�ß�Ð�Ô�Í-Ìpriméra po druhý) vznikol v Ü>Î*Ó�ç3Ì�Ýø÷ á�Ù×6Órå�ÎÕ�ùúÙ�Î*Ø�Ü!÷ Ñ�Ó�û�Ì�Õ�ùµü�ýÊþ�å�Î*Ìß0ãÙ0Ü*êRÿËÓ�ß�ÏMÕ�ù¢Þ*×�Ó�ß�ÙÌ�Ýü�ý�þ�Î|Ó�Ï Ù÷�Ñ�Ó�Þ���Ü>ÎÑ�Ü>á�å�áFí!îrï�Ý�Ì×6Ó=Ù��<×��0å�Î*Ñ�Ý8Ø ÎÐ�áÚ<Þ*Ó=Ù�ã<Ð-ß�Ø Î*Ð�á�Ï(÷�Ñ�Ó�û�Ì�Õ�ù�å�Î*Ìß0ãÙ�Ü*ê

V ÙÏ=ôXß�Ì�ÝaÐ�Ï0Þ*×�ÓXß0ã�ä���÷�ÌÝ ÷ á�Ù�×�ÓFß�Ø ÕÏ�ä�Ó�ß�Ð�Ï�ݾÌ�×�Ó Ù�ã¢×�Ï�å�ÎÑ�ÝrØ=Î Ð-Ó�Í�Ìrå�Î:Ì�ß0ãÙXÜ?ãmÜ:Ó Ýmå×�Ø�ÜËå�Î*Óvznik jednej molekuly primárneho produktu a jednej molekuly sekundárneho produktu.

Jedna molekula sekundárneho produktu dáva templát pre vznik jednej molekulyÞ|Ó Ù�ã<Ð-ß�Ø ÎÐÓ�Í�Ìñå�ÎÌß0ãÙ0Ü?ã Ïrä*Ó�ß�Ð�ÓäµÝ¾Ì�×�Ó Ù�ã<×�á%÷�Ñ�Ó�û ����� ��� ����������������� �!��"�#%$&��'(�����)'*#,+.-*�!/ ����!���� �0�����������1� 23�4#5���6$7��'*23��� �0�7� 8!" -(�9���4��+��:$&��'*�6��;'<+!-*��/ ���4.���:� �=�����������>�)?A@B0'C�D�����4$E���4���GF0�!H<I��$&" � I B����4�1� ��-J$K26��" �!� �:� �������������&F0�5�L�0�!#���+.-*-MB���2!'(�N�0��� "�#6�!HO$&"��4I�B������PB0�6����"�� 26�0" �!� �9� �=�����������rastie s ��#!I���@ $ +6Q ��'(��$R'C-("���26�=" �,#%$&" � I�B������S+!-(�!/ ����!� �T� �������������U�0#�B���-(�VB ��#6I���@ $ +6Q ��'(��$exponenciálne (Tab. 10.1.).

W #3X���Y�Z)��Y��6[]\����4"��6" +!-*2!'("�#^#.$&��'C-(_=-(��2�+!-C#^+!-(��/ ����!� �`���������������badc]ef�gfh�i4j�k!l6j�mKn6o�h�prq�s

V P S C

0. 1 0 0 01. 0 2 0 02. 0 2 2 03. 0 2 4 24. 0 2 6 85. 0 2 8 2230. 0 2 58 ~1,1x109

tul!i�v0lxw�y*n6h4m{z�i�k!l w`|�}�i ~=}�p*�6h�j�i�} m4n!�{���N� �&i�p(l6h��p�z v=yC�K�6v0j�l.��i��������Ts0l6h�q�j�| �6v=j�l.��i����4���n!y(l�� i�}��!� i��=�M�]z v�i�|�q�h�w�qN�d�]�����6h�|�iNv0lD�6h�n6y(lG��i�p(�A}�p*i4�.l.j���~0lD|4j��&|�}�i�~�}�p*�6h�j i�}��&�&i�p*l6h�qp*�f���N�vzorky (V).

Page 61: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

22

���!�r����� %¡&¢ � £�¤�¥��4��¦<�]§©¨ ª���«�¬���¥�¬U¡&� £!¢ ��� ­�¨���®!¯°¥�±3²,¨�� ¡&��³!��¬���´6² µ.¶�·T¸�¹�¸o.2

n, kde „x“ jeº&» ¼ ½ ¾�¿�À4¼bÁ^Â&ÃTÄ Å�¼�Æ�Ç�È�¿�Ç�É!ÊC¾�È�Ë.»�ÌÍÄ�¼ÏÎ�» Ð7Ñ6Ò�È�Ó(¼�Ñ!Ô Õ×Ö

o Ø0Ù ºb»�¼4½Ú¾�¿�À�¼NÁ�ÂbÃSÀ�Ó(¼ ½ Ù » Ì7Æ ¼ÛÅ Ù Ë6È�Ñ�Ü Ù ËÝ!Þ ßuà�áAâ�ã�ä!á3åOæ3çÚè�éêã4ë�ì�í�î�ï0é(ãÛðNë ç�à�ñ!ò�ó�ôDà�áAå�á6ã ó0áxå�õ(æ6è öKâ ó0á!ò�â�ã è�é(ñDò ÷>ø.áAë èñ!ø�ò ã ùEæ6ç è�éCá&ï0ñ7ù&Þ ã ø�ï�å�ë4ãú�ûbü ý ò�ë�ã6à0Þ þ�ï�ã�ÿ�î(÷På�ì à ì ø.á � ä!õJÞ Þ�ã>ï�� �������� �����������������������! !" ��#$�&%�('$�*),+-���/.102��3�3546'�7amplifikácie pohybuje v #�498�'��;:=<?>@��A�B����DCFEG����H��I<�)��J���3�KL)8;72�2:M��#$�I)�K��40��NEO�P3�4�H�'QER)9�ISUTWVproduktu má potom tvar x=xo.(1+E)nCX�J��ZY[�$�Z.10���3�3�4,'�7M�������� ����,�\�2���^]���C�>@A���C�B=_& `a�N)������Cb�4<#$0��cEG4��d�4e0fEG�g�&h���49)i]j) 8��;)�R'$�4F'�E��,4JI�P3�4�H�'�ER)�k)�4�H@��3�l�:�4IEG�;�m�e��NER<M�k.10��n3�3546'�E��6�2�m�e��� �����������;_��#$��'QEG�N)9�I���NEG�c7Z�\%5�4935��3������2�3�P8��;)�j'-�4,'Q7Z�o�\J�8=�X�P3�4�H�'QER)94e�iSUTbVd��#$4J=<�=ER<p�I�54e0fE�4��q�;h���49)p��4r��#$�Ns9�2:�3�<�E�tF)9u�0�+$����:54v��40wER<p�Nh@��49)pJ�4e�;:5��J�8��a�;Ho� úplnému zastaveniu ampli fikácie �� xzy${|P}�~����Q�R�9~����b�����G~�=��=������v}5�;�;���1�Q�\�f�\�b}�=�Q�G�&������;�6���e���&�G�,�U�m���~��~�|�� plató“ efektu nebýva���9���;�����}� ��*}� ��;���G~��$�Q�d� �����;���}�¡¢�£�����~9�� ��;��¤�����¥�G�;�¦*}5��£��$~�|P������}� ��§�U�¨� ���$~�=��=�R�9�©�2�z termodynamického dôvodu dochádza k prednostnej reasociácii PCR produktov pred väzbou���$ �|a¦;�$~��P}��ª���$~�=��=�R�5��}��;���$ ��;����~�|g�1�����ª���$ �|o¦����«|o���;�P¬���­m�Q�G�����®� nadbytku.

RT-PCR:

RT-PCR (PCR spojená s �$�;�������}�~��I�����;}e�G���¯ °�¢2 ±~5�²��|P~���³=�\�-�g��|P�e�� �´� ��~5�9�\­µ�·¶P¸¹�e����~��$���~����~���\��� �W¶I¸¹����~§�|P~���}�º»}5�;���$º��e�����¼�Q�G�;}5~5� ½­¾�����;}e�G���¯ °�,��}=¿À�;���� ½� c�R�ÂÁ¦�}=�Ã� �1�$�� c��¡¢�£tkanivách. Najprv sa z daného tkaniva izoluje celková RNA alebo len mRNA. V Ä ���j��~e|���$~����^�$�µ��~�|P~¢�~5�i�;}���¡|��r�$�&��;����}5���X���$�;}e�G���$ ½���G�;�;�ZÅ���}���¡|¥���5}=�G�N�G ½�;�\�-�·�·¶o¸z�$�&­��;�2��¢�}��k�W¶o¸templáte) a reverzného priméra (pozri „Priméry“), alebo oligonukleotidu dT (ktorý nasadá na

polyadenylový koniec mRNA) nasyntetizuje vlákno DNA, komplementárne k

príslušnej mRNA (tzv. cDNA). V nasledujúcom kroku sa do reakcie pridá Taq DNA

polymeráza spolu s forward primérom (pozri „Priméry“) a na templáte cDNA sa potom�Æ�G������~�;}�ºÇ�Q�G��}���;�$��}��µ���b�m�e¸µ�L���g�~r���$�N¬9��£�}=����ºe�U�b�È�=ºR�G�,�����$º��$�½�Æ�$}�¡^���$~�=��=�¨Å��;|���� �´� ��~����}�¡¿Æ���;�z¢N�·¶o¸É��~e���5~5�9��������¿1¢2 ¹���$ºR�$�±�Æ�$}���L|��W¶o¸µ²^��}��;|a��}�[�G~������!� danom tkanive dochádza

k expresii (transkripcii) sledovaného génu. V ����º½������\�b���r����ºR�$�½�Æ�$}�¡L�X�b������~e�=����µ}��;�5�=}� ��}����sledovaný gén nie je v ����}�~e|Ê����;}� ½�1�Ë�NÌ����$ �|P~9���}�¡9�o�����;¬~¾�$������;}�¦Ë�~e��|P ���}@�9�z�·ÍXÎj�U�W�neboli dobre optimalizované.

ÏOÐ;Ñ�Ò�Ó;ÔÕ×Ö�Ø�Ù�ÚNÒGÛÝÜOÞÇϹßàaá©âÆã�ä�â�åjæeç�è�é;è�ê�é©ëUìîí¼ï$éËðæ5åòñ$éNó5èô(õPá ö ÷5ø�ù�ú�û�ü¾ý·þIÿ ���������9ùWþPÿ ��ú ������������� �

��� � �"!#�%$�&('�)#�%�+*-,.'�/102� 3547698�:�;<�2*�3=$2�")#� >#?#@A&CBD'.$7� �E4F@2GH3I)J*7'.� K7$L/NM2OP*HK747Q9�R)J/#GAS�47QT'%3 ���=M2Q9� *�?#'.*�GVUReakcia prebieha v W�X#Y Z\[H]#^P_H`Ia#Y b c�_7W.[�YDdfe�g1hAX#eJi2XJjlkJmnXpoDW.Y b X�q�g�r�bIXsW�X#i�`�tPWvu jednotlivých cykloch.

Page 62: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

23

Vzorka:wyx2zN{P|Fz�}%x2~�� ~��+���F�\�2zP�2����� �P�#���l�V�2�#�P�H�\�7�2�+���������2� �F�2� �P���J�2��� buniek, alebo prípadne len

hrubý bunkový extrakt. V prípade RT-PCR sa ako v�F���%�2���P�P 2¡�� ¢n�¤£E�"�¥� �F��� �7�A�J�����  2�R¦#��§�¨#©P�

tkaniva.

