POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW · ENTEROKRWOTOCZNE SZCZEPY EschErichiA coLi (EHEC) I...

Punktacja za publikację naukową wg MNiSW: 13.00 (2010)Index Copernicus ICV = 9,00 (2010)Impact Factor ISI = 0,108 (2010)

http://www.pm.microbiology.pl

Kwartalnik

Tom 50

Zeszyt 2•2011KWIECIE¡ – CZERWIEC

CODEN:

PMKMAV 50 (2)

2011

Advances in Microbiology

POLSKIE TOWARZ YST WO MIKROBIOLOGÓW

Kwartalnik

Tom 50

Zeszyt 3•2011LIPIEC – WRZESIE¡

CODEN:

PMKMAV 50 (3)

2011



Kwartalnik

Tom 50

Zeszyt 4•2011PAèDZIERNIK – GRUDZIE¡

CODEN:

PMKMAV 50 (4)

2011



RADA REDAKCYJNA

JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski),JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), DANUTA DZIERŻANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka),

EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski),WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny),ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski),

ANTONI RÓŻALSKI (Uniwersytet Łódzki), ALEKSANDRA SKŁODOWSKA (Uniwersytet Warszawski),BOHDAN STAROŚCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUSŁAW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdański),

ELŻBIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii),STANISŁAWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Państwowy Zakład Higieny),

GRZEGORZ WĘGRZYN (Uniwersytet Gdański), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski)

REDAKCJA

JERZY HREBENDA (redaktor naczelny), JACEK BIELECKI (zastępca),BOHDAN STAROŚCIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich)

ADRESY REDAKCJI

Redaktorzy:

Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawskiul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa, tel. (22) 554 13 05/304, fax (22) 554 14 04

e-mail: [email protected]; [email protected]

Sekretarz

Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medycznyul. Oczki 3 (parter), 02-007 Warszawa, tel. (22) 628 08 22, (22) 621 13 51

e-mail: [email protected]

PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY

Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie)

Adres Redaktora działu Publikacje Metodyczne i Standardy

Katedra i Zakład Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej, Al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin,tel./fax: (91) 46 616 51, 52, lub fax: (91) 46 616 59, e-mail: [email protected] lub [email protected]

STALI RECENZENCI:

JERZY DŁUGOŃSKI (Uniwersytet Łódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków),JÓZEF KUR (Politechnika Gdańska), EUGENIUSZ MAŁAFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki),

ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wrocławiu)

CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOWĄ POMOCĄMINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WYŻSZEGO

ISBN 978 - 83 - 923731 - 3 - 1

Informacja o zdjęciu na okładce:

Komórki Bacillus subtilis (BR-1-S) wnikające do komórki linii Int 407Fotografia: J. Wiśniewski – Zakład Mikrobiologii Stosowanej

Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego

P O L S K I E T O W A R Z Y S T W O M I K R O B I O L O G Ó W

Nakład 1150, Objętość 11 arkuszy wyd., Papier offser 80 g

Skład i druk: Zakład Wyd. Letter Quality, tel. 22 631 45 18, 607 217 879,e-mail: [email protected]; projekt okładki: Jerzy Grzegorkiewicz

POST. MIKROBIOL.,2011, 50, 3, 175–190http://www.pm.microbiology.pl

1. Wstęp

Mimo iż większość szczepów Escherichia coli to bak-terie występujące w jelicie człowieka jako komensale, występują wśród nich również szczepy patogenne dla ludzi. Przykładem są enterokrwotoczne E. coli (EHEC), powodujące krwawe biegunki, ze stosunkowo często występującymi poważnymi powikłaniami, jak np. zespół hemolityczno-mocznicowy [98]. Zakażenia szczepami EHEC mają najczęściej charakter lokalnych epidemii, czego przykładem były niedawne liczne infekcje, które miały miejsce w Niemczech i które doprowadziły do kilkudziesięciu zgonów zakażonych osób [71].

Szczepy EHEC produkują różnorodne czynniki infekcyjne, niemniej jednak najgroźniejszymi z nich są toksyny Shiga. To właśnie działanie tych toksyn powo-duje najpoważniejsze powikłania związane z infekcjami

tymi bakteriami [62]. W przeciwieństwie do wielu innych czynników infekcyjnych, toksyny Shiga kodo-wane są nie w chromosomie bakterii, ale w genomie bak-teriofagów występujących w szczepach EHEC w postaci profagów [41]. W związku z powyższym efektywna ekspresja tych genów (zwanych stx) następuje dopiero po indukcji profaga i rozpoczęcia przez bakteriofaga rozwoju litycznego. Związana z tym masowa produk-cja to ksyn Shiga oraz ich uwolnienie po spowodowanej przez faga lizie komórki bakteryjnej skutkuje ich specy-ficznym działaniem na komórki ludzkie, wywołującym charakterystyczne objawy chorobowe.

W tym artykule podsumujemy aktualną wiedzę o szczepach EHEC i bakteriofagach kodujących toksyny Shiga oraz przedyskutujemy problemy związane z potencjalnym zapobieganiem zakażeniom i ich efektom oraz leczeniem, w przypadku gdy do zakażenia doszło.

EntErokrWotocznE szczEpy EschErIchIa colI (EHEc)i baktEriofagi kodującE toksyny sHiga

joanna Monika Łoś1*, grzegorz Węgrzyn1

1 Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk

Wpłynęło w czerwcu 2011

1. Wstęp. 2. Bakteriofagi niosące geny toksyn Shiga – ogólna charakterystyka. 3. Bakteriofagi lambdoidalne. 4. Bakteriofag λ. 4.1. Adsorpcja i injekcja DNA. 4.2. Faza decyzji „liza czy lizogenia”. 4.3. Rozwój lizogeniczny. 4.4. Indukcja. 4.5. Rozwój lityczny. 5. Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC). 6. Toksyny Shiga. 7. Indukcja profagów niosących geny toksyn Shiga. 8. Rola represora CI i miejsc operatorowych fagów kodujących toksyny Shiga. 9. Podsumowanie

Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli (EHEc) and shiga toxin-encoding bacteriophages

Abstract: Escherichia coli is a bacterium naturally present in the mammalian intestine, occupying this habitat as a commensale. Most E. coli strains are lysogenic and the prophage status usually does not changes their relations with the host. However, some strains of this bacterium, including enterohemorrhagic E. coli (EHEC), carry virulence genes, and thus are capable of causing disease in humans. Infection of humans by these strains causes hemorrhagic colitis and may result in hemolytic-uremic syndrome, a severe complication, which can be fatal. The major virulence factors of EHEC are Shiga toxins, encoded by genes located on genomes of lambdoid prophages. Effective production and release of these toxins depend mostly on the induction of Shiga toxin-converting prophages. Many antibiotics used to treat bacterial infections stimulate induction of Shiga toxin-converting prophages, enhancing severity of the disease symptoms. Hence, treatment with antibiotics is restricted if infection with EHEC is confirmed or even suspected, which causes serious therapeutic problems. In this light, understanding the mechanisms of prophage induction and regulation of development of lambdoid phages in human intestine is important to facilitate the discovery of procedures preventing or alleviating Shiga toxin-caused diseases. In this article, we present an overview of EHEC and Shiga toxin-converting phages, providing also the background for molecular biology of lambdoid bacteriophages (which is important to understand mechanisms of control of development of phages carrying Shiga toxin genes) and discussing recently published reports in this field.

1. Introduction. 2. Bacteriophages carrying Shiga toxin genes – general characteristics. 3. Lambdoid bacteriophages. 4. Bacteriophage λ. 4.1. DNA adsorption and injection. 4.2. Decision phase: “lysis or lysogeny”. 4.3. Lysogenic development. 4.4. Prophage induction. 4.5. Lytic development. 5. Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli (EHEC). 6. Shiga toxins. 7. Induction of prophages carrying )Shiga toxin genes. 8. Role of the CI repressor and operator sites of Shiga toxin-encoding bacteriophages. 9. Concluding remarks

słowa kluczowe: bakteriofagi lambdoidalne, enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli, indukcja profagakey words: Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli, lambdoid bacteriophages, prophage induction.

* Autor korespondencyjny: Katedra Biologii Molekularnej, Uniwersytet Gdański, ul. Kładki 24, 80-822 Gdańsk; tel. (58) 523 6387; fax: (58) 523 5501; e-mail: [email protected]

176 JOANNA MONIKA ŁOŚ, GRZEGORZ WĘGRZYN

2. bakteriofagi niosące geny toksyn shiga – ogólna charakterystyka

Bakteriofagi przenoszące geny toksyn Shiga zostały zidentyfikowane w 1983 roku. Genomy tych bakte-riofagów stanowi dwuniciowy, liniowy DNA o dłu- gości od około 40 do 70 tysięcy par zasad (kpz) [73]. Na podstawie ich budowy morfologicznej można wyróż-nić kilka typów. Jedne są zbudowane z ikozaedralnej główki i krótkiego cienkiego ogonka np. 933W i φ24B [3]. Inne składają się z wydłużonej ikozaedralnej główki oraz długiego, cienkiego ogonka np. H-19B [81] i 2851 [83]. Mogą też posiadać ikozaedralną główkę i gruby, długi ogonek np. φP27 [51]. Fagi z krótkim ogonkiem wykorzystują do adsorpcji białko YaeT. Jest to białko zewnętrznej błony, szeroko rozpowszechnione i konser-wowane ewolucyjnie u bakterii Gram-ujemnych. Fagi z długimi ogonkami adsorbują się zwykle na ligandach powierzchniowych, takich jak OmpC [81].

Bakteriofagi przenoszące geny toksyn Shiga należą do fagów lambdoidalnych, których genom zbudowany jest w podobny sposób jak u faga λ (Rys. 1). Składa się on z bloków genów, kodujących białka odpowiedzialne za konkretne funkcje. Skutkiem tego jest to, że genomy fagów lambdoidalnych wykazują mozaikowatą budowę

gdyż często dochodzi pomiędzy nimi do rekombinacji i wymiany genów [35]. Mimo podobieństw w morfo-logii i strukturze genomu mają zróżnicowaną sekwencję nukleotydową [14]. Poza kodowaniem toksyny Shiga, część z tych fagów koduje również kinazę serynowo--treoninową oraz zawiera geny dla rzadkich tRNA izoleucyny i argininy, które to aminokway znajdują się w toksynie oraz we wspomnianej wcześniej kinazie [63]. Bakteriofagi te są zdolne do infekcji i lizogeniza-cji laboratoryjnych [1] oraz pochodzących z ludzkiego jelita szczepów E. coli zarówno niepatogennych jak i patogennych, również tych posiadających już profaga kodującego toksynę Shiga. Powstałe w ten sposób lizo-geny są zdolne do produkcji toksyn oraz infekcyjnych cząstek fagowych. Powoduje to rozprzestrzenianie się genów toksyn wśród innych szczepów E. coli oraz innych szczepów z rodziny Enterobacteriaceae [72]. Fagi te w podobny sposób powodują transdukcję genów to k-sy ny Shiga również u zwierząt [15]. Wydaje się że jedy-nym możliwym ograniczeniem w rozprzestrzenianiu się tych fagów w jelitach ssaków jest brak odpowiedniego gospodarza, wrażliwego na danego faga [75]. Kolejnym ważnym czynnikiem umożliwiającym rozprzestrzenia-nie się genów tych toksyn, jak i innych genów są defek-tywne profagi. Okazuje się, że część z nich, po zakaże-niu komórki innym fagiem indukuje się i jest uwalniana z komórki bakteryjnej jako DNA mogące transformo-wać inne bakterie. Stanowią więc one ważne elementy genetyczne o dużej zdolności do rozprzestrzeniania się wśród komórek bakteryjnych [5].

Ponieważ – jak wspomniano powyżej – bakteriofagi niosące geny toksyn Shiga należą do rodziny fagów lambdoidalnych, poniżej omówione zostaną pokrótce mecha-nizmy kontroli rozwoju faga λ, najlepiej poznanego człon- ka tej rodziny. Poznanie bowiem tych mechanizmów jest kluczowe dla zrozumienia specyfiki regulacji zarówno procesów zachodzących podczas rozwoju fagów niosą-cych geny toksyn Shiga jak i produkcji tych toksyn.

3. bakteriofagi lambdoidalne

Cechą charakterystyczną wszystkich fagów lambdo-idalnych jest podobna organizacja genomu. Zbudowany jest on z bloków genów, z których każdy odpowiada za poszczególne funkcje np.: blok genów regulacyjnych, replikacyjnych czy strukturalnych. Powoduje to, że geny odpowiedzialne za poszczególne procesy mają podobną lokalizację w genomie np.: gen represora cI jest położony zawsze pomiędzy promotorami pL i pR. Kolejną cechą tych fagów jest to, że geny znajdują się pod kontrolą podobnie działających promotorów oraz są regulowane przez podobne procesy jak np.: antyterminacja trans-krypcji. Również powstające białka wykazują podobień-stwo w funkcji, np. żaden z fagów lambdoidalnych nie

Rys. 1. Uproszczona mapa genomu bakteriofaga λ i plazmidów od niego pochodzących. Zaznaczone są rejony genomu kodujące białka pełniące funkcje w poszczególnych procesach zachodzących podczas rozwoju bakteriofaga (tworzenie główki i ogonka, rekom-binacja, replikacja, regulacja ekspresji genów, liza komórki gospo-darza). Strzałkami zaznaczone są główne transkrypty, a poprzeczne

linie oznaczają położenie głównych terminatorów transkrypcji

ENTEROKRWOTOCZNE SZCZEPY EschErichiA coLi (EHEC) I BAKTERIOFAGI KODUJĄCE TOKSYNY SHIGA 177

koduje własnej polimerazy, ale każdy ma swoje białka antyterminatorowe [12]. Dzięki takiej budowie genomu łatwo dochodzi do wymiany poszczególnych modułów genów pomiędzy fagami lambdoidalnymi. Proces ten zachodzi poprzez horyzontalny transfer genów, który może nastąpić albo w procesie homologicznej rekom-binacji, dzięki krótkim sekwencjom homologicznym znajdującym się na granicy genów, albo rekombinacji niehomologicznej, w przypadkowym miejscu w geno-mie. Niehomologiczna rekombinacja może prowadzić do uszkodzenia regionów kodujących, co z kolei może powodować eliminację takiego faga z naturalnego śro-dowiska. W związku z tym pozostaną tylko te, które w wyniku takiej rekombinacji nie mają uszkodzonych żadnych istotnych genów [10]. Skutkiem tych procesów jest powstanie bakteriofaga o genomie, który składa się z bloków genów pochodzących od różnych fagów, czyli charakteryzuje się mozaikowatą budową genomu np.: geny strukturalne faga λ mają inną zawartość par GC niż geny regulacyjne, co może świadczyć o tym, że pocho-dzą z innego źródła [13].

Bakteriofagi posiadają również dodatkowe elementy genetyczne nazwane w literaturze anglojęzycznej „mo- ron” (od ang. more – więcej), ponieważ zwiększają one ilość DNA w genomie faga. Są to geny, pochodzące z zewnętrznego źródła, nie związane z funkcją sąsia-dujących genów, posiadające własny promotor i ter-minator. Mogą dawać korzyść gospodarzowi lub być wykorzys tane w czasie rozwoju faga [29]. Do wymiany tych elementów genetycznych pomiędzy bakteriofagami może dojść, gdy tę samą bakterię atakują różne fagi, lub gdy w zaatakowanej bakterii znajdują się profagi [28]. W genomach niektórych bakterii, np. enterokrwotocz-nych E. coli (EHEC), może być nawet do kilkunastu pro-fagów lambdoidalnych, co prowadzi do łatwej rekombi-nacji z genomem infekującego faga. Niektóre profagi są defektywne, a ich geny mogą być wykorzystywane przez bakterię, np. produkty genów ogonka znajdujących się pod kontrolą regulacyjnych systemów bakterii mogą działać jako bakteriocyny [30]. Mechanizm wymiany dodatkowych elementów genetycznych prowadzi mię-dzy innymi do przenoszenia przez bakteriofagi genów kodujących czynniki wirulencji takie jak toksyny Shiga, białka błony zewnętrznej czy enzymy zmieniające struk-turę LPS [91]. Bakteriofagi są więc ważnymi pośred- nikami w horyzontalnym transferze genów pomiędzy bakteriami, oraz wpływają na różnorodność bakteryj-nych genomów [58, 61].

4. bakteriofag λ

Najlepiej poznanym przedstawicielem fagów lamb-doidalnych jest bakteriofag λ (Rys. 2). W tym rozdziale, w przypadku podstawowych informacji będziemy odno-

sić się do opublikowanych stosunkowo niedawno arty-kułów przeglądowych [59, 93, 95], w których czytelnik znajdzie szersze dane literaturowe, ograniczymy się natomiast do cytowania jedynie najważniejszych i najnow-szych prac oryginalnych dotyczących bakteriofaga λ.

Genom faga λ, schematycznie przedstawiony na Rys. 1., stanowi linowa, dwuniciowa cząsteczka DNA o długości 48502 par zasad zakończona 12-nukleoty-dowymi lepkimi końcami. Bakteriofag λ został skla-syfikowany do rzędu caudovirales i rodziny siphovi-ridae. Wirion zbudowany jest z ikozaedralnej główki o średnicy 54 nm i ogonka nie posiadającego kurczliwej pochewki o średnicy 15 nm i długości 150 nm. Na końcu ogonka znajduje się włókienko końcowe o średnicy 2 nm i długości 25 nm. Badania nad bakteriofagiem λ zaczęto w połowie XX wieku. Od tego czasu stał się on organizmem modelowym, dzięki któremu poznano regulację podstawowych procesów genetycznych takich jak: represja i aktywacja promotorów, antyterminacja transkrypcji czy rekombinacja DNA [95]. Wykorzysty-wany jest również jako najprostszy model do badania czynników mających wpływ na wybór alternatywnych dróg rozwojowych. Jest to kluczowe dla efektywnej pro-pagacji tego faga, w różnych warunkach wzrostu komó-rek gospodarza [95]. Poniżej przedstawione zostaną dwie alternatywne drogi rozwojowe bakteriofaga λ i poszczególne ich etapy.

Rys. 2. Wirion bakteriofaga λ.Zdjęcie spod mikroskopu elektronowego TEM

(dzięki uprzejmości dr Grażyny Konopy, Uniwersytet Gdański).


4.1. adsorpcja i injekcja dna

Infekcja rozpoczyna się od adsorpcji faga na powierzchni komórki bakteryjnej [95]. Podczas tego procesu dochodzi do specyficznego oddziaływania pomiędzy fagowym białkiem J, budującym włókienko końcowe, a bakteryjnym białkiem LamB, tworzącym porynę maltozową. Poryna ta umożliwia transport mal-tozy do wnętrza komórki i jest umiejscowiona wzdłuż komórki gospodarza na błonie zewnętrznej. Adsorpcja faga zależy od obecności jonów Mg2+, które neutrali-zują ujemny ładunek na powierzchni błony. Pierwot-nie wyizolowany bakteriofag λ miał dodatkowo sześć długich włókien przyśpieszających adsorpcję, jednak zostały one utracone przez mutację w genie stf. Efektem tego było zwiększenie łysinek fagowych co znacznie uła-twiło pracę z tym bakteriofagiem. Natomiast w warun-kach naturalnych, czyli w jelitach ssaków, gdzie znaj-dują się sole żółciowe i węglowodany, do adsorpcji faga na powierzchni komórki potrzebne jest jeszcze jedno białko zewnętrznej błony gospodarza: Ag43, które bierze udział w autoagregacji komórek Escherichia coli. Białko to może działać jako dodatkowe miejsce wiązania faga z komórką bakteryjną w środowisku o niskim stężeniu jonów dwuwartościowych [95].

Po zaadsorbowaniu się cząstki fagowej na powierzchni błony dochodzi do przesunięcia związanego wirionu z białkiem LamB do bieguna komórki. Tutaj znajduje się największa koncentracja białka ManY, niezbędnego do injekcji fagowego DNA. Białko to umiejscowione jest w błonie wewnętrznej i jest jednym z elementów budu-jących system transportujący mannozę. Tak się dzieje jeśli komórkę gospodarza zainfekuje mała liczba cząstek fagowych od 1 do 5 na jedną komórkę (niskie m.o.i. czyli wielokrotność zakażenia). Przy większej liczbie bakteriofagów injekcja może nastąpić w miejscu zaad-sorbowania się faga. W procesie tym biorą też udział następujące białka fagowe: V (główne białko ogonka), G i H (białka łączące włókienko końcowe z ogonkiem) oraz Z (łączy główkę z ogonkiem oraz jest związane z końcem DNA wystającym do ogonka) [17]. Podczas wprowadzania fagowego materiału genetycznego do wnętrza komórki dochodzi do niespecyficznych wiązań z białkami gospodarza np. HU. Powoduje to kondensa-cję DNA fagowego i wepchnięcie go na skutek gradientu ciśnienia osmotycznego pomiędzy cytoplazmą a śro-dowiskiem zewnętrznym do upakowanej cytoplazmy gospodarza [34].

4.2. faza decyzji „liza czy lizogenia”

Po injekcji następuje cyrkularyzacja fagowego DNA dzięki 12-nukleotydowym końcom cos, które są ligo-wane przez ligazę gospodarza. Na tym etapie fag musi „podjąć decyzję” o wyborze jednej z alternatywnych

dróg rozwojowych: litycznej bądź lizogennej (do szcze-gółowych odnośników literaturowych odsyłamy czytel-nika do prac przeglądowych: [59, 95]). Po cyrkularyzacji genomu faga, bakteryjna polimeraza RNA rozpoczyna transkrypcję z dwóch wczesnych promotorów fagowych: pL i pR. Pierwszymi genami transkrybowanymi z pro-motora pR są cro i cii. Natomiast z promotora pL trans-krybowany jest gen N, kodujący białko antyterminato-rowe. Tworzy ono kompleks z białkami bakteryjnymi powodujący, że polimeraza RNA nie rozpoznaje termi-natorów w operonach pL i pR, co umożliwia transkrypcję kolejnych genów. Z kolei białko CII (produkt genu cii) jest aktywatorem promotora pE, z którego rozpoczyna się transkrypcja genu ci. Współzawodnictwo pomię-dzy białkiem Cro (produkt genu cro), decydującym o rozwoju litycznym, a białkiem CI (produkt genu ci), decydującym o rozwoju lizogenicznym, jest kluczowym procesem przy decyzji „liza czy lizogenia”. Związane jest to z oddziaływaniem obu tych białek z regionami ope-ratorowymi OL1, OL2 i OL3 promotora pL oraz OR1, OR2 i OR3 promotora pR, w wyniku czego dochodzi do zaha-mowania transkrypcji z tych promotorów [59].

Białko CI działa jako dimer w którym każdy z mono-merów zbudowany jest z dwóch domen. Jedną z nich jest domena N-terminalna zawierająca motyw helisa--zwrot-helisa, odpowiadająca za wiązanie do DNA. Natomiast druga domena C-terminalna zawiera har-monijkę β biorącą udział w tworzeniu dimerów i inte-rakcji pomiędzy dimerami. W tej domenie znajduje się też miejsce autoproteolizy białka CI, do której docho-dzi podczas indukcji profaga. Dimery białka CI koope-ratywnie wiążą się do operatorów OL1 i OL2 hamując aktywność promotora pL oraz do operatorów OR1 i OR2 hamując aktywność promotora pR. Następnie dochodzi do zagięcia DNA i oddziaływania pomiędzy ustawio-nymi naprzeciwko siebie tetramerami CI związanymi z wyżej wymienionymi miejscami operatorowymi, two-rząc oktamery. Powoduje to powstanie pętli na DNA, która wzmacnia aktywność promotora pM, zaktywowa-nego po związaniu białka CI w operatorze OR2. Z tego promotora następuje efektywna transkrypcja genu ci. Podczas rozpoczęcia transkrypcji polimeraza RNA może wiązać się zarówno do promotora pR jak i pM, ale szybkość tworzenia kompleksu otwartego na promoto-rze pR jest wyższa niż na pM. Ponadto jeśli polimeraza RNA jest związana jednocześnie z tymi promotorami, to na pM nie dochodzi do utworzenia kompleksu otwar-tego. Otwarcie kompleksu transkrypcyjnego zachodzi dzięki specyficznym oddziaływaniom między polime-razą RNA a dwoma regionami bogatymi w pary AT, które znajdują się przed miejscem „start” na DNA. Powoduje to owinięcie DNA wokół polimerazy RNA w czym bierze udział C-terminalna domena podjednostki α polimerazy RNA. Promotor pM jest słabym promoto-rem bez aktywacji przez białko CI. Dochodzi do wiąza-


nia tetramerów CI w operatorach OL3 i OR3 co stabili-zuje powstałą pętlę i efektywnie hamuje promotory pL, pR jak i pM. Współdziałanie dimerów CI podczas wią - zania do operatorów nie jest konieczne w rozwoju faga λ, ale powoduje, że mniejsza ilość tego białka jest potrzebna do ustanowienia decyzji o lizogenicznym roz-woju bakteriofaga [7].

Białko Cro zbudowane jest z jednej domeny i wiąże się również jako dimer do tych samych miejsc operato-rowych, ale w odwrotnej kolejności niż białko CI [59]. Do niedawna uważano, że białko Cro wiążąc się z ope-ratorem OR3 hamuje promotor pM, uniemożliwiając produkcję wystarczającej ilości białka CI do rozpoczę-cia cyklu lizogenicznego, a przez to powoduje rozpo-częcie rozwoju litycznego. Ostatnie badania pokazały, że związanie Cro do tego operatora nie jest konieczne do hamowania promotora pM podczas indukcji profaga [6]. Wydaje się, że rolą białka Cro w cyklu litycznym po związaniu do operatorów jest zahamowanie trans-krypcji z promotorów pL i pR. Powoduje to zatrzymanie transkrypcji genów cii i ciii, których produkty białkowe, odpowiednio CII i CIII, pozytywnie wpływają na ilość białka CI. Zaprzestanie produkcji białka CII podczas rozwoju litycznego jest istotne również dlatego, że jest ono toksyczne dla komórek gospodarza. Białko to przez wiązanie do podjednostki β polimerazy RNA może hamować transkrypcję bakteryjnych genów. Także nadprodukcja tego białka powoduje zahamowanie repli-kacji genomu gospodarza.

W zależności od tego, którego białka Cro czy CI jest więcej w komórce bakteryjnej, bakteriofag wybiera odpowiednią drogę rozwoju. Zależy to od warunków fizjologicznych w jakich znajduje się komórka gospo-darza. Rozwojowi litycznemu sprzyjają korzystne warunki wzrostu komórek gospodarza, takie jak: bogata pożywka, wysoka temperatura i niskie m.o.i. zaka-żającego faga. Natomiast rozwojowi lizogenicznemu sprzyjają niekorzystne warunki wzrostu, czyli: uboga pożywka, niska temperatura oraz duża liczba fagów infekująca tą samą komórkę bakteryjną [95]. Również w populacji bakterii rosnących w takich samych warun-kach, komórki większe, czyli będące w lepszej kondycji częściej będą lizowane po zakażeniu bakteriofagiem λ niż te mniejsze [82].

4.3. rozwój lizogeniczny

Kluczowym białkiem w rozwoju lizogenicznym jest białko CII, od którego aktywności zależy poziom biał- ka CI. Białko CII tworzy tetramery zbudowane z podob-nych dimerów. Każdy z monomerów tego białka zawiera motyw helisa-zwrot-helisa, ale tylko dwa monomery biorą udział w wiązaniu do DNA. Białko to jest aktywa-torem trzech promotorów fagowych: pE, pI i paQ (Rys. 3). Stymulacja tych promotorów polega na związaniu się

białka CII w miejscu zachodzącym na rejon –35 pro-motora i oddziaływaniu z podjednostką α polimerazy RNA. Aktywacja promotora pE powoduje transkrypcję genu ci. Dzięki temu powstaje pula białka CI aktywująca, po związaniu z OR2, własny promotor pM [59].

Z kolei na matrycy mRNA tworzonego z promo-tora pI powstaje białko Int niezbędne w procesie integra-cji genomu faga λ z chromosomem gospodarza (Rys. 3). Gen int jest także pod kontrolą promotora pL, ale powstające z niego transkrypty są degradowane zanim dojdzie do translacji białka Int. Dochodzi tutaj do tzw. retroregulacji. Polega ona na tym, że za genem int znaj-duje się region sib tworzący strukturę szpilki do włosów. Jest to struktura rozpoznawana przez bakteryjną RN--azęIII, która degraduje mRNA dla białka Int. Region sib jest transkrybowany, ponieważ polimeraza RNA jest w kompleksie z antyterminatorowym białkiem N, przez co nie rozpoznaje terminatora tLI położonego pomiędzy genem int a regionem sib. Natomiast gdy transkrypcja genu int zachodzi z promotora pI polimeraza RNA nie jest związana z białkiem N i zatrzymuje się na termina-torze tLI. Region sib nie jest transkrybowany i dochodzi do efektywnej translacji białka Int.

Ostatnim promotorem aktywowanym przez tetramer białka CII jest promotor paQ, w wyniku czego powstaje RNA antysensowny do transkryptu białka Q (Rys. 3). Białko to jest kolejnym czynnikiem antyterminatoro-wym umożliwiającym transkrypcję genów struktu-ralnych bakteriofaga λ oraz genów kodujących białka powodujących lizę komórki gospodarza. Dzięki aktyw-ności paQ nie dochodzi do złożenia i uwolnienia cząstek fagowych w komórce lizogennej fagiem λ. W aktywacji promotorów pI i paQ, ale nie pE może brać udział oprócz białka CII również bakteryjne białko SeqA [95]. Sche-mat przedstawiający początkową fazę wyboru rozwoju lizogenicznego jest przedstawiony na Rys. 3.

Ilość białka CII w komórce zależy od różnych czyn-ników zarówno bakteryjnych jak i fagowych. Pierw- szym z nich jest antysensowny transkrypt powstający

Rys. 3. Schemat mechanizmu wyboru rozwoju lizogenicznego faga lambdoidalnego. Nazwy genów znajdują się pomiędzy prze-rywanymi liniami symbolizującymi genom faga λ. Strzałki wzdłuż przerywanych linii pokazują kierunek transkrypcji z promotorów. Strzałki odchodzące od białka N pokazują antyterminację, a od białka CII aktywację promotorów. Tępo zakończone linie oznaczają

hamowanie aktywności białka lub genu


z fagowego promotora pO, tzw. OOP RNA. Jest on kom-plementarny do końca 3’ transkryptu dla białka CII, co uniemożliwia translację i powstanie tego białka. Stabil- ność OOP RNA zależy z kolei od wydajności jego polia-denylacji przez bakteryjną poli(A) polimerazę I, PAP I, co powoduje degradację tak zmodyfikowanego mRNA przez RN-azę III. W wolno rosnących komórkach gospo-darza dochodzi do wydajniejszej poliadenylacji OOP RNA, a co za tym idzie do powstania większej ilości biał- ka CII, mogącego aktywować promotory pE, pI i paQ [33].

