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Prctica # 4 DDIIFFUUSSIINN YY SSMMOOSSIISS

I. Objetivos Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de:

* Calcular la tasa de difusin de un reactivo dado. * Describir el concepto de membrana permeable selectiva y explicar su papel en la smosis * Entender los conceptos de hipotnico, hipertnico e isotnico. * Discutir la influencia de la membrana celular sobre el comportamiento osmtico en las clulas. * Describir el mecanismo de difusin a nivel molecular. * Reconocer los procesos de difusin, smosis y dilisis en clulas vivas. * Explicar como la presin que ejercen las molculas favorece los procesos de la difusin y smosis * Identificar el efecto del tamao de la molcula y su polaridad sobre la permeabilidad de la membrana.

II. Introduccin Cualquiera que sea la organizacin especfica de un ser vivo, unicelular o pluricelular, procariota o eucariota, en sus clulas no puede faltar la membrana celular. La membrana celular es la estructura que separa al lquido intracelular (LIC) del extracelular (LEC). Est formada por dos compuestos orgnicos: los fosfolpidos y las protenas. Su estructura actual fue propuesta en 1972 por S. Singer y G. L. Nicholson. Su modelo se conoce con el nombre de mosaico fluido o mosaico de los lquidos. El modelo de mosaico fluido explica que la membrana plasmtica consiste en una bicapa lquida de molculas de fosfolpidos en donde estn incluidas las protenas.

Las protenas de la membrana celular permiten el paso del medio intracelular (LIC) al medio extracelular (LEC) y viceversa, de molculas pequeas ya sea en forma activa o pasiva, otras actan como receptoras de seales como por ejemplo de hormonas; otras actan como sitios de fijacin para enzimas solubles y para el citoesqueleto.

Es a travs de la membrana celular que se controla el transporte de materiales entre el lquido intracelular (LIC) y el lquido extracelular (LEC), dado que es selectiva y semipermeable, pues impide que algunas sustancias grandes como los lpidos y protenas la atraviesen fcilmente; pero permite el paso de azcares simples, oxgeno, dixido de carbono, agua, glicerol, urea y otras molculas. Este paso depende del tamao y carga de las molculas y de la composicin de la membrana celular. Este transporte celular puede ocurrir por procesos pasivos y activos.

Los transportes pasivos no requieren el aporte de energa celular (ATP), y las molculas se desplazan a favor de una gradiente de concentracin: la sustancia se desplaza del sitio de mayor al de menor concentracin. Entre los ejemplos estn la difusin, smosis y dilisis. La difusin es el movimiento de partculas (tomos, iones y molculas) de una regin de alta concentracin a otra de menor concentracin, puede ocurrir en presencia o no de una membrana celular.

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La smosis es un proceso que describe el movimiento del agua (solvente) a travs de la membrana celular desde una regin con menor concentracin de soluto (ms diluida) a una ms concentrada. Cuando una clula se sumerge en un lquido con diferente concentracin al del medio intracelular, la presin osmtica puede ocasionar cambios importante en el volumen de la clula (se entiende por presin osmtica la presin que sera necesaria para detener el flujo de agua a travs de la membrana semipermeable). De acuerdo con la presin osmtica, las soluciones extracelulares se dividen en isotnicas, hipotnicas e hipertnicas

En las soluciones isotnicas, la concentracin de solutos en el lquido intracelular es igual a la concentracin presente en el lquido extracelular, por lo que no se observa un movimiento neto de agua y soluto. En las soluciones hipotnicas, el lquido que rodea a la clula tiene menor concentracin de sustancias, ms volumen de agua y menor presin osmtica que el interior de la clula; por lo tanto, el agua difunde desde el exterior hacia el interior celular. Bajo stas condiciones, se observan los procesos de lisis y turgencia en clulas animales y vegetales, respectivamente.

En contraste, las soluciones hipertnicas tienen mayor concentracin de solutos, menor cantidad de agua y mayor presin osmtica que el LIC, esto provoca que el

agua pase del interior al exterior de la clula. En stos casos se observan los fenmenos de crenacin y plasmlisis en clulas animales y vegetales, respectivamente

El proceso de dilisis, se refiere a la separacin de mollculas de soluto en funcin de su tamao, utilizando una membrana con permeabilidad diferencial. Esta membrana tiene poros que permite el paso de molculas pequeas e impide el paso de molculas de mayor tamao, como globulinas, albumina, etc. Los conceptos de smosis y dilisis tienen diferenctes aplicaciones en el campo de la nutricin, biologa y medicina. Osmosis generalmente explica fenmenos naturales tales como la apertura/cierre de los estomas en las hojas que permite controlar la evaporacin en las plantas; las diferencias adaptativas que se observan entre peces marinos y dulceaqucolas, o cmo los productos de desechos son eleiminados del torrente sanguneo. Dilisis es un proceso frecuntemente en el tratamiento a pacientes con fallo renal. La sangre arterial del paciente alimenta a una mquina que contiene un tubo de dilisis que acta como una membrana de permabilidad diferencial. Alrededor de ste tubo se localiza una solucin isotnica con respeto a todo los componentes que permanecen en el flujo sanguneo (sin los desechos). Esta solucin isotnica, regresa entonces al paciente.