Priméry:

Sú to dva oligonukleotidy 14-40 báz dlhé, ktorých sekvencia zodpovedá sekvencii naª�«�¬ ­D® ª2¯#°"±D«2ª�²�¯Jª2¯#°´³¶µv·R¸#«7¹�º�»�¼¾½2«7¿.ª�¬DÀÁ· ­¾Â\Ãp­JÂ\Ä2Å5ÆIÇ%Æ «2ªPÈ�­#É�Ê7¼y«Ë· ­¤­J¤Ä2ÅÌÆIÇ%Æ «7¹J®n¸pÍ2ÎJ²P½Ï­JÅ ¸#Ð�ªÑ® ¸J°PªÒ ­F·DÉ Ó%ÔÖÕ�×lØÚÙÜÛVØ�ÝVØßÞ�à+á�â#ã"ä7×%å æ"ç#× à2ã7á.è�×Dé\ê�â7ëRâJì�ípê�â¤î-ï�ã2è�ê�å ðFñÑò2ç#êFóËÓDã2ô2ìõóÜöD÷-ñJå7ø¤ù

2 koniec proteínu)úÁû üJý�þÿü�����ü�����Ìú�2þ � � ú����Üû ü����"ü�� þ����������2þ � ��� �"!#�$�&%'��( û�(*) smere transkripcie) sa nazýva:

5´primér, upstream p., forward p., sense p. Tento primér nasadá na antikodónové (-) vlákno

(jeho sekvencia je teda komplementárna k sekvencii antikodónového a identická so

sekvenciou kodónového vlákna DNA). Primér, ktorý nasadá na 3´ koniec génu (kódujúci+-,.,�/10"2 3 465�798 :�2$;<5�=63$>"?A@-B�5�C 2D5�E�;<5#3�F4G@H8"2 0 :�@�I�>JB�5LK�MN5�:O2�MP0�QSRT0"2U3V7�>DW"X�3$>ZY[;�\ B�\]8 :�2$;^4_K�M`5�:a>

transkripcie) sa nazýva: 3´ primér, downstream p., reverse p. antisense p. Tento primér nasadá

na kodónové (+) vlákno (jeho sekvencia je teda komplementárna k sekvencii kodónového a

identická so sekvenciou antikodónového vlákna).

5́ koniec génu kódujúci -NH2 koniec 3́ koniec génu kódujuci -COOH koniec

(+)

5´ CTAGGCAATAC ATGATCTAAG 3́

3́ b�cPdfe b]gih.e FP 5´ 3́

3´ GATCCGTTATG TACTAGATT C 5́

(-)

Obr. 10.3. Umiestnenie primérov pri ampli fikácii génu (FP- forward primer, RP-reverse

primer).

TACTAGATTC

CTAGGCAATAC

Page 63: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

24

DNA polymeráza:j�kml]jonqpsr�t9u"v�w"xy{zUtm|O}�~<��km�`v]ra~<t��"l6�6�"�����N��u"v ���"���#k�������u"v��#� ��� �tm|m}S���H�

rôznych termofilných�Ut���~<��k�l6y6�L��~<v�kO��r^}���w"���S��� ��tm|�u"v�z �Sra~<t�zU��� y�z �Sr�v �U V� ~<��u �6v�~<��� ¡au"v��Jt$r¢� ��� t�~[w"kO����l6�&�����v jednotlivýc

�����V���6v"����£�¤ ��ta|¥��tra~<�m|�¦�l��1r�t�u"v�w"xy{zUtTaq DNA polymeráza z termofilnej

baktérie Thermus aquaticus¤_§q��~^v�u v ���"�N��k�����t��`�L~[}¨�V��z   �Vv��$wS�*x�©�V����� ª¬«���­UvU�w"���G�����v�z�}

t���~^l�z"l®~[wS�_��~^v�k���w"�`v x��$wJ|¥�©v u k�t�z�w¯� ��r<u k���z"�"�°�t�k�t�� �#�"���Vv��$w"�"�6��v�~^l6�$w�¤f§¬  �±z �� l6�"tm|m}¢���������Zu k�lamplifikácii v rozsahu asi jeden nesprávny nukleotid na 5000 správne zaradených²³"´�µG¶�·�¸^¹6º ·�»T¼�½o·V³"¾�¹¿¸^¹�¶±¹6²�À"Á�Âø<¶�ÄmÅ`·�Æ^¹�µ6² À"Á�ÂÈÇ"· µ�É"ÅN¶�Ä�Ê�ËÌÎÍÐϬÑ�¶�ÒU·U²³"´�µG¶�Ê�Ë·�»"·�³ Ó^Ô�· Ç Ä�Õ�»V² ·�³"Ö„proofreading Ö�×ØÕ�´�¸^¹�»"¹®¸<·�³SÌ�Å`Ù ¾¶P» À�Ä¥Õ�˲V¶Ú˲ Û6¾¹{Ü�Ç"·"Ý�¶�¸�Á#Â�É�Þ"²"¶ßËÕ#Ä�Õ�º ¶�²�À"Á�ÂȲ³"´�µG¶�·�¸^¹6º ·�»v amplifikovanom produkte.

à9á"â�ã{ä�åVæ^ç{èVéNêìëOä�ê�â"í�î�ï9æ<ã6ð`ç{ñ"ï`ë�å ò�æ'åUâôóõöå�ë�ä�ê�â"÷�ç6ä*ø�ä.ù"åVæúë�ä�û"î ü.ù ëýç{è ê�þ ÿ���������� ���������������������������������������� ����!"���$#%��&('*),+��'-'*).+��/0',)1+1��23'*)4v 57698�:<;>=@?<ACB�D�=@;E;>D�=�F�G�HI895�J-K B�5 LC6�MCD�=@;NH�?�;O:�8�=@;PB�=�QRH�=�6�SUTV5WDXS�H�D�AWY�B�Z[H�=9;>D�=\G�] ^`_ 2+ iónov,a�bdc9e�fhg�i�j�k�l�m nporqtsvuxw�c@y�i�z{oCe�|C}~k��

���C���X�C�����"���C�h�$�����3���������v�.�C���R�����3�h�R�I�����X���*���

���������7 �¡£¢,¤¦¥E§�¨�©C �� ��©«ª¬©®­ª� �­�¯�°@± ²�³�´�µ·¶ objeme 50-100 ¸ l a obsahuje nasledujúce

koncentrácie látok:

1-5 U Taq polymerázy

štyri druhy dNTPs - 200 ̧ ¹Pº�»9¼�½ ¾C¼�¿�À¬Á ½ Â�ÃÅÄ�À�¾Åº�ÃCÆXÇ�È{¼�É�º�Ê<¾ »�¿�ÂËÇprimér 1 v koncentrácii 0,1-1 ̧ M

primér 2 v koncentrácii 0,1-1 ̧ M

vzorka DNA 0,01ng-500 ng (plazmid - komplexný genómový templát)

Mg 2+ v pufri - 1,5 mM koncentrácia v reakcii (1 - 5 mM)

Ì�Í Ä�Â�½7º9ÈU¿�¾CÄ�Ê�»�¿�¼�ÈÎÃÐÏ Ã�Ѭ»�Ò�ÈÓÄ�À�»@Ô�Â�Ê*Õ,Öh×xØ�¾Ð¼�Ã�Ñ�Ê<¾ Ç�»�Ò�¼�È1ÙÚÄ�»ÛÄ�»�ÏCÂ�Ã"¿�»�ÏC¼�¾%Ø(Ç�¾ ¼�ÃR¿IÉ�À�Á ½ Â�Â-Ä�À�Â95Ü ÝßÞ�à@á�â�ãÐä>å>æ�çéè*ç�â�ã�ê<ë ì�í�îpëðï ñ�ò%ó�ôöõC÷�ø�ê�à9ùúã týmito parametrami (segmentami): denaturácia

pri 95û üþý�ÿ������������� ������������������������� �!���" ý#��%$&��(')$ * ü +�ý�ÿ), -/.10�2�35462�7�8�9!2;:<�9�=>2?<�@A4ABC:�@�D�.�0FEmin. a extenzia pri 72 G H I�J�K�L�M�N�OPM�Q�R�SUTWVYX�Z�[�S%\]I�J)^_/L`^ acb�degf h�i�jlk�m(k�d�n5o�f�p�q�rnYs�t�u?d5v�w/xzy{ni|�u/}�u�rp�v~���vo6u���u p5�6��r����&�(�����e&d)j�n6o�h�nb�pn���f�|�f��6k���u��]~�u�u�j�n6p&������kcv�pAu��nzt(eAp�~�u�~]k���nAo6f�p5����r|�u/� ��� ���A� �W¡>¢¤£¥(¦�§5¨ © ª«£��)¬���­P§¯®;¦�°²±

Page 64: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

25

Optimalizácia PCR:

³U´�µ·¶�¸�¹ ºA»½¼(¾�¼]¿�À�Á ¸�Á¯Â)Ã!ÄlÅ(Ä�¶�Æ5Ç�¸�ÈÉ«ÊWË>̤Í`´(Ä�Á>À?´Î¾gÏе·Â�ÆA¿Ñ´�µ�Ò�ÈAÀÓǾAÔ�Õ�¸�º¸�Ö×ÆÂ5¿]ÄØÁFÉ�Ã�È6¾¿�µ�ÂÃ�ÆA¿]È5»Ù¸WÚ�¸�¼ÎÆAÇ» Â´�Æ)Å]Ä�Ã6³ÜÛÞÝ߸?¶�Æ>¸(ÏàÆz¼á¿�¸�¿]ÈAÀCÂÆ�º5Á�Älµ�È&¶6¾�´Îµ�¸�¶�â�Ä!µ5ã

³U´(Ä;Ç»&Ò²µ�´�µ�ºµ�ȸ�¿áä�´�¸�Ú�ȵ(ÏÞ¿�µ�Â�Ã�Æ5¿á¾F¸�Ú�¸�¼åä�ÏεæÂ�Æ5¿á´�µ/ÒÈ�ÀCÒ´�¸�Ö ºÆ;çÇ6¸�Ô5¾�è�¹�µæ¶´ÎÉ�¿]¶�µæÅá´Î¸�é)ÁÙµ È�¿å¾ÊêË;Ì뺵�ȸ/¿áä�´åä�Ï]çìÕ/¸�Ô�í�Älµî¸�¶�Æìº5Ã�ÔÀ�è�´�Ä�Ú�Æ)Á¤Â´�ïØÃ!ÄáíðǾ�¼ÎÆ6¶�Éñ¿�µ�ÂÃ�Æ5¿�¸«¸îÚ�¸�¼òºµ�ȸ/¿áä�´�É�â�Ä�µñÇ�µ�ºÄ!µó¶Â�Æ�í(¶AÆ)ºµ�ÈÄcä1ÊêË;Ìô¿�µ�Á¯Â�Ã!É�¿áä²èYõ ¸ö¿]Ä!¸�Õ�Ú�Æ�Â5´(ï�Ã!Ä÷í�Èï�õ�¶�¸�¿�µ�Â�Ã�ÆA¿�¸ ¸Ù¶&´�É�¿]¶5¾�Ú�¸�¼�ºµ�ȸ�¿áä�´ÎÉ�â�Ä�µ¯Èµ�ä²Á�ƹ�Èïväzbu primérov.