Kolejnym białkiem bakteryjnym wpływającym na ilość białka CII, w tym przypadku wpływającego na jego stabilność, jest proteaza HflB (FtsH), która degraduje białko CII (Rys. 3). Dzieje się tak dzięki odpowiedniej sekwencji sygnałowej znajdującej się na C-końcu mono-meru CII. Na stabilność białka CII ma także wpływ tem-peratura. Im jest ona niższa tym powstaje więcej stabil-nych tetramerów białka CII. W temperaturze poniżej 20–25°C dochodzi tylko do rozwoju lizogenicznego. W wyższych temperaturach przeważają monomery i dimery białka CII, które są efektywnie degradowane przez proteazę HflB. Natomiast aktywność tej proteazy jest hamowana przez bakteryjne alarmony głodu cAMP i ppGpp, których ilość wzrasta w komórkach gospodarza podczas hodowli w ubogiej pożywce. Prowadzi to do zwiększenia stabilności białka CII. Nukleotyd ppGpp jest również negatywnym regulatorem promotora pR oraz pozytywnym promotorów pE, pI i paQ aktywowa-nych przez białko CII [95].

Następnym czynnikiem mającym wpływ na stabil-ność białka CII jest fagowe białko CIII. Jest ono zbudo-wane z 54 aminokwasów i zawiera centralną α-helisę biorącą udział w aktywności tego białka. CIII chroni białko CII przed degradacją przez proteazę HflB. Dzieje się tak dlatego, ponieważ białko CIII jest kompete- tywnym inhibitorem proteazy HflB, który wiąże się do miejsca degradacji w tej proteazie, bardziej efektywnie niż CII. W ten sposób, samemu ulegając trawieniu, hamuje degradację CII [36].

Ilość białka CIII w komórce jest zależna od tempe-ratury, im jest ona niższa tym wydajniejsza translacja tego białka. Spowodowane jest to tworzeniem dwóch alternatywnych struktur transkryptu. W niskich tempe-raturach powstaje transkrypt z łatwo dostępnym miejs-cem Shine-Dalgarno i kodonem „start” dla rybosomu, dzięki czemu zachodzi wydajna translacja tego białka. Translacja jest również stymulowana przez wiązanie RN-azy III do mRNA, co powoduje ekspozycję miejsca przyłączenia rybosomu, a nie degradację transkryptu. W niskiej temperaturze promotor pL, pod którego kon-trolą znajduje się gen ciii, jest bardziej aktywny. Białko CIII powoduje też indukcję bakteryjnej odpowiedzi stresowej poprzez stabilizację czynnika σ32, który umoż-liwia transkrypcję białek szoku termicznego. Tak samo jak w przypadku białka CII, dzięki trawieniu CIII przez

proteazę HflB, nie dochodzi do trawienia tego czynnika transkrypcyjnego. Powoduje to z jednej strony pro-dukcję bakteryjnej proteazy Lon, degradującej fagowe białko N, a z drugiej strony białek DnaJ, DnaK i GrpE potrzebnych podczas replikacji genomu faga λ. Ilość białka CIII zależy również od ilości fagów zakażających jedną komórkę bakteryjną [95].

Przy niskim m.o.i, kiedy injekcja fagowego DNA zachodzi na biegunach komórkowych, dochodzi rów-nież do wydajnej degradacji białka CII. Dzieje się tak dlatego że w tym miejscu jest także duża ilość proteazy HflB, która efektywnie trawi CII, do tego jest mało kopi genu CIII, a w związku z tym powstaje mniej tego białka. Przy wysokim m.o.i. gdy injekcja genomu faga λ nastę-puje w miejscu adsorpcji cząstki fagowej jest nie tylko wyższa produkcja białka CIII, ale również CII może pojawić się tam gdzie jest mniejsza ilość proteazy HflB, co zmniejsza efektywność trawienia tego białka [17].

Podczas rozwoju lizogenicznego następuje integracja genomu faga λ z chromosomem Escherichia coli. Odpo-wiedzialny jest za to proces rekombinacji miejscowo--specyficznej pomiędzy fagowym miejscem attP (POP’) a bakteryjnym miejscem attB (BOB’). Miejsce attP znaj-duje się za genem int w genomie bakteriofaga, a miejsce attB jest pomiędzy operonami gal i bio na chromosomie gospodarza. Miejsca integracji są do siebie homolo-giczne tylko w części rdzeniowej O, zbudowanej z 15 par zasad i bogatej w pary AT. Pozostałe elementy P, P’, B i B’ tworzą proste jak i odwrócone powtórzenia oraz sekwencje palindromiczne rozpoznawane przez białka biorące udział w integracji i wycięciu DNA fagowego. W rekombinacji miejscowo-specyficznej udział bierze poza fagowym białkiem Int, także bakteryjne białko IHF, które po związaniu z DNA powoduje jego zagięcie i ekspozycję miejsca attB. Białko Int po rozpoznaniu miejsc attP i attB przecina obie nici zarówno fagowego jak i bakteryjnego DNA w rejonie O, a następnie łączy je ze sobą, co powoduje integrację materiału genetycznego bakteriofaga z chromosomem gospodarza. W wyniku tej reakcji genom profaga jest flankowany hybrydowymi miejscami att: BOP’ i POB’. Miejsce attB rozpoznawane przez bakteriofaga λ, mimo że nie koduje żadnych genów jest takie same w różnych szczepach E. coli. Bak-teriofag ten posiada też dodatkowe miejsce integracji z chromosomem gospodarza [38, 59].

Stan profaga jest bardzo stabilny dzięki aktywności promotora pM, z którego jest transkrybowany gen ci. Dzięki temu białko CI utrzymuje się na stałym poziomie i efektywnie hamuje promotory pL i pR oraz chroni bak-terię przed zakażeniem przez innego faga λ, czyli przed tak zwaną superinfekcją (Rys. 4). Z tego promotora dochodzi również do transkrypcji dwóch dodatkowych genów: rexA i rexB. Gen rexB ma dodatkowo jeszcze dwa promotory pLit1 i pLit2, które są aktywne w stanie pro-faga. Produkt tego genu, białko RexB chroni komórkę


gospodarza przed śmiercią w czasie głodu aminokwaso-wego, związanego z aktywnością systemu genów mazE i mazF. Zapobiega również śmierci komórki bakteryjnej po utracie profaga P1, wykorzystującego system phd--doc, przez inaktywację bakteryjnej proteazy ClpXP. Natomiast produkty obu genów rex biorą udział w blo-kowaniu superinfekcji innymi fagami np. mutanta faga T4 w genie rii. W stanie profaga dochodzi do ekspresji także innych genów fagowych. Należą do nich dwa geny strukturalne ogonka G i T, gen bet, którego produkt biał-kowy bierze udział w rekombinacji homologicznej, gen xis związany z wycięciem genomu faga z chromosomu gospodarza oraz otwartej ramki odczytu orf63, której funkcja nie jest znana [60].

4.4. indukcja profaga

Indukcja jest to proces, podczas którego następuje przejście ze stanu profaga w rozwój lityczny [59, 95]. Może ona nastąpić w sposób spontaniczny lub zostać wymuszona przez czynniki powodujące uszkodzenia w DNA, takie jak: promieniowanie UV, X czy za pomocą mutagenów takich jak mitomycyna C. Promieniowanie UV generuje pęknięcia w DNA, powoduje hydratację cytozyny i uracylu oraz powstawanie kowalencyj-nych wiązań, czego efektem są dimery pirymidynowe. Ponadto promieniowanie to sprawia powstawanie wol-nych rodników, które mają wpływ na indukuję profaga λ. Dodanie substancji wyłapującej wolne rodniki np., glutationu, powoduje opóźnienie w indukcji profaga [43]. Natomiast aktywny metabolit mitomycyny C alkiluje azot guaniny w strukturze DNA oraz kowalen-cyjnie łączy komplementarne nici DNA. Może również reagować z komórkowymi cząsteczkami tlenu tworząc wolne rodniki. Indukcję profaga λ mogą wywoływać także związki nie działające bezpośrednio na strukturę DNA np. norfloksacyna (NFLX) [50]. Jest to antybiotyk należący do drugiej grupy fluorochinolonów. Hamuje on aktywność gyrazy DNA wiążąc się do jej podjednostki A, która jest odpowiedzialna za oddziaływania z DNA. Gyraza DNA wprowadza negatywne skręty do struktury DNA. Działanie NFLX powoduje zahamowanie syntezy

DNA i powstanie jednoniciowych fragmentów DNA. Indukcję profaga powodują również czynniki, których metabolizm w komórce prowadzi do powstania reak-tywnych form tlenu np. nadtlenek wodoru. Prowadzi to do oksydacji zasad DNA i uszkodzenia jego struktury.

W procesie indukcji profaga bierze udział bakteryjne białko RecA. Jest to heksamer wiążący się przy udziale ATP z jednoniciowym DNA, które powstaje w wyniku działania różnych czynników indukujących profaga. W takiej formie białko RecA jest aktywne i stymuluje autoprotolizę kolejnego bakteryjnego białka, LexA. To z kolei aktywuje geny systemu S.O.S. biorące udział w naprawie uszkodzonego DNA [25]. W podobny spo-sób białko RecA oddziałuje z fagowym białkiem CI, powodując jego autoprotolizę. Spadek stężenia repre-sora CI sprawia, że promotor pM traci swoją aktywność, a promotory pR oraz pL są odblokowane i rozpoczyna się z nich transkrypcja [59, 95]. Białko CII jest degra-dowane przez bakteryjną proteazę HflB i jest hamowane przez białko Cro. Nie dochodzi więc do aktywacji pro-motora pE, z którego mógłby powstawać transkrypt dla białka CI. Następuje wycięcie profaga z chromosomu gospodarza przy udziale fagowych białek Int i Xis oraz bakteryjnych białek IHF i Fis. Brak białka CII powo-duje, że promotor pI nie jest aktywny, ale dochodzi do efektywnej transkrypcji mRNA dla białka Int z promo-tora pL. W stanie profaga za genem int znajduje się miej-sce att BOP’, a region sib w wyniku cięcia w rejonie O miejsca attP podczas integracji, znajduje się za miejscem att POB’. Białko Xis razem z białkiem IHF powodują zagięcie DNA umożliwiając wycięcie genomu profaga w procesie rekombinacji miejscowo-specyficznej przez białko Int. Wiązanie białka Fis do DNA umożliwia przy-łączenie białka Xis, co jest niezbędne do efektywnego wycięcia profaga. Po wycięciu się profaga rozpoczyna się rozwój lityczny. Dochodzi do replikacji fagowego DNA, produkcji białek strukturalnych, składania nowych cząstek fagowych i uwolnienia ich przez lizę komórki gospodarza [59, 95].

Indukcja profaga może również zajść bez udziału aktywnego białka RecA. Przykładem takiej indukcji jest indukcja zygotyczna, do której dochodzi pod-czas koniugacji pomiędzy komórkami bakteryjnymi. W wyniku tego procesu dawca może przekazać biorcy fragment chromosomu zawierający profaga. Brak białka CI w komórce biorcy powoduje aktywację promotorów pR oraz pL i rozpoczęcie rozwoju litycznego. Również wywołanie szoku solnego w komórkach lizogennych fagiem λ wywołuje indukcję profaga. Powodem tego może być nagły wzrost superskrętów w strukturze DNA, co sprawia że represor CI oddysocjowuje od miejsc operatorowych uwalniając promotory pR oraz pL [80]. Natomiast w stacjonarnej fazie wzrostu komórek bakte-ryjnych, przy nadekspresji genu dsrA również dochodzi do indukcji profaga bez udziału białka RecA [68].

Rys. 4. Schemat transkrypcji genów profaga λ regulowanej przez białko CI. Nazwy genów znajdują się pomiędzy przerywanymi liniami symbolizującymi genom profaga λ. Strzałka wzdłuż prze-rywanej linii pokazuje kierunek transkrypcji z promotora. Strzałka odchodząca od białka CI pokazuje aktywację promotora, a tępo zakończone linie oznaczają hamowanie aktywności promotorów.


4.5. rozwój lityczny

W regulacji rozwoju litycznego oprócz białka Cro ważną rolę odgrywa również białko N tworzące kom-pleks antyterminatorowy z polimerazą RNA i innymi czynnikami bakteryjnymi (Rys. 5). Umożliwia to trans-krypcję kolejnych genów z promotorów pL i pR. Białko N

torowe. Replikacja rozpoczyna się w oriλ, które znajduje się w środku sekwencji genu o, zawierającego rejony bogate w pary AT. Produkt tego genu, białko O, wiąże się jako pierwsze w oriλ tworząc strukturę O-somu. Następnie przyłącza się kompleks białka P z bakteryjną helikazą DnaB. Nie dochodzi do rozplecenia nici DNA przez helikazę, ponieważ białko P hamuje jej aktywność. Zdolność do działania białka DnaB przywracają białka szoku termicznego DnaK, DnaJ i GrpE przekształcając preprimosom tak, że helikaza odzyskuje swoją aktyw-ność rozplatania nici DNA [93]. W inicjacji replikacji ważną rolę odgrywa również aktywacja transkrypcyjna origin przez bakteryjne białko DnaA. Jest to białko aktywatorowe, które po związaniu się do DNA faga stymuluje transkrypcję z promotora pR, pod którego kontrolą są między innymi geny o i P. Białko to stymu-luje wiązanie, a następnie opuszczenie promotora przez polimerazę RNA. Przesuwanie się polimerazy RNA powoduje zmiany w topologii DNA, które stymulują inicjację replikacji. Kolejnym czynnikiem aktywującym transkrypcję z tego promotora jest białko SeqA. Oba te białka konkurują ze sobą o miejsce wiązania w regionie regulatorowym promotora pR. Następnie do kompleksu replikacyjnego dołącza się holoenzym polimerazy DNA i dodatkowe białka gospodarza biorące udział w repli-kacji, takie jak gyraza DNA, SSB [93]. Rozpoczyna się replikacja typu θ, a powstały kompleks replikacyjny jest dziedziczony przez jedną z nici potomnych [93].

Od ilości białka O zależy wydajność inicjacji repli-kacji fagowego DNA. Białko to w wolnej formie jest degradowane przez bakteryjną proteazę ClpP/ClpX. Dopiero utworzenie kompleksu z białkami P, DnaB i DnaK w oriλ chroni białko O przed degradacją przez te proteazy [93, 95]. W warunkach umożliwiających szybki wzrost komórek gospodarza białko O jest pro-dukowane w dużym nadmiarze w porównaniu z ilością jaka jest potrzebna do wyprodukowania potomnych cząstek fagowych. Dzięki temu proteaza ClpP/ClpX nie jest w stanie strawić wystarczającej ilości tego białka aby nie dopuścić do powielenia fagowego materiału gene-tycznego [93, 95]. Podczas replikacji faga λ tworzą się dwa rodzaje kompleksów replikacyjnych: stabilne, które mogą funkcjonować przez kilka rund replikacyjnych i niestabilne. Jednak w warunkach szoku termicznego stabilne kompleksy rozpadają się w wyniku relaksacji DNA i oddysocjowania od origin. Podczas indukcji profaga w wyniku naświetlania światłem UV powstają tylko niestabilne kompleksy replikacyjne, które umoż-liwiają wydajne powielenie DNA faga, bo nie dochodzi w tych warunkach do relaksacji DNA. W tych warun-kach białko RecA uniemożliwia tworzenie się stabilnych kompleksów replikacyjnych [94].

Po 5–6 rundach dwukierunkowej replikacji typu θ, podczas której powstaje około 50 kopii genomu bakte-riofaga λ, dochodzi do jednej rundy jednokierunkowej

Rys. 5. Schemat mechanizmu wyboru rozwoju litycznego faga lambdoidalnego. Nazwy genów znajdują się pomiędzy przery-wanymi liniami symbolizującymi genom faga λ. Strzałki wzdłuż przerywanych linii pokazują kierunek transkrypcji z promotorów. Strzałki odchodzące od białka N i Q pokazują antyterminację. Tępo zakończone linie oznaczają hamowanie aktywności promotora

rozpoznaje specyficzną sekwencję nutL w powstającym transkrypcie z promotora pL, znajdującą się pomiędzy genem N a promotorem oraz nutr zlokalizowaną na transkrypcie za genem cro. Miejsce nut zbudowane jest z dwóch elementów: boxA i boxB [59]. Białko N wiąże się do struktury szpilki do włosów w boxB. Powoduje to zagięcie RNA i związanie białka antyterminatorowego z polimerazą RNA. Do tego kompleksu przyłączają się bakteryjne białka stabilizujące to wiązanie. W boxB są to białka NusA i NusG a w boxA NusB i NusE (S10) [59]. Powstanie tak złożonego kompleksu umożliwia przejście polimerazie RNA przez terminatory tL i tR, w wyniku czego dochodzi do transkrypcji pozosta-łych genów z operonów pL i pR. Dzięki temu procesowi powstaje odpowiednia ilość białek potrzebnych podczas rozwoju litycznego bakteriofaga λ. Wiązanie białka N do miejsca nutL powoduje również represję translacji tego białka przez zablokowanie wiązania rybosomu do miejsca Shine-Dalgarno [59, 95]. Jednak w warunkach umożliwiających szybki wzrost komórek gospodarza, RN-aza III przecina sekwencję nutL, co powoduje uwol-nienie sekwencji Shine-Dalgarno i efektywną transla-cję białka N. Jest to istotne aby zapewnić odpowiednią ilość białka antyterminatorowego podczas rozwoju litycznego, ponieważ białko to jest degradowane przez bakteryjną proteazę Lon [95]. Antyterminacja może być także kontrolowana przez kinetykę dysocjacji białka N z polimerazą RNA i białkami Nus.

W rozwoju litycznym dochodzi do replikacji mate-riału genetycznego faga w wyniku czego powstaje około 100 dodatkowych kopii cząsteczek DNA. W procesie tym biorą udział fagowe białka O i P, a także bakteryjne białka szoku termicznego, białka replikacyjne i regula-


replikacji typu θ. Spowodowane jest to tym, że białko DnaA zostaje wymiareczkowane, przez związanie się w wielu miejscach na DNA bakteriofaga. Nie następuje, więc aktywacja transkrypcyjna bez której nie może zajść dwukierunkowa replikacja typu θ. Podczas jednokie-runkowej replikacji dochodzi do odepchnięcia końca 5’ przez rosnący koniec 3’ nowo syntetyzowanej nici i roz-poczyna się replikacja typu σ, czyli toczącego się koła. Następuje to w około 15 min po infekcji [95]. W wyniku tego typu replikacji tworzą się długie konkatameryczne cząsteczki DNA. Następnie są one cięte w miejscach cos i pakowane do równocześnie powstających główek bakteriofagowych [93, 95].

Transkrypcja genów białek budujących wirion faga λ zachodzi dzięki antytermiatorowemu białku Q, którego gen jest pod kontrolą promotora pR. Rozpoznaje ono dwie specyficzne sekwencje (QBE) na DNA pomiędzy miejscem –10 a –35 promotora pR’. Podczas transkryp-cji z tego promotora polimeraza RNA zatrzymuje się na specyficznej sekwencji tuż za promotorem two-rząc kompleks mający cechy kompleksu zamkniętego i otwartego. Dopiero oddziaływanie z białkiem Q zwią-zanym z sekwencją QBE umożliwia powstanie stabil-nego kompleksu elongacyjnego. Antyterminator może przyłączyć się do polimerazy, ponieważ dochodzi do destabilizacji oddziaływań pomiędzy podjednostką σ70 a podjednostką β polimerazy RNA przez nowopowsta-jący transkrypt [57]. Białko Q współzawodniczy z pod-jednostką σ70 o miejsce w podjednostce β polimerazy RNA. Specjalne miejsca wiązania na promotorze pR’ oraz oddziaływania z polimerazą sprawiają, że antytermina-tor Q jest specyficzny tylko dla tego promotora [16]. Związanie polimerazy RNA z białkiem Q powoduje, że nie rozpoznaje ona terminatorów i następuje trans-krypcja genów strukturalnych faga oraz genów umoż-liwiających lizę komórki gospodarza, czyli tzw. genów późnych. Schemat przedstawiający fazę wyboru rozwoju litycznego znajduje się na Rys. 5.

W końcowym etapie rozwoju litycznego dochodzi do składania główek fagowych, w czym udział biorą również bakteryjne białka szoku termicznego GroEL i GroES [64]. Do główek pakowane jest DNA bakterio-faga, cięte w miejscach cos, eksponowanych przez białko IHF. Następnie do wypełnionej główki przyłączany jest ogonek i potomne cząstki fagowe uwalniają się z komórki gospodarza w procesie lizy. Liza komórki bak-teryjnej zachodzi dzięki fagowym białkom S, R, Rz i Rz1. Gen s koduje dwa rodzaje holiny S105 i S107. Holina S105 niszczy błony komórkowe, a białko S107 działa jak antyholina, hamując aktywność białka S105. Holina S105 tworzy oligomeryczne pory w błonie wewnętrz-nej przez które wydostaje się endolizyna R, niszcząca ścianę komórkową bakterii [70]. Kolejne białko Rz, umiejscowione jest w błonie wewnętrznej a Rz1 w bło-nie zewnętrznej. Ich C-końce wystają do przestrzeni

peryplazmatycznej. W ostatnim etapie lizy zmieniają swoją konformację, oddziałują ze sobą i powodują połą-czenie błony zewnętrznej z wewnętrzną, co usuwa ostat-nią barierę do uwolnienia potomnych cząstek fagowych. Ostatni etap może być istotny w naturalnym środowisku gdzie jest więcej jonów dwuwartościowych stabilizują-cych błonę zewnętrzną [9]. W wyniku cyklu litycznego powstaje około 100 nowych cząstek fagowych mogących zakażać kolejne komórki Escherichia coli [59, 93, 95].

W podsumowaniu należy zaznaczyć, że poszcze-gólne etapy rozwoju wszystkich bakteriofagów lamb-doidalnych, łącznie z fagami niosącymi geny toksyn Shiga, przebiegają podobnie, aczkolwiek mogą różnić się w szczegółach. Niemniej jednak, szczegółowe pozna-nie mechanizmów regulujących rozwój tych fagów ma ogromne znaczenie dla zrozumienia mechanizmu pato-genności szczepów EHEC.

5. Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEc)

Gospodarzem dla bakteriofagów przenoszących geny toksyn Shiga są enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC). Wywołują one u ludzi krwotoczne zapa-lenie okrężnicy (HC) oraz zespół hemolityczno-mocz-nicowy (HUS). Ze względu na częstość powodowania objawów chorobowych i epidemii u ludzi podzielono je na 5 seropatotypów od A do E. Najczęściej opisywane bakterie E. coli produkujące toksyny Shiga to O157:H7, należące do seropatotypu A, który zawiera najbardziej wirulentne szczepy EHEC. Zakażenie tą bakterią daje najsilniejsze objawy chorobowe, które najczęściej rozwi-jają się w zespół hemolityczno-mocznicowy, najczęściej też dochodzi do powikłań oraz do epidemii w porówna-niu z innymi serotypami EHEC [27]. Infekcja tym szcze-pem jest najbardziej niebezpieczna u dzieci do 10 roku życia i u ludzi starszych, ponieważ u tych osób istnieje najwyższe prawdopodobieństwo wystąpienia HUS. 80% przypadków kończących się zespołem hemolityczno--mocznicowym jest spowodowana przez szczep E. coli O157:H7. Wśród pacjentów zakażonych EHEC z krwo-tocznym zapaleniem okrężnicy od 3 do 15% przypad-ków może rozwinąć się w HUS, z czego śmiertelność wynosi około 10% [65]. Zespół hemolityczno-mocznicowy charakteryzuje się ostrą niewydolnością nerek, ane- mią i małopłytkowością. Również inne organy takie jak: płuca, trzustka czy serce mogą zostać uszkodzone [28]. Część pacjentów cierpi też na problemy ze strony układu nerwowego takie jak: śpiączka, dezorientacja, letarg [65].

Rezerwuarem szczepów EHEC są przeżuwacze, głównie bydło i inne zwierzęta gospodarskie, ale wystę-pują też u zwierząt domowych np. psów oraz u dzikich zwierząt. Szczepy EHEC bytują w jelitach tych orga-nizmów nie powodując objawów chorobowych. Do zakażenia tymi patogenami dochodzi najczęściej przez


zjedzenie zainfekowanego niedogotowanego mięsa, głównie wołowiny, lecz również przez spożycie zainfe-kowanego surowego mleka lub jego przetworów, np. sera czy jogurtu. Kolejnym źródłem zakażenia mogą być nie-domyte warzywa hodowane na nawozach organicznych lub kiełki tak hodowanych roślin. Także wypicie zain-fekowanej wody czy nawet kąpiel w takiej wodzie może prowadzić do zakażenia EHEC. Kolejną drogą zakażenia tymi patogenami jest bezpośredni kontakt ze zwierzę-ciem lub z człowiekiem będącym nosicielem [27].

Cechą charakterystyczną dla zakażeń EHEC jest bardzo niska dawka infekcyjna wynosząca poniżej 100 komórek, wystarczająca do rozwoju objawów cho-robowych. Kolejną cechą jest wysoka oporność na nie-korzystne warunki wzrostu. W związku z tym, że bak-terie te muszą przejść przez kwaśne środowisko żołądka wykazują dużą oporność na niskie pH. Rosną też w sze-rokim zakresie temperatur. Następnymi cechami tych patogenów jest niezdolność do fermentacji sorbitolu oraz nie produkują one β-glukuronidazy. Jednak nie wszystkie szczepy O157:H7 wykazują te właściwości i są takie, które fermentują sorbitol oraz produkują β-glukuronidazę [40]. Powoduje to, że mikrobiologiczne testy na obecność tej bakterii są nieskuteczne. Również testy immunologiczne nie są dostatecznie wiarygodne, ponieważ jest wiele serotypów powodujących podobne objawy chorobowe. W diagnostyce EHEC najlepiej sprawdzają się testy genetyczne oparte na wykrywaniu genów toksyny Shiga [48].

Szczepy EHEC kolonizują jelito grube człowieka, przy- legając do komórek nabłonka gdzie następnie wydzie-lana jest toksyna Shiga. Dzięki zmysłowi gęstoś ciowemu rozpoznają środowisko jelita i następuje aktywacja genów odpowiedzialnych za kolonizację, które znajdują się na wyspie patogennej LEE. Wyspa ta zawiera geny kodujące aparat sekrecyjny typu III, przez który wydzie-lane są różne białka Esp oraz białko Tir, również kodo-wane na LEE. Kolejnym genem występującym na tej wyspie jest gen eae kodujący główne białko adhezyjne, intyminę. Intymina znajduje się na powierzchni ko- mórek bakteryjnych i jest rozpoznawana przez bak-teryjne białko Tir umiejscowione w błonie komórek gospodarza co powoduje przyleganie bakterii do ściany jelita [27]. Intymina rozpoznaje również eukariotyczne białko nukleolinę będące na powierzchni różnych komórek, co zwiększa adherencje bakterii do komórek eukariotycznych [67]. Białko Tir wraz z białkami Esp powoduje też transdukcję sygnału w komórkach euka-riotycznych, w wyniku czego dochodzi do zmiany struk-tury cytoszkieletu [27]. Następnie jest uwalniana tok-syna Shiga, która uszkadza komórki nabłonkowe jelita oraz naczynia krwionośne, co powoduje krwawienie do światła jelita [40]. Obecność toksyny zwiększa również zdolność bakterii do przylegania do komórek nabłonka i kolonizacji jelita przez zwiększenie ilości białka nukle-

oliny na powierzchni komórek eukariotycznych [67]. Toksyna ta może przedostać się do krwiobiegu i powo-dować uszkodzenia organów wewnętrznych, głównie nerek [40]. Ekspresja genów znajdujących się na wyspie patogennej LEE następuje w późnej fazie wzrostu wykładniczego, a genów toksyn Shiga wzrasta podczas wejścia w fazę stacjonarną wzrostu bakterii [8].

Szczepy Escherichia coli O157:H7 posiadają też plazmid pO157 o wielkości od 93,6 do 104 kpz, na którym znajdują się różne geny mogące wpływać na wirulent-ność tej bakterii. Należy do nich enterohemolizyna (Ehly), należąca do rodziny toksyn RTX. Może ona być wykorzystywana do lizy erytrocytów i uwalniania jonów żelaza, które przyśpieszają wzrost bakterii. Szczep ten posiada specjalny system transportu żelaza umożliwia-jący wykorzystanie hemu i hemoglobiny jako źródła żelaza [54]. Na plazmidzie może znajdować się również gen kodujący toksynę ToxB podobną do toksyn clostri-dium difficile oraz gen katP kodujący białko o aktyw-ności katalazy i peroksydazy [40, 41]. Główne czynniki wirulencji zostały przedstawione na Rys. 6.

6. toksyny shiga

Głównym czynnikiem wirulencji EHEC jest toksyna Shiga. Wyróżniamy dwa podstawowe rodzaje tych toksyn: Stx1 i Stx2. Białko Stx1 enterohemolitycznych Escherichia coli jest identyczne do toksyny Shiga pocho-dzącej ze szczepu shigella dysenteriae I. Natomiast białko Stx2 jest homologiczne z Stx1 w 55% w podjednostce A i 57% w podjednostce B. Do tego można wyróżnić kilka wariantów toksyny Stx2 różniących się między sobą sekwencją aminokwasową: Stx2c, Stx2d, Stx2e, Stx2f, Stx2v i inne. Komórka bakteryjna szczepu EHEC może kodować tylko toksynę Stx1 lub Stx2, może kodować też obie te toksyny lub różne warianty białka Stx2 [54]. E. coli

Rys. 6. Główne czynniki wirulencji enterokrwotocznych szczepów Escherichia coli O157:H7


O157:H7 najczęściej koduje toksynę Stx2, która jest bar-dziej toksyczna dla komórek nabłonka jelita i nerek oraz częściej powoduje HUS niż toksyna Stx1.

Toksyny Shiga są podobnie zbudowane. Składają się z jednej domeny A o wielkości 32 kDa i pierścienia zbu-dowanego z pięciu domen B, każda o wielkości 7,7 kDa. C-koniec domeny A jest zakotwiczony wewnątrz pen-tameru B. Pierścień zbudowany z domen B rozpoznaje specyficzny receptor na powierzchni komórek euka-riotycznych Gb3 (Stx2e wiąże się z receptorem Gb4). Poprzez endocytozę toksyna zostaje wprowadzona do wnętrza komórki gdzie może ulec fuzji z lizosomem, dzięki czemu jest degradowana. Może też być transpor-towana do aparatu Golgiego. W takim przypadku, prze-chodzi następnie do retikulum endoplazmatycznego, gdzie domena A toksyny jest odcinana przez proteazę od podjednostki B. Powstaje katalitycznie aktywny frag-ment A1 (27 kDa) i fragment A2 (4 kDa). Uwolniony do cytoplazmy fragment A1 ma aktywnośc N-glikozydazy RNA i tnie specyficzne wiązanie w 28S rRNA. Powo-duje to zahamowanie łączenia się amino-acylo-tRNA do podjednostki 60S rybosomu, a w konsekwencji zatrzy-manie procesu syntezy białek, a to prowadzi do śmierci komórki [40].