III. Procedimiento Durante la sesin de laboratorio se realizarn cinco (5) experimentos donde se estudiaran distintos aspectos del transporte de solutos y agua a travs de membranas. Para lograr ste objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesin de laboratorio, realizarn y analizarn un experimento, de acuerdo a las indicaciones del instructor.

Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se renen para hacer una discusin de los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir sus resultados.

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Experimento 1 Determinacin de la tasa de difusin de solutos

Los distintos solutos se mueven en el interior celular y en los espacios intercelulares a travs del proceso de difusin. Sin embargo, la tasa de difusin (la distancia que recorre el soluto en un tiempo determinado) es afectada por mltiples factores. El siguiente experimento demuestra el efecto del tamao molecular o la concentracin en la tasa de difusin sobre un sustrato comn (agar). En este experimento el agar es utilizado como sustrato permeable y por lo tanto simula el espacio citoplasmtico, no una membrana. Para calcular la tasa de difusin utilizaremos la siguiente ecuacin:

Tasa de difusin = distancia (mm,cm)/ tiempo (seg,min,hrs)

1. Describa brevemente su hiptesis de trabajo y prediga sus resultados 2. En su mesn de trabajo encontrar una caja de Petri que contiene una capa fina (matriz) de gelatina clara

solidificada o agar (2%).

3. Verifique que su placa cuenta con 3 pozos pequeos, de lo contrario proceda a perforar 3 pozos en la superficie de la matriz.

4. Agregue una gota de uno de los colorantes disponible a uno de los pozos (evite la formacin de burbujas y el derrame de la sustancia). A partir de este momento (tiempo 0) se iniciar la toma de datos.

5. Repita el procedimiento para cada colorante (una gota de colorante para cada pozo). 6. Transfiera cuidadosamente la caja de Petri sobre una hoja blanca, evitando hacer movimientos bruscos. 7. Durante 30 minutos, mida la distancia que recorre cada colorante cada 2 minutos, colocando una regla

transparente sobre cada pozo.

8. Al finalizar los 30 minutos, mida la distancia recorrida cada 5 min, hasta completar 40 min 9. Haga una grfica donde se represente la distancia recorrida por cada colorante en funcin del tiempo

transcurrido. Calcule la tasa de difusin de cada soluto como la pendiente de la curva.

10. Responda las preguntas especificadas en su reporte.

Experimento 2 Simulacin del proceso de smosis

1. Colecte 6 bolsas de dilisis que contienen agua destilada (dH2O) y sacarosa a distintas concentraciones (0.2M, 0.4M, 0.6M, 0.8M y 1.0M). Tenga cuidado de identificarlas correctamente y no mezclarlas.

2. Lave cuidadosamente cada bolsa con dH2O y seque el exceso de solucin utilizando papel absorbente con cuidado.

3. Pese cada una de las bolsas de dilisis en una balanza y anote el peso en un cuadro elaborado para dicho fin, utilice al menos 2 decimales.

4. Coloque cada bolsa de dilisis en un envase con dH2O y espere 1 hora. 5. Mientras espera, disee una hiptesis experimental y prediga el resultado.

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6. Retire las bolsas de dilisis y pselas nuevamente. Recuerde secar el exceso de solucin en la superficie externa de la bolsa antes de pesar. Verifique que al finalizar sus medidas el rea de pesado se encuentre seca y ordenada.

7. Calcule la diferencia en pesos antes y despus de 1h y determine el porcentaje de cambio en el peso de la bolsa de dilisis.

%cambio peso = (Peso final-Peso inicial)/Peso inicial x 100 8. Responda las preguntas especificadas en su reporte.

Experimento 3 Efecto de la presin osmtica sobre las clulas

(A) Clulas vegetales

1. Sobre un portaobjetos coloque una gota de solucin de NaCl 0.9% (isotnica) y un fragmento de epidermis de cebolla u hoja de Elodea. Cubra y observe al microscopio.

2. Haga un dibujo de la preparacin (rotule las estructuras observadas). Describa la apariencia de las clulas que observa en trminos de distribucin de los cloroplastos y estado de la vacuola.