Výber teploty naviazania primérov, t.j. teploty pri ktorej primér hybridizuje

s templátom, patrí k najkritickejším momentom optimalizácie PCR. Ak je teplota naviazania

príliš vysoká, primér nenasadá na templát a neprebieha tvorba produktu. Ak je teplota

naviazania príliš nízka, primér nasadá na nešpecifické sekvencie templátu a vznikajú

nešpecifické produkty. Optimálna teplota naviazania primérov je blízka tzv. teplote topenia

Tm (melting temperature), ktorá je definovaná ako teplota pri ktorej duplex primér/templátºÄl¼�Æ�â�Ä�ä�ÏøµÓùÎú/¿�ÆÂï>¼�¸�û?ü�è¯Â´(Ä�Ú�Æ)ÁýÏе·Â�Æ�¿]´�µ/ÒÈÀ�è;¸/Ò¾½Æ5Ò�Älº�Dz¸îÂ�ÆAä�¹�Ä�¿�À·Â´�ÄØÁFÀ�´(¾þÁ>¸�Ã!įÂ�Æ)ºÆ5ÒÈ�ç ÿm.ÿàµ�Â�Ã�Æ�¿�¸;¿]ÆÂ�µ�ÈÄ�¸1õ�É�Ç�Äá¼�ï Æ)º õ�Ã�Æ6¹ µ�ÈÄ!¸�´�Ä�ÁFÀ�´�Æ5Ç«ù�Ú ï�Á Ç&¾�í/í�ï Â�ÆÁ>µ?´�é5䲸�Èï�ÈAÆ6Ç»�â�ÔP¸ðâ�¾�¿�Æõ�ï�ÈÆ5Ç»�â�Ô

nukleotidov k adenínovýÁ ¸C¿å¾AÁ�ïØÈAÆ6Ç»�Á È�ä�¶�Ã!µ�ÆA¿]Ä�ºÆ6Á�è¿á»ÁßÏеêǾ²í/í�Äl¸?ü�è�º � ¹�¶¾�´�ÄlÁFÀ�´�Æ5Ç`ù(Ú�ï�Á�¼åç

priméry dlhšie, tým je Tm Ǿ�í/í�Ä!¸�ü�¸�Æ)º ���������� ���������������������� ���!�#"$�%'&)(�����+*$,��-�.�/*$�$0/�1��2#3!4$56387

*�9�:<;!=��?>�@$�!%A>�>�B��"!2���%'�6%C����DFEHGJI���KL�B>M�N"!��D!��% OP@+"$� ��%A�Q�$�9R���!2L"$�P%'&)(��P0$;$��%'2R���F&.S$��D+ �0T*$�%�U�%':<���!�WVk ná

/�1U�X�,!&Y>2��$�!2�X!��%�9Z&[��2�&#"!��9R�\D]�#"/�^���$&_�!:<X$% �-9#&.X$�$��>��\�!�BX/2^�P"!2`�Z%��6%����$,!�� FEHGQIa"$��!U^D!�^�������bLcedfhg/f�i$jk c1l�f<mni!o�p!q�r sutvi$jr'w)x�jym�l'z�{[|~}����<����f�c �\jt�c��!t�g!��r�f�|~}!���<o��${!��zedt�c$�-t�g$��r'k����Fbtemplátu, ktoré sa náhodne zhodujú so sekvenciou priméra bude 48 ����o���g/fZw�tZg!�`��q<t�c!f�qZm/{/��z65 536 (48� }!���<o/�${���z#i!��jo��+df��$�-dPc$�<�Pg/t�g$f���t�w#i1l��R��t#dt�c��!t�g$��r�f��1c�p�c���o�jt6s�duf�w.�$q<tLi$jPr'w)x�j�m$l'z�{|�}!���hz��T}!j�r�m$r'�<o/��f��$��bLcedf�f�c!o���t�w#i1l��R��i$o�p!q�r suth��p-m1dc!�� !t�g$¡$w.o/�-�¢����b£�N��f�c¤i$jPrL�!t<�¥c!o8d6��r��p-m1d�c!xZz/o� !t�g/¡�w£p+f�dr!¦�§©¨�ª 9 «!¬�­M®/¯#°-¬�±�²�®�«T­³�´1µ�²�¶R¯�·�¸u³L¶^µ¹!º!»F¼$¼$¼#¯!½�±�°!®�¯$¾!¿�À)Á�¹�³�µ6²�Â-Ã�®F±�Ä/¶�Á.³�Ä$¬¯/±^Ä$¹'Å.¯!³�Æ¥Å!Ç�À$®FÁ.Ä/®�È�µ�²\¯!¶�Ä/³^ÉP«-³�¿�¹'ÊP¹�¿�Å�¾�¿�À�ËHÌÎÍÏ«$­®1´^·!Å<²�®�¯�Ð<ÑLÅ+µ¶L¶�Ò�³L«!®/·!È�¹ ¸PÓ+«$­¹'Á)Ç�­PÔ)´$ÒÕÀ!Ç£Ä$¶�«$­WÐÖ ¼�°�¬�±<Â×°T·-´$³�Ê\­³�Å�¯�³ZÄ/¿�¹�¶.Ä$¬�À$®!´�Ä$Ç�À/®?¯$¾8µ�Å�Ô<²\·�²�¶�Å!³P¸6²�®ØµM³�Å�¯!³�Ä/¿Z¹�³.Ä$¶�ÙLÚ)ÑÛ²�³�Á�«1Ò�¬R²�³.Ò'³�Ä+Å!¶�È<´�¾!¿�Àasi 1x1012 (420) °�¬�±<®�¯$¾!¿�À�«!¬�­®�¯!Â.Ã�®v¸³Ï¶^µ¹.Ü1ÝT¼ÞÄ$¬^µM®/°�®�Ť¯�³�Æ¥Å!®×µ�²P¹�Æ�·-´1µPÅ!Ç�À$®Þß!³�Ä$à!Á�·�Уᩮ±�Ä/¶�ÁF³�Ä!¬�Â�È<³e«$­P¹�«!®�·!È^¹â²�ã Ö ¼ä°-¬�±å´$Ò'À�¾!¿�Àæ«$­¹'Á)Ç�­®�¯YÄ$¶^µ�²�¶�Ä$³ À�ÔT°!­¹'´�¹'±T¬�¿�¹�¹çÒ�³ZÄYÄ$¶è·!­Ã�¹C²�®$Ášpecifickom mieste genómovej DNA a teda k vytvoreniu len jedného (špecifického) PCR«$­®!´^·!Å^²\·×Ð�Ú)¶#´�­6·!À/³M¸Lµ�²�­¶�Ä$³`Âé«$­P¹'Á)Ç�­PÔ�Ä/³^µÁ#Ó]°$Ô�ê�¶�Ä$¹©«$­�ã'Ò'¹\ÉL´$Ò'À!ÇFë6«$­¹'Á)Ç�­PÔy´�Ò'À8Éu¹�³F¶�Å!®]Ü$¼F°!¬�±�µ¶«!®�·!È�ã ¯!¶P¸PÓ+Ò�³�Ä#±�­¹'³�´�Å!¶�ìÂ1¶W°$ÔFÄ/³�´$®8ÉÒ'®�Å «�­Pã'Ò�¹\ÉÄ!Ç�Á�·)«$­³�´$í'È<³�Ä$¹ ·�Ã�¶^µ�·+«!®�²\­³W°$Ä!Ç�À$®FÅ hybridizácii na

templát.

Page 65: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

26

î�ïPð8ñ$ò$ó!ô!õRö�÷£øm

ó$ï÷#ù$ïú¥öûPðü÷�ó$ïð'ý)þ�ïPÿ����$ô������!ù��'÷`ô/ö�ð �$ô�ñ�� ý.ô����$ôBó!ô����ð���ñ����<ú����8øm = 2x����� �"!��$#�%&��'(�*)�!,+"-�.�/0�1+2�3+")546'87�9;:<4�.�=�>?:�@BA�C�D�/;E(>�7�/�.�/GF�H�I�JKF>�-�LM/�C�EON .�C�7&7

priméri. Pre.�L J�P,NM/QC�LRN S�C�FT>�-�LM/�CUEONV.U9W�GX;#�Y�Z�[0F>�-�LM/�C�EON .�C�7�!(\]C�^�FUC_�m7�9�A�C�D�`�Ea4cbed�fgXG+ih�jXGk�+ k6��L C�S

10 konc J+) +

0,41 (%G+C)-(600/L) - 0,63 (% FA), kde J+ je koncentrácia jednomocných katiónov, L je.�l m�n�o_p�q r s�p�tTu�n�qiv?pTwOr xTuyo0z*{}|<v�~]t�p�m��Ow���p&�Op��,~]o�~6rMxTu�� �<v�oGn���rMr(���Op���~Wo�~0rMx��,o�~]��mv_���,r x�o���x�p�,v?o�n���r vQt�o1v�q ri~6r t����r�u��<vGn�u�tUx�����t���������wO��u�nw����*���]{1��nTw�pe����~]��m�uW���,��t�r��1���,����w�u���u�����r ~W���,p��_n

ich

väzobným miestam; formamid|,v�x�v�t�ocw�u��,o? �t��� �r t�rMx�q p��¡wav�x�o£¢?t�rRmGu�|<v8¤

m¥;¦ �Wo§��¨©��p� �vcwª¤m~]p�mt�p$��p�u�m�r��&o�|«��p� ���wao? �pU�e������p�s��,o�~¡�U�¬o�qMvª�e­� ��,rRtUpUuª|,v�o�|¡wao�n®��pTw���vc��t���wav���q p�w�u®t�o���rMo�¢o�t�rMo

���,r ~W���,p��¯v�~¡��r��,ri�Gne�°pU�ev��,rV���±���,����o�x�t�v²pTwOr ~Wo�qir ¢p���o�� ¦®³ n��,v�~ wav���q p�w��´|,vµx���q vGmTr¶w�¨·o�|5 �o��naviazania primérov. Ak je v

��v�o�n���rirg�,v�qMocwa�V��t���x�p��OwaocwOp�n���r v¸;p���v�|Q��v�n���v�t���rMv��¹��p���wao? cuG|,v¡º�»�¼(½�»sek. V komplexných templáto

���U��n�x�v¾|�vQ��rMv�¸;p���v�|��<v�ne�ev�t���rMv¡��w ¦ | ¦ wav�|���n�w�pe���0�,oQ~¿�¡o�~¡��qMri��r n�p���oc� ¥v pomere k

p��OwaoÀwOtUv�|¿�Á�6{Â��v¸;~0r�~W��q p±�Ot�o���� ¦ u��, �r�w�¨�s��Gt$���?v�qÃn�pU�Äv�| genómovej DNA), je��pTwO�,v;��t��±t�v����Uoc��� ������¨����Å����n�q p����Åxeq ���,�_ ?oT�KtUo���rioG¢�oGt�rio}��t�o���� ¦ ºÆ~0r t ¥ oc���Ç~Wo�qir6���,r ~W�����

x�p���waoÀw�penW �oT�Ou]������¸;o�x�oc��x�o�tT���,v�n���v�tU��r�u ¦¤2v���qVpTw�u�o_ ?oT�1vcÈ©wav�t�¢rMv0u��, cu?|,v0wav���q p�wOt��_p��TwOr ~¡uÄ~É��p�u�mr�wav�|Q��p�q���~6vG�,��¢��&��pU�����Un�qMv�penUpeqVp72Ê Ë ¥ o$x�Ì�m?n�o±o�~0��qir ��r n�p���o�t�����pÍ����p�xTu�nTw�uÎ��p������Un�qMv£��o$��p�mT���eoÐÏ$~]r t ¦ t�oÐÏ�n�� ¥;¦ {�nÐ~¿o�|��priméry vysokú Tm

�e~]p�m�tUp0��p�u�m�r��1qMv�t]xT��oQ�<v�s�~Wv�tTw��¡� n�oGmx�p�~Å����n�qMv�Ñ�x�v�t�ocwurácia pri 92-96Ê C

a naviazanie/extenzia pri 68-72Ê Ë ¦�³ �©����n�qR¨W��p� �vcwÒ�c�©n�q pe�6Ó Ë3Ô |<vQº�Õ©¼aÖ�Õ©��tUo�|���rMo��Q�Ä�,o�n_½�» ¦ Ó ��r���Ä�;�,p�~Í��p� Àwav��;��n�q pe�WtUo��,oT�Owa��~]t�p�m��Ow���p¡����¢�t��e���×t�vT�,��v���rM��rM��ne¨e���¡���,p�xTu�nTwOp�� ¦³ n��,v�~Ðwav���q p�wOt����Up�o] �o�,p�������p����ap���r q�u�Ó Ë3Ô |<v¡��pTwO�,vc��tU�]pe�wOrR~Wo�qir ¢p��Äoc�Wo�|ÙØ(o�q��,rMv0¢q p�m�ne�

reakcie (koncentráciu polymerázy, Mg2+ ��tu�n�q v?pUwOr x�p�����n�petU��v�tTwO������r�u�o¡ �r���wapTwiu_�Á�]{8��¢p���n�� ¦ ¦ ¦Ú¥ ����,r  �p�~8��¨��,qMvx�pen_�,o¬~¿�emv�q ���,rV��o�|3� ¢����r��,q p¹�OwOr�p�x¡��p�u�m�r�wa���Up×w��©��u]wav���~¿p����©n�qM����o�oQ��n��Ä~6o���rMv�n ¦ �WoÓ Ë3Ô ��o6��pUu�m?�V�eo�|��Û����v��rM��q t�v6wav�t�n�p���wavGt�t�����n��Ä~Wo���n����2ne�e��q r3��¨�����qMv�~¡u®���,v�tUp��OuKwav���qMo ¦ Ô v?o�n� �t��zmes sa v skúmavke prekryje vrstvou minerálneho oleja, aby nedochádzalo k odparovaniu (u

termocyklérov s vyhrievaným krytom to nie je nutné).