Geny toksyn Shiga znajdują się w genomie profagów lambdoidalnych zintegrowanych z chromosomem bak-teryjnym. Mogą się one znajdować na funkcjonalnych jak i kryptycznych profagach. Szczep E. coli O157:H7 EDL933 posiada 18 profagów i elementów pochodzenia fagowego [31]. Toksyny te są kodowane przez dwa geny: stxA kodujący domenę A i stxB kodujący domenę B. Gen stxA jest wydajniej transkrybowany niż gen stxB [32]. Znajdują się one wśród genów późnych bakterio-faga pomiędzy genami Q i s. Powoduje to, że ich eks-presja jest pod kontrolą późnego fagowego promotora R’ i antyterminatorowego białka Q. Co więcej, również uwolnienie toksyny Shiga jest regulowane poprzez lizę komórek bakteryjnych przez białka bakteriofagowe.

Szczepy EHEC nie posiadają systemu do sekrecji toksyn Shiga. Produkcja dużej ilości tych toksyn jest związana z cyklem rozwojowym faga, następuje tylko po indukcji profaga i jest uwolniona do wnętrza jelita razem z potomnymi fagami przez lizę komórki bakte-ryjnej. Dotyczy to zarówno toksyny Stx2 [89] jak i Stx1 [90]. Geny toksyn Stx1 i Stx2 posiadają również własne promotory, które różnią się między sobą, ale wydajność transkrypcji jest podobna [85]. Schemat przedstawiający lokalizację genów toksyny na chromosomie faga znaj-duje się na Rys. 7.

Promotor pstx1 zawiera miejsce wiązania bakte-ryjnego białka Fur, przez co jest zależny od stężenia jonów żelaza [11]. Wysokie stężenie tych jonów powo-duje zahamowanie transkrypcji z tego promotora [92]. Natomiast aktywność promotora pstx2 jest niezależna od jonów żelaza. Nie posiada on miejsca wiązania białka

Fur. Na ekspresję z tego promotora nie mają też wpływu warunki tlenowe wzrostu bakterii, źródło węgla, wartość pH od 6,5 do 8,5 ani różne stężenia octanu sodu. Jednak fagi które mają insercje w tym promotorze oraz posia-dają gen Q podobny do genu Q faga φ21, produkują małą ilość toksyny w porównaniu z fagami o niezmie-nionym promotorze pstx2 i genie Q podobnym do genu Q faga 933W [49].

W związku z tym, że produkcja toksyny jest zwią-zana z indukcją profaga, zależy ona od bakteryjnego białka RecA, powodującego trawienie represora fago-wego [51]. Ilość produkowanej toksyny zależy też od rodzaju bakteriofaga i od szczepu bakteryjnego [87]. Szczep O157:H7 produkuje większe ilości toksyny niż inne szczepy zarówno podczas spontanicznej indukcji jak i po indukcji spowodowanej mitomycyną C, co może mieć wpływ na większą wirulentność tych szczepów [69].

W związku z mechanizmem produkcji toksyny przez szczepy EHEC trudno jest leczyć pacjentów zakażonych tymi bakteriami. Syntezę toksyny wywołują różne anty-biotyki, nie tylko te, które wywołują odpowiedź S.O.S. Wykazano, że również niektóre makrolidy, np. erytro-mycyna u jednych szczepów EHEC obniża produkcję białka Stx, a u innych podwyższa. Podobna sytuacja dotyczy niektórych antybiotyków β-laktamowych, które są podawane podczas biegunki będącej pierw-szym objawem po zakażeniu EHEC [26]. W związku z tym podawanie antybiotyków i innych antybakteryj-nych leków jest problematyczne, ponieważ może nasilić objawy chorobowe i zwiększyć ryzyko wystąpienia HUS [65] oraz spowodować rozprzestrzenianie się fagów przenoszących toksynę Shiga wśród innych szczepów bakteryjnych. Również na farmach powinno się z dużą ostrożnością używać antybiotyków aby nie sprzyjać roz-przestrzenianiu się tych fagów wśród innych szczepów Enterobacteriaceae [97].

Wykazano też, że około 10% pacjentów chorych na raka i traktowanych mitomycyną C cierpi na niewydol-ność nerek związaną z zespołem hemolityczno-mocz-nicowym [51]. Być może ma to związek z wywołaniem produkcji toksyn Shiga przez bakterie EHEC bezobja-wowo zasiedlające do tej pory jelito. Do niedawna nie znano czynnika w jelicie człowieka, który powoduje indukcje profagów kodujących białka Stx [27]. Nie wia-domo również dlaczego część osób jest nosicielami tych bakterii i nie wykazuje objawów chorobowych dopóki

Rys. 7. Lokalizacja genów toksyny Shiga w genomie bakteriofaga (na schemacie przedstawiony jest jedynie fragment tego genomu

– porównaj z Rys. 1)


nie zażyje odpowiedniego antybiotyku [21]. Może to być związane z naturalną florą bakteryjną jelita, co pokazano na mysim modelu. Powoduje ona zmniejszenie możli-wości kolonizacji jelita i przetrwania szczepów EHEC. Może też mieć wpływ na ilość produkowanej toksyny Shiga. Jeśli naturalna flora jelitowa jest oporna na faga kodującego toksynę to ilość produkowanego białka Stx maleje. Jeśli natomiast jest wrażliwa na takiego faga to dochodzi do produkcji dużo większej ilości toksyny [23]. Wśród ludzkiej flory jelitowej znaleziono szczepy E. coli powodujące zahamowanie wzrostu szczepów EHEC [66].

7. indukcja profagów niosących geny toksyn shiga

Mechanizm indukcji profagów niosących geny tok-syn Shiga jest podobny jak u bakteriofaga λ. Związany jest z aktywnością bakteryjnego białka RecA wiążącego się do jednoniciowych fragmentów DNA, co wywołuje odpowiedź S.O.S. Białko RecA bierze udział w trawie-niu fagowego represora CI co powoduje wycięcie się profaga z genomu bakteryjnego i zapoczątkowuje roz-wój lityczny [20]. Prowadzi to do powstania białka Q i transkrypcji z promotora pR’, pod którego kontrolą są geny stxA i stxB. Powstaje duża ilość toksyny, która jest uwalniana podczas lizy komórek bakteryjnych przez białka fagowe [86] (Rys. 8).

Wszystkie czynniki, które uszkadzają DNA wywo-łują indukcję profagów lambdoidalnych. Należą do nich między innymi promieniowanie UV, mitomycyna C, ale również szereg innych antybiotyków np. norfloksacyna, która początkowo była rekomendowana przy leczeniu zakażeń EHEC [50]. Indukcję tych profagów wywołują również czynniki używane do konserwacji żywności takie jak wysokie ciśnienie hydrostatyczne [2] czy pro-mieniowanie kobaltu-60 co może mieć wpływ na rozprze-strzenianie się tych bakteriofagów [96]. Profagi kodu- jące toksynę Stx indukują się z większą częstością niż profagi nie posiadające genów tej toksyny [44]. W przypadku faga 933W jest to związane ze słabszym oddzia-

ływaniem pomiędzy rep resorem CI a miejscem opera-torowym OR2 w promotorze pR [18]. Ostatnio opubliko-wane wyniki badań wskazały, że czynnikiem efektywnie indukującym profagi niosące geny toksyn Shiga jest nad-tlenek wodoru [45, 46]. Jest to odkrycie o tyle istotne, że warunki stresu oksydacyjnego mogą potencjalnie występować w jelicie człowieka, szczególnie w warun-kach infekcji bakteryjnej i zależnej od funkcji neutrofili (wydzielających H2O2) odpowiedzi immunologicznej.

Oprócz indukcji wymuszonej czynnikami wywołują-cymi odpowiedź S.O.S dochodzi też do indukcji sponta-nicznej bakteriofagów przenoszących geny toksyn Shiga. Związane jest to z różnicami w fizjologii bakterii raczej niż z różnicami w poziomie ekspresji represora i tylko mała frakcja lizogenów indukuje się spontanicznie [44]. Niewątpliwie ilość produkowanej toksyny a co za tym idzie wirulencja szczepów EHEC zależy od wydajności indukcji profagów [83] oraz wydajności procesu repli-kacji DNA faga wpływającego na liczbę kopii genów stx w komórce [55, 56].

Indukcja profagów niosących geny toksyn Shiga za- leży także od miejsca integracji w genomie gospodarza. Do tej pory znaleziono 5 głównych miejsc integracji genomu fagów kodujących toksynę Shiga w chromoso-mie E. coli. Dwa najczęściej występujące miejsca to gen yehV, kodujący regulator transkrypcyjny i wrbA, kodu-jący oksydoreduktazę. Kolejne geny to sbcB, kodujący egzonukleazę, z2577 kodujący oksydoreduktazę i yecE o nieznanej funkcji [76].

Miejsce integracji zależy od rodzaju faga i od dostęp-ności danego miejsca integracji. Fagi kodujące toksynę Stx1 najczęściej wybierają gen yehV. To samo miejsce wybierają też fagi kodujące toksynę Stx2, ale jeśli jest ono zajęte przez innego faga to integrują się w genie wrbA [78]. Natomiast fagi kodujące toksynę Stx2c integrują się w miejscu genu sbcB, dzięki czemu w chromosomie bakteryjnym może znajdować się kilka różnych kopii genu toksyny [84]. Ten sam bakteriofag może również integrować się w kilku miejscach w tej samej komórce bakteryjnej. Uwarunkowane jest to kodowaniem genu dla białka anty-represora, co umożliwia superinfekcję tym samym fagiem [19]. Miejsce insercji oraz utrzyma-nie się profaga zależy od tła genetycznego gospodarza [24]. Wykazano, że gdy z genomem bakteryjnym są zin-tegrowane dwa profagi kodujące toksynę Shiga to po działaniu czynnikiem indukującym indukuje się tylko jeden z nich. Wpływają one zatem nawzajem na ekspre-sję swoich genów [53].

8. rola represora ci i miejsc operatorowych fagów kodujących toksyny shiga

Podczas powstania stanu profaga a następnie jego indukcji ważną rolę może odgrywać białko represora CI oraz miejsca operatorowe wczesnych genów faga,

Rys. 8. Czynniki prowadzące do indukcji profaga i ekspresjigenów toksyn Shiga


tak samo jak ma to miejsce w przypadku bakteriofaga λ. Wykazano różnice w oddziaływaniu białka represora z miejscami operatorowymi OR i OL pomiędzy fagiem λ a fagami przenoszącymi geny toksyn Shiga, które mogą wpływać na rozwój tych fagów oraz produkcję toksyny. Bakteriofag 933W, tak jak fag λ, posiada trzy miejsca operatorowe OR [37, 59, 95]. Wiązanie represora do miejsc OR1 i OR2 hamuje transkrypcję z promotora pR i aktywuje działanie promotora pM u obu bakteriofagów. Jednak u faga λ dochodzi do kooperatywnego wiązania podobnej ilości represora do obu tych miejsc. Natomiast ilość represora faga 933W potrzebna do związania się z operatorem OR2 jest czterokrotnie wyższa niż do ope-ratora OR1. Związane jest to z niższą zdolnością wiąza-nia się represora do operatora OR2 i brakiem koopera-tywności wiązania [37]. Powodować to może mniejszą stabilność lizogenów faga 933W niż faga λ, ponieważ mniejsze różnice w ilości represora mogą prowadzić do indukcji profaga. U obu tych fagów wiązanie represora do operatora OR3 powoduje zahamowanie ekspresji z promotora pM [37, 59, 95].

Kolejną różnicą pomiędzy tymi bakteriofagami jest to, że fag 933W posiada tylko dwa miejsca operato-rowe OL a nie trzy tak jak fag λ. Jednak wiązanie repre-sora 933W do tylko dwóch miejsc operatorowych jest wystarczające do zahamowania ekspresji z promotora pL. Również miejsce cięcia represora przez białko RecA jest inne u faga 933W niż u faga λ. Do cięcia u faga 933W dochodzi pomiędzy leucyną a glicyną a nie alaniną i gli-cyną jak to ma miejsce u faga λ [37].

Natomiast bakteriofag H-19B posiada cztery miejsca operatorowe OR. Represor CI faga H-19B najpierw wiąże się do operatora OR1, a potem do pozostałych opera-torów. Jednak ilość represora potrzebna do związania się z operatorami OR2 i OR3 jest tylko nieco wyższa niż w OR1. Również siła wiązania represora do operatora OR2 wydaje się być niezależna od związania represora w operatorze OR1. Bakteriofag H-19B tak jak fag λ posiada trzy miejsca OL [79]. Białko represora fagów kodujących toksynę Shiga bierze również udział w pro-cesie insercji drugiego takiego bakteriofaga do genomu gospodarza. Powoduje też, że podwójne lizogeny są bardziej stabilne, a co za tym idzie rzadziej dochodzi do indukcji profaga i rozpoczęcia cyklu litycznego, czyli zmniejsza ilość produkowanej toksyny [77].

9. podsumowanie

Mimo intensywnych badań dotyczących bakteriofa-gów przenoszących geny toksyn Shiga nadal niewiele wiadomo co powoduje indukcję tych profagów, a co za tym idzie produkcję dużej ilości toksyny w jelitach czło-wieka [27]. Wykazano, że dodanie enterokrwotocznej E. coli do hodowli tkankowej ludzkich neutrofili powo-

duje produkcję i uwolnienie toksyny Shiga. Neutrofile podczas kontaktu z patogenem wydzielają nadtlenek wodoru [88], który jest czynnikiem uszkadzającym DNA. W tym świetle ważne wydają się ostatnie donie-sienia o indukcji profagów niosących geny toksyn Shiga pod wpływem działania nadtlenku wodoru [45, 46]. Warto zauważyć, że podczas stanu zapalnego wywoła-nego toksyną Shiga dochodzi do przenikania neutro-fili w miejsce zapalne. Toksyna ta powoduje również opóźnienie apoptozy neutrofili, co może prowadzić do dodatkowych uszkodzeń tkanek przez te komórki [42]. Co więcej, również bakterie obecne w ludzkim jelicie mogą powodować powstawanie reaktywnych form tlenu [39], które powodują indukcję profaga λ i innych fagów lambdoidalnych [43].

Należy stwierdzić, że niewiele też wiadomo o roz-woju bakteriofagów niosących geny toksyn Shiga. Nasza wiedza w tym względzie opiera się głównie na znajo-mości procesów zachodzących podczas rozwoju faga λ, najlepiej poznanego przedstawiciela fagów lambdoidal-nych. Problem ten dotyczy zarówno rozwoju lizogenicz-nego jak i rozwoju litycznego po indukcji profaga, i to zarówno w warunkach laboratoryjnych jak i w warun-kach powolnego wzrostu komórek bakteryjnych wystę-pujących w jelitach. Wiadomo, że rozwój bakteriofaga λ zależy od stanu fizjologicznego komórek gospodarza i jest zahamowany podczas powolnego wzrostu ko mórek bakteryjnych [47].

Konkludując, należy podkreślić iż pomimo podo-bieństw w budowie i funkcji pomiędzy fagiem λ a fagami lambdoidalnymi niosącymi geny toksyn Shiga, szcze-

gółowe mechanizmy regulujące rozwój tych ostatnich, a co zatem idzie produkcję toksyn, pozostają nie-dostatecznie poznane, szczególnie przy wzięciu pod uwagę specyficznych warunków panujących w świe-tle ludzkiego jelita jako środowiska bytowania EHEC. Konieczne są zatem dalsze intensywne badania nad tymi mechanizmami, które w ostateczności powinny pozwo-lić nam poznać sposoby zapobiegania skutkom infekcji szczepami EHEC lub efektywnego leczenia.

piśmiennictwo

1. Acheson D.W.K., Reidl J., Zhang X., Keusch G.T., Mekalanos J.J., Waldor M.K.: in vivo transduction witch Shiga toxin 1-enco-ding phage. infect. immun. 66, 4496–4498 (1998)

2. Aertsen A., Faster D., Michiels C.W.: Induction of Shiga toxin--converting prophage in Escherichia coli by high hydrostatic pressure. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1155–1162 (2005)

3. Allison H.E., Sergeant M.J., James C.E., Saunders J.R., Smith D.L., Sharp R.J., Marks T.S., McCarthy A.J.: Immunity profiles of wild-type and recombinant Shiga-like toxin-enco-ding bacteriophages and characterization of novel double lyso-gens. infect. immun. 71, 3409–3418 (2003)

4. Altuvia S., Oppenheim A.B.: Translational regulatory signals within the coding region of the bacteriophage λ cIII gene. J. Bacteriol. 167, 415–419 (1986)


5. Asadulghani M., Ogura Y., Ooka T., Itoh T., Sawaguchi A., Iguchi A., Nafayama K., Hayashi T.: The defective prophage pool of Escherichia coli O157: prophage-prophage interactions potentiate horizontal transfer of virulence determinants. PLos Pathog. 5, e1000408 (2009)

6. Atsumi S., Little J. W.: Role of the lytic repressor in prophage induction of phage λ as analyzed by a module-replacement approach. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 103, 4558–4563 (2006)

7. Babic A. C., Little J. W.: Cooperative DNA binding by CI repres-sor is dispensable in a phage λ variant. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 104, 17741–17746 (2007)

8. Bergholz T.M., Wick L.M., Qi W., Riordan J.T., Ouellette L.M., Whittam T.S.: Global transcriptional response of Escheri-chia coli O157:H7 to growth transitions in glucose minimal medium. BMc Microbiol. 7, 97 (2007)

9. Berry J., Summer E.J., Struck D.K., Young R.: The final step in the phage infection cycle: the RZ and Rz1 lysis proteins link the inner and outer membranes. Mol. Microbiol. 70, 341–35 (2008)

10. Brussow H., Hendrix R.W.: Phage genomics: small is beautiful. cell, 108, 13–16 (2002)

11. Calderwood S.B., Mekalanos J.J.: Iron regulation of Shiga-like toxin expression in Escherichia coli is mediated by the fur locus. J. Bacteriol. 169, 4759–4764 (1987)

12. Campbell A., Botstein D.: Evolution of the lambdoid phages (w:) Lambda II red. Hendrix R.W., Roberts J.W., Stahl F.W., Weisberg R.A., Cold Spring Harbor, Lab. Press, New York, USA, 1983 s. 365–380

13. Canchaya C., Fournous G., Chibani-Chennoufi S., Dillman M.-L., Brussow H.: Phage as agents of lateral gene transfer. curr. opinion Microbiol. 6, 417–424 (2003)

14. Creuzburg K., Kohler B., Hempel H., Schreier P., Jacobs E., Schmidt H.: Genetic structure and chromosomal integration site of the cryptic prophage CP-1639 encoding Shiga toxin 1. Microbiol. 151, 941–950 (2005)

15. Cornick N.A., Helgerson A.F., Mai V., Ritchie J.M., Acheson D.W.K.: In Vivo transduction of an Stx-encoding phage in ruminants. Appl. Environ. Microbiol. 72, 5086–5088 (2006)

16. Deighan P., Montero Diez C., Leibman M., Hochschild A., Nickels B.E.: The bacteriophage λ Q antiterminator protein con-tacts the β-flap domain of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 105, 15305–15310 (2008)

17. Edgar R., Rokney A., Feeney M., Semsey S., Kessel M., Goldberg M.B., Adhya S., Oppenheim A.B.: Bacteriophage infection is targeted to cellular poles. Mol. Microbiol. 68, 1107–1116 (2008)

18. Evans T., Bowers R.G., Mortimer M.: Modelling the stability of Stx lysogens. J. Theor. Biol. 248, 241–250 (2007)

19. Fogg P.C.M., Gossage S.M., Smith D.L., Saunders J.R., McCarthy A.L., Allison H.E.: Identification of multiple inte-gration sites for Stx-phage φ24B in the Escherichia coli genome, description of a novel integrase and evidence for a functional anti-repressor. Microbiol. 153, 4098–4110 (2007)

20. Fuchs S., Muhldorfer I., Donohue-Rolfe A., Kerenyi M., Emody L., Alexiev R., Nenkov P., Hacker J.: Influence of RecA on in vivio virulence and Shiga toxin 2 production in Escheri-chia coli pathogens. Microb. Pathog. 27, 13–23 (1999)

21. Gamage S.D., Strasser J.E., Chalk C.L., Weiss A.A.: Nonpatho-genic Escherichia coli can contribute to the production of Shiga toxin. infect. immun. 71, 3107–3115 (2003)

22. Gamage S.D., Patton A.K., Hanson J.F., Weiss A.A.: Diversity and host range of Shiga toxin-encoding phage. infect. immun. 72, 7131–7139 (2004)

23. Gamage S.D., Patton A.K., Strasser J.E., Chalk C.L., Weiss A.A.: Commensal bacteria influence Escherichia coli O157:H7 per-sistence and Shiga toxin production in the mouse intestine. infect. immun. 74, 1977–1983 (2006)

24. Garcia-Aljaro C., Muniesa M., Jofre J., Blanch A.R.: Genotypic and phenotypic diversity among induced, stx2-carrying bac-teriophages from environmental Escherichia coli strains. Appl. Environ. Microbiol. 75, 329–336 (2009)

25. Giese K.C., Michalowski C.B., Little J.W.: RecA-dependent cleavage of LexA dimers. J. Mol. Biol. 377, 148–161 (2008)

26. Grif K., Dierich M.P., Karch H., Allerberger F.: Strain-spe-cific differences in the amount of Shiga toxin released from enterohemorrhagic Escherichia coli O157 following exposure to subinhibitory concentrations of antimicrobial agents. Eur. J. Microbiol. infect. Dis. 17, 761–766 (1998)

27. Gyles C.L.: Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. J. Anim. sci. 85, 45–62 (2007)

28. Hendrix R.W., Smith M.C.M., Burns R.N., Ford M.E., Hatfull G.F.: Evolutionary relationships among diverse bacte-riophages and prophages: all the world’s a phage. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 96, 2192–2197 (1999)

29. Hendrix R.W., Lawrence J.G., Hatfull G.F., Casjens S.: The origins and ongoing evolution of viruses. Trends Microbiol. 8, 504–508 (2000)

30. Hendrix R.W.: Bacteriophage genomics. curr. opinion Micro-biol. 6, 506–511 (2003)

31. Herold S., Karch H., Schmidt H.: Shiga toxin-encoding bac-teriophages-genomes in motion. int. J. Med. Microbiol. 294, 115–121 (2004)

32. Herold S., Siebert J., Huber A., Schmidt H.: Global expression of prophage genes in Escherichia coli O157:H7 strain EDL933 in response to norfloxacin. Antimicrob. Agents chemother. 49, 931–944 (2005)

33. Jasiecki J., Węgrzyn G.: Growth-rate dependent RNA poliade-nylation in Escherichia coli. EMBo rep. 4, 172–177 (2003)

34. Jeembaeva M., Castelnovo M., Larsson F., Evilevitch A.: Osmo-tic pressure: resisting or promoting DNA ejection from phage? J. Mol. Biol. 381, 310–323 (2008).

35. Johansen B.K., Wasteson Y., Granum P.E., Brynestad S.: Mosaic structure of Shiga-toxin-2-encoding phages isolated from Escherichia coli O157:H7 indicates frequent gene exchange between lambdoid phage genoms. Microbiol. 147, 1929–1936 (2001)

36. Kobiler O., Rokney A., Oppenheim A.B.: Phage lambda CIII: a protease inhibitor regulating the lysis-lysogeny decision. PLos oNE, 2, e363 (2007)

37. Koudelka A.P., Hufnagel L.A., Koudelka G.B.: Purification and characterization of the repressor of the Shiga toxin-encoding bacteriophage 933W: DNA binding, gene regulation and auto-cleavage. J. Bacteriol. 186, 7659–7669 (2004)

38. Kuhn J., Campbell A.: The bacteriophage λ attachment site in wild strains of Escherichia coli. J. Mol. Evol. 53, 607–614 (2001)

39. Kumar A., Wu H., Collier-Hyams L.S., Hansen J.M., Li T., Yamoah K., Pan Z.Q., Jones D.P., Neish A.S.: Commensal bac-teria modulate cullin-dependent signaling via generation of reactive oxygen species. EMBo J. 26, 4457–4466 (2007)

40. Law D.: Virulence factors of Escherichia coli O157 and other Shiga toxin-producing E. coli. J. App. Microbiol. 88, 729–745 (2000)

41. Lim J.Y., Yoon J.W., Hovde C.J.: A brief overview of Escherichia coli O157:H7 and its plasmid O157. J. Microbiol. Biotechnol. 20, 1–10 (2010)

42. Liu J., Akahoshi T., Sasahana T., Kitasato H., Namai R., Sasaki T., Inoue M., Kondo H.: Inhibition of neutrophil apop-tosis by verotoxin 2 derived from Escherichia coli O157:H7. infect immun. 67, 6203–6205 (1999)

43. Liu Y., Zhang Q., Fang C., Zhu S., Tang Y., Huang S.: Effect of glutathione on UV induction of prophage lambda. Arch. Micro-biol. 183, 444–449 (2005)


44. Livny J., Friedman D.I.: Characterizing spontaneous induction of Stx encoding phages using a selectable reporter system. Mol. Microbiol. 51, 1691–1704 (2004)

45. Łoś J.M., Łoś M., Węgrzyn G., Węgrzyn A.: Differential effi-ciency of induction of various lambdoid prophages responsible for production of Shiga toxin in response to different induction agents. Microb. Pathogen. 47, 289–298 (2009)

46. Łoś J.M., Łoś M., Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Hydrogen peroxide--mediated induction of the Shiga toxin-converting lambdoid prophages ST2–8624 in Escherichia coli O157:H7. FEMs immu-nol. Med. Microbiol. 58, 322–329 (2010)

47. Łoś M., Golec P., Łoś J.M., Węglewska-Jurkiewicz A., Czyż A., Węgrzyn A., Węgrzyn G., Neubauer P.: Effective inhibition of lytic development of bacteriophages λ, P1 and T4 by starvation of their host, Escherichia coli. BMc Biotechnol. 7, 13 (2007)

48. Łoś M., Łoś J.M., Węgrzyn G.: Rapid identification of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) using electric biochips. Diagn. Mol. Pathol. 17, 179–184 (2008)

49. Matsumoto M., Suzuki M., Takahashi M., Hirose K., Minagawa H., Ohta M.: Identification and epidemiological description of enterohemorrhagic Escherichia coli O157 strains producing low amounts of Shiga toxin 2 in Aichi prefecture. Jpn. J. infect. Dis. 61, 442–445 (2008)

50. Matsushiro A., Sato K., Miyamoto H., Yamamura T., Honda T.: Induction of prophages of enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 with norfloxacin. J. Bacteriol. 181, 2257–2260 (1999)

51. Mühldorfer I., Hacker J., Keusch G.T., Acheson D.W., Tschäpe H., Kane A. V., Ritter A., Olschläger T., Donohue--Rolfe A.: Regulation of the Shiga-like toxin II operon in Esche-richia coli. infect immun. 64, 495–502 (1996)

52. Muniesa M., Recktenwald J., Bielaszewska M., Karch H., Schmidt H.: Characterization of a Shiga toxin 2e-converting bacteriophage from an Escherichia coli strain of human origin. infect. immun. 68, 4850–4855 (2000)

53. Muniesa M., Simon M., Prats G., Ferrer D., Panella H., Jofre J.: Shiga toxin 2-converting bacteriophages associated with clonal variability in Escherichia coli O157:H7 strains of human origin isolated from single outbreak. infect. immun. 71, 4554–4562 (2003)

54. Nataro J.P., Kaper J.B.: Diarrheagenic Escherichia coli. clin. Microbiol. rev. 11, 142–403 (1998)

55. Nejman B., Łoś J.M., Łoś M., Węgrzyn G., Wegrzyn A.: Plas-mids derived from lambdoid bacteriophages as models for stu-dying replication of mobile genetic elements responsible for the production of Shiga toxins by pathogenic Escherichia coli strains. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 17, 211–220 (2009)

56. Nejman B., Nadratowska-Wesołowska B., Szalewska-Pałasz A., Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Replication of plasmids derived from Shiga toxin-converting bacteriophages in starved Escherichia coli. Microbiol. 157, 220–233 (2011)

57. Nickels B.E., Roberts C.W., Roberts J.W., Hochschild A.: RNA--mediated destabilization of the σ70 region 4/β flap interaction facilitates engagement of RNA polymerase by the Q antitermi-nator. Mol. cell. 24, 457–468 (2006)

58. Ohnishi M., Kurokawa K., Hayashi T.: Diversification of Esche-richia coli genomes: are bacteriopheges the major contributors? Trends Microbiol. 9, 481–485 (2001)

59. Oppenheim A.B., Kobiler O., Stavans J., Court D.L., Adhya S.: Switches in bacteriophage lambda development. Annu. rev. Genet. 39, 409–429 (2005)

60. Osterhout R.E., Figueroa I.A., Keasling J.D., Arkin A.P.: Global analysis of host response to induction of a latent bacteriophage. BMc Microbiol. 7, 82 (2007)

61. Papke R.T., Doolittle W.F.: Phage evolution: new worlds of genomic diversity. curr. Biology, 13, 606–607 (2003)

62. Pennington H.: Escherichia coli O157. Lancet, 376, 1428–1435 (2010)

63. Plunkett III G., Rose D.J., Durfee T.J., Blattner F.R.: Sequence of Shiga toxin 2 phage 933W from Escherichia coli O157:H7: Shiga toxin as a phage late-gene product. J. Bacteriol. 181, 1767–1778 (1999)

64. Polissi A., Goffin L., Georgopoulos C.: The Escherichia coli heat shock response and bacteriophege λ development. FEMs Microbiol. rev. 17, 159–169 (1995)

65. Razzaq S.: Hemolytic Uremic Syndrome: An emerging health risk. Am. Fam. Physician, 74, 991–996 (2006)

66. Reissbrodt R., Hammes W.P., Bello F., Prager R., Fruth A., Hantke K., Rakin A., Starcic-Erjavec M., Williams P.H.: Inhi-bition of growth of Shiga toxin-producing Escherichia coli by nonpathogenic Escherichia coli. FEMs Microbiol. Lett. 290, 62–69 (2009)

67. Robinson C.M., Sinclair J.F., Smith M.J., O’Brien A.D.: Shiga toxin of enterohemorrhagic Escherichia coli type O157:H7 pro-motes intestinal colonization. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 103, 9667–9672 (2006)

68. Rozanov D.V., D’ari R., Sineoky S.P.: RecA-independent path-ways of lambdoid prophage induction in Escherichia coli. J. Bac-teriol. 180, 6306–6315 (1998)

69. Sablet T., Bertin Y., Vareille M., Girardeau J., Garrivier A., Gobert A.P., Martin C.: Differential expression of stx2 variants in Shiga toxin-producing Escherichia coli belonging to sero-pathotypes A and C. Microbiol. 154, 176–186 (2008)

70. Savva C.G., Dewey J.S., Deaton J., White R.L., Struck D.K., Holzenburg A., Young R.: The holin of bacteriophage lambda forms rings with large diameter. Mol. Microbiol. 69, 784–793 (2008)

71. Scheutz F, Møller Nielsen E., Frimodt-Møller J., Boisen N., Morabito S., Tozzoli R., Nataro J.P., Caprioli A.: Characteri-stics of the enteroaggregative Shiga toxin/verotoxin-producing Escherichia coli O104:H4 strain causing the outbreak of haemo-lytic uraemic syndrome in Germany, May to June 2011. Euro surveill. 16, pii=19889 (2011)