3. Retire la preparacin del microscopio y agregue una gota de solucin de NaCl 5% (hipertnica) en uno de los bordes del cubreobjetos. En el lado opuesto coloque un pedacito de papel absorbente para permitir que la solucin hipertnica quede en contacto con las clulas. Observe al microscopio, enfocando la parte de la muestra que ha estado en mayor contacto con la disolucin.

4. Haga un dibujo de la preparacin que ilustre los cambios observados en la apariencia de las clulas en esta condicin experimental. Rotule las estructuras observadas.

5. En la misma preparacin, reemplace la solucin hipertnica por agua destilada siguiendo el mismo procedimiento anterior. Observe al microscopio y explique los cambios que ocurren.

6. Haga un dibujo de la preparacin que ilustre los cambios observados en esta condicin experimental. Rotule las estructuras observadas. En todos los casos recuerde anotar el aumento de la muestra.

7. Complete las preguntas del reporte

(B) Clulas animales 1. Tome un algodn con alcohol y limpie la zona de la yema del dedo ndice de un compaero. 2. Con una lanceta punce el rea y oprima el dedo para sacar tres gotas de sangre y colquelas en un

tubo de ensayo pequeo

3. Agregue 0.5 ml de 0,95 % NaCl y mantenga la preparacin en fro 4. Ponga media gota de la solucin de sangre sobre un portaobjetos, cbrala con cubreobjetos y observe

en 40X la forma de los eritrocitos. Mida el dimetro de clulas diferentes unas 10 veces en esta solucin. Calcule el promedio y la desviacin estndar de sus datos

5. En otro portaobjeto, coloque media gota de la solucin de sangre y agregue con una pipeta o gotero media gota de la solucin 0.1M sacarosa y coloque el cubreobjetos. Observe el comportamiento de los eritrocitos. Mida el dimetro de 10 clulas diferentes. Calcule el promedio y la desviacin estndar de sus datos

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6. En otro portaobjeto. coloque media gota de la solucin de sangre y agregue con una pipeta o gotero media gota de la solucin 0.3M sacarosa y coloque el cubreobjetos. Observe el comportamiento de los eritrocitos en sta solucin. Mida el dimetro de 10 clulas diferentes. Calcule el promedio y la desviacin estndar de sus datos

7. Finalmente, coloque en otro portaobjeto, media gota de la solucin de sangre y agregue con una pipeta o gotero media gota de la solucin 0.6M y cubra con un cubreobjetos Observe el comportamiento de los eritrocitos en sta solucin. Mida el dimetro de 10 clulas diferentes. Calcule el promedio y la desviacin estndar de sus datos.

8. Complete las preguntas del reporte.

Experimento 4 Factores que afectan la oermeabilidad de la membrana.

El mecanismo mediante el cual un soluto presente entra a la clula desde el medio extracelular depende de la polaridad del soluto y de su tamao molecular, entre otros factores. Solutos no polares pasan directamente a travs de la membrana plasmtica. Dentro de un grupo de compuestos qumicamente relacionados (compuestos no polares) aquellos con mayor solubilidad en lpidos pueden entrar a la clula ms rpidamente que aquellos compuestos similares pero con baja solubilidad en lpidos.

En este experimento se observar el efecto del tamao molecular y la polaridad de un solvente en el grado de permeabilidad de la membrana. Para ello utilizaremos cubos o cilindros de remolacha (Beta vulgaris) cuyas clulas contienen una gran cantidad de pigmento rojo denominado betanas. Cuando ocurre alguna ruptura mecnica o qumica de la membrana plasmtica, el pigmento es liberado. Como agentes disruptores de la membrana, utilizaremos distintos alcoholes que dependiendo de su estructura molecular, poseen diferentes grados de solubilidad en lpidos y tamao molecular.

Como un ndice del grado de solubilidad lipdica utilizaremos el coeficiente de particin que mide la afinidad relativa de la sustancia en un solvente orgnico y grasa (octanol) en funcin de la solubilidad en agua. Mientras mayor es su valor, mayor es la solubilidad en octanol y solventes grasos, y por lo tanto, menor es la polaridad.

1. Plantee una hiptesis de trabajo y su respectiva prediccin. 2. Corte cubos o cilindros de remolacha, de aproximadamente el mismo tamao, de lo contrario, solamente

tome algunos cubos de tamaos similares. Lvelos muy bien con una solucin de 0.9% NaCl, de forma de eliminar cualquier remanente de antocianina presente debido a dao mecnico.