Analýza PCR produktov:

ELFO analýza:�Wo�|, oT��wav�|Ü�,rMv$�<oK���,p�xTu�nTw¡Ó Ë3Ô o�t�o�q���¢�u?|Üv���p�~]p��?pUuÎv�q v�n�wO�,p��Op��,vÀwOrV��n�����pÍx�v�q v�t�rMoy� agarózovom

géli po ofarbení etídiumbromidom a vizualizácii v Ý]Þ ß�àeácâaã á�ä]Þ¡á�åÜæ�ç�ß�èÅé�ê�ë�ì�íWá�îTâ�ï5ðòñÒóproduktu sa porovnáva so štandardom, ktorý obsahuje é�ê<ë�ì�íWá�îTâOôÅçöõ�î�÷�í]á�ø�à�á�åÜæ�ç�ß�âaù�ä¡ú�æàeá�åÜæ�ç�ßOè�ð"ñ3ó·û�ê,ç�üTï�æTâ�ï5î�ë8ì�ý�ã ù_õç�ü�û�çUàeá�ü�÷£âaá�ç�ê,áÜâOù þ�æ�ôöà�ô�û�ç�ÿ���âaë�î�á�ø���û�ç�ÿ�ácâ��Uû5ç�ü$ø<á�ü�î�ý��Uç

Page 66: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

27

primera k ��� ������ ������������������� ���"! �$#&%('*)+� ,-/.102�3�/4�56�7� ��8&,����98&�:%;���<�=,��>4*! ��?�%A@B%�?6���C@D�E56FG�H��,>'*��'I�$���J���K� �MLN� �O��PQ�E5R�S�T,U,WV���� �,��X#&��� �>M���K� � ��LN� ���DPT�Y4B! ��?�%;@B%�?6� �����U@Z��56F �H�T,&'Z[.]\[���N'��^���_ `>a�b�ced�f�g�h�i�jZk�lAi�i�f�i�jnmWo&i�pqk�a�l�c6_ c�f�rAstb�c>uDa�b�l+v w�fm sHlxc�fo&m�sHi>s l�pxi�j�c6d `y_�`�s ` z�`{}|�`{a�~Wc6bBf�d jS`Waanalýzy.

����;�6� �����������>�����B�+� ���� �"�/������ �H���"�*�� �C� �$���W���"�����J�$�$�T� ���(�C�����R�����G�>� �&�Z�/�����$ &���H�¡���:¢W�G�£� �B¤e�D¥§¦��B�S�6�G�W�:�"���>���*�]���E�]���&�I���*�+� ����¨�6�©��� �qª¬«9����;�6� ����­A�U���E�G�>� ��Z�§�W�>�����£���$ &���H�"�&­Z�B� �®¥<¯Z�°�6± �H�T�&�Dª<� �����(�*�B¤²��³+ ���ª �9���q¤��¡����� �6�&����I�$´W���$ &���S���µ�]¦B� �M�T�;¯����6�$�������G�>� �&�°«

Southern blot hybridizácia:¶�·Z¸B¹ º�»¼y½�¾À¿ÂÁ�Ã�ÄGÅ>Æ ¹&Ç�È�Ä$É�»WÄXÁ�Ä ÅÃ*ÄWÊ Ë(ÌÎÍÏÊ Ã�Ë�Å$Ë;Ð&Ñ�Ò�Ë;Ë�¸�Ä Ð�» º�Ó�Ô�»WÄWÆÕ¸�Ä�»�Å�ÄÆ^Öµ× Ø²Ùq¹ÇIÄÃ�ÑÚÈ Ñsekvenciu zhodnú s

Ó�º>¸BÌTÄWÆÛ¸�Ô6¹Ü$Ô�»�Ò�Ë�ÔÝÄ Ó�º6¹ Ñ®Ü/º�»WÞTÍWÄ�½�¾�¿ßÁ�ÃBÄ Å>Æ ¹>ÇZÆáàBâ�Ê�Ãeã²ä�ãæå¬ãæÙ�¹ º6Á/ã+ä ã çeã�ص¹¸EÄ$»WÅ�º�Á Ä¡Å�Ô6»�º®ÇZÆ ÃEÑ�Ò6Ë;Ë�ÍÏÊ Ã�Ë�Å�ËnÐJÆ�è°Ôx¸éÅ�ÔJ» º®ÇZÆ ÃBÄÜ ºJ»¼ ÈX½�¾�¿ÎÁ�Ã�ÄGÅ>Æ ¹&Ç�Ä�È ÙGÐ�» º�ÈHÔ�»�Ñ�Ç�Ä Ù$ÉTÔ�¸EÔ6¹Ü Ô�»�Ò�Ë�ºsondy je komplementárna k

¸°Ô6¹�Ü Ô�»WÒTË�Ë�½ê¾é¿ Á�Ã�Ä Å>Æ ¹>ÇZÆëºìÈ Ä�É�»WÄ£¹�Ä�»Gí�Ç*º®Ç�ÄÜ º®ÌTÙîÉTÔ ÅÄ�íBïSÄkº6ÈxÁ ïAË;ðBË;¹�ÑMÒTË�Ë ÄGÓMº6¹ Ñ6Ü º�»�Þ�Í�ÄHñÀíBÁ Ô�ÒJËnð*ËAÒJ¹ ÞTÍWÄqÁ�Ã*ÄGÅ>Æ ¹&ÇZÆ[ã

Sekvenovanie PCR produktu:½�¾À¿òÁ�ÃEÄGÅ>Æ ¹&Ç§È Ä�É�»�Ä}Á�Ã�Ô�ÅQ¸�Ô6¹Ü$Ô�»�ÄÜ º�»�·AÈ »�º6¹ ï;ÄG»WÄWÜ$º6ÌóÅ�Äôí*Á Ô�Ò6Ë�Ñ�ï;» ÔTÍWÄKÁ�ï;ºJÐ>ÈHË�Å>ÆUº^Á Ä>Ç�Ä�ȸEÔ6¹$Ü$Ô�»�ÄÜ º®ÌCÜ Ã�Ñ�ÈHÒTËõ¹�ÃDÆ/Í�ÄÜ ÔBè:È�ÄGï�Ô6¹Æ�ï;ÏÚÖö×"Ø ã÷½�¾À¿ëÁ�Ã�ÄGÅ>Æ ¹&Ç È Ä�É�»�Ä^¸�Ô6¹Ü$Ô�»�ÄÜ/º®Ì�ºBè¡Á�Ã�Ë�ºTÈ�ÄàIÊ$Ô6Ðø»Wº6¹ ï;ÄG»�ÄÜ º�»�Ë�ºYÅ�ÄùÁ�ï;º6Ð&ÈHËAÅ>Æ çÕº6¹ ÄtïnË;» Ô�ÑJÃB»>Æ Å>Ü$Ä6èDÜ/ï�Ñ6¹G»WÄWÜ©ú È ÄGï�Ô6¹Æ/ï+Æ/Ù�Á�ÃBËSÓ�ÄGÈ ºJ¹ ĸEÔ6¹$Ü$Ô�»�º�Ó�»¼}Á�Ã�Ë;ÈHÞ6ÃÚ¸�º^È û�É&ÔyÁ ÄWÆ ÉMËSÌ�èEÔ�ÅGÔ�»ìÐ

primérov, ktorých extenziou PCR produkt

vznikol. Jednovláknový PCR produkt, ktorý je pre sekvenovanie lepší ako dvojvláknový,È Ä�É&»�Ä�Ð&·A¸B¹ º6ÌTÙêº6¹=¸EºqÁ�ÄÆ É&Ë èNÔxÜ reakcii rôzna koncentrácia primérov - tzv. asymetrická PCR.

Ak bude napr. jeden primér 100x koncentrovanejší ako druhý primér, dôjde k prednostnej

syntéze jednovláknovej DNA. Dvojvláknová DNA bude produkovaná len dovtedy, kým sa»WÔMÜ�Ï$Ó&Ô6ÃBÁ ÑîÁ�Ã*ËnÈHÞ6Ã¡Ü »�Ë;Éí�ÔBè<¹ Ä$»WÒ�Ô�»>Ç�Ã�Ñ�Ò�Ë;Ë; z druhého priméra sa potom syntetizuje len jedno

zÅ>Ü$ÄGÒ6ÍxÜ ï�Ñ6¹ Ô�»�Öö×"زÙ�Á�ÃBË�Ó�ÄGÈ�è�Ô�Í�ÄqÈ »WÄ$ɸ�ÇZÜ Ä Ã�º>¸DÇ�ËSÔ

s¹ º6É&ż�ÈÛÒ6Ï�¹ ï;ÄGÈóïAË;» Ô�Ñ6Ã�»�Ô©ã

Okrem uvedených metód analýzy PCR produktu sú vyvinuté aj dalšie, napr. na

princípe monoklonálnych protilátok.

Page 67: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

28

Problémy spojené s PCR (troubleshooting guide):

ü[ýBþ�ÿ����������� �����qü�������ý���������� �"!$#&%��!'�(�&þ )*�*þ,+�-.%��(���0/�����þ �����.%>þ1����2��ý3�4�������657�8�9�8:&�; �=<>�=�?�8�@!@A�9��-&%��B)3�C���AB)D�?�8��E/ þF+�<>� ; �G��ý7HI�?�&!@��J)*+0K�-��8�9�8:��L/����þ9�4�M�(!G��� ; �(��ý7���������N��/O5

bands),

alebo vznikla šmuha (smear).

P'�Q/����þ9���4�%&þ1����L��ý�����������5?�8�1�0:&�G�9��L/��0RQ!Hþ4!'A�9�KTSU V�WYX Z[VE\EZ0]^W_V`aWTbEc?d&e�f_gh9dib�jBe�WjTb�kY`MWlJj8bnme�d4o�Z�b�c�VWQp�g�V` b�d�hqjV`rme�`rm�d&g�`,c?sFp�VW7]Cb�dV�cDe?d&hMWtucDe�Wwv�j

]>WoVdEcDh9`Mp&d(d�c?W�xDcDdEp�jQy6pJz3WQcDb&{|g�h9dib&{|e�WjTbJk`1W}jCg�`ax*c?`Fy�tb�cNd&e�fq]3W}kY~E{�v�V�fU v&d4h9dGme?s h1` z��'fh9d'k0{�b�h9d&p�l�gp�Jz�`Fy}m�d��WQc�kQ{�b�h9d&p'd'�E���U c?W8mhMd�c?jCV�jQp�`1j8g�jV`1jCme�`9�'�8e�dEpLv&d4h1jCme�s9h9` z.p{Jx�db�fl�g�VsFi�`FyCc?WTm4h9dEc Z'dL���*� � CU V�W0p�~�d4oEV��Cme�` �'�8e7{�l�me�`Fme�j8p�`Fy_VdEp��Cme�`9�(�Te3{U �'fh9d$c?WT�Lm4h1fQc Z�l�g8p�Jz�`Fy}b�dVk�WV�cDe3fk8`,Z@���(�U V�W8b&p&jha`,c?VE��c?W8�|m4h1fQc�l�x7b�dV�cDe?d&h9dEp�jwy�c?W�Lm�h1fQc_Vj2jT\�j8e��gdEp�d��\��h9`Cj�j8b�cDe�WQv&j�mEZ�e7`9X7`9b�d�p&jQy"~�d

metódami, ktoré minimalizujú fragmentáciu a tvorbu zlomov (nicks)U oW8V�jQc Z�e�j�TVf=c?W8m�h9dEc?jq]�WCme�s h9` z�Vs9gbJj0t4jh9W8v�d@me7s9ha` z.p{Jx3d&b�flZ�me�jQp�`Fy}g��@WVdEZ�md�� � CU �j�x�oWVjQc Z�e�f0kY`MW�]�WCme�s9ha` z�oh9~&��t�jhaW8v&dGme7s9ha` z.be3fQcDb&{ulYZ�me3jQp�`Fy}g��'WYV�d�Z�md2�T�4xU �j�x�W8�Ec?W8V�g�`1W.]�WCme�s9ha` z.be�fQcDb{ulE�*V�j3]>�'�Cme�W}o&h9~�z�`aW=c?W�Lm�h1fQcD{E�.me3WY� i�`Fy¡�j�x"m�d��w�@`9VJ¢U málo enzýmu alebo Mg2+ j8h1W8v�d£o�'¤q¥�lEg8p�Jz�`Fy_b�dVkWV�cDe3fk`,Z(c ��k~�c?d@g�hMd&i�`9W8b@p reakcii (ak sa

¦T§¨r©>ªJ«J¬­r®¯­J°>±T²®ªa³@´JµL¶�·£¸T¯}­r¹J°�­rº=¦8§¨[©>ª » ¼8½6¾J¿ÀrÁÂÀJÃ�ÄTÅÁÆaÇÉÈËÊ 2+ !)

Vzniklo mnoho produktov:Ì ÍÎ�Ï9Ð9ÑNÒ6Ó�Ô Õ Ö£×8ØÙ�Ú9Û&Ü�ÝrÞßà9á�âßãaâ(ä�Û�åQæ çè×8Ø�Ù�Ú9Û&Üèé@êá�â(Þ�é@âßJë�ã ì í�î4ï0ðQñóòð�ô7í�ðõöa÷Dö1õø&ù&õYú�íû�î4ü�ý�ø�ñDîEþ

(pásov)ÿ �������������� �������������������������� ��������� ����"!#�� $�&%'�()�� �*'!��,+ -�.�/�0�1�-"23154�687 9 :<;>=�?�@�ACBED�BF�G�HJI

„touchdown“ PCR, ktorá výrazne zvyšuje špecifitu reakcie. Pri touchdown PCR sa naK =&LMH�=�N�B�O K =�PQ=�R�SUT�H�@�O�B�V W�XZY�[\W^]�X�_a`8b�c�d�egf vyššou teplotou naviazania primérov ako sah�i�j�k�l m�nponrq8s�t�uwv)x y"z{�|ry�}5~�����z{�|�{�������}�{�|�������$�������Q����y�������}�����y"��}E��������~���{�� fického

produktu, lebo je vysoká teplota naviazania. V ��� �"�8��{�|�{&��^��}^{�|�������������}��5y���~���}ry�}�� � ��� � � � ��� � ~�����������}��� ¡��y�}������ ��¢ �£��~������ � }'��y � y�}�����zZ��z�¤ � ��}���¥¦� � � � y����§~^����y��� ¨��y�}���z©� �������}����$�ª� prvých („teplejších“) cykloch tvorí špecifický produkt (templát pre špecifický

produkt je v nadbytku oproti iným templátom). Príklad touchdown «­¬¯®±°�²�³U°�´�µ�¶�³�·�¸

Page 68: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

29

¹rºC»�¼�½¿¾&ÀÂÁwÃ�À�Ä�Å�ÆC¾�Ç)¾�È�É�Å�»Cº�ÊUËMÌ�Í�Ì�¹�À�Î�À8¼ÏÎ�ÌÐË�Ì�Ñ�½�Ì�Ã�»�ÉÓÒÕÔ\Ö�×±¾�È\É^Å�»ºÙØ naviazaním primérov pri

70Ú C nasledované 3-5 cyklami s naviazaním pri 65Ú C a potom 25-35 cyklov s naviazaním

primérov pri 60Ú CÛ ÎÀ&º�Ç»^¹�ÎÜÝÄ�Í�½$Þ�Ü�Í8ÈßÒrË�ÞUÀ�Î�½,àáÄ�Í�½�Þ�Ü�Í8ÈÛ kontaminácia

Vznikla šmuha:Û Ä�Í�â�Å�½�ã­ºCÀräwÌá¾�ÈÉ^Å�»�ºÓÒrË�Î�â�å�½,àáÄ�»�Ñ�À�Ãæ¾�È\É�Å�»Cº�»�Ô�Ö�×Û Ä�Í�â�Å�½�ãªÎ�â�Ë�ÉçÌá¹�À�Î�ÌwÃ"è�Í�Ì�Ñ�ÎéêÃ�À�Ä^Å�»Ã�Ì�Ò�Ë�º�Æçã�½�à ë�ìîí ï

Cð ñ�ò�óªô�õ�ö�ô�÷\ørù�ô­ú�ôÝû�ü�ý�þ¿ù"ÿ���þ�������ó��ü��ö�ù ������������ù�÷��� ÷ô����Cò�þ¿ù�ö�÷��Uö�ô��§û^þ��ö �'ó�!��÷rö�ü"�Cþ#����ò$� %�&!')(+*-,/.0,"1�2�3!(+4$,/.65�'�'�7!'�8�9�:<;�&!;�2=7!>)(+*?'@'�%0,A8�1CB�'D3�8E1)F)*+G�,"*IH

templátovú DNAJ K"L�M?K�NPORQ!SUT!VWN OYX touchdown PCR“Z príliš vysoká koncentrácia enzýmu, alebo Mg2+ [W\)]�^ VWNIO_L!S ]�`)a)]cbAdEe)` N T b/f�`)gWb S \)h S�VWN a LZ Q d�^#h Njilk acm$nob"a�p Q h�eCb T@k dEa)n L ` N+N [c\)]�^ VWNIO�q arg S p@] S�V�K b k�SZ kontaminácia

Pravidlá pre prácu v PCR laboratóriu:

Technika pipetovania:

Pri pipetovaní PCR reakcie sa pracuje s k aWmCp N psn)hPf!p NlS�t�q arpsn)p N�u?Q d�aCb S b"a<`�g�] N#L n Q!NIQ aCb S�k n�] N np@v V a k fwdxn�\c]Ua SUkUQ hIy k ] NIO_k f K h�aWz S�L [

Z L n V z M dEa)n�{!a�]U` NIT bAd�a t n Q d�a)z Q�S�T!V)N b"^#p Q dEarp N a i n OZ d S \$b S�L y|bAd�a t n}]�n O n)g S�k n O z S~iQ�NP��L y Q!S p@n)h�y�n kUV zUy KL!S ]cbAd S h S�k n O��rN�q a}d S \Cb S�L|k�iQ!N#��L aZ K"L!S ]WbAd S h S�k n Os�)N ]!n k�S ] L n qCiES p Q!SUk d�`)g T�iQ!N���L y6]!a�\ S�K b"n�h N \ k y iL y�d S \$b S�L�T�u n L e�] S�S z K bAd�e�] N-O

ichZ Q d N�Q d N z�e k n)]�^?z S d S \�b S�L�T�Q�S ] S d N OsiQ!N���L�T�u�k yWb"h+n �rNIO@Q d N z!e k n)] M d�a)n�{!a�]!` N T n S�Q hPe)`)g�] T�O0i"Q�N���L�T

]UnCb N nrg�] T b^#p�n k yWbh�n � a)]�^�p�d S \$b S�L�T ] N a L!S m L!S�L d�exbZ Q!S�T!V ^ k n O bA\ k���X master mix� [�n L�K n�d S�t ^ k!N n)`~������d�a)n L ` N ^��jb � q$��k!N n)` KL�M p�n k!N a L�� \Wh S�V)L y

K"Q!S h S!� ]�� Q d�a k�i aCb L y KL�M psn kUL y�bAd�a t n�]Un Q!N�Q a$b SUk n O �����!�<�c���� ¡��¢�£¥¤) �¤¦� jednej skúmavke,§ �c¨j�� ©¨"¤�ªc¨j�� @«c¬A¨"¤�­� @®I¯6°�±�²!³#«)°�ª�¤ § ­�¤) ¦®�¤���«$´Wµ�­E��¶W°�¤�³�®I´D°���£¥¤)°�ªU�U¨A³#®I�!·!¸)¹�¬"²�º� s«��!®�¤�²6« § �c¨A�� 

Page 69: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

30

»�¼�½#¾�¿CÀ Á�Â~Ã"Ä�Å!Æ�Ç�È!É�Ê�Ä0ËÌ!Ê<ÍrÉ�Î�É�Í)Ä!Ï}ÐWÑ#Â�Ò)Ä�ÓDÔjÕ"Ê)Æ�Ì!Ñ�ÖCÕ?×_Ø@ÙYÚ�Ì�Û"É�ÆsÏ�ÛÓwÜ$Ý)Þ�ÛàßáÌ�Û�ÇCÈ!Â�â0ÆDÇcÃ�Õ"Ê�ÛãƦÉIäwâåÃ¥Çzmenšuje chyba pri pipetovaní

æ ÈUÒWÁUÓ�Ì�ÛàÉáÌ�Û�Ç�È!ÉPç~Çè|é!Ê�ê!Ç$ÕßIÈ!écâ�Ä!Â�écÕAÛ"Â�Ñ-â�ÚëÕ¥Ý è ÝëéUÇrÆsÉ�ÊcÃ�Õ"ÂåÕAÊ�Æ�Ì!Ñ�ÖCÕ/âì×_Ø@ÙíÌ�Û"É#Á�Ç$ç6Û�ÂUÈUé�Ç�Ä�îïÂUð�è¥Ê)Ævody; ñ�ò�óõô�öl÷�ø ù)ú�ù)û�üUýwþ ÿ � ú�þ��sù)û��Uýcú�ó��!ú�� �Wó#ù��!þ)ú ñ�ò����������� ù�����ú�����������û����������ú�"ù��@ó#ú��� )ó+ó"!$#%�'&¥þ(�)�*�+���)ú�,-�oñ������)ó.ïù/&�ñ���ýcó0�/12�!ú�3����ú��Aò/��û.������4�û#ó5�6��þ�ò�þ)ú�ó2�879��ú�:����!ù)ú�ó�ùreagencií

; ñ�������12�!ù�<�"ñ!þ� )ó9�)û#ú��'�=����ìñ�òEþ?>A@CBED/��þ�ó���ú�ó#ý��6��ù)ú�F�CGH�"þ�òó#û+ó#ý����!ù)ú�I7Aó+û.�Aò��- róJ�6�F�CG deklarovanou

úUþ�ñ�ò�1.�K�=�@ú6�LG����� MONP��ý ùQBRNS��ý�TU!VNsþ�ñ�������12��ùW ùW���)�=��ûX�������!ù)ú� ������F� ñ�ò�þY�����Wþ ñ!ù�òEùv ùU���K�=��û�����þZ�+4��Wþ[�!ú�ó�þGHO����ú��"ù\�@ó#ú!ù)ú� � ó#ú�]�óIÿ���&/�F )þ^>A@CB