72. Schmidt H., Bielaszewska M., Karch H.: Transduction of ente-ric Escherichia coli isolates with a derivative of Shiga toxin 2-encoding bacteriophage φ3538 isolated from Escherichia coli O157:H7. Appl. Environ. Microbiol. 65, 3855–3861 (1999)

73. Schmidt H.: Shiga-toxin-converting bacteriophages. res. Micro-biol. 152, 687–695 (2001)

74. Scott Samuels D., Garon C.F.: Coumermycin A1 inhibits growth and induces relaxation of supercoiled plasmids in Borrelia burgdorferi, the lyme disease agent. Antimicrob. Agents che-mother. 37, 46–50 (1993)

75. Sekse C., Solheim H., Urdahl A.M., Wasteson Y.: Is lack of susceptible recipients in the intestinal environment the limi-ting factor for transduction of Shiga toxin-encoding phages? J. Appl. Microbiol. 105, 1114–1120 (2008)

76. Serra-Moreno R., Jofre J., Muniesa M.: Insertion site occu-pancy by stx2 bacteriophages depends on the locus availability of the host strain chromosome. J. Bacteriol. 189, 6645–6654 (2007)

77. Serra-Moreno R., Jofre J., Muniesa M.: The CI repressor of Shiga toxin-converting prophages are involved in coinfection of Escherichia coli strains, which causes a down regulation in the production of Shiga toxin. J. Bacteriol. 190, 4722–4735 (2008)

78. Shaikh N., Tarr P.I.: Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin-enco-ding bacteriophages: integrations, excisions, truncations and evolutionary implications. J. Bacteriol. 185, 3596–3605 (2003)

79. Shi T., Friedman D.I.: The operator-early promoter regions of Shiga-toxin bearing phage H-19B. Mol. Microbiol. 41, 585–599 (2001)


80. Shkilnyj P., Koudelka G.B.: Effect of salt shock on stability of λimm434 lysogens. J. Bacteriol. 189, 3115–3123 (2007)

81. Smith D.L., James C.E., Sergeant M.J., Yaxian Y., Saunders J.R., McCarthy A.J., Allison H.E.: Short-tailed Stx phages exploit the conserved YaeT protein to disseminate Shiga toxin genes among Enterobacteria. J. Bacteriol. 189, 7223–7233 (2007)

82. St-Pierre F., Endy D.: Determination of cell fate selection during phage lambda infection. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 105, 20705–20710 (2008)

83. Strauch E., Schaudinn C., Beutin L.: First-time isolation and characterization of a bacteriophage encoding the Shiga toxin 2c variant, which is globally spread in strains of Escherichia coli O157. infect. immun. 72, 7030–7039 (2004)

84. Strauch E., Hammerl J.A., Konietzny A., Schneiker-Bekel S., Arnold W., Goesmann A., Puhler A., Beutin L.: Bacteriophage 2851 is a prototype phage for dissemination of the Shiga toxin variant gene 2c in Escherichia coli O157:H7. infect. immun. 76, 5466–5477 (2008)

85. Sung L.M., Jackson M.P., O’Brien A.D., Holmes R.K.: Transcrip-tion of the Shiga-like toxin type II and Shiga-like toxin type II variant operons of Escherichia coli. J. Bacteriol. 172, 6386–6395 (1990)

86. Tyler J.S., Mills M.J., Friedman D.I.: The operator and early promoter region of the Shiga toxin type 2-encoding bacterio-phage 933W and control of toxin expression. J. Bacteriol. 186, 7670–7679 (2004)

87. Wagner P.L., Acheson D.W.K., Waldor M.K.: Isogenic lysogens of diverse Shiga toxin 2-encoding bacteriophages produce markedly different amounts of Shiga toxin. infect. immun. 67, 6710–6714 (1999)

88. Wagner P.L., Acheson D.W.K., Waldor M.K.: Human neutrophils and their products induce Shiga toxin production by entero hemorrhagic Escherichia coli. infect. immun. 69, 1934–1937 (2001)

89. Wagner P.L., Neely M.N., Zhang X., Acheson D.W.K., Waldor M.K., Friedman D.I.: Role for a phage promoter in Shiga toxin 2 expression from pathogenic Escherichia coli strain. J. Bacteriol. 183, 2081–2085 (2001)

90. Wagner P.L., Livny J., Neely M.N., Acheson D.W.K., Fried-man D.I., Waldor M.K.: Bacteriophage control of Shiga toxin 1

production and release by Escherichia coli. Mol. Microbiol. 44, 957–970 (2002)

91. Waldor M.K.: Bacteriophage biology and bacterial virulence. Trends Microbiol. 6, 295–297 (1998)

92. Weinstein D.L., Holmes R.K., O’Brien A.: Effects of iron and temperature on Shiga-like toxin I production by Escherichia coli. infect. immun. 56, 106–111 (1988)

93. Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Replikacja DNA bakteriofaga λ: nowe odkrycia dokonane przy użyciu starego modelu badawczego. Post. Biochem. 52, 42–48 (2006)

94. Węgrzyn A., Węgrzyn G.: Formation and stability of the bacte-riophage λ replication complexes in UV-irradiated Escherichia coli. curr. Microbiol. 41, 157–160 (2000)

95. Węgrzyn G., Węgrzyn A.: Genetic switches during bacterio-phage lambda development. Prog. Nucleic Acid res. Mol. Biol. 79, 1–48 (2005)

96. Yamamoto T., Kojio S., Taneike I., Nakagawa S., Iwakura N., Wakisaka-Saito N.: 60Co irradiation of Shiga toxin (Stx)-produ-cing Escherichia coli induces Stx phage. FEMs Microbiol. Lett. 222, 115–121 (2003)

97. Zhang X., McDaniel A.D., Wolf L/E., Keusch G.T., Waldor M.K., Acheson D.W.K.: Quinolone antibiotics induce Shiga toxin--encoding bacteriophages, toxin production and death in mice. J. infect. Dis. 181, 664–70 (2000)

98. Zoja C., Buelli S., Morigi M.: Shiga toxin-associated hemolytic uremic syndrome: pathophysiology of endothelial dysfunction. Pediatr. Nephrol. 25, 2231–2240 (2010)

Autorzy pragną wyrazić podziękowania wszystkim członkom zespołu naukowego z Katedry Biologii Molekularnej Uniwersy- tetu Gdańskiego oraz Pracowni Biologii Molekularnej (afiliowa-nej przy Uniwersytecie Gdańskim) Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, pracującego nad regulacją rozwoju bakterio fagów niosących geny kodujące toksyny Shiga, za zaanga- żowanie w badania oraz stymulujące dyskusje. Wyżej wspomniane badania są finansowane w ramach grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (projekt nr N N301 192439, kierownik: dr hab., prof. PAN Alicja Węgrzyn).


1. Wstęp

Poliomawirusy, należące do rodziny Polyomaviridae, powodują zakażenia wielu różnych gatunków ssaków, w tym również człowieka [6]. Obecnie znanych jest 5 poliomawirusów ludzkich: wirus BK (BKV), wirus JC (JCV), wirus WU (WUV), wirus KI (KIV) oraz polio-mawirus komórek Merkela (MCV) [24]. Poliomawi-rusy ludzkie po raz pierwszy odkryto w roku 1971, gdy z mózgu osoby chorej na postępującą wieloogniskową leukoencefalopatię (progressive multifocal leukoen-cephalopathy – PML) wyizolowano wirusa JC, a BKV z moczu pacjenta po allogenicznym przeszczepieniu nerki [37, 51]. W roku 2007 dwa niezależne zespoły ze Szwecji (Karolinska Institutet) oraz ze Stanów Zjedno-czonych (Washington University), wyizolowały z mate-riałów klinicznych pochodzących z układu oddecho-wego dwa kolejne poliomawirusy ludzkie: KI oraz WU [29, 42]. Niedługo po tym odkryciu, w roku 2008, w zmienionych nowotworowo komórkach Merkela zidentyfikowany został następny poliomawirus czło-wieka – MCV [11]. Określenia BKV oraz JCV pochodzą od inicjałów pacjentów, od których zostały po raz pierw-

szy wyizolowane, natomiast poliomawirusy WU oraz KI nazwano od instytucji, w których zostały wykryte [44]. Jedynie nazewnictwo MCV odbiega od tradycyjnego nazewnictwa opartego na pochodzeniu i wywodzi się z rodzaju komórek nowotworowych, w których po raz pierwszy zidentyfikowano ten patogen [23].

Zakażenia poliomawirusami są szeroko rozpowszech-nione u ludzi i zwierząt, a zakażenia pierwotne mają zwykle przebieg bezobjawowy. Szacuje się, że ponad 80% populacji osób dorosłych ma wykrywalne prze-ciwciała przeciwko poliomawirusom BK oraz JC [2, 33, 35]. Zakażenia BKV, KIV oraz WUV zazwyczaj mają miejsce we wczesnym dzieciństwie, natomiast JCV kilka do kilkunastu lat później [1, 6]. Drogi transmisji polio-mawirusów nie zostały do końca poznane; sugeruje się, że wirusy te przenoszone są drogą oddechową, fekalno--oralną, a także wraz z krwią i przeszczepianym narzą-dem [6, 22]. W następstwie zakażeń w wieku dziecię-cym wirusy te przedostają się do różnych tkanek, gdzie powodują zakażenie przetrwałe [22]. Za główne miejsce persystencji BKV i JCV uważa się tkanki układu moczo-wego, natomiast KIV i WUV – tkanki układu oddechowego [1, 23, 42]. Poliomawirusy ulegają reaktywacji

zakażEnia ludzkiMi polioMaWirusaMiosób poddanycH iMMunosuprEsji

sylwia rynans*1, tomasz dzieciątkowski1, grażyna Młynarczyk1

Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medycznyul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa

Wpłynęło w marcu 2011 r.

1. Wstęp. 2. Ogólna budowa poliomawirusów. 3. Zakażenia układu oddechowego. 4. Śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej. 5. Krwotoczne zapalenie pęcherza. 6. Postępująca wieloogniskowa leukoencefalopatia. 7. Stwardnienie rozsiane – przypuszczalny udział poliomawirusów w patogenezie. 8. Choroby nowotworowe powodowane przez ludzkie poliomawirusy. 9. Diagnostyka. 10. Terapia zakażeń poliomawirusami. 11. Profilaktyka. 12. Podsumowanie

polyomavirus diseases of immunosuppressed patients

Abstract: The human polyomaviruses are a group of nonenveloped, icosahedral viruses with a small, supercoiled double-stranded DNA genome. Nowadays, there are five known human polyomaviruses widespread within population: BK, JC, WU, KI and Merkel cell polyomavirus. After primary infection, they establish ubiquitous, persistent infections in healthy individuals. Reactivation can occur when the immune system is impaired, leading to disease progression. All of them are recognized as important pathogens causing severe morbidity and mortality in immunocompromised patients, especially in persons who have received a solid-organ transplant. They cause a variety of diseases in this group of patients, such as: BKV nephropathy, hemorrhagic cystitis, multifocal leukoencephalopathy, some types of cancer and also probably multiple sclerosis. This review describes the general aspects of human polyomavirus infections and pathogenicity. Commonly used diagnostic and therapeutic procedures in the field are also discussed.

1. Introduction. 2. Polyomavirus morphology. 3. Respiratory tract infection. 4. Polyomavirus nephropathy. 5. Hemorrhagic cystitis. 6. Multifocal leukoencephalopathy. 7. JC virus and multiple sclerosis. 8. Human polyomaviruses and cancer. 9. Diagnostics of polyomaviral diseases. 10. Treatment of polyomavirus infections 11. Prevention and prophylaxis. 12. Summary

słowa kluczowe: poliomawirusy ludzkie, immunosupresja, zakażeniekey words: human polyomaviruses, immunosuppression, infection

* Autor korespondencyjny: Sylwia Rynans, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny; ul. Chałubińskiego 5, 02-004 Warszawa; tel: 022 628 27 39; e-mail: [email protected]

192 SYLWIA RYNANS, TOMASZ DZIECIĄTKOWSKI, GRAŻYNA MŁYNARCZYK

w wyniku osłabienia układu immunologicznego, głów-nie na skutek immunosupresji związanej z przeszcze-pieniem organów [6, 49]. Wówczas mogą one powo-dować zakażenia układu oddechowego (KIV, WUV), śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej (BKV), krwotoczne zapalenie pęcherza (BKV), postępującą wie-loogniskową leukoencefalopatię (JCV) [13, 23]. Są także prawdopodobnie zaangażowane w patogenezę stward-nienia rozsianego (JCV), a także niektórych chorób nowotworowych (JCV, MCV) [13, 23]. JCV oraz BKV wykryto w nerkach, migdałkach oraz leukocytach, a JCV dodatkowo w tkankach płuc uzyskanych od pacjentów z postępującą wieloogniskową leukoencefalopatią. KIV oraz WUV można wyizolować z materiałów klinicz-nych układu oddechowego, a także z tkanki limfoidalnej pacjentów poddanych immunosupresji [29].

2. ogólna budowa poliomawirusów

Genom poliomawirusów stanowi kolisty, dwuni-ciowy DNA zawierający ok. 5000 par zasad (pz). Jest on zamknięty w ikozaedralnym kapsydzie o średnicy ok. 40–45 nm złożonym z 72 kapsomerów i pozbawionym osłonki. Wirusowe DNA zawiera 3 różne funkcjonalnie regiony: wczesny i późny region kodujący oraz niekodu-jący region regulatorowy. Region regulatorowy zawiera miejsce początku replikacji DNA oraz czynniki trans-krypcyjne regulujące ekspresję genów wczesnych oraz późnych [6]. Region wczesny, transkrybowany przed replikacją DNA, koduje dwa białka niestrukturalne tzw. duży i mały antygen T, natomiast region późny koduje białka kapsydu VP1, VP2, VP3 oraz niestrukturalną agnoproteinę [8]. Genomy BKV oraz JCV wykazują względem siebie ok. 72% homologii [10].

DNA poliomawirusa BK zawiera 5153 pz. Na podsta-wie różnic w sekwencji nukleotydowej genomu, wyróż-

niamy 4 podtypy wirusa oznaczone od I do IV, w tym 4 podgrupy w obrębie podtypu I (a, b1, b2, c) [28]. BKV wiąże się do powierzchni komórki gospodarza przez receptor, który stanowi glikoproteina zawiera-jąca łańcuchy N-glikanowe. Po endocytozie wirusa jego cząstki transportowane są do jądra komórkowego poprzez retikulum endoplazmatyczne. Białka kapsydu są usuwane przed wniknięciem DNA do jądra komór-kowego, w którym następuje proces transkrypcji. Poja-wienie się antygenu T w komórkach permisywnych powoduje przejście infekcji w zakażenie produktywne. Antygen T (T-Ag) występuje w przeważającej części (95%) w jądrze komórki gospodarza w formie wolnej lub związanej z komórkowym DNA. T-Ag jest podsta-wowym białkiem wirusowym, niezbędnym do replika-cji wirusowego materiału genetycznego. Ma ono także zdolność do regulacji cyklu komórkowego, przez bezpo-średni wpływ na komórkowe czynniki transkrypcyjne, takie jak c-Jun czy c-Fos [26]. Nowe wiriony składane są ze zreplikowanego wirusowego DNA oraz białek strukturalnych VP1, VP2 oraz VP3. Wydostają się one z komórki poprzez jej lizę, aczkolwiek przy zakażeniach persystentnych można je także wykryć w pęcherzykach znajdujących się wewnątrz cytoplazmy [22].

Genom wirusa JC zawiera DNA o długości 5130 pz, a jego dwustronna organizacja przypomina organiza-cję genomu BKV [19]. JCV ulega adsorpcji do komórki poprzez wiązanie reszt kwasu sialowego, a jego recep-torem jest najprawdopodobniej receptor serotoninowy 5HT2AR [41]. Wirus dostaje się do komórek na drodze endocytozy i transportowany jest do jądra komórko-wego w którym zachodzi replikacja DNA oraz trans-krypcja genów wczesnych i późnych [25]. Wyróżniamy dwa warianty JCV: archetypowy oraz przestawiony. Forma archetypowa zawiera niezmieniony region regu-latorowy i wykrywana jest zwykle w moczu. W wyniku mutacji niektórych sekwencji regulatorowych, powstaje wariant „przestawiony”, o innym tropizmie tkankowym oraz wyższym potencjale patogennym, przez co może powodować rozwój chorób takich jak postępująca wie-loogniskowa leukencefalopatia [26].

Wirusy KI oraz WU zaklasyfikowano do poliomawi-rusów ludzkich ze względu na wysoką homologię oraz podobieństwo w organizacji genomu do poliomawi-rusów BK i JC. Mają one regiony kodujące antygeny T oraz białeka strukturalne VP1, VP2 i VP3, nie kodują jednak białka niestrukturalnego agnoproteiny [11]. KIV oraz WUV wykazują wysoką homologię we wczesnym regionie kodującym, natomiast ich regiony późne znacz-nie się różnią [4]. Genom wirusa KI zawiera 5040 pz, natomiast wirusa WU – 5229 pz [45].

Spośród ludzkich poliomawirusów MCV ma naj-większy genom, który zawiera 5387 pz [17]. Duży antygen T wirusa wykazuje jedynie 30% homologii w sto-sunku do dużego antygenu T kodowanego przez pozo-

Rys. 1. Częstość występowania przeciwciał przeciwko poliomawi-rusom BK i JC w odniesieniu do wieku osób badanych [wg 2, 33]

ZAKAŻENIA LUDZKIMI POLIOMAWIRUSAMI OSÓB PODDANYCH IMMUNOSUPRESJI 193

stałe poliomawirusy. Zwiększa to możliwości MCV do wiązania białka p53 oraz integracji wirusowego DNA do DNA ludzkiego, co sprzyja procesom nowotworzenia w komórkach Merkela. Podobnie jak u wirusów JC oraz WU, genom MKV nie koduje agnoproteiny [24].

3. zakażenia układu oddechowego

Zakażenia układu oddechowego, powodowane przez WUV oraz KIV, występują najczęściej u kilkuletnich dzieci, ale także u pacjentów powyżej 45 roku życia [39]. Szacuje się, że poliomawirusy KI powodują ok. 1–2,5% zakażeń układu oddechowego, natomiast poliomawirusy WU 3–7% zakażeń układu oddechowego u dzieci poni-żej 4 roku życia [38]. W badaniach przeprowadzonych przez N e s k e i wsp. poliomawirus WU został wykryty w 4,9% próbek popłuczyn gardłowych uzyskanych od dzieci hospitalizowanych z powodu ostrych zakażeń układu oddechowego. Obecność DNA wirusa stwier-dzono głównie w próbkach pochodzących od pacjentów poniżej 4 roku życia, co wskazuje na większą częstość zakażeń u dzieci w wieku przedszkolnym [40]. Detekcja KIV oraz WUV związana jest zazwyczaj ze współzakaże-niem innymi wirusami, powodującymi infekcje układu oddechowego. Najczęściej wykrywanymi patogenami są w tym przypadku rinowirusy oraz bokawirusy ludzkie, nieco rzadziej adenowirusy [39].

4. Śródmiąższowe zapalenie nerki przeszczepionej

Poliomawirus BK jest rozpoznawany jako główny czynnik etiologiczny śródmiąższowego zapalenia nerki u pacjentów po allogenicznym przeszczepieniu tego na- rządu. Reaktywacja wirusa w wyniku immunosupresji może prowadzić do rozwoju nefropatii u 2–9% biorców, która jest przyczyną odrzucenia przeszczepu w 30–60% przypadkach [52]. Częstość występowania nefropatii związanej z zakażeniem BKV (BK virus nephropathy – BKVN) znacznie wzrosła w ostatnich latach, co może być związane z wprowadzaniem nowych leków immu-nosupresyjnych, wzrostem liczby zabiegów transplan-tacyjnych, a także rozwojem nowych technik diagnos-tycznych [53]. Czynnikami ryzyka choroby mogą być: obecność przeciwciał anty-BKV u dawcy narządu, nie- zgodność antygenów tkankowych HLA dawcy oraz biorcy, starszy wiek pacjenta czy też płeć męska [23]. Do reaktywacji BKV dochodzi zazwyczaj w pierwszym roku po transplantacji. BKVN została najwcześniej zdiagno-zowana już w 6 dniu, natomiast najpóźniej w 6 lat po przeszczepieniu [8]. Do tej pory nie ustalono, czy nefro-patie BKV są wynikiem reaktywacji zakażeń persystent-nych, czy też mogą być powodowane przez nadkażenia poliomawirusami pochodzącymi od dawcy narządu [34].

Nefropatia związana z zakażeniem poliomawirusem BK charakteryzuje się nekrozą kanalików proksymal-nych nerki oraz denudacją błony podstawnej nabłonka, wynikających z zakażenia litycznego komórek nabłon-kowych nerki [23]. Śródmiąższowe zapalenie nerki jest chorobą przewlekłą oraz skąpobjawową, dlatego też jest trudno odróżnialne od ostrego odrzucania prze-szczepu. Ostateczną diagnozę można postawić dopiero po wykonaniu biopsji nerki oraz zaobserwowaniu efektu cyotpatycznego w komórkach nabłonkowych kanali- ków nerkowych [9].

W trakcie rozwoju choroby możemy wyróżnić jej trzy progresywne stadia. Początkowo wirusowe DNA jest wykrywalne w moczu, następnie w surowicy oraz ostatecznie w nerkach pacjenta [6, 47]. Wiremia BKV wykrywalna jest w surowicy większości pacjentów z aktywną nefropatią. Niektóre raporty wskazują na obecność wiremii oraz wirurii nawet u 77% pacjentów po przeszczepieniu nerki. W badaniach przeprowa-dzonych przez K o u k o u l a k i i wsp. wiremię BKV wykryto w 14%, natomiast wirurię BKV w 25% próbek pochodzących od 32 pacjentów po transplantacji nerki. Obserwacje te potwierdzają, że miejscem zapoczątkowa-nia replikacji wirusa jest układ moczowy [27].

Pacjenci po przeszczepieniu nerki, u których doszło do rozwoju nefropatii, stanowią grupę ryzyka rozwoju choroby nowotworowej. Potrzebne są jednak dokład-niejsze badania stwierdzające, czy proces nowotworze-nia związany jest z zakażeniem poliomawirusami, czy też wynika z immunosupresji [7].

5. krwotoczne zapalenie pęcherza

Reaktywacja zakażenia poliomawirusem BK u pa- cjentów po allogenicznym przeszczepieniu komórek krwiotwórczych (Hematopoietic Stem Cell Transplan-tation – HSCT) może powodować rozwój krwotocznego zapalenia pęcherza moczowego (Hemorrhagic cystitis – HC) w 5–40% przypadków [20]. HC u pacjentów hematologicznych objawia się różnostopniową hema-turią oraz bolesnym lub utrudnionym oddawaniem moczu [23]. Na podstawie ostrości hematurii krwo-toczne zapalenie pęcherza można podzielić na cztery stopnie. Z pierwszym stopniem mamy do czynienia przy mikro-, a ze stopniem drugim przy makrohematurii. Trzeci stopień choroby jest obserwowany przy hematu-rii z widocznymi skrzepami, natomiast stopień czwarty przy makrohematurii z widoczną skrzepliną oraz uszko-dzeniem funkcji nerek. Przebieg kliniczny choroby może być łagodny, umiarkowany lub ciężki [31].

Zakażenie BKV zostało po raz pierwszy powiązane z krwotocznym zapaleniem pęcherza w roku 1976, gdy w )moczu pacjenta z HC w mikroskopii elektronowej wykryto cząstki wirusowe podobne do papowawirusów.


Już po 10 latach wiedziano, że wiruria BKV u pacjen-tów po HSCT jest powiązana z rozwojem HC [32]. W badaniach przeprowadzonych przez L e u n g i wsp. dowiedziono, że poziom wirurii u pacjentów z HC jest znacznie wyższy niż w przypadku pacjentów po HSCT wykazujących wirurię, ale u których nie doszło do roz-woju HC. U pacjentów bez HC, poziom wirurii BKV po przeszczepieniu komórek krwiotwórczych wynosił ok. 104–105 kopii/ml, natomiast u pacjentów chorych na krwotoczne zapalenie pęcherza – 108–1010 kopii/ml [30].

Krwotoczne zapalenie pęcherza moczowego u pa- cjentów po transplantacji komórek krwiotwórczych roz-wija się głównie w późnym okresie poprzeszczepowym [14]. Jednakże do rozwoju HC może dojść nawet w kilka dni po transplantacji. W badaniach przeprowadzonych przez E r a r d i wsp., spośród 33% biorców allogenicz-nego przeszczepu komórek krwiotwórczych u których wykryto wiremię BKV, do rozwoju HC doszło u 43% pacjentów, średnio w 9 dniu po przeszczepieniu. Krwo-toczne zapalenie pęcherza u tych osób skorelowane było m.in. ze zmniejszoną liczbą płytek krwi [16].

Potencjalnymi czynnikami ryzyka rozwoju krwo-tocznego zapalenia pęcherza związanego z reaktywacją zakażenia BKV są: rodzaj zastosowanych leków immu-nosupresyjnych, podtyp poliomawirusa BK, poziom wirurii, a także, zwłaszcza u pacjentów pediatrycznych, występowanie choroby przeszczep przeciwko gospoda-rzowi (Graft-versus-host disease – GvHD) [14, 21].

6. postępująca wieloogniskowa leukoencefalopatia

Poliomawirus JC jest czynnikiem etiologicznym ze- społu klinicznego znanego jako postępująca wieloognis-kowa leukoencefalopatia (PML). Jest on zaburzeniem powodującym demielinizację tkanki nerwowej central-nego układu nerwowego oraz pojawieniem się oligo-dendrocytów o nieprawidłowej budowie, będących głównym miejscem aktywnego zakażenia JCV. PML charakteryzuje się niedowładem połowicznym, demen-cją lub otępieniem, zaburzeniami mowy oraz widzenia [26]. Objawy nasilają się w trakcie trwania choroby, która w ciągu 3 do 6 miesięcy może spowodować zgon pacjenta. Nie jest do końca jasne czy zakażenie mózgu spowodowane przez JCV wynika z reaktywacji wirusa, czy też jest zakażeniem de novo [23]. Według F o c o s i i wsp. zakażenie JCV u pacjentów hematologicznych po przeszczepie komórek krwiotwórczych jest znaczącym czynnikiem ryzyka rozwoju PML [18].

Postępująca wieloogniskowa leukencefalopatia roz-wija się często u osób zakażonych HIV oraz pacjentów poddanych immunosupresji. Liczba pacjentów z HIV chorych na PML wynosi ok. 5%, aczkolwiek obecnie odsetek ten utrzymuje się na stałym poziomie na skutek wprowadzenia wysoce efektywnej terapii antyretrowiru-

sowej (Highly Active Antiretroviral Therapy – HAART) [6]. Związek pomiędzy PML indukowanym zakaże- niem JCV, a zakażeniem HIV nie jest do końca jasny. Obniżenie poziomu oraz osłabienie funkcji limfocytów T CD4+ może aktywować replikację JCV. Zakażenie HIV może również powodować załamanie się bariery krew-mózg, co umożliwia penetrację do tkanek mózgu limfocytom B zakażonym poliomawirusem JC. Kolejną hipotezą jest produkcja licznych cytokin w centralnym układzie nerwowym w odpowiedzi na zakażenie HIV, która może zainicjować aktywację promotora genu regulatorowego JCV [23].

Zmiany demielinizacyjne mózgu obrazowane są przy udziale rezonansu magnetycznego, aczkolwiek osta- teczne rozpoznanie PML wymaga przeprowadzenia bio psji mózgu. W badaniach histopatologicznych stwier-dza się ogniska demielinizacyjne w warstwie podkoro-wej istoty białej, naciek komórkami ezozynofilnymi, a także powiększone jądra komórek glejowych skąpo-wypustkowych oraz astrocytów. Rozpoznanie choroby można potwierdzić wykazując przy pomocy mikrosko-pii elektronowej obecność JCV w ciałkach wtrętowych wewnątrz oligodendrocytów [25].

7. stwardnienie rozsiane

Poliomawirus JC ma również stwierdzoną unikalną zdolność do wiązania komórek glejowych. Właściwość ta, wraz z wysoką zakaźnością wirusa oraz jego zdol-nością do wywoływania zakażeń persystentnych, skło-niła do postawienia hipotezy, iż wirus ten może powo-dować rozwój stwardnienia rozsianego [25]. Istnieje kilka sprzecznych raportów dotyczących wiremii JCV u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym. Niektórzy autorzy podają, że wykryli poliomawirusa JC w pły-nie mózgowo-rdzeniowym pobranym od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym, inni z kolei wskazują na brak dowodów, iż zakażenia JCV związane są z rozwo-jem choroby [23].

8. choroby nowotworowe powodowane przez poliomawirusy ludzkie

Ważną grupą schorzeń, które mogą powodować poliomawirusy ludzkie są choroby nowotworowe. JCV może prawdopodobnie mieć udział w powstawaniu nowotwo-rów przewodu pokarmowego oraz guzów mózgu [26], natomiast MCV jest czynnikiem etiologicznym nowo-tworów komórek Merkela (Merkel Cell Carcinoma – MCC) [17]. Nefropatie BKV mogą być także znaczą-cym czynnikiem ryzyka rozwoju nowotworów [7]. Jak dotąd nie ustalono czy KIV oraz WUV mają właściwości onkogenne [56].


Obecność sekwencji antygenu T wirusa JC wyka-zano w licznych badaniach nad nowotworami przewodu pokarmowego, w tym raku przełyku, żołądka, jelita oraz okrężnicy [26]. Przypuszczalnie są dwa mechanizmy transformacji nowotworowej związanej z zakażeniem poliomawirusem JC. Pierwszy z nich polega na uaktyw-nieniu się obecnego w przewodzie pokarmowym JCV w przypadku pojawienia się zmian nowotworowych. Drugi mechanizm zakłada zapoczątkowanie nowotwo-rzenia bezpośrednio przez JCV oraz związane z tym uszkodzenie DNA ludzkiego przez duży antygen T. W badaniu przeprowadzonym na 100 próbkach zmie-nionych nowotworowo fragmentów okrężnicy, sekwen-cje dużego antygenu T poliomawirusa JC stwierdzono w 56% przypadków. Podobną częstość detekcji JCV obserwuje się w innych badaniach nad występowaniem tego wirusa w zmienionych nowotworowo tkankach przełyku czy też żołądka [26].

Szacuje się, że ok. 69% pacjentów z różnymi guzami mózgu zawiera sekwencje wczesnych genów JCV, co sugeruje udział wirusa w etiologii tego rodzaju nowo-tworów. W rozwoju guzów mózgu najprawdopodobniej uczestniczą agnoproteina oraz mały i duży antygen T poliomawirusa JC. Rola JCV w rozwoju guzów mózgu jest jednak kontrowersyjna. Niektórzy autorzy podają, że specyficzne sekwencje wirusa stwierdzono w ponad 40% przypadków badanych pacjentów; natomiast w innych badaniach częstość ta wynosi zaledwie kilka procent [26].

Nowotwór komórek Merkela występuje rzadko, ale jest jedną z najbardziej agresywnych postaci neuroek-todermalnego raka skóry [56]. Rolę poliomawirusa ko- mórek Merkela w rozwoju MCC opisali F e n g i wsp. [17]. Przeprowadzili oni badanie na próbkach pochodzą-cych od 10 pacjentów chorych na MCC oraz od 84 pa- cjentów zgrupowanych w 2 grupy kontrolne. Pierwszą grupę kontrolną stanowiło 59 osób, od których pobrano

różne próbki tkanek, w tym 9 próbek skóry. Druga grupa kontrolna skupiała 25 pacjentów nie wykazujących MCC, od których pobrano próbki zdrowej lub zmie-nionej nowotworowo skóry. Obecność sekwencji geno-mowych MCV stwierdzono u 8 z 10 pacjentów grupy badanej, natomiast w obu grupach kontrolnych zaledwie w 8% i 16% próbek. U 6, spośród 8 pacjentów z MCC zakażonych MCV, nastąpiła integracja wirusowego DNA do DNA komórek zmienionych nowotworowo, co suge-ruje, że zakażenie oraz integracja MCV może powodo-wać klonalną ekspansję komórek nowotworowych [17]. Obserwacje te zostały potwierdzone przez innych auto-rów, którzy w swych pracach wykazują zbliżoną częstość występowania zakażeń MCV u pacjentów z nowotwo-rem komórek Merkela sięgającą ok. 80% [24]. Obec-ność MCV w zmienionych nowotworowo komórkach Merkela może wpływać na kliniczny przebieg choroby, gdyż zaobserwowano, ze pacjenci MCV-pozytywni żyją od 3 do 5 lat dłużej niż pacjenci MCV-negatywni [24].

9. diagnostyka zakażeń ludzkimi poliomawirusami

Zważywszy na ciągły wzrost częstości zakażeń polio-mawirusami ludzkimi potrzebne są skuteczne metody detekcji oraz monitorowania tych zakażeń. Do diagno-styki zakażeń BKV oraz JCV wykorzystuje się hodowle komórkowe, reakcje serologiczne, badanie cytologiczne osadów moczu, przezskórną biopsję cienkoigłową oraz metody biologii molekularnej [8].

Hodowle komórkowe stanowią tanią oraz łatwą me- todą służącą do detekcji polymawirusa BK. Aczkolwiek, z powodu ograniczeń czasowych, technika ta wykorzys-tywana jest niemal wyłącznie w badaniach naukowych [8]. Jak dotąd nie zidentyfikowano linii komórkowych wrażliwych na zakażenia WUV, KIV oraz MCV [11].

Przez wiele lat, „złotym standardem” w wykrywaniu zakażeń BKV było przeprowadzanie biopsji nerek oraz identyfikacja wtrętów wirusowych w komórkach epite-lialnych kanalików nerkowych [43]. Zmiany w zakażo-nych komórkach epitelialnych mogą być potwierdzone przy zastosowaniu mikroskopii elektronowej. Analiza ta umożliwia dostrzeżenie wewnątrzkomórkowych, uło- żonych równolegle gęsto upakowanych skupisk wirio-nówo średnicy 40–45 nm [8]. Stwierdzenie akumula-cji tysięcy cząsteczek wirusowych przed całkowitą lizą komórki potwierdza rolę efektu cytopatycznego w roz-woju nefropatii BKV po transplantacji nerki [10]. W diag-nostyce postępującej leukencefalopatii wieloogniskowej należy przeprowadzić biopsję mózgu. Szacuje się, że czułość tej metody wynosi 64–96%, aczkolwiek w wielu przypadkach może ona powodować zgon pacjenta. Bar-wienie immunohistochemiczne tkanki wykonuje się przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko antyge-nowi T poliomawirusa SV 40. Badanie histopatologiczne

Rys. 2. Efekt cytopatyczny wywołany przez poliomawirusa BK w nerce przeszczepionej. Strzałki wskazują komórki, które przy-brały rurkowaty kształt pod wpływem wirusa. Powiększenie mikro-

skopu x400 (badania własne)


potwierdza obecność ognisk demielinizacyjnych w war-stwie podkorowej istoty białej. W mikroskopie elektro-nowym możemy dodatkowo zaobserwować obecność JCV w ciałkach inkluzyjnych oligoendrocytów [6].

Do metod serologicznych służących do wykrywania poliomawirusów możemy zaliczyć: test zahamowania hemaglutynacji, test immunoenzymatyczny ELISA, odczyn neutralizacji oraz oznaczenia multiparametryczne na platformie Luminex, będącej udoskonaleniem testu ELISA. Każda z wymienionych metod serologicznych posiada pewne ograniczenia, dlatego też ich porówny-wanie może być niewspółmierne. Preferowaną metodą serologiczną do detekcji zakażeń poliomawirusami ludzkimi są testy ELISA oraz ich modyfikacja [11]. Do detekcji przeciwciał w teście ELISA wykorzystywane są rekombinowane antygeny VP1. Istnieją doniesie-nia o reaktywności krzyżowej przeciwciał anty-WUV z przeciwciałami anty-KIV, anty-JCV oraz anty-BKV, aczkolwiek badania przeprowadzone przez N g u y e n i wsp. wykazały, że reaktywność ta jest minimalna i nie powoduje obniżenia czułości metody [42]. Oznaczenia multiparametryczne z użyciem platformy Luminex po- zwalają na zwiększenie efektywności oraz jakości wyko-nywanych oznaczeń, przy jednoczesnym zmniejszeniu nakładu pracy oraz czasu w porównaniu do tradycyjnych testów immunoenzymatycznych. Przy zastosowaniu tej metody możliwe jest jednoczesna detekcja wielu anty-genów w pojedynczym dołku płytki pomiarowej [11].

Przeprowadzenie badania cytologicznego moczu umoż liwia identyfikację tzw. decoy cells, czyli wydalanych z moczem, apoptotycznych komórek epitelialnych nerki z charakterystycznymi wtrętami wirusowymi obecnymi w jądrze komórkowym [8]. Komórki te wykrywane są w osadzie moczu po zabarwieniu metodą Papanicolau. Cytologia jest szybką i prostą metodą pozwalającą wykluczyć nefropatię BKV gdy nie stwierdzamy obec-ności decoy cells w moczu. W przypadku pacjentów po przeszczepieniu nerki, obecność tych komórek może świadczyć o reaktywacji wirusa bez znacznego uszko-dzenia kanalików nerkowych, jak i o rozwoju śródmiąż-szowego zapalenia nerki [8].

Z racji ogniskowej natury zakażeń poliomawiru-sami wynik biopsji może być fałszywie negatywny, gdyż fragment badanej tkanki może nie być reprezentatywny. Użycie metod mniej inwazyjnych, takich jak badanie cytologiczne czy mikroskopia elektronowa jest ogra- niczone przez szerokie rozpowszechnienie wirusa w populacji. Dlatego też coraz częściej w detekcji zakażeń poliomawirusami ludzkimi wykorzystywane są metody biologii molekularnej [43].

Łancuchowa reakcja polimerazy (PCR) umożliwia powielenie materiału genetycznego poliomawirusów dzięki obecności specyficznych starterów. DNA polio-mawirusów możemy izolować z próbek pochodzących z różnych kompartmentów ciała. Do detekcji zakażeń

układu oddechowego możemy użyć próbek popłuczyn gardłowych lub popłuczyn pęcherzykowo-oskrze-lowych. DNA poliomawirusów możemy wykrywać również w próbkach krwi, płynu mózgowo-rdzenio-wego, moczu czy też kału [5]. Czułość detekcji DNA JCV w próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego przy zastosowaniu PCR sięga 72–92%, natomiast swoistość reakcji może wynosić od 92 do 100% [6]. Konwencjo-nalny PCR posiada jednak wiele ograniczeń. Główną wadą reakcji jest brak dokładnej informacji ilościowej. Związane jest to ze zmienną wydajnością amplifikacji pomiędzy kolejnymy cyklami, a także obecnością inhi-bitorów reakcji – zwłaszcza w jej ostatnich etapach. Te czynniki mogą prowadzić do uzyskania częstych wyni-ków fałszywie negatywnych. Ograniczenia te pozwala przezwyciężyć zastosowanie PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR, qPCR) [35, 36]. Real-time PCR wymaga minimalnej ilości matrycy, a także pozwala określić dokładną liczbę kopii materiału genetycznego wirusa w próbce. Real-time PCR pozwala zwiększyć czułość metody, minimalizuje ryzyko kontaminacji próbek oraz eliminuje etap poamplifikacyjnej obróbki powielonego produktu [15, 54].

Ze względu na szereg zalet, reakcja PCR w czasie rzeczywistym powinna być stosowana w rutynowej diagnostyce oraz monitorowaniu zakażeń wirusowych u biorców narządów [12]. Choć biopsje narządów są potrzebne do rozpoznania, ze względu na swoją inwa-zyjność nie są idealnym narzędziem do monitorowania infekcji. Zakażenia ogniskowe powodują, że wykry-wamy poliomawirusy w mniejszej liczbie próbek kli-nicznych, mimo iż większość dorosłych posiada prze-ciwciała, świadczące o uprzedniej ekspozycji na BKV. Do monitorowania zakażeń poliomawirusami u biorców alogenicznych przeszczepów nerki racjonalne jest uży-cie moczu, gdyż reprezentuje on materiał z całej nerki [48]. Przy zastosowaniu techniki real-time PCR można wykryć zakażenia poliomawirusami przed wystąpie-

Rys. 3. Zalecany schemat monitorowania zakażeń poliomawirusami u pacjentów poddanych przeszczepieniu nerki [wg 9, 36]


niem jakichkolwiek objawów klinicznych. Ilościowe oznaczanie liczby kopii wirusa w próbce umożliwia monitorowanie postępu zakażenia oraz zaklasyfikowa-nie pacjenta do grupy ryzyka rozwoju nefropatii. Moni-torowanie obecności wirusa, poprzez częste oznaczanie ilościowe jego kopii w materiale klinicznym, pozwala także badać skuteczność terapii przeciwwirusowej [43].

10. terapia zakażeń poliomawirusami

W związku z rosnąca liczbą osób chorych na AIDS oraz wykonywanych zabiegów transplantacyjnych nabiera znaczenia problem zakażeń poliomawirusami ludzkimi oraz potrzeba skutecznej terapii tych zaka-żeń. Jednak jak dotąd nie ma formalnie zatwierdzonych leków przeciwko poliomawirusom ludzkim.

W przypadku pacjentów poddanych zabiegom trans-plantacyjnym, obniża się dawki leków immunosupre-syjnych, aby organizm sam mógł zwalczyć zakażenie. Stwarza to jednak ryzyko ostrego odrzucenia prze-szczepu i nie jest efektywne u wszystkich osób. W nie-których badaniach klinicznych wykazano skuteczność cidofowiru, leflunomidu oraz fluorochinolonów zasto-sowanych u pacjentów ze śródmiąższowym zapaleniem nerki oraz krwotocznym zapaleniem pęcherza. Brak jest jednak konkretnych danych potwierdzających skutecz-ność tych preparatów [23].

Cidofowir jest analogiem nukleotydowym cytozyny, hamującym wirusową polimerazę DNA, który stoso-wany jest w terapii zakażeń wirusem cytomegalii (CMV) u pacjentów zakażonych HIV [3]. Jednakże mechanizm hamowania replikacji BKV przez ten lek nie jest znany, gdyż genom poliomawirusa BK nie koduje polimerazy DNA. Jego skuteczność przeciwwirusowa może być spo-wodowana zahamowaniem syntezy wirusowego DNA lub inhibicją domeny funkcjonalnej dużego antygenu T wirusa, posiadającego aktywność polimerazy DNA. Użycie cidofowiru może powodować istotną nefrotok-syczność, jakkolwiek istnieją doniesienia o jego skutecz-ności u pacjentów po przeszczepieniu nerki, u których rozwinęła się nefropatia oraz krwotoczne zapalenie pęcherza [14]. W badaniach przeprowadzonych przez S a v o n ę i wsp. podawano niskie dawki cidofowiru 19 pacjentom po przeszczepieniu komórek krwiotwór-czych u których rozwinęło się krwotoczne zapalenie pęcherza moczowego. Poprawa stanu klinicznego nastą-piła u 84% pacjentów, natomiast obniżenie poziomu wirurii zaobserwowano zaledwie u 47% pacjentów [50]. Z kolei Wu i wsp. wykazali brak skuteczności terapii cidofowirem u 14 pacjentów po transplantacji nerki u których doszło do rozwoju nefropatii BKV [55].

Leflunomid jest lekiem immunosupresyjnym zatwier- dzonym w terapii reumatoidalnego zapalenia stawów. Jego aktywność immunosupresyjna wynika z hamo-

wania aktywności kinazy białkowej oraz biosyntezy pirymidyn. Lek ten wykazuje także pewną aktywność przeciwwirusową in vitro w stosunku do CMV, wirusa opryszczki (HSV) oraz BKV. Jak dotąd w literaturze nie pojawiły się żadne doniesienia o stosowaniu leflu-nomidu u chorych na krwotoczne zapalenie pęcherza powiązane z zakażeniem poliomawirusowi BK, acz-kolwiek zważywszy na jego aktywność in vitro przeciw BKV, postulowane jest jego potencjalne użycie w lecze-niu tego schorzenia [14].

Aktywność in vitro przeciw poliomawirusom BK wykazują również fluorochinolony, antybiotyki hamu-jące replikację komórek bakteryjnych poprzez inhi-bicje aktywności topoizomeraz typu II, w tym gyrazy oraz topoizomerazy IV. Uważa się, że inhibitory gyrazy DNA mogą hamować replikację BKV poprzez inhibicję aktywności helikazy dużego antygenu T poliomawirusa, pełniącej funkcje zbliżone do gyrazy DNA [14]. W nie-randomizowanym badaniu klinicznym, po podaniu ciprofloksacyny zauważono spadek wirurii u pacjen- tów, aczkolwiek nie korelowało to z redukcją przy- padków krwotocznego zapalenia pęcherza. Fluorochi-nolony powinny być wobec tego stosowane nie jako czynniki terapeutyczne, a raczej w celu profilaktyki za- każeń BKV [21].

Nie istnieją również skuteczne leki przeciwwirusowe, które byłyby skierowane przeciwko JCV. U pacjentów zakażonych HIV, u których rozwinęła się PML roz-poczęcie HAART lub optymalizacja terapii, obniża poziom replikacji JCV, natomiast u biorców narządów z PML należy ograniczyć lub przerwać podawanie leków immunosupresyjnych [6].

W przypadku nowo odkrytych poliomawirusów ludzkich ważne jest poznanie ich biologii, dróg trans-misji oraz epidemiologii. Być może wówczas zostanie odkryty skuteczny lek przeciwwirusowy hamujący repli-kację KIV, WUV oraz MCV [23].

11. profilaktyka

Jak dotąd nie wynaleziono skutecznej szczepionki chroniącej przed zakażeniami poliomawirusami ludz-kimi [23]. Istnieje możliwość skonstruowania szcze-pionek na bazie niewywołujących zakażenia cząstek wirusopodobnych (VLP, virus-like particles), podobnie jak stało się to w przypadku papillomawirusów. VLP są strukturalnie podobne do naturalnych wirionów, ale nie mają zdolności wywoływania choroby, ze względu na brak zakaźnego DNA. W przypadku szczepionek skierowanych przeciwko poliomawirusom czynnikiem immunogennym byłoby tu prawdopodobnie główne białko kapsydu VP1, syntetyzowane in vitro z udziałem wektora bakulowirusowego w hodowli komórek owa-dów lub z wykorzystaniem drożdży [46].


U pacjentów po przeszczepieniach nerek oraz ko- mórek krwiotwórczych konieczna jest minimalizacja czynników ryzyka rozwoju chorób powodowanych przez poliomawirusy. Ważne jest jak najlepsze dopa-sowanie dawcy oraz biorcy, użycie mało toksycznych leków immunosupresyjnych, stałe monitorowanie wiremii oraz wirurii, zapobieganie rozwojowi GvHD, a także natychmiastowa terapia w przypadku reakty-wacji wirusa w okresie potransplantacyjnym [21].

12. podsumowanie

Poliomawirusy ludzkie są szeroko rozpowszechnione na całym świecie i atakują ok. 80% populacji. Większość chorób powodowanych przez BKV oraz JCV dotyczy dzieci i ma łagodny przebieg. Podobnie jest w przy-padku dorosłych pacjentów immunokompetentnych. W obu przypadkach poliomawirusy mogą powodować zakażenia persystentne w komórkach nerek, tkankach limfoidalnych czy też w komórkach układu nerwowego. U pacjentów poddanych immunosupresji może dojść do reaktywacji wirusów oraz rozwoju chorób takich jak krwotoczne zapalenie pęcherza, śródmiąższowe zapalenie nerki, postępująca leukencefalopatia wielo-ogniskowa czy też stwardnienie rozsiane. Nowoodkryte poliomawirusy ludzkie KI i WU mogą powodować zakażenia układu oddechowego, natomiast MCV nowo-tworzenie w komórkach Merkela. Chociaż w ostatnich latach nastąpił rozwój metod diagnostycznych, ułatwia-jących identyfikacje zakażeń, nadal brakuje skutecznych form terapii przeciwwirusowej. Stosowane w badaniach klinicznych cidofowir czy tez leflunomid nie są formal-nie zarejestrowanymi lekami. Ważne jest więc ograni-czenie transmisji zakażeń oraz lepsze poznanie biologii, patogenezy oraz dróg rozprzestrzeniania się, zwłaszcza niedawno odkrytych, poliomawirusów ludzkich.

piśmiennictwo

1. Abedi Kiasari B., Vallely P.J., Corless C.E., Al-Hammadi M., Klapper P.E.: Age-related pattern of KI and WU polyomavirus infection. J. clin. Virol. 43, 123–125 (2008)

2. Antonsson A., Green A.C., Mallitt K.A., O’Rourke P.K., Pawlita M., Waterboer T., Neale R.E.: Prevalence and stability of antibodies to the BK and JC polyomaviruses: a long-term longitudinal study of Australians. J. Gen. Virol. 91, 1849–1853 (2010)

3. Araya C.E., Lew J.F., Fennell R.S. 3rd, Neiberger R.E., Dharnidharka V.R.: Intermediate-dose cidofovir without pro-benecid in the treatment of BK virus allograft nephropathy. Pediatr. Transplant. 10, 32–37 (2006)

4. Bialasiewicz S., Whiley D.M., Lambert S.B., Gould A., Nissen M.D., Sloots T.P.: Development and evaluation of real-time PCR assays for the detection of the newly identified KI and WU polyomaviruses. J. clin. Virol. 40, 9–14 (2007)

5. Bialasiewicz S., Whiley D.M., Lambert S.B., Nissen M.D., Sloots T.P.: Detection of BK, JC, WU, or KI polyomaviruses in

faecal, urine, blood, cerebrospinal fluid and respiratory sam-ples. J. clin. Virol. 45, 249–254 (2009)

6. Boothpur R., Brennan D.C.: Human polyoma viruses and disease with emphasis on clinical BK and JC. J. clin. Virol. 47, 306–312 (2010)

7. Chen C.H, Wen M.C, Wang M., Lian J.D., Cheng C.H., Wu M.J., Yu T.M., Chuang Y.W., Chang D., Shu K.H.; High incidence of malignancy in polyomavirus-associated nephropathy in renal transplant recipients. Transplant. Proc. 42, 817–818 (2010)

8. Cimbaluk D., Pitelka L., Kluskens L., Gattuso P.: Update on human polyomavirus BK nephropathy. Diagn. cytopathol. 37, 773–779 (2009)

9. Costa C., Bergallo M., Astegiano S., Terlizzi M.E., Sidoti F., Segoloni G.P., Cavallo R.: Monitoring of BK virus replication in the first year following renal transplantation. Nephrol. Dial. Transplant. 23, 3333–3336 (2008)

10. Costa C., Bergallo M., Sidoti F., Astegiano S., Terlizzi M.E., Mazzucco G., Segoloni G.P., Cavallo R.: Polyomaviruses BK- and JC-DNA quantitation in kidney allograft biopsies. J. clin. Virol. 44, 20–23 (2009)

11. Dalianis T., Ramqvist T., Andreasson K., Kean J.M., Garcea R.L.: KI, WU and Merkel cell polyomaviruses: a new era for human polyomavirus research. semin. cancer Biol. 19, 270–275 (2009)

12. Deback C., Géli J., Aït-Arkoub Z., Angleraud F., Gautheret--Dejean A., Agut H., Boutolleau D.: Use of the Roche Light-Cycler® 480 system in a routine laboratory setting for molecular diagnosis of opportunistic viral infections: Evaluation on whole blood specimens and proficiency panels. J. Virol. Methods, 159, 291–294 (2009)

13. Debiaggi M., Canducci F., Brerra R., Sampaolo M., Mari-nozzi M.C., Parea M., Arghittu M., Alessandrino E.P., Nava S., Nucleo E., Romero E., Clementi M.: Molecular epidemiology of KI and WU polyomaviruses in infants with acute respira-tory disease and in adult hematopoietic stem cell transplant recipients. Med. Virol. 82, 153–156 (2010)

14. Dropulic L.K., Jones R.J.: Polyomavirus BK infection in blood and marrow transplant recipients. Bone Marrow Transplant. 41, 11–18 (2008)

15. Elfaitouri A., Hammarin A.L., Blomberg J.: Quantitative real--time PCR assay for detection of human polyomavirus infec-tion. J. Virol. Methods, 135, 207–213 (2006)

16. Erard V., Storer B., Corey L., Nollkamper J., Huang M.L., Limaye A., Boeckh M.: BK virus infection in hematopoietic stem cell transplant recipients: frequency, risk factors, and asso-ciation with postengraftment hemorrhagic cystitis. clin. infect. Dis. 39, 1861–1865 (2004)

17. Feng H., Shuda M., Chang Y., Moore P.S.: Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. science, 319, 1096–1100 (2008)

18. Focosi D., Maggi F., Andreoli E., Lanini L., Ceccherini-Nelli L., Petrini M.: The role of bone marrow cells for JCV pathogenicity. J. clin. Virol. 45, 230–231 (2009)

19. Frisque R.J., Bream G.L., Cannella M.T.: Human polyomavirus JC virus genome. J. Virol. 51, 458–469 (1984)

20. Giraud G., Priftakis P., Bogdanovic G., Remberger M., Dubrulle M., Hau A., Gutmark R., Mattson J., Svahn B.M., Ringden O., Winiarski J., Ljungman P., Dalianis T.: BK-viru-ria and haemorrha gic cystitis are more frequent in allogeneic haematopoietic stem cell transplant patients receiving full con-ditioning and unrelated-HLA-mismatched grafts. Bone Marrow Transplant. 41, 737–742 (2008)

21. Harkensee C., Vasdev N., Gennery A.R., Willetts I.E., Taylor C.: Prevention and management of BK-virus associated haemorrhagic cystitis in children following haematopoietic stem cell trans-plantation: a systematic review and evidence-based guidance for clinical management. Br. J. haematol. 142, 717–731 (2008)


22. Jeffers L.K., Madden V., Webster-Cyriaque J.: BK virus has tro-pism for human salivary gland cells in vitro: implications for transmission. Virology, 394, 183–193 (2009)

23. Jiang M., Abend J.R., Johnson S.F., Imperiale M.J.: The role of polyomaviruses in human disease. Virology, 384, 266–273 (2009)

24. Johnson E.M.: Structural evaluation of new human polyoma-viruses provides clues to pathobiology. Trends Microbiol. 18, 215–223 (2010)

25. Khalili K., White M.K.: Human demyelinating disease and the polyomavirus JCV. Mult. scler. 12, 133–142 (2006)

26. Kmieciak D., Dębicki S.: Rola wirusa JC w patogenezie chorób nowotworowych i zaburzeń związanych z osłabieniem odpor-ności. Post. Mikrobiol. 47, 5–14 (2008)

27. Koukoulaki M., Grispou E., Pistolas D., Balaska K., Apostolou T., Anagnostopoulou M., Tseleni-Kotsovili A., Hadjiconstan-tinou V., Paniara O., Saroglou G., Legakis N., Drakopoulos S.; Prospective monitoring of BK virus replication in renal trans-plant recipients. Transpl. infect. Dis. 11, 1–10 (2009)

28. Krumbholz A., Bininda-Emonds O.R., Wutzler P., Zell R.: Evolution of four BK virus subtypes. infec.t Genet. Evol. 8, 632–643 (2008)

29. Lam W.Y., Leung B.W., Chu I.M., Chan A.C., Ng H.K., Chan P.K.: Survey for the presence of BK, JC, KI, WU and Mer-kel cell polyomaviruses in human brain tissues. J. clin. Virol. 48, 11–14 (2010)

30. Leung A.Y., Suen C.K., Lie A.K., Liang R.H., Yuen K.Y., Kwong Y.L.: Quantification of polyoma BK viruria in hemorr-ha gic cystitis complicating bone marrow transplantation. Blood, 98, 1971–1978 (2001)

31. Leung A.Y., Mak R., Lie A.K., Yuen K.Y., Cheng V.C., Liang R., Kwong Y.L.: Clinicopathological features and risk factors of cli-nically overt haemorrhagic cystitis complicating bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 29, 509–513 (2002)

32. Leung A.Y., Yuen K.Y., Kwong Y.L.: Polyoma BK virus and haemorrhagic cystitis in haematopoietic stem cell transplan- ta tion: a changing paradigm. Bone Marrow Transplant. 36, 929–937 (2005)

33. Lundstig A., Dillner J.: Serological diagnosis of human polyo-mavirus infection. Adv Exp. Med. Biol. 577, 96–101 (2006)

34. Matłosz B., Durlik M.: Śródmiąższowe zapalenie nerki prze-szczepionej wywołane zakażeniem wirusem polyoma BK. Przegl. Epidemiol. 60, 133–140 (2006)

35. McNees A.L., White Z.S., Zanwar P., Vilchez R.A., Butel J.S.: Specific and quantitative detection of human polyomaviruses BKV, JCV, and SV40 by real time PCR. J. clin. Virol. 34, 52–62 (2005)

36. Merlino C., Bergallo M., Giacchino F., Daniele R., Bollero C., Comune L., Segoloni G.P., Cavallo R.: Human polyomavirus BK monitoring by quantitative PCR in renal transplant recipients. intervirology, 47, 41–47 (2004)

37. Miyamura T., Jikuya H., Soeda E., Yoshiike K.: Genomic struc-ture of human polyoma virus JC: nucleotide sequence of the region containing replication origin and small-T-antigen gene. J. Virol. 45, 73–79 (1983)

38. Mourez T., Bergeron A., Ribaud P., Scieux C., de Latour R.P., Tazi A., Socié G., Simon F., LeGoff J.: Polyomaviruses KI and WU in immunocompromised patients with respiratory disease. Emerg. infect. Dis. 15, 107–109 (2009)

39. Mueller A., Simon A., Gillen J., Schildgen V., Tillmann R.L., Reiter K., Schildgen O.: Polyomaviruses KI and WU in children with respiratory tract infection. Arch. Virol. 154, 1605–1608 (2009)

40. Neske F., Blessing K., Ullrich F., Pröttel A., Wolfgang Kreth H., Weissbrich B.: WU polyomavirus infection in children, Ger-many. Emerg. infect. Dis. 14, 680–681 (2008)

41. Neu U., Stehle T., Atwood W.J.: The Polyomaviridae: Contribu-tions of virus structure to our understanding of virus receptors and infectious entry. Virology, 384, 389–399 (2009)

42. Nguyen N.L., Le B.M., Wang D.: Serologic evidence of frequ-ent human infection with WU and KI polyomaviruses. Emerg. infect. Dis. 15, 1199–205 (2009)

43. Pang X.L., Doucette K., LeBlanc B., Cockfield S.M., Preiksaitis J.K.: Monitoring of polyomavirus BK virus viruria and viremia in renal allograft recipients by use of a quantitative real-time PCR assay: one-year prospective study. J. clin. Microbiol. 45, 3568–3573 (2007)

44. Payungporn S., Chieochansin T., Thongmee C., Panjaworayan N., Samransamruajkit R., Theamboolers A., Poovorawan Y.: Detection and discrimination of WU/KI polyomaviruses by real-time PCR with melting curve analysis. J. Virol. Methods, 153, 70–73 (2008)

45. Payungporn S., Chieochansin T., Thongmee C., Samransam-ruajkit R., Theamboolers A., Poovorawan Y.: Prevalence and molecular characterization of WU/KI polyomaviruses isolated from pediatric patients with respiratory disease in Thailand. Virus res. 135, 230–236 (2008)

46. Ramqvist T, Dalianis T. Immunotherapeutic polyoma and human papilloma virus-like particles. immunotherapy, 1, 303–312 (2009).

47. Randhawa P., Ho A., Shapiro R., Vats A., Swalsky P., Finkel-stein S., Uhrmacher J., Weck K.: Correlates of quantitative measurement of BK polyomavirus (BKV) DNA with clinical course of BKV infection in renal transplant patients. J. clin. Microbiol. 42, 1176–1180 (2004)

48. Randhawa P., Shapiro R., Vats A.: Quantitation of DNA of polyomaviruses BK and JC in human kidneys. J. infect. Dis. 192, 504–509 (2005)

49. Ren L., Gonzalez R., Xie Z., Zhang J., Liu C., Li J., Li Y., Wang Z., Kong X., Yao Y., Hu Y., Qian S., Geng R., Yang Y., Vernet G., Paranhos-Baccalà G., Jin Q., Shen K., Wang J.: WU and KI polyomavirus present in the respiratory tract of children, but not in immunocompetent adults. J. clin. Virol. 43, 330–333 (2008)

50. Savona M.R., Newton D., Frame D., Levine J.E., Mineishi S., Kaul D.R.: Low-dose cidofovir treatment of BK virus-associated hemorrhagic cystitis in recipients of hematopoietic stem cell transplant. Bone Marrow Transplant. 39, 783–787 (2007)

51. Sharp C.P., Norja P., Anthony I., Bell J.E., Simmonds P.: Reacti-vation and mutation of newly discovered WU, KI, and Merkel cell carcinoma polyomaviruses in immunosuppressed indi-viduals. J. infect. Dis. 199, 398–404 (2009)

52. Smith T.F., Espy M.J., Mandrekar J., Jones M.F., Cockerill F.R., Patel R.: Quantitative real-time polymerase chain reaction for evaluating DNAemia due to cytomegalovirus, Epstein-Barr virus, and BK virus in solid-organ transplant recipients. clin. infect. Dis. 45, 1056–1061 (2007)

53. Sung H., Choi B.H., Pyo Y.J., Kim M.N., Han D.J.: Quantitation of BK virus DNA for diagnosis of BK virus-associated nephro-pathy in renal transplant recipients. J. Korean. Med. sci. 23, 4–8 (2008)

54. Whiley D.M., Mackay I.M., Sloots T.P.: Detection and differen-tiation of human polyomaviruses JC and BK by LightCycler PCR. J. clin. Microbiol. 39, 4357–4361 (2001)

55. Wu S.W., Chang H.R., Lian J.D.: The effect of low-dose cidofovir on the long-term outcome of polyomavirus-associated nephro-pathy in renal transplant recipients. Nephrol. Dial. Transplant. 24, 1034–1038 (2009)

56. zur Hausen H.: Novel human polyomaviruses: re-emergence of a well known virus family as possible human carcinogens. int. J. cancer. 123, 247–150 (2008)


1. Wprowadzenie

Przeprowadzone w ciągu ostatnich lat badania z zakresu genomiki, dostarczyły ogromną ilość informacji pozwalających uświadomić sobie, iż genomy bakteryjne są bardzo plastycznymi strukturami, ulegającymi wielu rearanżacjom. Olbrzymi wkład w generowanie ich zmienności mają ruchome elementy genetyczne, posia-dające między innymi, zdolność przenoszenia informa-cji genetycznej pomiędzy komórkami nawet odległych filogenetycznie gatunków bakterii. Wśród nich, niezwy-kle istotną rolę odgrywają plazmidy i bakteriofagi.

Prawie wszystkie geny występujące u bakterii znaj-dują się na chromosomie bakteryjnym. Kilka genów jest zlokalizowanych w małych, kolistych cząsteczkach DNA zwanych plazmidami (u pewnych bakterii stwierdzono także obecność plazmidów liniowych), występujących dodatkowo u bakterii oprócz chromosomowego DNA. Są to głównie geny, które są przydatne bakteriom, ale nie są niezbędne do normalnego wzrostu i podziału komórki. Ulegają one niezależnej replikacji. Istnieje wiele różnych plazmidów, między innymi: plazmidy

typu R (opornościowe), typu F (konigacyjne), plazmidy kolicynowe, degradacyjne i plazmidy wirulencji. Bak-terie mogą posiadać jednocześnie kilka typów plazmi-dów. Jednak nie wszystkie rodzaje plazmidów mogą współistnieć w komórce bakteryjnej, o czym decyduje ich przynależność do określonej grupy niezgodności Inc (incompatibility), stanowiącej istotny element cha-rakterystyki plazmidów. Plazmidy zgodne (compati-ble) należą do różnych grup niezgodności, a niezgodne (incompatible) – do tej samej grupy niezgodności. Ist-nieje wiele grup niezgodności plazmidów. Tylko dla plazmidów występujących u enterobakteri wyróżniono ich około 30 (opisuje się je literami alfabetu i czasami jeszcze dodatkowymi oznaczeniami). Aby plazmidy mogły występować w tej samej komórce bakteryjnej muszą być ze sobą zgodne, czyli muszą należeć do różnych grup niezgodności. Plazmidy – samodzielne, pozachromosomowe replikony [51], są naturalnymi wektorami, mogącymi znacznie zwiększać zasób infor-macji genetycznej bakteryjnego gospodarza [19], wpły-wając przez to na jego zdolności adaptacyjne. Niektóre plaz midy integrują się z chromosomem bakteryjnym

plazMidy i baktEriofagi WystĘpującEu baktErii salMoNElla

bożena dera-tomaszewska*

Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Katedra Mikrobiologii,Zakład Mikrobiologii Molekularnej i Serologii, Krajowy ośrodek salmonella, ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdańsk

Wpłynęło w maju 2010 r.

1. Wprowadzenie. 2. Pozachromosomowe elementy genetyczne bakterii salmonella. 2.1. Plazmidy. 2.2. Bakteriofagi. 3. Podsumowanie

plasmids and bacteriophages harboured by salmonella

Abstract: The genomic era brings the opportunity to analyze more comprehensively the phylogenetic relationships between salmonella species, the evolution of pathogenicity and the genetic variability within these microoragnisms. Vast amounts of information can potentially be obtained from the multiple salmonella genome sequences now available. Genome information can be used to gain insight into the evolution of the genus salmonella, to identify stable regions conserved between different salmonella species and serovars, and to identify regions that appear to be specific for individual serovars. In addition to the pathogenicity islands of salmonella, major variations between the genomes are found in the form of mobile genetic elements such as plasmids and bacteriophages. salmonella often carry autonomously replicating plasmids, some of which can be transferred between bacteria by conjugation. Some of these plasmids are involved in virulence or harbour drug-resistance genes, while other are cryptic, with no ascribed function. One of the most surprising revelations of the recent salmonella genome sequencing was the relatively high proportion of bacteriophage genes within the chromosome. The genome sequence comparisons of DNA from salmonella Typhi and salmonella Typhimurium revealed that genes from F-type plasmids and lambdoid-like phages are major points of diversity between these two salmonella serovars. It is clear that the number and repertoire of plasmids and prophages represent a significant source of genetic variation, and may have played a crucial role in evolution and specialization of salmonella. Plasmids and bacteriophages which are readily harboured by salmonella microorganisms are discussed in detail in this paper.

1. Introduction. 2. Extrachromosomal genetic elements of salmonella. 2.1. Plasmids. 2.2. Bacteriophages. 3. Summary

słowa kluczowe: bakteriofagi, ruchome elementy genetyczne, salmonella, plazmidykey words: bacteriophages, mobile genetic elements, salmonella, plasmids

* Autor korespondencyjny: Gdański Uniwersytet Medyczny, Wydział Lekarski z Oddziałem Stomatologicznym, Katedra Mikro-biologii, Zakład Mikrobiologii Molekularnej i Serologii, Krajowy ośrodek salmonella; ul. Do Studzienki 38, 80-227 Gdańsk; e-mail: [email protected]

202 BOŻENA DERA-TOMASZEWSKA

i ulegają kopiowaniu w tym samym czasie co chro-mosom gospodarza. Ta zintegrowana forma plazmidu zwanego episomem, może przejść wiele podziałów komórkowych zanim plazmid ponownie oddzieli się od chromosomu. Cechy kodowane przez geny o loka-lizacji plazmidowej są bardzo różnorodne [3, 19, 46, 56, 68]. Jest ich niezwykle dużo, a wśród nich oporność na antybiotyki i inne leki bakteriobójcze, oporność na jony metali ciężkich, wytwarzanie antybiotyków i bak-teriocyn, katabolizm toksycznych związków, zdolność do koniugacji, fermentacji laktozy, pigmentacji i inne właściwości. Geny umiejscowione na plazmidach mogą również warunkować patogenność bakterii względem człowieka i zwierząt [22, 26, 34, 42, 43, 49, 50, 60]. Należą do nich, między innym, geny kodujące zdol-ność patogenu do adhezji do powierzchni odpowied-nich komórek u zakażonego gospodarza [7, 42, 43], penetracji do wnętrza komórki, zdolność do produkcji różnych toksyn [43], oporność na bakteriobójcze dzia-łanie czynników występujących w surowicy [18] i inne. Dobrze znany jest też udział plazmidów w interakcji bakterii z roślinami. Plazmidy odgrywają także istotną rolę w ewolucji organizmów prokariotycznych.

Dynamicznie ewoluująca populacja bakteriofagów [37] ma również ogromny wpływ na biologię wielu organizmów i ewolucję bakterii [11, 14]. Niektóre fagi mogą występować w komórce bakteryjnego gospo darza zarówno w formie plazmidowej, jak i zintegrowanej. Sposób przenoszenia genów bakteryjnych zależy od cyklu życiowego bakteriofaga. Większość bakteriofa-gów po zainfekowaniu komórki bakteryjnej jest zdolna wyłącznie do wywołania cyklu litycznego prowadzącego na ogół do lizy swojego gospodarza. Z kolei w cyklu lizogenicznym genom bakteriofagów występuje w sta-nie utajonym i nosi nazwę profaga. Większość fagów zdolnych do lizogenizacji występuje jako profagi w postaci zintegrowanej z chromosomem, a nie jako plazmidy. Zarówno aktywne profagi (kompletne, kodujące w pełni funkcjonalne bakteriofagi zdolne do pełnego cyklu litycznego), jak i nieaktywne profagi (defektywne, kodujące mniej lub bardziej obszerne fragmenty bakte-riofagów) znajdujące się w genomie bakteryjnym nadają gospodarzowi różne szczególne właściwości, a zjawisko to określa się mianem lizogennej konwersji [11]. Zdol-ność do lizogenizacji jest rozpowszechniona wśród wszystkich grup bakteriofagów DNA [38]. Wziąwszy pod uwagę fakt występowania w genomach wielu bak-terii sekwencji profagów, stanowiących często nawet kilka procent całego genomu, wpływ bakteriofagów na bakterie jest ewidentny [14].

Plazmidy i bakteriofagi, to mobilne elementy gene-tyczne stanowiące również istotne źródło zmienności genomów bakterii salmonella. Pełnią one bardzo ważną rolę w kształtowaniu nowych wariantów tych mikro-organizmów.

2. pozachromosomowe elementy genetyczne bakterii salmonella

Oprócz różnic w zakresie występowania wysp pato-genności, genomy bakterii Escherichia coli i salmonella oraz genomy różnych serowarów salmonella różnią się również między sobą obecnością mobilnych elementów genetycznych takich jak plazmidy i bakteriofagi [8, 55, 60, 66, 73]. Wiele bakterii salmonella zawiera autono-micznie replikujące się plazmidy. Są one zaangażowane w wirulencję tych drobnoustrojów lub noszą geny opor-ności na leki, chociaż są i takie, które nie posiadają żad-nej zdefiniowanej funkcji. Niektóre plazmidy mogą być przekazywane pomiędzy bakteriami na drodze koniu-gacji. Analiza sekwencji genomów bakteryjnych wyka-zała również obecność wielu sekwencji profagowych, stanowiących w niektórych przypadkach aż 10–20% całości genomu. Obecność aktywnych, ale również i defektywnych profagów stwierdzono u większości badanych szczepów. Na przykład, spośród 173 prze-badanych szczepów salmonella Typhimurium, aż 136 zawierało profagi [14]. Badania prowadzone z zasto-sowaniem takich metod jak hybrydyzacja DNA oraz analiza porównawcza sekwencji DNA genomów salmo-nella Typhi i salmonella Typhimurium wykazały, że to głównie zawartość genów pochodzących z plazmidów typu F i lambdoidalnych fagów decyduje o różnorod-ności obserwowanej pomiędzy tymi serowarami [8, 23].

2.1. plazmidy

Mapa genetyczna chromosomu salmonella Typhi-murium LT2 niewiele różni się od chromosomu E. coli K-12 [50]. Stopień zgodności sekwencji nukleotydo-wej pomiędzy odpowiadającymi sobie genami wynosi 80–85%. Aktywność niektórych genów bakterii salmo-nella została zidentyfikowana dopiero po wcześniej-szym ich odkryciu u E. coli. Plazmid koniugacyjny F, charakterystyczny dla E. coli, może być przekazywany w procesie koniugacji z E. coli do s. Typhimurium, a także do innych typów serologicznych salmonella [6, 9, 47, 62]. Izolowano szczepy s. Typhimurium, posia-dające plazmid F wbudowany do chromosomu; szczepy takie nazywane są, podobnie jak u E. coli, szczepami Hfr (high-frequency of recombination) [62]. Istnieje więc możliwość przekazywania z wysoką częstotliwością genów chromosomowych ze szczepów Hfr s. Typhimu-rium do szczepów E. coli i odwrotnie. Na przykład geny chromosomowe odpowiedzialne za syntezę antygenów O, H czy Vi bakterii salmonella, mogą być przekazywane w procesie koniugacji, wraz z plazmidem F, bakteriom z rodzaju Escherichia.

Plazmidy bakterii salmonella mogą kodować opor-ność na antybiotyki. Oporność pałeczek s. Typhi na nie-które antybiotyki ma związek z obecnością plazmidów

PLAZMIDY I BAKTERIOFAGI WYSTĘPUJĄCE U BAKTERII sALMoNELLA 203

z grupy niezgodności IncHI. Okazuje się, że plazmidy z tej grupy, niezależnie od geograficznej lokalizacji, wykazują wysoki stopień podobieństwa [65]. Determi-nanty oporności umiejscowione są razem i usytuowane w różnych regionach ewolucyjnie zakonserwowanego DNA. Znaleziony u s. Typhi CT18 plazmid pHCM1, należący do grupy IncHI1 wykazuje znaczące podo-bieństwo do plazmidu R27 [57, 63, 71], wyizolowanego w Winchester w 1961 roku ze szczepu s. Typhimurium, który kodował jedynie oporność na tetracyklinę. Oba te plazmidy wyizolowano z różnych serowarów, na róż-nych kontynentach, w odstępie ponad 30 lat, a mimo to wykazują one 99% podobieństwa w zakresie sekwencji DNA. I chociaż obserwuje się pewne różnice pomiędzy plazmidami z grupy niezgodności IncH oraz okazjonal-nie rejestruje również obecność plazmidów oporności z grup IncB, IncN, IncP, IncB/O [45] i IncF [52], to nie ulega wątpliwości, że plazmidy IncHI1, nadające opor-ność pałeczkom s. Typhi są ewolucyjnie konserwowane i szybko rozpowszechniane w obrębie populacji tych bakterii. Udział R-plazmidów w generowaniu leko-oporności u innych serowarów salmonella jest również dobrze udokumentowany [16, 20, 21, 30, 31].

Inne plazmidy bakterii salmonella kodują wytwarza-nie bakteriocyn, niektóre cechy metaboliczne jak zdol-ność fermentacji laktozy czy sacharozy, a także mogą powodować zmiany faktorów antygenów somatycznych. P o p o f f i L e M i n o r [58] wykazali, iż faktor O:54 bakterii salmonella jest determinowany obecnością plaz midu wielkości 7,5 kpz. Utrata plazmidu oznacza utratę faktora. Faktor O:54 występuje u 15 serowarów salmonella, uwzględnionych w tymczasowej grupie serologicznej O:54 schematu White’a-Kauffmanna-Le Minora (dokument referencyjny przeznaczony do iden-tyfikacji serologicznej bakterii salmonella) [29].

Część bakterii salmonella zawiera duże plazmidy typu F, wielkości od 50 do 90 kpz, kodujące niektóre cechy ich chorobotwórczości [60]. Występujące zwy-kle w niewielkiej liczbie kopii, tak zwane plazmidy wirulencji (virulence plasmids) bakterii salmonella zawierają ważne informacje genetyczne, które determi-nują ich właściwości patogenne. Plazmidy te są istotne dla namnażania się bakterii salmonella w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego stałocieplnych kręgowców. Obecność plazmidów wirulencji wyka-zano jedynie u kilku serowarów z podgatunku enterica, szczególnie u tych, które charakteryzują się znaczą- cą adaptacją do określonych organizmów (tzw. host- adapted serovars) i dlatego plazmidy te często określa się również mianem „serovar-specific plasmids” [60]. Są one potrzebne do wywoływania ogólnoustrojowych infekcji. Ich udział w przebiegu jelitowej postaci zakażeń salmonella jest niejasny. Chociaż plazmidy wirulencji nie uczestniczą bezpośrednio w procesach patologicz-nych zachodzących w organizmie podczas infekcji, to

jako czynniki kontrolujące ekspresję niektórych właści-wości patogennych zarazka, są pośrednimi wskaźnikami jego chorobotwórczości [53, 73]. Obecność różniących się wielkością plazmidów wirulencji typu F wykazano wśród wielu szczepów s. Typhimurium (90 kpz), s. Cho-leraesuis (50 kpz), s. Enteritidis (60 kpz), s. Dublin (80 kpz), s. Gallinarum (85 kpz), s. Gallinarum biowar Pullorum (85 kpz) i s. Abortusovis (50–67 kpz). Obecne były również w szczepach s. Johannesburg, s. Kottbus, s. Give, s. Newport oraz s. Derby. Co ciekawe, plazmi-dów tego typu (i regionu spv) nie posiadają pałeczki salmonella Typhi (wywołujące dur brzuszny), s. Para-typhi A i s. Paratyphi B (serowary odpowiedzialne za dury rzekome) oraz s. Sendai [60]. Wyjątek w tej gru-pie serowarów, patogennych wyłącznie dla człowieka (human-adapted serovars), stanowi s. Paratyphi C, chociaż udział plazmidu wirulencji (54 kpz) w prze-biegu uogólnionego zakażenia wywoływanego przez ten drobnoustrój jest nieznany. Znakomita większość plazmidów wirulencji może być przekazywana innym bakteriom, ale tylko niektóre z nich zachowały zdolności koniugacyjne [2].

M o n t e n e g r o i wsp. [54] w swoich badaniach wykazali, że większość plazmidów wirulencji jest wza-jemnie ze sobą spokrewnionych. Posiadają one wspólny region wirulencji, wielkości ~8kpz DNA, zawierający geny spv (salmonella plasmid virulence) [32], które u serowarów salmonella z podgatunków salamae (II), arizonae (IIIa) i indica (VI) odnaleziono w chromoso-mowym DNA, co wskazuje na zachodzące rearanża-cje materiału genetycznego. Plazmidy determinujące chorobotwórczość są niezbędne do ekspresji „pełnego” fenotypu wirulentnego in vivo. Na przykład, charaktery-s tyczna dla pałeczek s. Enteritidis skłonność do wywoły-wania i utrzymywania się zakażeń głównie u drobiu, jest zredukowana u szczepów pozbawionych plazmidu wiru-lencji [70]. Utrzymywanie się zakażeń u tego właśnie gospodarza, jak i wzmożona wirulencja względem tego gospodarza, może mieć związek z obecnością genów spv. Badania przeprowadzone na myszach dowiodły, że region wielkości ~8kpz, zawierający wszystkie geny spv (spvrABcD), może przywrócić wirulencję szczepom salmonella Typhimurium nie posiadającym plazmidu wirulencji [32]. Co więcej, obecność tylko 2 genów spvB i spvc jest wystarczająca do uzyskania pełnej wirulen-cji do zakażania myszy przez szczep s. Typhimurium pozbawiony pozostałej części plazmidu [48], a serowary gatunku s. enterica zmutowane w obrębie genu spvr pre-zentowały znaczne osłabienie właściwości chorobotwór-czych dla cieląt [44]. U s. Choleraesuis, s. Typhimurium, s. Dublin i pojawiających się ostatnio coraz liczniej, jednofazowych szczepów s. enterica o wzorze antyge-nowym 4,[5],12:i:− (zwanych również U302), wykazano związek plazmidów wirulencji z genami oporności na antybiotyki [16, 30, 31]. Obecność tych ostatnich, jest


prawdopodobnie wynikiem rekombinacji plazmidów wirulencji z plazmidami kodującymi lekooporność. Nie-zwykły, zdolny do samodzielnego przenoszenia się plaz-mid wirulencji pUO-stVR2, którego obecność wyka-zano u niektórych szczepów s. Typhimurium, posiada zarówno geny spv, jak i geny oporności na ampicylinę, chloramfenikol, streptomycynę, sulfonamidy i tetracy-klinę [31]. Wykazano również, iż plazmidy wirulencji posiadają wyrafinowane systemy, które zapewniają im możliwość utrzymania się w populacji bakterii [35]. W niektórych przypadkach, utrata plazmidu oznacza śmierć komórki gospodarza. Jednym z takich systemów jest tzw. system toksyna/antytoksyna (toxin/antitoxin system), określany również jako posegregacyjne zabi-janie komórek bezplazmidowych (postsegregation kil-ling), gwarantujący przeżywalność plazmidu w komórce bakteryjnej. Do F-plazmidowych genów należą także geny operonu pef [7], zawierające pełną informację genetyczną dotyczącą syntezy jednego z kilku rodza-jów fimbrii (tzw. plasmid-encoded fimbriae) oraz gen rck, kodujący oporność na działanie komplementu [36]. Geny wykazujące podobieństwo do genów faeh i faei, kodujących fimbrie E. coli K88, mogą wpływać na wiru-lencję s. Gallinarum. Obecność ich wykazano również w plazmidach wirulencji występujących u s. Dublin i s. Gallinarum biowar Pullorum; nie znaleziono ich jednak w plazmidach obecnych u s. Typhimurium, s. Enteritidis czy s. Choleraesuis [61].

U pałeczek s. Typhimurium i s. Enteritidis zaobser-wowano również pewną zależność pomiędzy obecnością plazmidu wirulencji i prezentowanym przez nie typem bakteriofagowym [73]. Typ bakteriofagowy pałeczek s. Typhimurium jest także determinowany przez nie-które plazmidy oporności [68].

Pozostałe plazmidy występujące u bakterii salmo-nella to tzw. plazmidy kryptyczne (cryptic plasmids), czyli plazmidy bez określonej (jak do tej pory) funkcji, których obecność nie nadaje komórce żadnych szczegól-nych cech fenotypowych odróżniających ją od komórki bezplazmidowej [5, 40]. Należy do nich mały, liczący ~3 kpz plazmid pIMVS1 występujący u s. Typhimu-rium. Sugeruje się, iż może on odgrywać istotną rolę w patogenezie zakażeń u ludzi, nie posiada jednak żad-nych genów charakterystycznych dla patogennego feno-typu. W tej grupie znajduje się także plazmid pHCM2, odkryty u s. Typhi CT18 w 1993 roku. Małe, kryptyczne plazmidy typu ColE1 (3–5,6 kpz) znaleziono również u bakterii salmonella Enteritidis. Jeden z nich (plaz-mid pC) koduje system modyfikacji czynnej restryk-cji, co mogłoby wyjaśniać wysoką oporność szczepów s. Enteritidis posiadających plazmid pC na zakażenia fagami i niezwykle rzadko prezentowaną przez ten sero-war, plazmidowo kodowaną lekooporność [27].

Niektóre plazmidy bakterii salmonella w pełni zse-kwencjonowano. Należą do nich: plazmid lekoopor-

ności R27 (prototypowy plazmid salmonella, wielkości 180 kpz, z grupy niezgodności IncHI1), dwa plazmidy pHCM1 (R-plazmid, ~200 kpz, grupa niezgodności IncHI1) i pHCM2 (funkcja nieznana, 106 kpz) występu-jące u s. Typhi CT18 [40, 57, 63, 71], plazmid wirulencji pSLT występujący u s. Typhimurium LT2 [50] oraz plaz-mid wirulencji pKDSC50, wielkości 50 kpz, znaleziony u s. Choleraesuis [33]. Dostępne są również mapy gene-tyczne i dane dotyczące częściowej sekwencji innych plazmidów bakterii salmonella, takich jak plazmid wiru-lencji, wielkości 60 kpz, występujący u s. Enteritidis [59].

2.2. bakteriofagi

Do pozachromosomowych elementów genetycznych wzbogacających genom komórki bakteryjnej, należą również bakteriofagi, wirusy zdolne do infekowania bakterii, występujące także u pałeczek salmonella [4, 8, 39, 41]. Bakteriofagi pośredniczące w transdukcji mate-riału genetycznego izolowano zarówno z zawartości jelit, jak i ze środowiska. Wiele bakteriofagów jest zdolnych do wejścia w stan zwany lizogenią (fagi lizogeniczne, czasem zwane łagodnymi) poprzez integrację z chromo-somem bakteryjnego gospodarza (z wyjątkiem faga Mu). Ma to szczególne znaczenie w sytuacji gdy bakteriofag jest nosicielem dodatkowych genów (cargo genes), nie odgrywających żadnej roli w procesie proliferacji faga [10]. Obecność aktywnych i nieaktywnych profagów w genomie gospodarza nadaje bakteriom różne szcze-gólne właściwości. Znaczącą manifestacją tego stanu jest tzw. „lizogenna konwersja”, w wyniku której, np.: niechorobotwórczy szczep bakteryjny może stać się szczepem patogennym na skutek nabycia dodatkowych determinant wirulencji zawartych w bakteriofagu [13]. Jedną z najbardziej nieoczekiwanych rewelacji, będącą wynikiem przeprowadzanych ostatnio badań porów-nawczych sekwencji genomów bakterii salmonella, była stosunkowo duża zawartość genów fagowych, co wskazuje na istotny udział bakteriofagów w procesie ewolucji salmonella [41, 50, 57, 67]. Znakomita więk-szość (ponad 170) bakteriofagów powodujących zaka-żenia pałeczek salmonella należy do rzędu caudovira-les, dużych wirusów, głównie lizogenicznych, o złożonej strukturze wirionu, charakteryzującej się posiadaniem ogonka, zawierających jako genom dwuniciowy, liniowy DNA (dsDNA). Te spośród nich, których genomy zostały całkowicie zsekwencjonowane przedstawiono w Tabeli I. Zakażenia bakterii salmonella powodują rów-nież bakteriofagi nie posiadające ogonków, o helikalnej bądź izometrycznej strukturze, należące do czterech rodzin: inoviridae (fagi ssDNA o helikalnym kapsydzie: C-2, I2-2, SF, tf-1, X-2), Leviv iridae (fagi ssRNA o izo-metrycznym kapsydzie: Iα, M, PRR1), Microviridae (fagi ssDNA o izometrycznym kapsydzie: φX174, 1φ7, 1φ1, 1φ3, 1φ9, φR) i Tectiviridae (fagi dsDNA o izometrycz-


nym kapsydzie: PRD1, PR5), chociaż nie są to wirusy sensu stricto specyficzne dla salmonella.

Analiza profagów bakterii salmonella opierała się głównie na wynikach sekwencjonowania materiału genetycznego szczepów s. Typhi CT18 i s. Typhimu-rium LT2. Bakteriofagowy DNA zawarty w obu geno-mach występował głównie w dwóch odmiennych for- mach. W postaci krótkich fragmentów (mniej niż 5 ge- nów), które często kodowały również transpozazy (enzym katalizujący proces transpozycji) i które świadczą o mają- cym wcześniej miejsce zjawisku wycięcia bakteriofa-gowego DNA z DNA komórki bakteryjnego przodka. Drugi rodzaj bakteriofagowego DNA zawiera większe zespoły genów kodujące kompletne profagi lub obszerne ich fragmenty. W przypadku s. Typhi CT18 geny te sta-nowiły około 4% genomu bakteryjnego [57]. Genom s. Typhimurium LT2 zawiera aż sześć regionów DNA, reprezentujących zarówno większe fragmenty profagów, jak i niewielkie ich pozostałości. Dwa lambdoidalne (lambdoid-like) profagi Gifsy-1 i Gifsy-2 wpływają na wirulencję swojego bakteryjnego gospodarza. Pozbawie-nie bakterii s. Typhimurium profaga Gifsy-2 stukrot-nie obniża ich wirulencję przy zakażaniu myszy [24, 25]. Do nie-fagowych genów wykrywanych w obrębie profaga Gifsy-2 należy gen sodci, kodujący dysmutazę nadtlenkową (superoxide dismutase), mającą związek z przeżywalnością bakterii w makrofagach [64, 69]. Bakteriofag Gifsy-1 zawiera gen gipA, uczestniczący w procesie kolonizacji jelita cienkiego i gen ssei, kodu-jący białko efektorowe systemu sekrecji typu III, zwią-zanego z wyspą patogenności 2 (SPI-2) [25]. Z kolei s. Typhi CT18 jest gospodarzem siedmiu regionów DNA pochodzenia bakteriofagowego, wykazujących silne podobieństwo do fagów z rodzin faga P2, P4, Lambda i faga Mu [67]. Badania porównawcze zawartości genów fagowych w szczepie s. Typhi CT18 i innych szczepach s. Typhi oraz innych serowarach salmonella wskazują na ogromną różnorodność genów bakteriofagowych obecnych w genomach bakterii salmonella warunku-

jącą znaczne zróżnicowanie pomiędzy serowarami sal-monella (inter-serovar variation), ale również w obrębie przedstawicieli tego samego serowaru. Niektóre z tych profagowych regionów były specyficzne dla szczepu s. Typhi CT18, co sugeruje „wewnątrzserowarową” zmienność (intra-serovar variation) zachodzącą w obrę-bie poszczególnych szczepów s. Typhi [67]. To podważa opinię na temat pałeczek s. Typhi powszechnie uznawa-nych za organizmy klonalnie spokrewnione („clonal” organisms). Owe różnice dotyczą na ogół regionów genomu skojarzonych z małymi wysepkami genowymi (gene islets), regionów znajdujących się w obrębie wysp patogenności i w bakteriofagach. Zatem chromosom s. Typhi może również posiadać pewne „plastyczne” regiony, spełniające rolę niestabilnego źródła genetycz-nego zróżnicowania w obrębie „highly clonal” popula-cji jaką stanowią pałeczki duru brzusznego. Regiony te zachwiały stabilność klonalnej ekspresji s. Typhi.

Badania w dziedzinie typowania bakteriofagowego przyniosły wiele wniosków z zakresu lizogenii i dzie-dziczności oraz stały się podstawą interpretacji wyników lizotypii w dochodzeniach epidemiologicznych w przy-padkach występowania zjawiska zmienności w obrębie tego samego typu bakteriofagowego [12, 17].

Fagi bakteryjne zdolne do lizogenizacji mogą rów-nież, w wyniku lizogennej konwersji, modyfikować strukturę części O-antygenowej LPS bakterii salmonella [39]. Bakteriofag P22 jest odpowiedzialny za zmianę typu wiązania pomiędzy glukozą i galaktozą w pod-jednostce O-swoistego łańcucha LPS, z wiązania 1–4 na wiązanie 1–6, co w efekcie objawia się powstaniem nowego czynnika O:1 [28]. Pojawienie się determinanty antygenowej O:27, będącej efektem zmiany rodzaju wiązania pomiędzy monomerami, z 1–2 na wiązanie typu 1–6, uważane do tej pory za wynik lizogenizacji fagiem φ27, w rzeczywistości jest modyfikacją uwa-runkowaną obecnością genu wzyα(1–6) zlokalizowanego na chromosomie bakteryjnym, w obrębie głównego zespołu genów odpowiedzialnych za antygen O (major

caudovirales1 Myoviridae2 wirusy podobne do faga P2 fels-2, sopEφ, psp3 oraz fag felix o15

siphoviridae3 wirusy podobne do faga λ gifsy-1, gifsy-2, fels-1, Es18 wirusy podobne do faga P27 st64b

Podoviridae4 wirusy podobne do faga T7 sp6 wirusy podobne do faga P22 ε34, p22, st104, st64t oraz fagi ks7 i ε155

Tabela IBakteriofagi* występujące u bakterii salmonella, których genomy zostały w pełni zsekwencjonowane [1, 15, 41, 74]

*192 bakteriofagi (zarówno lityczne, jak i lizogeniczne) powodują zakażenia bakterii salmonella; 176 spośród nich, to głównie lizogeniczne fagi należące do rzędu caudovirales (w tym 44 z rodziny Myoviridae, 68 z rodziny siphoviridae i 64 z rodziny Podoviridae) 1 duże fagi posiadające ogonki, zawierające jako genom dwuniciowy, liniowy DNA (dsDNA); 2 fagi posiadające kurczliwe ogonki (np.: fagi P2, Mu); 3 fagi posiadające długie, niekurczliwe ogonki (np.: fag λ); 4 fagi posiadające krótkie, niekurczliwe ogonki (np.: fagi T7, P22); 5 fagi Felix O1 oraz KS7 i ε15 spełniają taksonomiczne kryteria przynależności do rodziny odpowiednio Myoviridae i Podoviridae, jednak ze względu na brak podobieństwa do innych bakteriofagów z danej rodziny, nie należą do żadnego ze znanych rodzajów (określane są mianem „orphans”)

Rząd Rodzina Rodzaj Bakteriofag


O-antigen gene cluster) [29, 72]. Fakt ten uwzględniono w najnowszej edycji schematu White’a-Kauffmanna-Le Minora rezygnując z podkreślenia przy prezentowa-niu faktora O:27 (faktory będące wynikiem lizogeni-zacji wyróżnia się w schemacie podkreśleniem) [29]. Fagi ε15 oraz ε34 zmieniają O faktory w grupie O:3,10 (E1). Znacząca liczba, jak i różnorodność profagów, których obecność wykazano w genomach pałeczek salmonella, stanowi ważne źródło genetycznej zmienności i może odgrywać istotną rolę w ewolucji i specjalizacji tych bakterii.

