* Media berisi bahan-bahan yang berdasarkan fungsinya dapat dibagi menjadi :1. 1. NutrisiBerisi protein, peptida, asam amino. Komponen protein yang diperlukan mikroorganisme adalah pepton, tergantung kebutuhannnya dapat berupa meat pepton ataupun non meat pepton (casein atau soya pepton) ataupun campuran dari keduanya.

2. 2. EnergiBahan yang digunakan adalah karbohidrat yang paling banyak digunakan adalah glukose, laktose, manose, sukrose, dan maltose. Sukrosa : merupakan sumber karbohidrat bagi khamir, dimana setelah mengalami fermentasi, sukrosa akan berubah menjadi glukosa dan fruktosa yang juga dibutuhkan oleh khamir Dekstrosa berfungsi sebagai sumber karbon Lactose merupakan sumber energi dan juga karbohidrat

3. 3. Logam dan MineralDapat dibagi menjadi 2 yaitu :- Makro komponen : Na, K, Cl, Ca, Mg, Fe- Mikro Komponen : Zn, Mn, Bi.Logam dan mineral terkandung didalam pepton, buffer dan agar, sehingga seringkali tidak tercantum dalam resep.4. 4. BufferUntuk pertumbuhan mikroorganisme tertentu dibutuhkan pH medium yang optimal. Contoh : Phosphat, Citrat, Acetat, dan Asam amino spesifik.

5. 5. Indikator.Penambahan indicator merupakan cara efektif untuk mendeteksi fermentasi karbohidrat spesifik.

6. 6. Bahan SelektiveBahan selective dapat berupa bahan kimia atau anti biotika ditambahkan pada media bertujuan untuk menekan pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan sehingga hanya mikroorganisme yang diinginkan tumbuh.

7. Aquadest selain berfungsi sebagai sumber oksigen, juga berfungsi sebagai pelarut sehingga memberi konsistensi cair pada mdium

Yang harus diperhatikan saat praktikum pembuatan media :

B. Alat-alatAlat-alat gelas yang akan dipakai harus disesuaikan dengan media yang akan di buat:- Sesuaikan alat gelas dengan volume media yang akan dibuat.- Sesuaikan alat gelas dengan media yang akan kita buat misalnya untuk media yang berbahan dasar agar-agar gunakan Erlenmeyer dan untuk media cair atau broth gunakan beaker glass.

D. PenimbanganGunakan alat pelindung diri misalnya masker dan sarung tangan jika menimbang karena media berbentuk serbuk mudah berhamburan dan toxic bagi pernafasan- Timbang dengan benar dan harus bebas dari angin.- Jangan membuka terlalu lama media setelah penimbangan.- Menimbang harus tepat dikarenakan mempengaruhi komposisi media tersebut.

E. E. Pelarutan Jangan terlalu lama dalam melarutkan media karena akan merusak komposisi protein, pH maupun karbohidrat.

F. F. Penetapan pHPenetapan PH bias kita lihat dalam petunjuk pembuatan media karena disana akan tertera berapa pH yang sesuai untuk media tersebut.

G. G. Sterilisasi- Segera setelah pH media segera ditutup dengan rapat dan segera disterilisasi dengan autoklaf- Untuk sterilisasi kita akan bahas pada bab selanjutnya.

H. H. Penyimpanan media jadi - Seteleh media dingin simpan sesuai dengan jenis media yang dibuat , bisa disimpan dalam almari es, suhu ruang maupun tempat gelap.- Untuk penyimpanan media ada hal hal yang harus diperhatikan antara lain :1. Jangan terkena sinar matahari secara langsung atau terkena panas secara langsung2. Untuk media-media yang diperkaya dengan darah, antibiotic maupun serum harus disimpan dalam lemari es3. Media yang ditempatkan dicawan petri harus dijaga jangan sampai kering sebaiknya simpan didalam lemari es dan ditempatkan dalam plastik tertutup.

I. I. Kontrol KualitasDalam control kualitas ini media yang akan digunakan dalam indentifikasi harus dilakukan karena itu akan berpengaruh dengan kualitas media ada beberapa tahap control kualitas yang dilakukan:

1. Secara Visual. Perhatikan warna dan kekeruhan secara langsung A Bila terjadi kekeruhan dalam media cair atau terjadi perubahan warna maka bisa dipastikan media itu tidak steril atau terkontaminasi.B Media yang dalam tabung dan berisi tabung durham jika terlihat gelembung udara dalam tabung durham maka bisa dipastikan bahwa media itu belum diseteril atau bisa juga terkontaminasi.

2. Test SterilisasiTest sterilisasi ini sangat perlu karena suatu keharusan terutama pada media yang diperkaya dengan bahan-bahan tertentu :- Ambil sebanyak 5% dari tiap batch media, inkubasi selama 2 x 24 jam dengan suhu 37oC, jika terjadi pertumbuhan lebih dari 2 koloni percawan petri maka seluruh media dalam batch pembuatan itu tidak dapat digunakan.- Dengan penanaman kuman control positif dan control negative

J. Kesalahan-kesalahan yang terjadi pada proses pembuatan media :1. Kwalitas aquadest yang jelek2. Wadah yang tercemar3. Terlalu panas pada proses pembuatannya4. Terlalu lama disimpan pada suhu 50oC5. pH tidak sesuai6. Cara melarutkan tidak sempurna7. Kesalahan penyimpanan media dan bahan baku