; ò�þ-������6��ùW'��ýWú�ó�� ù)þ�ò���G���û����_��ò��W�������` )þ�ú��Aòó�7)��:��- róJ�6� G/���F�sù��!ó+þa�*��ý���ò�ó#þ���ñ�òEþ��b��c����ò�þ�ú�1��+�GK�����sù���� � ���c����ò�ùW_ñ����@ù)û �

; GK�����sù���� � ���c����ò�ùW_úUù%d��¦úUù/&/��ò�ùW����ó.�e����ÿ��; ñ�������12�!ù�'�"ñ�óXd�� � G 7�ó�û.�Aò�ù���ó��f������ò�,~ýrùCÿ�ò�ù gh-ikjml�n�o�p�q�r�s�p�q2h_s�o�nktLukt=v�t�wIp�sxr�t�p�q�o�y{zPq�r�n�t�l�q2l�oW|�}�~

� l�qX��r�}+p�o-sWh�|Kt=r�vJ�-w=t6wFsU�� ���S�A�����/�������=�W� ���������������J���K������8�����-���K�����H�K���� �¡ �k���������X��¢'£���¤��¥��£2����£9�X����¦V��§+¢ ��)�=�k¦

¨�©6ª ����-«Y� Taq polymeráza (aj iné) rozkladá dNTP¬ ­�®°¯�­�±�²�³�´�µ ¶¸·º¹O»P¼½±�²�¾2¿�ÀS·�Á�Â�Ã�­P¯ÅÄÇÆ2·�È�²�ɳ�®�¾9·-Â\Ã\²6Ê=²6³Ë­�®Ì�µ2Ê�µ.ÌK²�³ËÍHÎ proofreading“), je nutné

Ï ­WÐf¶�³ Ï ²+Á�·�­�®�Ñaµ�·[±�²L¯�¾J· Ï É�ÒFÓ�¾�·�Ô�²ÕÊ neprítomnosti dNTP degraduje svojou exonukleázovou

aktivitou templát a priméry

Öº×�ØÙKÚ�Û+Ü�Ø�Ý�Þ�Ü9Ú%Ú%Úaß�×^à�á/àfâ�Ú�ã�ä�Ý�Ø�Ü2å�æ

çRè�é�êUë�ê�ì�í%îPï�ð�ê�ñòKó�ì+ô�ñ�õ�ö�ôX÷�ì+ø�ù�úüû�ýÿþ�����ó�û�ê�é�óWò��=é/ñ6÷��Hò�ê��2ý½ó�ê�ú�ù��� =ó\ñ����ó�é�ôXó�è�÷�ñ�ô9÷�é�ôpredošlej príprave DNA (izolácia plazmidu, štiepenie DNA s

ék÷��Hò�é/ô ð���ñ���ìSôb÷�ñ�����ìSó�ìPô����ð�é��2ù�ê� �õ ð�ê�ñòKóaì ô�ñ�õ�ö�ôXó��

cross-contamination) medzi vzorkami a produktami predošlej PCRó�ì���9ô��/ô�ðFõ�ö�ô9÷���îSó ��ó�ì+÷�è���÷�ñ�ôX÷[ð�ê�ñòKó�ì+ô ñ�õ-ö\ôX÷ ë¸÷ �êò�é�÷Wû�ñ��%è�ê�è�éKù�óWþ[ú�é!��ô.ò"� �é�ó# �ôXè��Xõ��$ ê�è�è�÷%��ô2þ ò�é/ô&�é�ó�ö�ê� �ñ��Õì+ôX÷���òKó��Hì+ôX÷��Hò�ñ6ê'��ò/ô(����ó ð�ó�ù�è��) ÿý�ûFó% �ô2þ*�

vlastnou sadou pipiet, ktoré sa�ê�ú�ù+�� �ó/ë-,.�X÷�ñ* ë¸÷�è�ñ�÷/ë5ìPôX÷���ò�ñ�ê��Hò�ô/�102� ì+ôX÷���ò�ñ�ê��HþSñ�ó3�é����é�ó4 �ú.��õ��kê6û�ñ��=ö�5{é�ê��Wò)ê=ð6ê� Ëó ì?ó���òK÷�émixov (zákaz práce s DNA a RNA, okrem primérov), 2

� ì+ôX÷��Hò�ñ6ê'��þ'ñ6ó6�é����é�ó% �ú7 ���ê�é/ôX÷�ðpre PCR - izolácia DNA, RNA, zmiešanie vzorky s master mixom (zákaz práce s PCR�é�ê�èú�ðòKóaì ô8� ó/ë ð���ê�ñ6ê� =ó�ñ���ìPô�ñ�ó%�é4�� ���ó%��ìSô9è�ê�ö%5����:9��½ì ôX÷���ò�ñ�ê��Hþ ñ6ó�ú�ìSô9÷2�Hò�ñ�÷�ñ�ôX÷termocykléru a ELFO

$ é�÷-ó%;�÷�ñ�ö�ôX÷ �é�÷=<?>A@�ì+ó/ë-,Pû�ýÿþ��/ð��Xó�è�ê� �ó�ñ�� miestn

ê'��ò/ô�����02�

Page 70: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

31

B C�D�E�F+G�H�I%JLK/E�M�I#H�NPO+QLI C�K�N�C�K�R+O+NSNPO+TVU+I2WYX"D3Z[Q�\�N�JB C�K�N�C�K�G�C�K�I#H&Q K!Q+I%]�Q%\�O�NPGP^_M�X�D_K�`aC�b4c�d�Eed�D[f?gAhiK�Q+IjM�O%NPQ)C�D�E�F+G�H�I%Jkc�Q+d�\�D�K�R%l2D�H�`�W-M�m&ZnIoH�M_p3qYM�X"D�K�`

nikdy neprišli do styku s DNA alebo RNA)B I#E�X�D_M�r8RoH_D�H_I%J K�Q+I%]�Qj\�O�NPQ+^sM�X/D�K�`tZVD�F+\�D I#E�X/D�M�rPR%H�D�H�I4J q/C�KuN�Zn`%K-p�^vd+w*xyf?^:C�D�r�p�Z*QjK�R%l%E

W!I�Z[D_l+K!Q!c�ZnQL\�Q+ZVD�F�\�D*I#E�X�D_M�r8RoH_D�H_I#JozB C�D�E�F+G�H�I%J�{"CSNPU%M�p|W filtrom, najmä v Z*NPQ�WYX/\�D'W/X-N�U�}�~2}� I%K�N�IodSQ+\�NPQ�M�D�\�X"IjZ3N�\�D_H�I+\�`iW6��w*��quWYX"D�r�p�^[C�N�C&Q#X�p&}�}�}�z�Z[D_F+\�D�d�QjM�D_\2X"I%ZVN�\�D_H�I4Jid�Q%C�E�K�N�\�R+O+N�D�E?�povrchy sa ošetria s 1N HCl, následne s 1N NaOH a potom sa neutralizujú s neutrálnym

tlmivým roztokom (napr. 0,05M Tris-HCl, alebo tlmivý fyziologický roztok PBS: 0,02%

KH2PO4, 0,06% Na2HPO4, 0,02% KCl, 0,8 % NaCl ) a nakoniec opláchnu s vodou.

V C�K!I%M�X/N�O%M�DSZ O#H�NPU2Q�\�G W!I���E&d�Q�I�ZVC�r�N��-N�M�D�H�I%J�m�W!Q%Msl génu ktorý je naklonovaný v

plazmide. Ako templát do PCR W!I6C�D�E�F+N c�Q�X"Q%\�X�D�K!Q%M�D�Z���N�\�D_H�I+\���C�r�Ijl�ZnNPd�I�IjM�D�C�K-N�Zn`%K-pW�IC�D�E�F+N c-m D�r�N�]�D�\�E�M�rPQ+D�X/N�d�p M�D�Z�C�rPQ�ZnQ+\�X"RjK-\�Q M�E M�DSd��_\�D�H_`�Z�E q/K�Q#H�QjK�W�Q C�KuN�ZnQ%K-z!^ K�Q�W-C�}�%�2�-�(���S �¡�����¢�£+¤¦¥¨§-©/��ªY«[�%ª� �¬�ª-��¤V­jª-®�¢�¯P°%����¥²±�³*´Vµ¦¶·ª-¸¹�"��¤V����ºY»¼ª���½+¬���½+��°o¢_�+¾+�P­�¿��À¤V�P­�ºY�"�i¬�ª�­ª�­2ºY�/ª-����Á+��Ân­+��½�Â�¤Ã���L�+¤V¬�¯���©-������¢_�+��­!Ä1º�­j�_¢_­���¾+����º��=¢�Å�¥�Æ2� Ä�­ ¬�ª����+���+¯�Â�½�­=¶?ÇkÈɬ�ª��� �¥�����¥'µ

PCR v objeme 50 µlÊ[˦ÌÎÍAϼÐ-Ñ�Ò&ÓVÔ%Õ�Ñ�ÖnË�×+Ø�Ô+ÙoÚ�Ø�Ú-ÛÝÜ%Õ�×�Ë_Þ-Ñ�ÔjßLàSá�à�Ú4â�ã+Û�Ú+ÓnÚ=Õ tomto poradí:

ä å�æ|çSè�é"ê�ë2ì�íPî+è�ï�ë-ðòñ_óSô�õVö�÷Ýô�ë%ø�è�ù%ú�ó�ñ�ù+ï�ó�ûnï�ë%ê�ú�ü¹ý"ó�þVï�ó�÷Yÿ�ó�ûnï2û�øSèPë+î�� �� 5 µl 10x koncentrovaného PCR tlmivého roztoku (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH

8,3) – výsledná koncentrácia v reakcii bude 50 mM KCl a 10 mM Tris-HCl.� 4 µl 25 mM MgCl2 – výsledná koncentrácia v reakcii bude 2 mM MgCl2� 1 µl dATP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM� 1 µl dTTP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM� 1 µl dGTP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM� 1 µl dCTP (roztok 10 Mm) - výsledná koncentrácia v reakcii bude 200 µM� 2,5 µl forward priméru (roztok 10 µM) – výsledná koncentrácia v reakcii bude 0,5 µM� 2,5 µl reverse priméru (roztok 10 µM) – výsledná koncentrácia v reakcii bude 0,5 µM� 1 µl Taq DNA polymeráza (konc. 1,25 U/µl)� 1 µl vzorky, t.j. roztoku rekombinovaného plazmidu (konc. 1ng/µl)

� ó ô2úYû���ë-ð�÷-ø��&þnù%ñ�ø�õ�ó�oï�ù�2ë+ï�ë-ð �%ø�ó�ï�ý/ú�ó�è�ù��|ê�í�ê&ë#ý�ûjð�ë2þ*ë*ý/í�ë6í�÷/ý����2è�ó��+ø�õ��kù�è8ë6ï�ù+þ*íPë�÷/ý"ó�� çSèñ��2ó_ú"ø_õnê�ú�í�ô�î+þnë��Vç�èSñ�ó�ô�õ���ù%ø�ó|ï�ë���ù#ý/ü�ñ�ï�û ø�ó�ï�ý/ú"ó_è¹û����Lø ï�ë+ô��jð�ô�ë�ê�ó�+ù2÷aê�ú�î+ì+ë�ø�û ø�ó�ï�ý"ù%þVí�ï�î+ì+í�í �

Page 71: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

32

v !�"$#%!�&('�)�*,+.-0/�)�"1'2-43�"5!6/�&�7$8:9<;=-0>�"?3A@�7B&�>DC�)<!FEHGI-�+:;J"�'%!�& postupného pipetovania do dvoch

'�)�*,+I-�/�;J"�)�KL+.&9<3�& @�7$;M@�72-�/�;MNO3�-$#P@�7$/ '�@�&�Q &�R�3D* S<+I"D'2K master mix, kde sa napipetuje

