TRONCO COMUN DIVISIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD. MODULO: ENERGIA Y CONSUMO DE SUSTANCIAS FUNDAMENTALES. PRACTICA No. 3 HIDRLISIS DEL ALMIDN POR AMILASA VEGETAL

OBJETIVO: Determinar la presencia de enzimas hidrolticas durante la germinacin por el mtodo colorimtrico tomado como factor el tiempo de actividad enzimtica.

GENERALIDADES: Investigacin bibliogrfica por parte de los estudiantes sobre cintica enzimtica de amilasa y factores que afectan la germinacin.

MATERIAL POR EQUIPO: 11 Tubos de ensaye (16 x 150) 1 Gradilla 4 Pipetas graduadas de 1 ml (plstico) 1 Pipeta de 5 o 10 ml 1 Vaso de Precipitado de 250 ml 1 Mechero 1 Soporte Universal con anillo 1 Embudo de plstico 1 Mortero de porcelana con pistilo 1 Vaso de precipitado 1 Pipeta de 1 ml. REACTIVOS: Solucin de glucosa al 1% Agua destilada Acido 3,5-Dinitrosalicilico (DNS) en frasco ambar.

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Solucin de Yodo (I2Kl en una solucin de HCl 0.05 N) en frasco ambar. Solucin de CaCl2 20 mM-NaCl 200 Mm Solucin de Almidn al 0.2 Solucin Buffer pH 5

APARATOS POR GRUPO: 1 Balanza Granataria 2 Espectrofotmetros 8 Celdas

LOS ALUMNOS DEBEN TRAER POR EQUIPO: 10-12 Semillas de maz (Zea mays) Frijol (Phaseolus vulgaris) de 7-8 das de germinacin. 1 plumn indeleble. Jabn y franela para limpiar Hielo 3 Sobres de gasa Masking tape Ligas.

METODO: 1. Pesar de 10 a 12 semillas germinadas de maz o frjol de 7 a 8 das de germinacin para la obtencin de la amilasa. 2. Moler las semillas en un mortero usando 3 ml de agua destilada por cada gramo de tejido. 3. Filtrar la molienda con ayuda del embudo y de dos capas de gasa. 4. Mantener el filtrado en un tubo de ensaye. Permitir que se sedimente y mantenerlo en un bao de hielo. 5. Diluya el filtrado 1:10 con solucin amortiguadora de acetato pH 5.0, seguir manteniendo en frio. 6. Prepare la mezcla de reaccin en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera:

Tubo AYB

Almidn 0.2% en buffer pH 5.0 4 ml

Solucin CaCl-NaCl 4 ml

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La parte de la prctica se realizar entre dos equipos, un equipo trabajar el ensayo A y otro equipo trabajar el ensayo B.

ENSAYO A 1. Prepare 10 tubos de ensaye (13 x 150) agregando a cada uno 1 ml de la solucin de yodo. 2. A un tubo agregar 3 ml de agua destilada, este servir para calibrar el espectrofotmetro al 100% de transmitancia o cero de absorbancia (densidad ptica). 3. El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; tome 1 ml del tubo de reaccin que contiene la enzima diluida, a cada uno de los tubos de la serie que contiene solucin de yodo. 4. Agitar 5. Agregar a cada tubo 2 ml de agua destilada y agitar. 6. Colocar en una celda y leer la absorbancia a 620 nm. 7. Graficar la absorbancia a 620 mn contra tiempo de reaccin, y correlacione con el cambio de color de la serie B.

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ENSAYO B 1. Prepare 10 tubos de ensaye (13x150) agregando a cada uno 1 ml de la solucin de DNS (cido 3,5 Dinitrosalicilico). 2. Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servir para calibrar 575 nm el espectrofotmetro a 100% de transmitancia o cero de absorbancia (densidad ptica) 3. Al primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; tome 1 ml del tubo que contiene la enzima diluida y agregue a cada uno de los tubos que contienen solucin de DNS. 4. Calentar los tubos durante 10 minutos a bao mara. 5. Agregar a cada tubo 8 ml de agua destilada y agitar, incluyendo al tubo para calibrar. 6. Enfriar los tubos en un vaso de precipitados con hielo y agua. 7. Tomar lectura de cada uno de los tubos (utilizando la celda), leer en absorbancia a 575 nm de cada tubo. 8. Graficar absorbancia contra tiempo de reaccin. 9. Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solucin de yodo.

METODO PARA ELABORAR LA CURVA DE CALIBRACIN CON GLUCOSA QUE SERVIRA COMO PATRN PARA HACER EL ANLISIS DE REGRESIN LINEAL, INCLUYENDO EL COEFICIENTE DE COORELACIN (r) Solucin Glucosa 0.1% Agua Destilada Reactivo DNS 1 0 1.0 1.0 2 0.1 0.9 1.0 3 0.2 0.8 1.0 4 0.4 0.6 1.0 5 0.6 0.4 1.0 6 0.8 0.2 1.0 7 1.0 0 1.0

BIBLIOGRAFIA: 1. Kaufman P.B., Labavitch J., Anderson-Prouty A., y Ghosheh N.S. (1975). Laboratory Experiments in Plant Physiology Laboratory Manual. Macmillan Publishing Co., Inc. Nueva York. 261 pp. 2. Ross C.W. (1974) Plant Physiology Laboratory Manual. Wadsworth Publishing Co.,Inc. Belmont. 200 pp. 3. Buchanan B.B., Gruissem W.Y., Jones R.L. (2001). Biochimestry and molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologists. Rockville. 1400 pp.

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CUESTIONARIO: 1. A que grupo pertenece la enzima amilasa vegetal? 2. Qu diferencia bioqumica existe entre glucosa y almidn, y cual relacin hay entre ellas? 3. Porqu aparece la enzima en el germinado de maz? 4. Cules son las condiciones que alteran el funcionamiento de las enzimas? 5. Cmo se distingue bioqumicamente la degradacin del almidn por amilasa y por fosforilasa? 6. Cul es la utilidad del coeficiente de correlacin en el anlisis de regresin para la elaboracin de la curva de calibracin?

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