3. podsumowanie

Genomy bakteryjne, są strukturami dynamicznymi, podlegającymi stałej ewolucji. Najważniejszym mecha-nizmem warunkującym ich ciągłą zmienność jest horyzontalny transfer genów, stanowiący główną siłę napędową ewolucji bakteryjnej, stwarzającą możliwość nabycia wielu genów w czasie jednego zdarzenia rekom-binacyjnego. Jest ona szczególnie istotna dla bakterii patogennych, do których należą również pałeczki sal-monella. Rola jaką odgrywają w tym procesie ruchome elementy genetyczne, takie jak plazmidy i bakteriofagi, jest ogromna. Przenoszenie genów za pośrednictwem plazmidów i bakteriofagów, to najczęś ciej transfer odbywający się w obrębie gatunku, lecz możliwa jest również międzygatunkowa wymiana informacji gene-tycznej. Plazmidy są naturalnymi wektorami, mogą-cymi znacznie zwiększać zasób informacji genetycznej swojego bakteryjnego gospodarza. Pałeczki salmonella, podobnie jak wiele innych bakterii, zawierają autono-micznie replikujące się plazmidy, które przede wszyst-kim uczestniczą w wirulencji tych drobnoustrojów lub noszą geny oporności na leki, chociaż izoluje się również tzw. plazmidy kryptyczne, czyli plazmidy bez określo-nej (jak do tej pory) funkcji. Do pozachromosomowych elementów genetycznych wzbogacających genomy bak-terii salmonella, należą również bakteriofagi. Obecność aktywnych i nieaktywnych profagów w genomie nadaje bakteriom salmonella różne szczególne właściwości. Modyfikują one strukturę części O-antygenowej LPS, zmieniają faktory antygenów somatycznych, wpły-wają na wirulencję swojego bakteryjnego gospodarza, warunkują znaczne zróżnicowanie pomiędzy serowa-rami salmonella i wśród przedstawicieli tego samego serowaru. W wyniku przeprowadzanych ostatnio badań porównawczych sekwencji genomów pałeczek salmo-nella, wykazano stosunkowo dużą zawartość genów fagowych, co wskazuje również na istotny udział bak-teriofagów w procesie ewolucji tych drobnoustrojów. W niniejszej pracy opisano najważniejsze, poznane do tej pory plazmidy i bakteriofagi, które goszczą u bakterii salmonella. Ich znacząca liczba i różnorodność stanowi

ważne źródło genetycznej zmienności pałeczek salmo-nella oraz odgrywa istotną rolę w ewolucji i specjalizacji tych mikroorganizmów.

piśmiennictwo

1. Ackermann H.W.: salmonella phages examined in the elec-tron microscope (w) salmonella. Methods and Protocols, red. A. Schatten, A. Eisenstark, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, 2007, s. 213−234

2. Ahmer B., Tran M., Heffron F.: The virulence plasmid of sal-monella typhimurium is self-transmissable. J. Bacteriol. 181, 1364−1368 (1999)

3. Anderson E.S., Threlfall E.J.: The characterization of plasmids in the enterobacteria. J. hyg. camb. 72, 471−487 (1974)

4. Anjum M.F.: Revealing the mosaic nature of salmonella geno-mes using microarrays (w) salmonella. Molecular biology and pathogenesis, red. M. Rhen, D. Maskell, P. Mastroeni, J. Threl-fall, Horizon Bioscience, Norfolk UK, 2007, s. 169−190

5. Astill D.S., Manning P.A., Hauzenroeder M.W.: Characteriza-tion of the small cryptic plasmid, pIMVS1, of salmonella ente-rica ser. Typhimurium. Plasmid, 30, 258−267 (1993)

6. Baron L.S., Carey W.F., Spilman W.M.: Characteristics of a high frequency of recombination (Hfr) strains of salmonella typhosa compatible with salmonella, shigella, and Escherichia species. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 45, 1752−1757 (1959)

7. Bäumler A.J., Tsolis R.M., Bowe F.A., Kusters J.G., Hoffmann S., Heffron F.: The pef fimbrial operon of salmonella typhimurium mediates adhesion to murine small intestine and is necessary for fluid accumulation in the infant mouse. infect. immun. 64, 61−68 (1996)

8. Bishop A.L., Dougan G., Baker S.: The salmonella genome: a global view (w) salmonella infections. Clinical, immuno-logical and molecular aspects, red. P. Mastroeni, D. Maskell, Cambridge University Press, Cambridge UK, 2006, s. 117−145

9. Boyd E.F., Hartl D.L.: Recent horizontal transmission of plas-mids between natural populations of Escherchia coli and sal-monella enterica. J. Bacteriol. 179, 1622−1627 (1997)

10. Boyd E.F., Brüssow H.: Common themes among bacteriophage--encoded virulence factors and diversity among the bacterio-phages involved. Trends Microbiol. 10, 521−529 (2002)

11. Brüssow H., Canchaya C., Hardt W-D.: Phages and the evolu-tion of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion. Microbiol. Mol. Biol. rev. 68, 560−602 (2004)

12. Buczowski Z., Lachowicz K.: Obserwacje dotyczące zmien-ności typów bakteriofagowych s. typhi. Med. Dośw. Mikrobiol. 5, 297−301 (1953)

13. Canchaya C., Fournous G., Chibani-Chennoufi S., Dill-mann M.L., Brüssow H.: Phage as agents of lateral gene transfer. curr. opin. Microbiol. 6, 417−424 (2003)

14. Casjens S.: Prophages and bacterial genomics: what we have learned so far? Mol. Microbiol. 49, 277−300 (2003)

15. Casjens S.R., Gilcrease E.B., Winn-Slapley D.A, Schickl- maier P., Schmieger H., Pedulla M.L., Ford M.E., Houtz J.M., Hartfull G.F., Hendrix R.W.: The generalized transducing salmonella bacteriophage ES18: complete genome sequence and DNA packaging strategy. J. Bacteriol. 187, 1091−1104 (2005)

16. Chu C., Chiu C.H., Wu W.Y., Chu C.H., Lu T.P., Ou J.T.: Large drug resistance virulence plasmids of clinical isolates of salmo-nella enterica serovar Choleraesuis. Antimicrob. Agents chemo-ther. 45, 2299−2303 (2001)


17. Chomiczewski J.: Badania nad typowaniem bakteriofagowym i biochemicznym salmonella typhi. Zmienność obrazu typów bakteriofagowych w środowisku endemicznym. Med. Dośw. Mikrobiol. 13, 217−228 (1961)

18. Cirillo D.M., Heffernan E.J., Wu L., Harwood J., Fierer J., Guiney D.G.: Identification of a domain in Rck, a product of salmonella typhimurium virulence plasmid, required for both serum resistance and cell invasion. infect. immun. 64, 2019−2023 (1996)

19. Cohen S.N.: Transposable genetic elements and plasmids evo-lution. Nature, 263, 731−738 (1976)

20. Cooke F.J., Wain J.: Antibiotic resistance in salmonella infec-tions (w) salmonella infections. Clinical, immunological and molecular aspects, red. P. Mastroeni, D. Maskell, Cambridge University Press, Cambridge UK, 2006, s. 25−56

21. Cooke F.J., Threlfall J., Wain J.: Current trends in the spread and occurrence of human salmonellosis: molecular typing and emerging antibiotic resistance (w) salmonella. Molecular bio-logy and pathogenesis, red. M. Rhen, D. Maskell, P. Mastroeni, J. Threlfall, Horizon Bioscience, Norfolk UK, 2007, s. 1−29

22. Elwell L.P., Shipley P.L.: Plasmid-mediated factors associated with virulence of bacteria to animals. Ann. rev. Microbiol. 34, 465−469 (1980)

23. Emmerth M., Goebel W., Miller S.I., Hueck C.J.: Genomic sub-traction identifies salmonella typhimurium prophages, F-rela-ted plasmid sequences, and novel fimbrial operon, stf, which are absent in salmonella typhi. J. Bacteriol. 181, 5652−5661 (1999)

24. Figueroa-Bossi N., Bossi L.: Inducible prophages contribute to salmonella virulence in mice. Mol. Microbiol. 33, 167−176 (1999)

25. Figueroa-Bossi N., Uzzau S., Maloriol D., Bossi L.: Variable assortment of prophages provides a transferable repertoire of pathogenic determinants in salmonella. Mol. Microbiol. 39, 260−271 (2001)

26. Gemski P., Lazere J.R., Casey T.: Plasmid associated with patho-genicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. infect. immun. 27, 682−685 (1980)

27. Gregorova D., Pravcova M., Karpiskova R., Rychlik I.: Plazmid pC present in salmonella enterica serovar Enteritidis PT14b strains encodes a restriction modification system. FEMs Micro-biol. Lett. 214, 195−198 (2002)

28. Grimont P.A.D., Grimont F., Bouvet P.: Taxonomy of the genus salmonella (w) salmonella in domestic animals, red. C. Wray, A. Wray, CABI Publishing, New York USA, 2000, s. 1−17

29. Grimont P.A.D., Weill F-X.: Antigenic formulae of the sal-monella serovars, 9th edition. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on salmonella, Institut Pasteur, Paris, France, 2007

30. Guerra S., Soto S.M., Arguelles J.M., Mendoza M.C.: Multidrug resistance is mediated by large plasmids carrying a class 1 inte-gron in the emergent salmonella enterica serotype [4,5,12:i:-]. Antimicrob. Agents chemiother. 45, 1305−1308 (2001)

31. Guerra B., Soto S., Helmuth R., Mendoga M.C.: Characteri-zation of a self-transferable plasmid from salmonella enterica serotype Typhimurium clinical isolates carrying two integron--borne gene cassettes together with virulence and drug resis - tance genes. Antimicrob. Agents chemother. 46, 2977−2981 (2002)

32. Guling P.A., Danbara H., Guiney D.G., Lax A.J., Norel F., Rhen M.: Molecular analysis of spv virulence genes of the salmonella virulence plasmids. Mol. Microbiol. 7, 825−830 (1993)

33. Haneda T., Okada N., Nakazawa N., Kawakami T., Danbara H.: Complete DNA sequence and comparative analysis of the 50-kilobase virulence plasmid of salmonella enterica serovar Choleraesuis. infect. immun. 69, 2612−2620 (2001)

34. Harris J.R., Wachsmuth J.K., Davis B.R., Cohen M.L.: Highmo-lecular-weight plasmid correlates with Escherichia coli entero-invasiveness. infect. immun. 37, 1295−1298 (1982)

35. Hayes F.: Toxin-antitoxin: plasmid maintenance, program-med cell death, and cell cycle arrest. science, 301, 1496−1499 (2003)

36. Heffernan E.J., Harwood J., Fierer J., Guiney D.: The salmonella typhimurium virulence plasmid complement resistance gene rck is homologous to a family of virulence-related outer membrane protein genes including pagc and ail. J. Bacteriol. 174, 84−91 (1992)

37. Hendrix R.W., Lawrence J.G., Hatfull G.F., Caskjens S.: The origins and ongoing evolution of viruses. Trends Microbiol. 8, 504−507 (2000)

38. Hendrix R.W.: Bacteriophage genomics. curr. op. Microbiol. 6, 506−511 (2003)

39. Iino T., Ledeberg J.: Genetics of salmonella (w) The world pro-blem of salmonellosis, red. E. Van Oye, Dr. W. Junk Publishers, Hague, 1964, s. 111142

40. Kidgell C., Dougan G. i wsp.: Characterisation and distribution of a cryptic salmonella typhi plasmid pHCM2. Plasmid, 47, 159−171 (2002)

41. Kropinski A.M., Sulakwelidze A., Konczy P., Poppe C.: salmo-nella phages and prophages – Genomics and practical aspects (w) salmonella. Methods and Protocols, red. A. Schatten, A. Eisenstark, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, 2007, s. 133−175

42. Levine M.M., Nataro J.P., Karach H., Baldini M.M., Kaper J.B., Black R.E.: The diarrheal response of humans to some classic serotypes of enteropathogenic Escherichia coli dependent on a plasmid encoding an enteroadhesivenes factor. J. infect. Dis. 152, 550−559 (1985)

43. Levine M.M.: Escherichia coli that cause a diarrhea: entero toxi genic, enteropathogenic, enteroinvasive, enterohaemorrha gic and enteroadherent. J. infect. Dis. 155, 377−389 (1987)

44. Libby S.J., Adams L.G., Ficht T.A., Allen C.A., Whitford H.A., Buchmeier, S. Bossie N.A., Guiney D.G.: The spv genes on the salmonella dublin virulence plasmid are required for severe enteritis and systemic infection in the natural host. infect. immun. 65, 1786−1792 (1997)

45. Ling J., Chau P.Y.: Plasmids mediating resistance to chloram-phenicol, trimethoprim, and ampicilin in salmonella typhi strains isolated in the Siutheast Asian region. J. infect. Dis. 149, 652 (1984)

46. Ling J., Chau P.Y.: Incidence of plasmids in multiply-resistant salmonella isolates from diarrhoeal patients in Hong Kong from 1973–82. Epidem. inf. 99, 307−321 (1987)

47. Mäkelä P.H.: Hfr males in salmonella abony. Genetics, 48, 423−429 (1963)

48. Matusi H., Bacot C.M., Garlington W.A., Doyle T.J., Roberts S., Guling P.A.: Virulence plasmid-borne spvB i spvc genes can replace the 90-kilobase plasmid in conferring virulence to salmonella enterica serovar Typhimurium in subcutaneously inoculated mice. J. Bacteriol. 183, 4652−4658 (2001)

49. Maurelli, A.T.: Regulation of virulence genes in shigella. Mol. Biol. Med. 6, 425–432 (1989)

50. McClelland M., Wilson R.K. i wsp.: Complete genome sequ-ence of salmonella enterica serovar Typhimurium LT2. Nature, 413, 852−856 (2001)

51. Miljkovic-Selimovic B., Babic T., Kocic B., Stojanovic P., Rostic L., Dinic M.: Bacterial plasmids. AMM, 46, 61−65 (2007)

52. Mirza S., Kariuki S., Mamun K.Z., Beeching N.J., Hart C.A.: Analysis of plasmid and chromosomal DNA of multidrug--resistant salmonella enterica serowar Typhi from Asia. J. clin. Microbiol. 38, 1449−1452 (2000)


53. Molenda J.: Czynniki chorobotwórczości pałeczek salmonella. Post. Mikrobiol. 30, 3−19 (1991)

54. Montenegro M.A., Morelli G., Helmuth R.: Heteroduplex ana-lysis of salmonella virulence plasmids and their prevalence in isolates of defined sources. Microb. Pathog. 11, 7−16 (1991)

55. Namimatsu T., Asai T., Osumi T., Imai Y., Sato S.: Prevalence of virulence plasmid in salmonella Typhimurium isolates from pigs. J. Vet. Med. sci. 68, 187−188 (2006)

56. O’Brien T.F., Ross D.G., Guzman M.A., Medeiros A.A., Hedges R.W., Bostein D.: Dissemination of an antibiotic resistance plas-mid in hospital patient flora. Antimicrob. Agents chemother. 17, 537−543 (1980)

57. Parkhill J., Barrell B.G. i wsp.: Complete genome sequence of a multiple drug resistant salmonella enterica serowar Typhi CT18. Nature, 413, 848−852 (2001)

58. Popoff, M.Y., Le Minor L.: Expression of antigenic factor O:54 is associated with the presence of a plasmid in salmonella. Annales de l’institut Pasteur/Microbiologie, 136b, 169−179 (1985)

59. Rodrígues-Peña J.M., Buisán M., Ibáñez M., Rotger R.: Gene-tic map of the virulence plasmid of salmonella enteritidis and nucleotide sequence of its replicons. Gene, 188, 53−61 (1997)

60. Rotger R., Casadesús J.: The virulence plasmids of salmonella. internatl. Microbiol. 2, 177−184 (1999)

61. Rychlik, I., Lovell M.A., Barrow P.A.: The presence of genes homologous to the K88 genes faeh and faei on the virulence plasmid of salmonella gallinarum. FEMs Microbiol. Lett. 159, 255−260 (1998)

62. Sanderson K.E., Ross H., Ziegler L., Mäkelä P.H.: F+, Hfr, and F’ strains of salmonella typhimurium and salmonella abony. Bacteriol. rev. 36, 608−637 (1972)

63. Scherburne C.K., Lawley T.D., Glimour M.W., Blattner F.R., Burland V., Grotbeck E., Rose D.J., Taylor D.E.: The complete DNA sequence and analysis of R27, a large IncHI plasmid from salmonella typhi that is temperature sensitive for transfer. Nucleic Acids res. 28, 2177−2186 (2000)

64. Slauch J.M.: Genetic analysis of bacterial pathogenesis (w) Molecular paradigms of infectious disease. A bacterial per-spective, red. C.A. Nickerson, M.J. Schurr, Springer, New York USA, 2006, s. 1−33

65. Taylor D.E., Brose E.C.: Characterization of incompatibility group HI1 plasmids from salmonella typhi by restriction endo-nuclease digestion and hybridization of DNA probes for Tn3, Tn9, and Tn10. can. J. Microbiol. 31, 721−729 (1985)

66. Tezcan-Merdol D., Ygberg S.E., Rhen M.: The salmonella ente-rica virulence plasmid and the spv gene cluster (w) salmonella. Molecular biology and pathogenesis, red. M. Rhen, D. Maskell, P. Mastroeni, J. Threlfall, Horizon Bioscience, Norfolk UK, 2007, s. 89−103

67. Thomson N., Dougan G. i wsp.: The role of prophage-like ele-ments in diversity of salmonella enterica serovars. J. Mol. Biol. 339, 279−300 (2004)

68. Threlfall E.J., Ward L.R., Rowe B.: The use of phage typing and plasmid characterization in studying the epidemiology of mul-tiresistant salmonella typhiumurium (w) Antibiotics: methods of assessing antimicrobial resistance and the occurrence of resi-stance, red. A.P. Russell, L.B. Quesnel, Academic Press, London UK, 1983, s. 285−297

69. Uzzau S., Bossi L., Figuerosa-Bossi N.: Differential accumula-tion of salmonella [Cu, Zn] superoxide dismutases SodCI and SodCII in intracellular bacteria: correlation with their relative contribution to pathogenicity. Mol. Microbiol. 46, 147−156 (2002)

70. Virlogeux-Payant I., Mopart F., Velge P., Bottreau E., Pardon P.: Low persistence of a large-plasmid-cured variant salmonella enteritidis in ceca of chicks. Avian Dis. 47, 163−168 (2003)

71. Wain J., Dougan G. i wsp.: Molecular analysis of incHI1 anti-microbial resistance plasmids from salmonella serovar Typhi strains associated with typhoid fever. Antimicrob. Agents che-mother. 47, 2732−2739 (2003)

72. Wang L., Andrianopoulos K., Liu D., Popoff M., Reeves P.R.: Extensive variation on the O-antigen gene cluster within one salmonella enterica serogroup reveals an unexpected complex history. J. Bacteriol. 184, 1669−1677 (2002)

73. Woodward M.J., McLaren I., Wray C.: Distribution of virulence plasmids within salmonellae. J. Gen. Microbiol. 135, 503−511 (1989)

74. Whichard J.M., Weigt L.A., Borris D.J., Li L.L., Zhang Q., Kapur V., Pierson F.W., Lingohr E.J., She Y.M., Kropinski A.M., Sriranganathan N.: Complete genomic sequence of bacterio-phage Felix O1. Viruses, 2, 710−730 (2010)


1. Wstęp

Odkrycie przez A. Fleminga antybiotycznych właś- ciwości pleśni kropidlaka Penicillum notatum, a następ-nie penicyliny i jej aktywności terapeutycznej przez H. Florey i B. Chain rozpoczęło złotą erę antybiotyków [25]. Jednak powszechne i często nieprawidłowe stoso-wanie leków spowodowało pojawianie się antybiotyko-oporności wśród mikroorganizmów. Obecnie można zaobserwować pewnego rodzaju wyścig pomiędzy naukowcami poszukującymi nowych, bardziej skutecz-nych antybiotyków, a mikroorganizmami rozwijający- mi nowe mechanizmy antybiotykooporności. Dlatego zwrócono uwagę na związki przeciwdrobnoustrojowe, w tym peptydy kationowe, zaangażowane we wrodzone mechanizmy odpowiedzi immunologicznej zarówno zwierząt (kręgowców i bezkręgowców), jak i roślin. Stwierdzono również, że bakterie, głównie Gram-dodat-nie pałeczki fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacil-lus, są zdolne do wytwarzania przeciwdrobnoustrojo-wych peptydów – bakteriocyn (AMP’s – Antimicrobial

Peptides) [33, 44, 49]. Badania dowiodły, że AMP’s poza działaniem przeciwdrobnoustrojowym (przeciwko bak-teriom Gram-dodatnim, Gram-ujemnym, grzybom), wykazują również działanie przeciwwirusowe, prze-ciwnowotworowe, przeciwpasożytnicze i/lub antykon-cepcyjne [44, 48, 50]. Ważną cechą peptydów kationo-wych jest działanie immunomodulujące, warunkujące koordynację całego układu immunologicznego gospo-darza, pozwalające na skuteczną eliminację czynników patogennych lub komórek nowotworowych. W celu podkreślenia tej funkcji, peptydy kationowe są również nazywane peptydami odpornościowymi (Host Defense Peptides – HDP) [17, 20, 27, 31]. Obecnie prowadzone są badania nad uzyskaniem syntetycznych i modyfiko-wanych pochodnych na bazie naturalnie występujących AMP’s (LL-37), charakteryzujących się niewrażliwością na działanie proteaz, brakiem toksyczności, zdolnością do hamowania stanu zapalnego poprzez efektywniejsze wiązanie LPS (lipopolisacharydu) lub LTA (kwasu lipo-tejchojowego) oraz większą aktywnością przeciwdrobno - ustrojową [37]. Ogromnym problemem w medycy-

przEciWWirusoWE pEptydy kationoWEczŁoWiEka i oWadóW

Magdalena Mizerska-dudka1*, Mariola andrejko2, Martyna kandefer-szerszeń1

1 Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMCS, ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin2Zakład Immunologii Bezkręgowców, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMCS


1. Wstęp. 2. Ogólna charakterystyka peptydów przeciwdrobnoustrojowych. 3. Przeciwwirusowe peptydy kationowe. 3.1. Peptydy kationowe człowieka. 3.1.1. Defensyny. 3.1.2. Katelicydyny. 3.1.3. Laktoferyna i jej pochodna laktoferycyna. 3.2. Peptydy kationowe owadów. 3.2.1. Melityna i cekropina A. 3.2.2. Alloferon 1 i 2. 3.2.3. Mirystylowany peptyd heliothis virescens. 4. Mechanizmy przeciwwirusowego działania peptydów kationowych. 5. Podsumowanie

antiviral cationic peptides in humans and insects

Abstract: Antimicrobial peptides (AMP’s), sometimes called Host Defense Peptides (HDP’s), synthesised by various kind of living organisms (animals, plants, bacteria) present broad range of activities. Antibacterial, antifungal, antiparasitic, antiviral, anticancer or even contraceptive activities of AMP’s have been indicated. Important feature of these molecules is also immunomodulation, which enable synchronized function of immune system against infection or cancer cells. Properties and modes of action of AMP’s make them potential therapeutic agents against viruses. Among human AMP’s, antiviral activity was examined for defensins, LL-37 or lactoferrin/lactoferricin. Insects like other invertebrate organisms, are also good source of antiviral peptides, for example cecropin A, melittin, alloferon 1 and 2, myristoylated peptide of heliothis virescens. These peptides inhibit binding of viruses to host cells, exert influence on viral envelope or host cells membranes. AMP’s can also modulate expression of both viral or host genes essential for viral replication. Important features of antiviral peptides are the regulation of the synthesis of cytokines and their receptors, and modulation of immunocompetent cell activity or chemotactic activity, called in general immunomodulation.

1. Introduction. 2. Basic features of antimicrobial peptides. 3. Antiviral cationic peptides. 3.1. Cationic peptides in humans. 3.1.1. Defensins. 3.1.2. Cathelicidins. 3.1.3. Lactoferrin and its derivative – lactoferricin. 3.2. Cationic peptides from insects. 3.2.1. Melittin and cecropin A. 3.2.2. Alloferon 1 and 2. 3.2.3. Miristoylated peptide of heliothis virescens. 4. Mechanisms of action of antiviral cationic peptides. 5. Summary

słowa kluczowe: AMP’s człowieka, AMP’s owadów, immunomodulacja, przeciwwirusowe peptydy kationowe, odporność wrodzonakey words: antiviral cationic peptides, human AMP’s, immunomodulation; innate immunity, insect AMP’s

*Autor korespondencyjny: Zakład Wirusologii i Immunologii, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, UMCS; ul. Akademicka 19, 20-033 Lublin; tel. (081) 537 59 42; e-mail: [email protected]

210 MAGDALENA MIZERSKA-DUDKA, MARIOLA ANDREJKO, MARTYNA KANDEFER-SZERSZEŃ

nie obok antybiotykooporności bakterii i grzybów jest dostępność związków przeciwwirusowych, skutecznych wobec zagrażających życiu wirusów, np. HIV (Human Immunodeficiency Virus), HBV (Hepatitis B Virus) i HCV (Hepatitis C Virus). Właściwości oraz mecha-nizm działania peptydów kationowych skłoniły wielu badaczy do poszukiwania tych związków wśród AMP’s.

2. ogólna charakterystyka peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Na podstawie informacji umieszczonych w bazie danych Antimicrobial Peptides Database, do grudnia 2010, u organizmów prokariotycznych i eukariotycz-nych opisano 1670 peptydów przeciwdrobnoustrojo-wych [24]. Do AMP’s zaliczono peptydy zbudowane z 12–50 aminokwasów i posiadające masę cząsteczkową 3–10 kDa, rzadko powyżej 20 kDa, których cechą cha-rakterystyczną jest obecność 2–9 ładunków dodatnich. Obecnie do przeciwdrobnoustrojowych i odpornoś-ciowych AMP’s włączono także polipeptydy i białka o masie cząsteczkowej znacznie większej od klasycznych AMP’s oraz peptydy o charakterze anionowym [39, 60]. Obecność dodatniego ładunku w cząsteczkach AMP’s związana jest z brakiem lub niewielką ilością aminokwa-sów kwaśnych (Glu lub Asp) oraz dużą aminokwasów zasadowych (Arg, Lys, His). Aminokwasy hydrofobowe stanowią 30–50% składu aminokwasowego AMP’s [20].

Na podstawie sekwencji aminokwasowej oraz struk-tury drugorzędowej, określonej za pomocą spektro-skopii magnetycznego rezonansu jądrowego (Nuclear Magnetic Resonance – NMR), AMP’s można zaliczyć do następujących klas [44]:

• liniowych, α-helikalnych peptydów;• peptydów o strukturze stabilizowanej mostkami

dwusiarczkowymi, zawierających w cząsteczce kom - binację układu α-helisy i β-kartki, trzy antyrów-

nolegle ułożone struktury β-kartki lub strukturę szpilki do włosów zbudowaną z motywu β-kartki;

• peptydów zawierających znaczną ilość amino-kwasu jednego typu, np. glicyny i/lub proliny;

• peptydów zawierających rzadkie, modyfikowane aminokwasy.

Podstawową właściwością peptydów przeciwdrob-noustrojowych, warunkującą zdolność niszczenia ko- mórek drobnoustrojów i komórek nowotworowych jest posiadanie dodatniego ładunku oraz właściwości amfi-patycznych. Dzięki temu peptydy kationowe wiążą się z ujemnie naładowaną powierzchnią komórki docelowej [23]. W przypadku komórek bakterii Gram-ujemnych AMP’s oddziałują z LPS, a w przypadku Gram-dodat-nich z kwasem tejchojowym i peptydoglikanem (PG), wypierając jony dwuwartościowe. Umożliwia to wiąza-nie się z ujemnie naładowanymi lipidami, występują-cymi po zewnętrznej stronie błony komórkowej, tj. z fos-fatydyloglicerolem, kardiolipiną, czy fosfatydyloseryną [21]. Peptydy kationowe wykazują również działanie przeciwnowotworowe, wiążąc się z ujemnie naładowa-nymi lipidami w błonie komórek nowotworowych [23]. Mechanizm działania peptydów kationowych polega na dezintegracji błony komórkowej, poprzez formo-wanie w niej kanałów, depolaryzację lub fragmentację, w efekcie prowadząc do śmierci komórki. Na podstawie sposobu oddziaływania peptydów z błoną komórkową oraz mechanizmu jej niszczenia wyróżniamy kilka modeli oddziaływania AMP’s z błoną komórki docelo-wej: model „dywanowy”; „klepek beczki”; „porów toro-idalnych” oraz model nawiązujący do działania deter-gentów [23]. Według modelu „dywanowego” peptydy układają się na powierzchni błony komórkowej, rów-nolegle do jej płaszczyzny. Po osiągnięciu określonego stężenia progowego, wykazują właściwości podobne do detergentów, co prowadzi do powstawania w błonie porów i jej fragmentacji w wyniku formowania miceli. Natomiast model „klepek beczki” sugeruje, że peptydy

Rys. 1. Rola peptydów przeciwdrobnoustrojowych w regulacji odpowiedzi immunologicznej ssakówna przykładzie defensyn i LL-37 [8, 18, 31]

PRZECIWWIRUSOWE PEPTYDY KATIONOWE CZŁOWIEKA I OWADÓW 211

wbudowują się w błonę komórkową prostopadle do jej płaszczyzny, ściśle przylegając do siebie w ten spo-sób, że ich hydrofilne regiony skierowane są do światła formowanego kanału, natomiast regiony hydrofobowe oddziałują z dwuwarstwą lipidową. Również model „porów toroidalnych” zakłada formowanie porów przez AMP’s w błonie komórki docelowej, z tym że hydro-filne regiony peptydów asocjują z resztami fosfolipido-wymi lipidów błony, natomiast regiony hydrofobowe z lipidami. W powstających porach błona komórkowa wyściela wnętrze porów [27]. Wykazano, że niektóre AMP’s mogą prowadzić do śmierci komórki docelowej poprzez hamowanie syntezy białek, składników ściany komórkowej, hamowanie aktywności enzymów czy hamowanie syntezy DNA lub RNA [23, 27, 30, 39, 42].

Badania wykazały, że niektóre z peptydów przeciw-drobnoustrojowych charakteryzują się słabą aktywnoś-cią bakteriobójczą, a ich główną funkcją jest immuno-modulacja, umożliwiająca zsynchronizowane działania całego układu odpornościowego, w celu zwalczenia zaka- żenia lub eliminacji komórek nowotworowych. Akty-wują one wrodzone mechanizmy odpowiedzi immuno-logicznej, regulują stan zapalny, stymulują gojenie ran i inicjują odporność nabytą [31].