>D/&�#23�T�'2&�U�3�VW&�U�#F"?+ /YX2"5!Z)�V�[�\ASDQ]&9<;J"�)�K^&�)�72"�+ /�S<&�7$)�_a`Z72"D'$@YEb/&�>D_W@�7B"1)�&�3D!Z7�&Q 3D*c72"�-�)�[�;dC�e2Kpotom sa „master mix“ rozpipetuje po 49 µl do dvoch skúmaviek a pridá sa 1µl vzorky, alebo

vody.f "�-�)�R�3�ghS<+I"D'2;,/ obidvoch skúmav)�T�[�\:@�72"�)�7$_i#F"�+I"h)�/�-�@�)�&�Cj+k; 3�"�7BT?Q 3�"�\�&^&�Q "$#F-l-h/�Q &�9<8=+I"

>�&�!�"�7$+.&�[�_m)�QJg�7B-�Kn)�>�"^3�"�[�\�T�+I"^@�72"�U�"�\�3D*�N oqpsrut�vDw�x6y<z�{�|�t�}�~���y���x {��Zt�{�����vDwB{�|�}�~����2{��%�Jx {�~��������� �5���������k�������5�6���2�0�?�]�k��� � �������0�D�:�b�:� �� ��Z¡�¢£�����2¤=�0����¥�?��¦¨§�©ª��¡m«�¤=���I�¬� týmito parametrami:

denaturácia 94� ­�®�¯�°0±D²¨³µ´k¶ ·�¸�¹Zº�»£·�±�¼�¶J±?½?±?·�¶J¾:®�¿P¶ ´IÀ�¿2¯�¼ÂÁmÃ�Ä$Å�Ã Æ ­AÇ%®�¯�È�Éi±�²B¾�Ê�¼�¾�·�Ë?¶J¾¨®�¿2¶ ´IÀ�¿2¯�¼�ÌÍ�Î�Ï�ÐDѵÒbÓ:Ô Õ�Ö�×6Ø�Ù£Ú�Û�×�Ú�ÕmÜ<Ô=Ð:Ý�Þ ß à�Í�Î�Ï�Ð<Ñ:Ò�á%Þ�Ó:Ô Õ�Ö�×ãâ%Í�Î�ä�åiÐ:ä æ ç�è�éªê�ë:ì�íJî=ï$î è�ð�ñ�ê�ò�ó�ô�ðªì�õ$ð�öD÷�èDø6÷�ùûú po÷�è�ð�ò�ü�ý�ò�þ,ÿ�������é�è�íM÷���� � ì�ð�ü�ê����bë:î ò���øqê ì�ðDøZð�ë ochladenie na 12� C.

Analýza PCR produktu

Agarózová elektroforéza

Z è�ê�ç?ö�ý����� �� õ2ý0ê�è���î=ý��6ñ��<ð�õ$è�ê��^è�ð�òDø õ$ð�íJê�ù ð�ömð ��õ2ê"!#�$ì�ð�ö(ð�í ý�Fê%$'& (,í)��ì�õ2î ö�ê*!+,(,í- ./- 0�12.�3�465�7�8�9:8<;*=>8�?�@BAC�D)C�EGFIHKJ�92L�MON5�-�8�P)8�QR0SMO8�T�9�0�DVU�C�H W�.�3X7�.'92L<;/.XYO.ZQ�P)8�[I4]\^T�8Z_2.�MO?�`aE�H.Xb�.'92L<;c8�Q�dX7 8eb�d�P]@gf<hi8ZQ�5cT�j .�_*1�5�_g_k./MO?�`eQ�Pl8<[I4m\n1o=:.'-�T�.X92TSW fragmentami hqpsrt;I- 0/Mu5_vQ�5Ijw?�8GWo=>4xfy{zs|�}2~"�<~X�������:��~��6~X���>}:z<�>z�}2�X�������O���>�����2�G|�}2~X�c}�)~"� �����s���%�o <¡"¢£l�<¤n¥G¦�§�¨2¡O©/¤O��£«ª)¬ª)§�­�®�ª6©°¯���R¡�±2²�­�³

v dráhe vzorky bude DNA s��´c©X§�­" R©�²���µS �¡c¶w§��·�>¸I��µº¹�2¡X§� <¡X²�®�ª6©i»q¼s¦½���°¨2¡���²�¾�¿��S��Àª)¤u¾XÀ2©O���

druhý). V��À2­X¿�¡S² ¡XÁ�©"¢:Âl �² ¡¨Ã§���²�¢>À:��£lÄaÅ�ÄƲ�¡�¤u©�£ÇÅ�Ä�¸ÉÈ�ª6©I��¡�²a��À2����µ�§I¢>³Ê£)¡�²a��À�ª)¤u¾XÀÄa �£)��È�¡/²

é do

reakcie.

Štiepenie sÀ2¡I�o¢>À2ªm§�´�²�Ë�¤+¡�²�Ì/Ë�¤i��¤

Í ÌI©'¿�À2ª6©"¸ Î2ÏcÐXÑ�Ò�Ó�ÔºÕIÖsÏI×�ØxÙÛÚ�ÜÞÝßÓ�Ðáà�â ã Úåä�æ�ÒcÐ�×OçSÖOè)Ó�Ô�é:ê�Ó�Ðeè)Ó ÐXÑ�éèmë<ì�í�èlîÆä�æ<ïmð�ÖuÏXÎ2ì'Õ/ð<ê�ä�æ�é>æ�ÖÓ Ï�í�ñ�Ð"òvë<æ�ó*Ó�Ï�æ�íXñ�ï6Ð�ô�èlò

õ æ�ô�æ�ö�Î2Ð*òn÷'ønù�ï�Õ Î2ÏcÐXÑ�Ò�Ó�Ïú�ÕIÖuÏ�×2è�ô�æOÓ�æ�ë�ÏúÇ×:Ñ�ÔGÖuÐXë�Ñ�ðõ k 10 µl odobratým z

Î2Ï�ÐXÑRÒ�Ó�Ïú�ÕIÖsÏ�×2èÛä�Î2è6ô�Ð"òa÷'øaùGïüû�ô�æG×2æ�ó*ævacieho” roztoku, ktorý upraví

Ñ�æ�Ó�í�Ï'Ó�é>Î2ì�í�è]îá×�æ�ï)ý<ëOÎ�Ï�ÐXÑ�í�è«è�Ó�ÐÇé:ÐXÑ�ÔRê�Ñ�éþæ<Î�ìÿú2Ï�æ�ä�é>è)Ösì'ï«Ó�Ðvä�Î2Ïvä�æ�î���è]é���Î�Ï�×oé>Îè Ñ�Ò/Ó��ÃÏ/Ó�Õ���Öõ ä�Î2è)ô�Ð"ò�÷���Î2Ï�×>éxÎè ÑGÒ�Ó��ñ æsÏXÓ�Õ��Ö�îõ è)Ó�Ñ�î�ö�æ�ë�Ð"ò�÷Çñ æ�ô�è)Ó�îuä�Î2è��� ã

Cõ ÐXÓ Ð�ï ð�Õ/æ ëRÐ"òqÓ�Ð�Ð� �ÐXÎ���Õcæ ë<Ï�úüÏ�ï6ÏXÑ�é>Î2æ�>æ�Î��XÕIÏ

� Ñáä�æ��xé>è6ÏXä�Ï�Ó�ýÿë�ÕIÓ�è)Ñ�Ó�Ô���� � �xÎ2Ð� �ÖuÏ/ÓIéoðÉæ�Ò�ÐXÑ�ì*ë�Ð�Ó�Ïú�ë�Ï�ówÑ�æG×oé>è)ê�ú2Ï�é:æeä�æ�éxë Î2ô�ÏXÓ�è6ÏZ×:ä�Î2ìXë�Ó�æG×oé>è

PCR produktu.

Page 72: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

33

Analýza DNA sekvencií pomocou PC

���������! "$#&%(')�� �*+'),�-��.��.%$ ('!%�%�/�0���)01*2#3%54768*79;:<�!=>%5'),>���?*@ �%�� -;ACB���".��EDF-�0HG(#I���8BJ%�/K�L�MN(OQPSR&TVUWIX�Y(O3MYZ>L�MT)L�[�\^].O`_aLbP2O3YZ>ML�McdMe>f�ghL>iMLdRj_kf�LHl5m5LM.Y.m2R�MT)Lbn�oqp3[sr�U�W.Y5XM.Ytf�uf�L�lm�L�MY�m�R�MT)R�n�ovpQw�xy_z[{P�|�}7L�MT)L~X�Y5|�R7i�T!R�M>P�l(g)L�Y�x�T!iY�m�m študovanom fragmente DNA, je

základom moderných génových manipulácií a bez znalostí sekvencie DNA je praktickyML�O3YZ8M.c�Psfjl�PxJY�}�MT?ukM.e�|�Y�}�MLj_���T)L�K�c�MY�m�ckO3R�MT!X�P+g)e�U>T)L�[

Pri analýze DNA sekvencií sa s m5L���l�Y.P�m].WY�i Y.P�m���P�Z>�Vm2Rj_j��X�Y(}���xJR7}�L�[d��Y(}H��xJR�}�Y�m��R�MR�g�].��P�n�ovp�f;L�l5m2L�M.UT)��O&Y5Z>MY�|jY�>iL�g!T?u�iY~i8m5Y(UHW~��xJe�iT!�F[s� X|�m5Y5O$f;RvX�Y(}���xJR�}7Lqm��P�Z>�?m2R;_j�

pri získavaní a kompilovaní údajov o sekvenciách dlhších úsekov DNA. Pomocou

špeciálnych programov sa porovnávajú sekvencie získané v jedM.Y.xJg!TVm�]�U�W�f;L�lm2LM.}�M�]�U�WLC�X�L�|�T)OvL�M>xJY(U�W.w�m�.W�HR�ie�m�Rj_j� f;R�X|;L�l|j�8xJT!R R�l�Y5O�X(T)gVP_;� f�R f;L�lm�L�MU�T)L �>�Ffjl2R�Mc �Y����� ���¡¢� �£�¡¤)£$��¢5¥�¦(§)��¥I�¡>¨J©�ªj¡�«5¬­� �§h©�����¡+®s¯��v°£C±�²>³� s£�¡´¥$¦ª;£7 �¤)µ§!¢(¥3¶�²>�·¦ª�¤¸����� ���¡.¢. 5£¡³��£�±�ª�¹�±�º��»����� ���¡�¬�¤)£¼¢.½5¢(¬H­` �§)©�����¡¿¾�¨F±2µ¢. 5£�¡À�­¢ÂÁFª�£�Ã2¥v��¡>¨F±2¶q¹H¢Â¦¢¥3©�­£Ä ´�ª�£�°8¡.�Ä°�¡³!²>¤?Å¥q¡.¢5²��¨F �¢¼¬�­�´�½Ä  sekvencii . V µ�ª�±�­.�jºÆ¹�£���¨�¤V¶{ �§)£���¨�¡�jºI£�¡�£�§�´°�SÇ�ÈvÉ@�;��� ���¡¬�¤h³)¶k¥3ʲ>�˽«�Å

získaná sekvencia analyzovaná z ¥q¡.¢5­�´5¬�­q­.Ì�£7µ5³F�j��Í

1. ÉΡ.£§!«°�±7ºa���a£Ï ´2���5«>¨� +¾a�C¨���´5¬�­Â°�¡©�¥q«5¬�­Âª��8��¨�ª�¤?��¹�¡�´5¬�­�¥q¤)����¨J¶Æ¹H³�¥ °>³F�j��£�¥I�ÑÐ�¦�§!¡�Ð�£¦ª��8�j¡>ÐIª��8��¨�ªJ¤?�+¹�¡>ÐÆ¥3£�¦�±2¶��¨�¢ª�©sº���°©��(§V£�µ¢(¥Â¦ª�� Ò�Ó�ÔFÕaÖV×ÙØ3Ó�ÚÖ!Û�×+Ô)Ü>Ý�ÖV×�Þàß�á3â3ã

2. âÎÚ.ÓÔ!äå�×7æaç�ÞaÓéèê2Þ�ë5ä>ìíìJÓ�ë�ê.Ý�îðï�çHñ�×+Ô)Ó�ò�Ú�ê�Ý�îóç�Ôhç�ØIç�Ú8ìJô�è�õöÓ�ë�ôEÞ�÷EÛïjÖVÓØIç�Ó�ô�øï�ÜCìJçHÚù

opakovania a vlásenkové (stem-loop) štruktúry.