K. Akibat dari kesalahan pembuatan media 1. Terjadi kekeruhan atau pengendapan2. Warna terlalu gelap kadang-kadang media menjadi gosong3. Agar-agar terlalu lunak4. Pertumbuhan kuman yang jelek atau tidak tumbuh

FUNGSI PEPTON DAN NaCl :Pepton adalah hasil pemecahan protein sehingga bakteri sudah dipermudah, tidak usah mengeluarkan energi untuk memecahkan protein menjadi pepton. Pepton oleh bakteri akan diuraikan menjadi asam amino, kemudian diserap untuk digunakan sebagai sumber energi dan membangun sitoplasma. NaCl diperlukan untuk memberikan tekanan osmotik tertentu. Bila pembenihan dibuat tanpa NaCl ataupun dengan NaCl berkadar tinggi, pertumbuhan bakteri akan berkurang sampai terhenti. Air diperlukan untuk semua reaksi dalam makhluk hidup.

Isolasi dengan goresan (Streak plate method).Alat untuk isolasi dengan cara goresan ini ialah ose. Ose terbuat dari platina atau kawat dari nichrome, panjangnya kira-kira 5 cm. Ujungnya bulat dengan diameter 2-3 mm. Gagangnya dapat dibuat dari tembaga atau kuningan sebagai tempat pegangan. Setiap hendak mempergunakan ose harus dilidah apikan terlebih dahulu di atas nyala api Bunsen sampai membara, kemudian lakukan 3x di atas nyala. Jika sudah dipakai, dilidah apikan lagi seperti di atas. Janganlah meletakkan ose pada sembarang tempat, tetapi letakkanlah ose itu berdiri dengan gagangnya sebelah. Bahan-bahan yang ditanam dengan cara goresan, misalnya : darah, sediment urine, pus, sputum, cairan otak, dll. Sesudah ose dilidah-apikan, material diambil, kemudian dengan cepat ditanam pada perbenihan padat, misalnya : agar-pelat, Endo-agar, dll. Pertama-tama dibuat goresan pada permukaan media mulai dari kiri ke kanan (dari pinggir ke pinggir) sampai memenuhi pelat. Kemudian goresan-goresan selanjutnya menyilang goresan-goresan pertama tadi. Permukaan media tidak boleh luka karena goresan. Sesudah disimpan dalam inkubator, maka kita lihat tumbuhnya bakteri, banyak pada goresan-goresan pertama, makin lama makin berkurang. Pada goresan-goresan yang menyilang terdapat koloni-koloni bakteri yang terpisah (rein koloni), karena pada goresan-goresan ini sudah sedikit tempat bakteri. Cara lain ada juga dilakukan dengan goresan-goresan yang berliku-liku seperti zik-zak sampai memenuhi permukaan pelat. Cara ini keduanya baik, bergantung kepada pengalaman masing-masing. 1. Cara pengenceranCara pengenceran yaitu dengan mengencerkan misalnya 1 ose bakteri dengan air. Lalu hasil pengenceran tersebut diencerkan lagi dengan beberapa ketentuan. Hal ini bertujuan untuk mengurangi konsentrasi bakteri(Barazandeh,2008).Cara ini pertama-tama dilakukan oleh Lister dalam tahun 1865. Ia berhasil memiara murni Streptococcus lactis yang diisolasikannya dari susu yang sudah masam. Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Dan dari pengenceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita akan mendapatkan beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kita hanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat kita jadikan biakan murni. Kalau kita belum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel.2. Cara PenuanganCara ini pertama dilakukan oleh Robert Koch (1843 1905), yaitu dengan mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen. Adapun prosedur kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut : Siapkan cawan steril, tabung pengenceran yang akan ditanam dan media padat yang masih cair (>45oC),Teteskan 1 ml secara aseptis.suspensi sel kedalam cawan kosong,tuangkan media yang masih cair ke cawan kemudian putar cawan untuk menghomogenkan suspensi bakteri dan media, kemudian diinkubasi.3. Cara PenggoresanCara penggoresan bertujuan bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru. Isolasi bakteri dengan cara ini terbagi menjadi tiga yaitu :a. Goresan sinambungCara kerja : Ambil 1 ose suspensi bahan yang mengandung bakteri atau campuran bakteri secara aseptik,Sentuhkan ose pada media agar dan gores secara kontinyu sampai setengah permukaan agar,Jangan pijarkan ose, lalu putar cawan 180oC lanjutkan goresan sampai habis. Goresan sinambung umumnya digunakan bukan untuk mendapatkan koloni tunggal, melainkan untuk peremajaan ke cawan atau medium baru.

KEKERUHAN DAN GELEMBUNGMenurut Suriawiria (1985), kekeruhan yang terdapat pada tabung reaksi disebabkan karena adanya aktivitas dari suatu mikroorganisme. Kekeruhan yang terjadi pada tabung-tabung reaksi tersebut berbeda, ada yang mengalami kekeruhanpada bagian permukaannya saja dan juga ada yang mengalami kekeruhan merata pada seluruh media dan sampel. Kekeruhan yang terjadi merata pada media disebabkan karena adanya mikroorganisme anaerob fakultatif, yaitu mikroorganisme yang mampu hidup ataupun tumbuh dengan atau tanpa adanya oksigen. Kekeruhan yang terjadi pada permukaannya saja disebabkan karena adanya mikroorganisme aerob.Menurut Fardiaz (1992), Gelembung udara yang dihasilkan pada tabungdurham disebabkan oleh adanya aktivitas yang respirasi mikroorganisme, sehingga dapat dilihat hasil dari respirasi mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas.