Polymorphisme des gènes hrpII et pldh chez Plasmodium
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Raymond TABUEEntomologiste MédicalPNLP Cameroun
Elisabeth RAVAOARISOAInstitut Pasteur de Madagascar
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
EVALUATION
par les FACILITATEURS
Raymond TABUEEntomologiste MédicalPNLP Cameroun
Elisabeth RAVAOARISOAInstitut Pasteur de Madagascar
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
EVALUATION
par les FACILITATEURS
Du gène à la protéine
Histidine Rich Protein II (HRP-II) Expression Séquence
Plasmodium Lactate Deshydrogenase (pLDH) Expression Séquence
Polymorphisme intra-spécifique de HRP-II
Polymorphisme inter-spécifique de pLDH
Conclusion
Mots clés: Gène, polymorphisme, HRP-II, pLDH, diagnostic, espèce
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Gène: Un gène est une séquence d‘Acide DésoxyriboNucléique (ADN) qui spécifie la synthèse d'une chaîne de polypeptide
ADN ARNm ProtéineTranscription Traduction
Inactivation de la protéine
Augmentation de l’efficacité de la protéine
ADN
Mutation (Insertion,Délétion,Substitution)
Phase de lecture respectéeDécalage de phase de lecture
Mutation silencieuse Mutation non silencieuse
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Utilisation fréquente de HRP-II et pLDH en Test de Diagnostic Rapide (TDR) du paludisme:
Immunocapture des antigènes circulantsSystème anticorps capture- révélation
TDR d’une grande utilité dans la prise en charge du paludisme dans les zones rurales sans microscopie.
Polymorphisme des antigènes cibles affecte la sensibilité des tests?
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Expression (Howard J. 1986, Mayxay M. 2001) : Spécifique de Plasmodium falciparumProtéine abondanteExpression à tous les stades asexuésDemi-vie élevée (environ 10 jours)
Séquence (N° accession Swiss-Prot: sp|P05227|HRP1_PLAFA ):
Poids moléculaire 72 Kda35% Histidine, 40% Alanine et 12% Aspartate
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Expression (Makler M.T. et al. 1998, Berwal R. et al. 2008):Pan- spécifiqueEnzyme abondanteDemi-vie courte (2,5 jours environ)
SéquenceLDH présent chez l’hommepLDH diffère de la LDH humaine: épitope unique, utilisation cofacteur APAD (Pyridine Adénine Dinucléotide)296-310 acides aminés selon l’espèce plasmodialeRégion C-terminale très conservée.
N d’accession Swiss-ProtQ76NM3|Q76NM3_PLAF7 P. falciparumQ6JH30|Q6JH30_PLAVI P. vivaxQ6JH31|Q6JH31_PLAMA P. malariaeQ6JH32|Q6JH32_9APIC P. ovale
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Evidence 1: Baker J. et al. 2005
Collecte de 75 échantillons provenant de 19 pays.Extraction, amplification et génotypage, évaluation du nombre 14 séquences répétitives de Pf HRP-IIEtude comparative avec les TDR actuels
Le nombre des répétitions affecte la sensibilité des tests basés avec HRP-IIDiversité génétique varie d’une région à une autre
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Evidence 2: Lee N. et al. 2006
46 échantillons provenant de 4 pays, 8 souches de P. falciparum
Evaluation de 4 anticorps monoclonaux
Extraction d’antigène des isolats (analyse par Dot et Western blot, épitope mapping par ELISA)
Substitution au niveau des épitopes, diminution de la reconnaissance des anticorps
La fréquence des épitopes diffère d’un pays à un autre
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
F1:Séquence de réference FCCI/HNF:Seuence des isolats P. falciparumM:Sequence des isolats de P. .malariaeO1:Séquence des isolats de P. ovaleO2 et O3: Séquences des isolats de P. ovaleV: Séquence de la souche de référence de P. vivaxY: Séquence de la souche de référence de P. bergheiC: Séquence de la souche de référence de P. chabaudi
Collection des 8 espèces plasmodiales de part le monde
Extraction, amplification, Nested-PCR et génotypage
Variabilité intra-spécifique n’affecte pas l’efficacité des TDR pan-spécifiques
Evidence: Talman A. et al. 2007
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Polymorphisme HRP-II: faux-négatifs Criblage des régions conservées, épitopes universellement connus,
synthèse d’anticorps monoclonaux spécifiques à ces épitopes Ou utilisation d’anticorps monoclonaux qui ne sont pas affectés
par la variation génétique Combinaison des anticorps reconnaissant différents épitopes
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
pLDH très conservée et élimination rapide
Couplage avec HRP-II pour une meilleure sensibilité
Développement d’une nouvelle génération de TDR basé sur pLDH spécifique de P. vivax couplé avec pLDH spécifique de P. falciparum
Fiabilité du diagnostic différentiel?Epitope(s) cible(s)?Zone géographique cible?
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Il en ressort que le polymorphisme est l’un des facteurs contribuant à la sensibilité des test, il est donc nécessaire de:
- Développer des tests de TDR sensibles à toutes les régions- Améliorer la bonne stabilité des TDR à la température- Améliorer les bonnes pratiques de laboratoire
Avec le programme de lutte visant l’élimination du paludisme (P. falciparum), il convient de:
- Développer des tests différentiels de P. vivax (meilleure prise en charge, limitation des résistances et diminution du risque de recrudescence à P. vivax )
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009
Baker J. et al. Genetic diversity of P. falciparum Histidine Rich Protein –II (PfHRP-II) and its effect on the performance of PfHRP-II based RapidDiagnostic Test. The Journal of infectious diseases 2005,192: 870-877.
Berwal R. et al. Plasmodium falciparum: Enchanced soluble expression, purification and biochemical characterization of lactate dehydrogenase. Experimental Parasitology 2008, 120: 135-141.
Howard J.R. et al. Secretion of a Malarial Histidine Rich Protein (PfHRP-II) from P. falciparum infected erythrocytes. The Journal of Cell Biology 1986, 103: 1269-1277.
Makler M.T. et al. Lactate dehydrogenase and the diagnosis of malaria. Parasitology Today 1998, 14: 376-377.
Mayxay M. et al. Persistence of Plasmodium falciparum HRP-2 in successfully treated acute falciparum malaria Transactions of The Royal Society Of Tropical Medicine And Hygiene 2001, 9 5: 179-182.
Lee N. et al. Effect of sequence variation in P. falciparum Histidine Rich ProteinII on binding of specific monoclonal antibodies: implication of Rapid Diagnostic Tests for Malaria. Journal of Clinical Microbiology 2006, 2773-2778.
Talman A.M. et al. Evaluation of the intra-and inter-specific genetic variabilityof Plasmodium Lactate déhydrogenase. Malaria Journal 2007, 6: 140-146.
27/03/2009Atelier paludisme 7è édition 2009