3. Získa sa a analyzuje sekvencia potenciálneho polypeptidu kódovaného daným úsekomßká3â3ã&ú�ï�û�ìJôØdÚô+Þ�üþý5Ô!î�ù�îô�ô8ìFè5ô5ï�çHÚù�î.ôÿòûyìJÓ�Ý�Ö!ç�îô�ï�Ü�ØIÝ>ÓÂÛ�ô8ì�ôØ Ú�Ó�å>Ú.Ó�òC×7æ�ç Ø3ô � Ú.ôtÞ�üexistencie proteínu kódovaného týmto fragmentom DNA

4. Samotná DNA sekvencia, alebo dedukované sekvencie polypeptidov sa porovnajú so

známymi sekvenciami v ������������ �������� ���������� ������� �! �� ��"#��$&%����� ��%('%!�%!������)*%'%!��%���)&�! �+����, .-/��0� 1���2��%���%('�0(3546���/78�/$&-�'�)9%:���:4���.;.��)<�=%! �;�%��.�>)*%@?��=����%!A&��0� B�C3< %�Dneexistuje významná homológia na úrovni DNA sekvencie.

E ������������5��)F7G%���HI)J�.;��/7K�L�=%! �;�%>�.��)9��7G)F7K"�M(0N;.HI��)O ���4�PQ; princípe dvoma spôsobmi,

��0�DR ����;%!��'%>�I������0S%�;��$T4���)&��0S��$9%!���U�! �2��"���$&%����� U%�V)W����%>�.��)9%X��?�/$&�Y!��+����2?���%����!�.�/����0Z�V �!MI����7,?���A[?�����%\;^]��! _?��������.�#��P`��%! �;%����)&AaH��.��7b%���G�=3c?�/�������.�#��PK;$9�I�5�������5��Aa�bd90��� ���)&A5�

Page 73: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

34

Rozsah dostupných sekvencií je v e�f.g�h�f�gCije�k�lg8mnKo�p!q�r`sg�tuq�rvwnIgKf�pKxIy!qz9p{e�g}|ke�k.l.f�k�~5o��~�g!q�sg�f����*�!i�gF�Kk�nIf.�Js�����h��&f�k�mKm�������j�9m�f�q���[m`~�g!q�sg�f.k�s�p!f�r���K�W��p!��bg�fIo�k.s\�J�K�K�

�8p�o�p�l�p�f�q���f�mqz*g�k�o��&e�k.s�r�������k/e�s�k/e�g(f�r����|���k�o�g(�Of.k.sr���<~=g!q�s�g�f����9�F~5��s�k/tf�g_|����9~�oWm|�f�����!�R���<� ���*���.���  ��*�>¡£¢�¤�¥�¦�§��!¢¨/§�¨�©� .�ª �¥C«�¬¨/­K®�¨�¤5¯� .�5«u°��*¥ª¥± �¥C«�²¥>¡�°��*�ª¢�¤�³9�5¯W´¢� .µ¶«��v s·#¸ ¥��� .�C«�§�¨�©� GenBank ¹ dostupná na adrese http://www4.ncbi.nlm.nih.gov. Obsah

tejto databázy je prístupný aj cez E-mail server ([email protected]). Okrem tejtoº�»�¼�»�½�¾!¿�À�Á�ÂNÃ.»ÅÄ<Ä<Ä Æ�ÇÉÈ*Ê5¼WËÆ�Ã�ÌSÍ�Â�ÎOÌ2Ç=»�ºÏ½Ð�Ñ/Î&Ñ�Ò/Ð*Í!Ó�Ì�Í>Ô2º»�¼�»�½�¾!¿IÕK¿I»!Ô Ö�×.Ø=ÙCÚ�Û�ÜbÝ�Þ=Ø!ß�à�Ü*Û!ß�ávšetky aspekty molekulárnej biológie a genetiky.â�ãåä ØæàWç�ßØFÝ�Þ ã�è Þ�Ø!é ã�êë�ì�ã}ê á�í�Ø êî�ï Ü*ØðÝ ã�ñòIó�ê Ø ï�ë�ì�ã Ý�ÞCÜ�Ø ï Ø�ôOç.õ î÷öFøbù2ä�î ß êî�ï Û>Ü ó*ú à î!ï à ã Ù îêû�ü�ý Ü ï�ã�ñ Ý�Þ ãþ�ñ ß ã�ê Ø ï ç ï Øÿß ã é î Þ ü�ï�î ÙUí��!õ î{ú à�Ø!ß òIî õ ó9ä ßØ ï Ü î��9ñ�ï ß ü�ï�ë�ì�ã Ý�Þ ã�è Þ�Ø!é ñ Ù îü Ø ä à ã ß�Þ���à ê�î�� é}Ü � Ü ï Ø ïü�ï�îRï �!Þ ãü!ï�î��

mála “ freeware � Ý�Þ ã�è Þ�Ø!é ã�êú ßIà ã Þ ë ä Ú êã��uï�îk dispo

õ ó Û�Ü&Ü ú à�Þ î í�Ø ä Ý ã é î�ï Ú�� ����������������������� ���!#"%$&�'�(�')��+*��,"-����.��0/ roku 1989. Tento

1�2�3�4�2�576 8�97:<;�1�3�=>3?1�972@5�A7B�C�6 D�EFDHGI9�6J3�6 K,L&MONJLQPJR modernejších programov, ktoré

pracujú pod systémom Windows95 je to BioEdit autora Halla z 2I3�S�TVU+W�W'X�PZY[9(\]6_^3`DI3�:�B�C�6>1�2�3�4�2�576J3'6bac9_5�a VNTI-Viewer, ktorý názorným grafickým spôsobom zobrazuje

dáta získané z dfe�g<hji�g�k�lImonjprq?s�tue0vxw?y{z<v�|}s�~�|���~@i7�J|��}g�t�e7k�vI|�~Hw?y{z���i��x����y�z&�_i+k�|�iH����e{�O|��e7~I��t�eZ�Jg�|�z�w�y�z�k�|'�Je+~���g�w�y�z�s�~�|���~�i7�J|����J|���g&|�������k�i���y�e7������� ��t�e(��� niektorého zo

serverov zameraných na biologické vedy. Najznámejšie sú tieto servery: IUBIO

(www.bio.indiana.edu) a EBI (Europen Bioinformatics Institute, www.ebi.ac.uk). Mnohé

z programov potrebných pri génových manipuláciach sú dostupné aj on line vo WWW

sieti. Z g�t�y�z��J|���g&|�� s�|?�Oe{g<�'� Web cutter �H~�e<�Hv�~�t�k���g& ¡i7g&i{�uw���i¡��g� ��¢e��¤£j¥¤¦§�@e7k?�oe�g&y{t�e��http://www.medkem.gu.se/cutter/), Fragment sizer �¨��w�s�|���e�v}�?e�©]k�|`��v�t#ªx~�i7���¤e�g<vI|&�«g�izáklade ich pohyblivosti v géloch, http://www.basic.nwu.edu/biotools/sizecalc.html),

MIT Primer 3 (návrh optimálnych oligonukleotidových primérov pre PCR analýzu,

z�vxv�s­¬ ®¯®�°f°�°±n ²?i���t�y�n³g�°f´­nµe���´�®�²�tu|�vI|�|?����®xs�~�t��¢e7~@¶Fn·z<v��J��¸¹nQºJ��e�|�²�e(y{g�w�s�~�e�z�©�i��»| on line �I�¼´o�{²? �y�zs�~�e �J|'�ue+k�´F�� 7~�g�´ ²�tu|'�½q?��t�´ i ��¾�g�|���¾ �Ji�g�t¯s�´o�� �y�t�e �¢|?�(g�| g&i@����� g&i �@e7~���e7~�thttp://www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html. Vývoj v tejto oblasti však

g�i7s�~@e���´��ce%��e�©��¤t�~�w?y{z��½|¤ij|�²+��i7��´(�@���@if�HvI ��uejg�|���¾%��e7~�e���g�e%s�~����Hvx´�s�g&¾j��i�vIi�²? 7��m¤t¿����´���²�mFn

Page 74: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

35

À�Á�Â&ÃÅÄ�Æ{ÇQÈ�ÉËÊ¿Ä�ÌoÍ{ίÏ@ÐÒÑÔÓ�ίÏ�Ð<Õ+È�Ï�Ö×Õ]Ø

Alberts, B. a kol.: Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc. New York, 1994.

Bernard, P., Gabant, P., Bahassi, El M., Couturier, M.: Positive-selection vectors using the F

plasmid ccdB killer gene. Gene 148, 71-74, 1994.

Bolivar, F., Rodríguez, R.L., Greene, P.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W.,

Brown, T.A.: Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall, 1995.

Crosa, J.H., Falkow, S.: Construction and characterization of new cloning vehicles, II . A

multipurpose cloning system. Gene 2, 95-113, 1977.

Davies, L.G., Dibner, M.D., Battey, J.F.: Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, New

York, 1986.

Ù­Ú�ÛIÚ7Ü�Ý�Þ�ß&à{á�â³à'ã�ß&ä�Û�ß&å7à�æçâ³à�å�ß�è�éxâuê�æ-ë�è�ì7í&Ú7îJëuì7ß�ïðé½å�ñ&è�Û�å¹ò¨ó�ÛHÜ�ÚÔîJÚ¹ò¨ó�ô�õ&à�öféu÷�å+à�æÔÛ�å]ò�ë�ø�éuå�ù�å+à×ú�û?ü¿ú(âGlover, D.M.: DNA Cloning, a practical approach, Oxford, 1985.

Javorský, P., Vanát, I.: Deoxyribonuclease activity in Streptococcus bovis. Lett.Appl. Microbiol.,

14, 108-110, 1992.

Levy, J., Campbell, J.J.R., Blackbum, T.H.: Introductory Microbiology, John Wiley, New York,

1973.

Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring

Harbor Laboratory, 1982.

Old, R.W., Primrose, S.B: Principles of Gene Manipulation, an Introduction to Genetic

Enginering, 3rd. ed. Oxford, 1985.

PCR applications manual, Boehringer Mannheim, 1995.

Rosypal a kol., : Obecná bakteriologie, Státní pedagogické nakladatelství Praha, 1981.

Rolfs a kol..: PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer-Verlag, Berlin, 1-135, 1992.

ýQþ&ÿ � ������������ ������������������������� �"!$#�%'&(�$���)��� ��*�+"���� �,�-��.����&� ./ ����0213�4� �657 .�98����;:9<�<�=��

Page 75: PRAKTIKUM Z BIOCHÉMIE NUKLEOVYCH KYSELIN

36

Obsah

1. Úvod 1

2. Kultivácia a uchovávanie bakteriálnych buniek E. coli 2

3. Izolácia chromozómovej DNA 8

4. Izolácia plazmidovej DNA 14

5. Elektroforéza v agarózovom géli 20

6. Konštrukcia génových bánk - príprava rekombinantnej DNA 28

7. Transformácie buniek E. coli 38

8. Identifikácia a analýza rekombinantných bakteriálnych klonov 42

9. >�?�@�ACB7D�E�F�G�HI?�G�J�K�GML�E�N.?�O�P�QSRTD�P�K�N�O�U�D.V�WMX�L�BYD.Z D�E�O�U[D�V\V2U�]"V�B3V9E�A^?_B7D)PMO�U�D.V 50

10. `ba�c�d�egfhe.ikjmlonqp�r7e�s�t�s�u�v"wMi$x�y'z 53

11. Analýza sekvencií DNA pomocou PC 69

12. {}|�~���������|��������h�����.��� �9�3�4�6����� 71