3. Limpie los muestras de remolacha cuidadosamente con papel toalla. 4. Prepare 6 tubos de ensayos limpios y secos. Dispense las siguientes soluciones:

Concentracin y Nombre del alcohol

Coeficiente de Particin

22 M Alcohol Metilico (32.04 g/mol)

0.01

8.5 M Alcohol Etlico (46.07 g/mol)

0.03

3 M Alcohol Proplico (60.09 g/mol)

0.13

1.1 M Isobutl Alcohol (74,12 g/mol)

0.18

1.1 M n Butl Alcohol (74,12 g/mol)

0.58

0.38 M Amil-alcohol (88.15 g/mol)

2.00

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Tubo Contenido 1 2ml de alcohol metlico (22 M)d 2 2 ml de alcohol etlico (8.5 M) 3 2 ml de alcohol proplico (3 M) 4 2 ml de alcohol butlico (1.1 M) 5 2 ml de amil-alcohol (0.38 M)

5. Coloque un trozo de remolacha en cada tubo de ensayo. Anote el tiempo exacto en que se ha agregado a cada cubo, este corresponde al tiempo 0. Evite cualquier perturbacin mecnica de los tubos y observe detenidamente cada tubo de ensayo, esperando la liberacin de pigmentos.

6. Registre el tiempo requerido para la liberacin de la antocianina en cada tubo de ensayo. Anote ste valor en la columna tiempo en su hoja de datos.

7. Calcule el coeficiente de penetracin para cada alcohol, dividiendo el tiempo (en minutos) entre su concentracin.

8. Haga una grfica que correlacione el coeficiente de penetracin en funcin del coeficiente de particin para cada alcohol (ver cuadro al inicio).

Experimento 5 Observacin del proceso de dilisis

En vertebrados, los rinones tienen como function remover los compuestos txicos productos del metabolismo (urea, c. rico, creatinina, potasio, H+ entre otros), eliminar el exceso de agua corporales y mantener el balance de iones tales como potasio y sodio . Cuando se genera un fallo en la funcin renal, se observa acumulacin de desechos txicos, aumenta la presin sangunea y el volumen sanguneo.

En Costa Rica, a provincia de Guanacaste ha alcanzado la cifra de 112.9 por cada 100 mil habitantes de la poblacin padece de insuficiencia renal, una enfermedad en donde la funcin del rinon decae hasta valores entre 10-15%. En stos casos, los pacientes requieren de dilisis o transplante de rgano.

En la hemodilisis, la sangre del paciente fluye lentamente a travs de un filtro especial que remueve los desechos y el exceso de fludo y, posterioremente, regresa al

paciente (ver figura)

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En el siguiente experimento se simular el proceso de hemodilisis utilizando sangre artificial, que se separa de la solucin de dialisado, a travs de una membrana con permeabilidad selectiva

1. Dispense en un becker, 200 ml de una solucin 0.9% NaCl. Esta solucin representa el dialisado (ver figura).

2. Tome muestras pequeas del dialisado y determine la presencia de protenas, azcar, almidn, con los reactivos apropiados (recuerde los experimentos realizados en la prctica #3).

3. Obtenga 10 ml de de sangre artificial (ya preparada). Tome muestras pequeas de la sangre articial y determine tambin la presencia de protenas, azcar, almidn y el valor de pH.

4. Tome la bolsa de dilisis y ate fuertemente con un cordn, uno de los extremos del tubo de dilisis. 5. Con mucho cuidado vierta la sangre artificial en la bolsa de dilisis. Cierre la bolsa haciendo un nudo en

el otro extremo.

6. Lave cuidadosamente la cubierta externa de la bolsa con dH2O y seque el exceso de agua de utilizando papel absorbente.

7. Pese la bolsa de dilisis y registre ste valor. 8. Colquela bolsa de dilisis dentro del beaker con el

dialisado de forma que quede completamente cubierta. Anote el tiempo.

9. Disee una hiptesis de trabajo y una prediccin de sus resultados. Disee el experimento control apropiado.

10. Despus de 45 minutos, retire cuidadosamente la bolsa del beaker y colquela en un recipiente seco y limpio. Observe y registre cualquier cambio en la coloracin de la solucin contenida en la bolsa de dilisis y en el dialisado.

11. Seque con una toalla el exceso de solucin en el exterior y pese la bolsa de dilisis. Calcule el porcentaje de cambio en el peso de la bolsa de dilisis.

12. Tome muestras pequeas del dialisado y de la sangre artificial y determine la presencia de protenas, azcar, almidn, con los reactivos apropiados. Mida el pH en ambas soluciones.

13. Registre sus datos en el cuadro correspondiente en el reporte. 14. Con base en sus resultados, conteste las preguntas especificadas en el reporte.

+ Lugol