3. przeciwwirusowe peptydy kationowe

Większość obecnie znanych AMP’s posiada aktyw-ność przeciwbakteryjną i/lub przeciwgrzybową. Coraz większe zainteresowanie budzą jednak peptydy o dzia-łaniu przeciwwirusowym. Na podstawie bazy danych APD takie działanie przypisuje się obecnie 103 AMP’s. Wśród nich dużą grupę stanowią peptydy kationowe ssaków i owadów [24].

3.1. peptydy kationowe człowieka

3.1.1. defensynySsacze defensyny są to nieglikozylowane peptydy

kationowe o masie cząsteczkowej 3,5–6 kDa, zróżnico-wanej sekwencji aminokwasowej i konserwatywnych cysteinach tworzących mostki dwusiarczkowe stabili-zujące strukturę cząsteczki. U człowieka wyróżniono dwie klasy defensyn: α-defensyny i β-defensyny [14, 17]. α-defensyny posiadają mostki dwusiarczkowe utworzone pomiędzy cysteinami w pozycji 1 i 6, 2 i 4 oraz 3 i 5. Należą do nich HNP-1, 2, 3, 4 (Human Neu-trophil Peptides) oraz HD5 i HD6 (Human Defensins). W β-defensynach mostki dwusiarczkowe są formowane pomiędzy cysternami w pozycji 1–5, 2–4 i 3–6. U czło-wieka zidentyfikowano sześć β-defensyn, hBD-1 do 6 (human β Defensins) [17]. Defensyny wytwarzane są w postaci nieaktywnych propeptydów, ulegających akty-wacji na drodze proteolizy. α-defensyny są syntetyzo-wane konstytutywnie i magazynowane w granulach neu-

trofilów, komórkach Paneth’a, wytwarzane są również przez monocyty/makrofagi i komórki NK. Natomiast β-defensyny są syntetytyzowane po indukcji, np. LPS lub cytokinami (INF-γ, TNF, IL-1β) przez keratynocyty i komórki nabłonkowe błon śluzowych układu oddecho-wego, pokarmowego, moczowego i rozrodczego [14, 31].

3.1.2. katelicydynyKatelicydyny są peptydami powstającymi z białka

prekursorowego, zawierającego na N-końcu wysoce kon- serwatywną sekwencję sygnałową i proregion podobny do katelin, inhibitorów katepsyny L [32]. U człowieka pojedynczy gen camp koduje nieaktywne białko prekursorowe o masie cząsteczkowej ok. 18 kDa, zwane hCAP-18. Cząsteczka białka prekursorowego jest stabilizowana dwoma mostkami dwusiarczkowymi. Białko prekursorowe jest magazynowane w granulach neutro-filów, NK i komórek tucznych. Również komórki nabłonkowe skóry, płuc, jelit, gruczołów mlecznych wytwarzają i uwalniają hCAP18. W surowicy krwi stwierdzono obecność hCAP18, związanego z lipo-proteinami. W wyniku ograniczonej proteolizy z pre-kursorowego białka powstaje aktywny peptyd – LL-37. W jego uwalnianiu uczestniczy proteaza serynowa kali-kreina (z keratynocytów) lub proteinaza 3 z neutrofilów. W przypadku LL-37 powstającego w skórze, peptyd ten może ulegać dalszej obróbce z udziałem m.in. proteaz wytwarzanych przez mikroflorę do pochodnych o róż-norodnych funkcjach. Nazwa LL-37 dotyczy dojrzałego AMP’s. Zbudowany jest z 37 aminokwasów, z czego dwa pierwsze to leucyny. Peptyd ten, bogaty w lizynę i argi-ninę, należy do liniowych, α-helikalnych AMP’s [14, 17, 31, 32]. LL-37 został opisany jako peptyd przeciwbak-teryjny, ale o małej aktywności. Dopiero wysokie stęże-nie peptydu lub obniżona siła jonowa środowiska i za- wartość jonów dwuwartościowych, wpływa na wzrost aktywności przeciwbakteryjnej. Natomiast jego główną rolą jest udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej oraz działanie przeciwzapalne [32].

3.1.3. laktoferyna i jej pochodna laktoferycynaLaktoferyna jest glikoproteiną o masie cząst. 80 kDa,

wiążącą Fe3+ i wytwarzaną przez neutrofile. W dużych ilościach występuje np. w mleku, ślinie, spermie, łzach oraz w wydzielinie śluzowo-surowiczej okrężnicy. Jej właściwości przeciwdrobnoustrojowe determinuje zdol-ność wiązania jonów żelaza [3]. Pochodną laktoferyny o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych i immu-nomodulujących jest laktoferycyna. in vivo powstaje ona w przewodzie pokarmowym na drodze proteolitycznego odcięcia (z udziałem pepsyny) N-końca laktoferyny. Ludzka laktoferycyna, zbudowana z 49 aminokwasów jest stabilizowana przez dwa mostki dwusiarczkowe. Laktoferycyna ma właściwości amfipatyczne warunku-jące jej właściwości przeciwdrobnoustrojowe [36].


3.2. peptydy kationowe owadów

Zainteresowanie peptydami przeciwdrobnoustrojo-wymi bezkręgowców, a szczególnie owadów, rozpoczęło się w 1980 roku od izolacji cekropin z immunizowanych poczwarek hyalophora cecropia [52]. Od tego momentu opisano wiele peptydów u różnych przedstawicieli tej gromady. U Drosophila melanogaster, najlepiej zbada-nego gatunku owada stwierdzono obecność 20 genów kodujących 8 rodzin AMP’s (większość występuje w postaci kilku izoform): andropin, attacyn, cekropin, defen-syn, dipterycyn, drosomycyn, drosocyn, mecznikowin [26, 54]. W ostatnich latach opisano 12 peptydów otrzy-manych z hemolimfy gąsienic Galleria mellonella immu-nizowanych żywymi komórkami bakterii Gram-ujem-nej E. coli i/lub Gram-dodatniej Micrococcus luteus, tj. Gm peptyd bogaty w prolinę 1 i 2, Gm anionowy pep-tyd 1 i 2, defensyna Galleria (galiomycyna), Gm peptyd podobny do defensyn (gallerimycyna), Gm apolipofory-cyna, Gm peptyd podobny do cekropiny D oraz 4 pep-tydy podobne do moricyny A1 Bombyx mori [7, 12].

Głównym miejscem syntezy AMP’s owadów jest ciało tłuszczowe, a w mniejszym stopniu hemocyty i komórki nabłonkowe. Wydzielane do hemolimfy, współdziałają ze sobą oraz innymi czynnikami mechanizmów syste-mowej odpowiedzi immunologicznej. Z kolei wytwa-rzane przez nabłonki peptydy uczestniczą w lokalnych mechanizmach odpowiedzi immunologicznej [16, 22, 54]. Istnieją doniesienia o przeciwwirusowym działaniu niektórych peptydów kationowych owadów. Mechanizm działania przeciwwirusowego został zbadany m. in. dla melityny, cekropiny A, alloferonu 1 i 2 oraz mirystylo wa- nego peptydu wyizolowanego z heliothis virescens [58].

3.2.1. Melityna i cekropina aMelityna i cekropina A należą do klasy α-helikalnych

peptydów przeciwdrobnoustrojowych owadów. Cekro-piny były pierwszymi peptydami opisanymi u zwierząt [52]. Zbudowane są z 29–42 aminokwasów i pozba-wione cysteiny i metioniny [9]. Cechą charakterys-tyczną większości cekropin jest obecność tryptofanu jako pierwszego lub drugiego aminokwasu N-końca oraz obecność na C-końcu grupy amidowej. Liniowe, α-helikalne AMP’s wykazują przede wszystkim dzia-łanie bakteriobójcze w stosunku do Gram-ujemnych i w mniejszym stopniu do bakterii Gram-dodatnich [9]. Do cekropin należy również melityna, zbudowana z 26 aminokwasów, wyizolowana z jadu pszczoły Apis mellifera. Wykazuje ona toksyczne działanie wobec komórek ssaków (liza erytrocytów). Badania nad stworzeniem pochodnej owadzich peptydów cekro-piny i melityny, mającej zastosowanie terapeutyczne i pozbawionej aktywności hemolitycznej zaowocowały uzyskaniem peptydu modelowego CEMA (cecropin--melittin hybryd peptide), który wykazywał właściwości

immunomodulujące. Między innymi hamował ekspresję genów indukowaną LPS poprzez blokowanie oddzia-ływań pomiędzy endotoksyną i surowiczym białkiem wiążącym LPS ( LPS Binding Protein – LBP) [4, 21, 47].

3.2.2. alloferon 1 i 2Alloferon 1 i 2 zostały wyizolowane z hemolimfy

gąsienic plujki pospolitej, calliphora vicina, immuni-zowanych martwymi komórkami bakterii Gram-ujem-nej E. coli i Gram-dodatniej M. luteus. Zbudowane są odpowiednio z 13 i 12 aminokwasów. Alloferon 2 odpo-wiada skróconej, N-końcowej formie alloferonu 1. Nie wiadomo czy alloferon 2 powstaje na drodze proteolizy alloferonu 1, czy obie formy są kodowane przez dwa różne geny [11]. Nazwa alloferon nawiązuje do funk-cjonalnego podobieństwa (pobudzanie komórek cyto-toksycznych) pomiędzy tymi peptydami a interferonem (-feron) i izolacji z organizmu bezkręgowca (allo-) [48].

3.2.3. Mirystylowany peptyd heliothis virescensN-mirystylowany peptyd, o m. cząsteczkowej 916 Da

został wyizolowany z hemolimfy gąsienic h. virescens. Zbudowany jest z 6 aminokwasów, a na N-końcu ma przyłączoną resztę nasyconego, 14-węglowego miry-stylowego kwasu tłuszczowego. Natomiast na C-końcu cząsteczki występuje histydyna z przyłączonymi dwoma grupami metylowymi, co nadaje cząsteczce dodatni ładunek. Niewielka masa cząsteczkowa, obecność dodatniego ładunku oraz kwasu tłuszczowego warunkuje prawdopodobnie wewnątrzkomórkowe, przeciwwiru-sowe działanie peptydu [41]. Peptyd ten został wyizolo-wany ze zmelanizowanej hemolimfy, istnieje więc praw-dopodobieństwo, że jest on metabolitem powstającym podczas syntezy melanin. Obserwowana w badaniach aktywność przeciwwirusowa hemolimfy h. virescens wobec 6 wirusów DNA i RNA, związana z obecnością profenoolooksydazy i melanizacją, zależała właśnie od tego peptydu [40, 43].

4. Mechanizmy przeciwwirusowego działania peptydów kationowych

Przeciwwirusowe działanie, głównie przeciwko otocz- kowym wirusom DNA i RNA, wykazują przedsta wiciele wszystkich czterech klas AMP’s [27].Wyróżniono nastę- pujące mechanizmy przeciwwirusowego działania AMP’s:

1. Blokowanie adhezji wirusa do powierzchni ko- mórki wrażliwej.

2. Oddziaływanie z otoczką wirusową lub błoną komórki docelowej.

3. Modulowanie ekspresji genów wirusowych/inter-ferencja z replikacją wirusa.

4. Regulowanie/modulowanie odpowiedzi immuno-logicznej gospodarza.


ad. 1. Stwierdzono, że proteoglikany (anionowe związki występujące na powierzchni komórek i w macie-rzy zewnątrzkomórkowej), a w szczególności siarczan heparanu biorą udział w adhezji niektórych wirusów do powierzchni komórki [51]. W związku z tym, obdarzone dodatnim ładunkiem peptydy kationowe na zasadzie oddziaływań elektrostatycznych i kompetycji, mogą blokować wiązanie wirusów do powierzchni komórki docelowej. Stwierdzono, że α-defensyny, laktoferyna/laktoferycyna oraz peptyd LL-37 wiążą się do proteo-glikanów, hamując adhezję wirusów do komórki [2, 36, 45]. Laktoferyna i jej pochodna laktoferycyna są aktywne zarówno w stosunku do wirusów otoczko-wych, HSV-1 i -2 (Herpes Simplex Virus-1 i -2), HIV (Human Immunodeficiency Virus), HCV (Hepatitis C Virus), jak i pozbawionych otoczki, tj. HPV (Human Papillomavirus). Oba peptydy hamują zakażenie ko- mórek wrażliwych na wczesnych etapach infekcji, poprzez bezpośrednie oddziaływanie z wirusem lub wią-zanie do komórkowych receptorów wirusa, tj. siarczanu heparanu [1, 36]. Stwierdzono, że laktoferyna może efektywnie zapobiegać zakażeniom HCV poprzez bez-pośrednie oddziaływanie z białkami (E1 i E2) otoczki wirusowej. Natomiast działanie przeciwko HBV polega na bezpośrednim oddziaływaniu laktoferyny na komórki wrażliwe na wirusa [55].

ad. 2. Przeprowadzone badania dowiodły, że prze-ciwwirusowa aktywność peptydów kationowych może wynikać z ich oddziaływania na błonę komórki docelo-wej lub też na otoczkę wirusową. Niektóre z peptydów w sposób bezpośredni inaktywują wirusy, zapobiegając zakażeniom na etapach poprzedzających adhezję i wni-kanie wirusa do komórki wrażliwej. Prawdopodobny mechanizm takiego działania peptydów polega na nisz- czeniu otoczek wirusowych w sposób analogiczny do niszczenia błony komórek bakteryjnych [29]. Taki mechanizm działania przypisuje się α-defensynie człowieka, HNP-1, która jest aktywna wobec HSV-1 i HSV-2, jak również w stosunku do VSV (Vesicular Stomatitis Virus), wirusa grypy i CMV (Cytomegalovirus). Należy jednak zauważyć, że peptyd ten wykazuje różny stopień aktyw-ności wobec wymienionych wirusów, co może wynikać z różnej budowy otoczek lipidowych wirusów [13, 29]. Przeciwwirusowe działanie HNP-1 stwierdzono również wobec wirusa HIV. W dawkach nietoksycznych i fizjolo-gicznych oraz przy braku surowicy (np. na powierzchni błon śluzowych), peptyd ten w sposób bezpośredni działa na cząstki wirusa HIV, znosząc ich zakaźność [10, 34]. HNP1-3 mogą również funkcjonować jako lektyny, które wiążąc krzyżowo glikoproteinę gp120 HIV i CD4 komórki docelowej, zapobiegają zakażeniu na etapie adhezji i wnikania wirusa [58, 29]. Podobnie wiązanie krzyżowe hemaglutyniny wirusa grypy przez defensynę, HBD3 hamuje fuzję otoczki wirusa z błoną endosomów komórki gospodarza [29]. Natomiast β-defensyny 2 i 3

stymulują internalizację koreceptora CXCR4, niezbęd-nego do zakażenia przez wirus HIV komórek immuno-kompetentnych [15].

ad. 3. Niektóre peptydy kationowe, np. LL-37 i lak-toferycyna mogą wnikać poprzez błonę komórkową lub błonę jądrową, odpowiednio do cytoplazmy lub jądra komórkowego [32]. Dzięki temu mogą regulować aktyw- ność szlaków sygnałowych oraz wpływać na ekspresję genów zarówno komórkowych, jak i wirusowych. Stwier- dzono, że AMP’s modulują aktywność, proliferację i róż-nicowanie komórek immunologicznie kompetentnych, zaangażowanych w zwalczanie zakażeń wirusowych [6, 28, 56]. Mechanizm działania HNP-1 przeciwko HIV, w obecności surowicy lub po zakażeniu komórek wraż-liwych CD4+, polega na hamowaniu aktywności komór-kowej kinazy PKC, niezbędnej do replikacji wirusa. HNP-1 hamuje replikację wirusa na etapie odwrotnej transkrypcji i integracji genomu do materiału gene-tycznego gospodarza [10]. Owadzie peptydy kationowe, melityna i cekropina A, wykazują działanie przeciwko HIV, poprzez hamowanie ekspresji genów wirusa (genu gag) i hamowanie aktywności sekwencji LTR wirusa. Melityna może również regulować transdukcję sygna-łów, poprzez aktywację fosfolipazy A2 lub obniżenie aktywności kalmoduliny i PKC. Prowadzi do zmiany aktywności czynników zaangażowanych w transkrypcję HIV, np. NF-κB, AP-1 lub NFAT lub do indukcji inhibi-torów transkrypcji, podobnych do tych indukowanych interferonem [56]. Cekropina A zapobiega również nam- nażaniu wirusa Junin i innych gatunków arenawirusów przez zahamowanie syntezy białek wirusa. Cekropina A powoduje zmiany w ekspresji i rozmieszczeniu białka G1 wirusa Junin. Zaburzenia w transporcie i insercji tego białka do błony komórkowej gospodarza, zapobiega powstawaniu cząstek wirusowych, ponieważ w przy-padku arenawirusów są one uwalniane z zakażonej komórki poprzez pączkowanie błony komórkowej [35]. Również przeciwwirusowe działanie mirystylowanego peptydu h. virescens opiera się na zaburzeniu morfo-genezy i/lub pączkowania wirusów. Niektóre wirusy wykorzystują mirystylowane białka w celu przyłączenia się do błony komórkowej od strony cytoplazmatycznej, co inicjuje składanie cząstek wirusa i/lub pączkowanie z błony komórkowej. Owadzi peptyd kationowy na zasa-dzie kompetycji z białkami wirusowymi, hamuje for-mowanie zakaźnych cząstek wirusa. in vitro peptyd ten wykazuje działanie przeciwko HIV i HSV-1. Działanie przeciwko HIV może być uwarunkowane blokowaniem wiązania białka Gag do błony komórkowej, ponieważ posiada ono resztę kwasu mirystylowego na N-końcu, niezbędną do wiązania białka do cytoplazmatycznej warstwy błony komórkowej [41]. Stwierdzono, że ludzka laktoferyna może być pochłaniana przez niektóre typy komórek, np. monocyty oraz wykazuje zdolność wiąza-nia do DNA. Dodatkowo na N-końcu posiada 4 argininy,


które mogą stanowić sygnał transportu do jądra komór-kowego. Istnieje więc możliwość, że laktoferyna/lakto-ferycyna funkcjonują jako peptydy przeciwwirusowe o aktywności czynników transkrypcyjnych induku- ją cych odpowiedź immunologiczną gospodarza [1]. Peptyd LL-37 może być zaangażowany w różnicowanie komórek dendrytycznych. Pod jego wpływem mielo-idalne komórki dendrytyczne (Dendritic Cells – DC’s) wykazują zwiększoną zdolność do endocytozy i fago-cytozy, co prawdopodobnie jest wynikiem wzrostu eks-presji α2-integryn i receptorów CR3 i CR4. Takie zmiany w prekursorach DC’s, zwiększają ich zdolność do pre-zentacji antygenów, a tym samym do indukcji nabytych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej [5, 36].

ad. 4. Immunomodulująca funkcja peptydów katio-nowych polega na regulacji syntezy czynników odpo-wiedzi immunologicznej, np. cytokin i chemokin oraz ich receptorów, modulowaniu aktywności komórek immunokompetentnych oraz działaniu chemotaktycznym. Jest ona bardzo ważna w zwalczaniu zakażeń, ponieważ niektóre AMP’s w fizjologicznych warunkach (stężenie, obecność jonów czy surowicy) nie wykazują bezpo- średniej aktywności przeciwdrobnoustrojowej [29]. Do takich peptydów należy LL-37 [5]. Badania dowiodły, że peptyd ten zwiększa ekspresję IL-8, MCP-1 i MCP-3 oraz receptorów CXCR-4, CCR2 i IL-8R, jak również sekrecję IL-8. Immunomodulująca funkcja LL-37 zwią-zana jest z aktywacją kinaz MAP, ERK1/2 i p38 w mono-cytach krwi obwodowej i komórkach linii komórkowej nabłonka oskrzeli [6, 46]. Natomiast HNP-1 i HNP-2 w makrofagach zwiększają ekspresję CC-chemokin (MIP-1α i MIP-1β), które na zasadzie kompetycji o receptor (CCR5), uniemożliwiają wnikanie wirusa HIV do komórki docelowej [19]. Właściwości immunomo-dulujące posiadają także alloferony 1 i 2. in vitro syn-tetyczny odpowiednik tych peptydów stymuluje natu-ralną cytotoksyczność komórek NK. Natomiast in vivo po podaniu myszom obserwowano indukcję syntezy INF [11]. Jedną z funkcji kationowych peptydów, która również odgrywa istotną rolę w zwalczaniu zakażeń wirusowych jest działanie chemotaktyczne wobec leu-kocytów. Ludzka α-defensyna 1 i 2 wykazuje zdolność przyciągania limfocytów T i monocytów, natomiast β-defensyny 1 i 3 funkcjonują jako chemoatraktanty wobec niedojrzałych komórek dendrytycznych oraz limfocytów T pamięci poprzez oddziaływanie z CCR6 [53, 59]. Również peptyd LL-37 wykazuje zdolność do przyciągania komórek immunologicznie kompetent-nych (monocyty, limfocyty T, neutrofile oraz komórki tuczne) do miejsca zakażania [18, 38].

5. podsumowanie

Naturalnie występujące przeciwdrobnoustrojowe katio nowe peptydy, charakteryzujące się różnorodnymi właściwościami biologicznymi, stanowią atrakcyjne

źródło związków o znaczeniu terapeutycznym. Pozyski-wane na ich bazie syntetyczne pochodne mogą okazać się skuteczne w zwalczaniu zakażeń wirusowych oraz wywołanych patogennymi mikroorganizmami i paso-żytami. Obiecujące może być również stosowanie kon-wencjonalnych metod leczenia (np. antybiotykoterapia) w połączeniu z AMP’s. Tak skonstruowane terapie mogą okazać się skuteczne miedzy innymi ze względu na róż-norodne mechanizmy działania peptydów kationowych i obecnie stosowanych terapeutyków.

piśmiennictwo

1. Andersen J.H., Jenssen H., Sandvik K., Gutteberg T.J.: Anti--HSV activity of lactofferin and lactoffericin is dependent on the presence of heparan sulphate at the cell surface. J. Med. Virol. 74, 262–271 (2004)

2. Andersen J.H., Osbakk S.A., Vorland L.H., Traavik T., Gutten-berg T.J.: Lactoferrin and cyclic lactoferricin inhibit the entry of human cytomegalovirus into human fibroblasts. Antiviral res. 51, 141–149 (2001)

3. Baker E.N., Baker H.M.: Molecular structure, binding pro-perties and dynamics of lactoferrin. cell. Mol. Life sci. 62, 2531–2539 (2005)

4. Boman H.G., Wade D., Boman I.A., Wahlin B., Merrifield R.B.: Antibacterial and antimalarial properties of peptides that are cecropin-melittin hybrids. FEBs Lett. 259, 103–106 (1989)

5. Bowdish D.M.E., Davidson D.J., Lau Y.E., Lee K., Scott M.G., Hancock R.E.W.: Impact of LL-37 on anti-infective immunity. J. Leukoc. Biol. 77, 451–459 (2005)

6. Bowdish D.M.E., Davidson D.J., Speert D.P., Hancock R.E.W.: The human cationic peptide LL-37 induces activation of the Extracellular Signal-Regulated Kinase and p38 Kinase pathways in primary human monocytes. J. immunol. 172, 3758–3765 (2004)

7. Brown S.E., Howard A., Kasprzak A.B., Gordon K.H., East P.D.: The discovery and analysis of a diverged family of novel anti-fungal moricin-like peptides in the wax moth Galleria mello-nella. insect Biochem. Mol. Biol. 38, 201–212 (2008)

8. Bucki R., Leszczyńska K., Namiot A., Sokołowski W.: Cathelici-din LL-37: A Multitask antimicrobial peptide. Arch. immunol. Ther. Exp. 58, 15–25 (2010)

9. Bulet P., Stöcklin R.: Insect antimicrobial peptides: structures, properties and gene regulation. Protein Pept. Lett. 12, 3–11 (2005)

10. Chang T.L., Vargas J. Jr., DelPortillo A., Klotman M.E.: Dual role of α-defensin-1 in anti-HIV-1 innate immunity. J. clin. immunol. 115, 765–773 (2005)

11. Chernys S., Kim., Bekker G., Pleskach V.A., Filatova N.A., Anikin V.B., Platonov V.G., Bulet P.: Antiviral and antitumor pep-tides from insects. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 99, 12628–12632 (2002)

12. Cytryńska M., Mak P., Zdybicka-Barabas A., Suder P., Jaku- bowicz T.: Purification and characterization of eight peptides from Galleria mellonella immune hemolymph. Peptides, 28, 533–546 (2007)

13. Daher K.A., Selsted M.E., Lehrer R.I.: Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins. J. Virol. 60, 1068–1074 (1986)

14. De Smet K., Contreras R.: Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins, histatins. Biotechnol. Lett. 27, 1337–1347 (2005)


15. Feng Z., Dubyak G.R., Lederman M.M., Weinberg A.: Cutting edge: human β-defensin 3 – a novel antagonist of the HIV-1 coreceptor CXCR4. J. immunol. 177, 782–786 (2006)

16. Ferrandon D., Jung A.C., Criqui M., Scheffler L., Brunnert S., Tang H., Prince A.: A drospmycin-GFP reporter trans- gene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBo J. 17, 1217–1227 (1998)

17. Guani-Guerra E., Santos-Mendoza T., Lugo-Reyes S.O., Terán L.M.: Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease. clin. immunol. 135, 1–11 (2010)

18. Gudmundsson G.H., Agerberth B.: Neutrophil antibacterial peptides, multifunctional effector molecules in the mammalian immune system. J. immunol. Methods, 232, 45–54 (1999)

19. Guo Ch.-J., Tan N., Song L., Douglas S.D., Ho W.-Z.: Alpha--defensins inhibit HIV infection of macrophages through upre-gulation of CC-chemokines. AiDs, 18, 1217–1228 (2004)

20. Hancock R.E.W., Brown K.L., Mookherjee N.: Host defence peptides from invertebrates – emerging antimicrobial strate-gies. immunobiology, 211, 315–322 (2006)

21. Hancock R.E.W., Scott M.G.: The role of antimicrobial peptides in animal defenses. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 97, 8856–8861 (2000)

22. Hetru C, Hoffman D., Bulet P.: Antimicrobial peptides from insects (w) Molecular mechanisms of immune responses in insects, red. Brey P.T., Hultmark D., Chapman and Hall, Lon-don, 1998, s.40

23. Hoskin D.W., Ramamoorthy A.: Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochem. Biophys. Acta – Biomem-branes, 1778, 357–375 (2008)

24. http://aps.unmc.edu/AP/about.php (22 grudnia 2010)25. http://nobelprizes.com/nobel/nobel.html (22 grudnia 2010)26. Irving P., Troxler L., Hetru C.: Is innate enough? The innate

immune response in Drosophila. comptes rendus Biologies, 327, 557–570 (2004)

27. Jenssen H., Hamil P., Hancock R.E.W.: Peptide antimicrobial agents. clin. Microbiol. rev. 19, 491–511 (2006)

28. Kanyshkova T.G., Semenov D.V., Buneva V.N., Nevinsky G.A.: Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with diffe-rent affinities. FEBs Lett. 451, 235–237 (1999)

29. Klotman M.E., Chang T.L.: Defensins in innate antiviral immu-nity. Nat. immunol. 6, 447–456 (2006)

30. Kragol G., Lovas S., Varadi G., Condi B.A., Hoffmann R., Otvos L.Jr.: The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assited protein folding. Biochemistry, 40, 3016–3026 (2001)

31. Lai Y., Gallo R.L.: AMPed upon immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends immu-nol. 30, 131–141 (2009)

32. Lau Y., Rozek A., Scott M.G., Goosney D.L., Davidson D.J., Hancock R.E.W.: Interaction and cellular localization of the human host defense peptide LL-37 with lung epithelial cells. infect. immun. 73, 583–591 (2005)

33. Lüders T., Birkemo G.A., Fimland G., Nissen-Meyer J.N., Nes I.F.: Strong synergy between a eukaryotic antimicrobial peptide and bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl. Envi-ronment. Microbiol. 69, 1797–1799 (2003)

34. Mackiewicz C.A., Yuan J., Tran P., Diaz L., Mack E., Selsted M.E., Levy J.A.: α-defensins can have anti-HIV activity but are not CD8 cell anti-HIV factors. AiDs, 17, F23–F32 (2003)

35. Mantanic V.A.A., Castilla V.: Antiviral activity of antimicrobial cationic peptides against Junin virus and herpes simplex virus. int. J. Antimicrob. Agents, 23, 382–389 (2004)

36. Mistry N., Drobni P., Näslund J., Sunkari V.G., Jenssen H., Evander M.: The anti-papillomavirus activity of human and bovine lactoffericin. Antiviral res. 75, 258–265 (2007)

37. Nell M.J., Tjabringa G.S., Wafelman A.R., Verrijk R., Hiem-stra P.S., Driffhout J.W., Grote J.J.: Development of novel LL-37 derived antimicrobial peptides with LPS and LTA neutralizing and antimicrobial activities for therapeutic application. Pepti-des, 27, 649–660 (2006)

38. Niyonsaba F., Iwabuchi K., Someya A., Hirata M., Matsuda H., Ogawa H., Nagaoka I.: A cathelicidin family of human antimi-crobial peptide LL-37 induces Mast cell chemotaxis. immuno-logy, 106, 20–26 (2002)

39. Otvos L.Jr.: The short proline-rich antimicrobial peptide family. cell. Mol. Life sci. 59, 1138–1150 (2002)

40. Ourth D.D., Renis H.E.: Antiviral melanization reaction of heliothis virescens hemolymph against DNA i RNA viruses in vitro. comp. Biochem. Phys. B – comp. Biochem. 105, 719–723 (1993)

41. Ourth D.D.: Antiviral activity against human immunodefi-ciency virus-1 in vitro by myristoylated-peptide from helio-this virescens. Biochem. Biophys. research. comm. 320, 190–196 (2004)

42. Patrzykat A., Friedrich C.L., Zhang L., Mendoza V., Hancock R.E.W.: Sublethal concentrations of pleurocidin-derived anti-microbial peptides inhibit macromolecular synthesis in Esche-richia coli. Antimicrob. Agents chemother. 46, 605–614 (2002)

43. Popham H.J.R., Shelby K.S., Brandt S.L., Coudron T.A.: Potent virucidal activity in larval heliothis virescens plasma against helicoverpa zea single capsid nucleopolyhedrovirus. J. Gen. Virol. 85, 255–261 (2004)

44. Reddy K.V.R., Yedery R.D., Aranha C.: Animicrobial peptides: premises and promises. inter. J. Antimicrob. Agents, 24, 536–547 (2004)

45. Schmidtchen A., Frick I.-M., Anderson E., Tapper H., Björck L.: Proteinases of common pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37. Mol. Microbiol. 46, 157–168 (2002)

46. Scott M.G., Davidson D.J., Gold M.R., Bowdish D., Hancock R.E.W.: The human antimicrobial peptide LL-37 is a multifunc-tional modulator of innate immune responses. J. immunol. 169, 3883–3891 (2002)

47. Sitaram N., Nagaraj R.: Interaction of antimicrobial peptides with biological and model membranes: structural and charge requirements for activity. Biochem. Biophys. Acta – Biomembra-nes, 1462, 29–54 (1999)

48. Słocińska M., Marciniak P., Rosinski G.: Insects antiviral and anticancer peptides: new leads for the future? Protein Pept. Lett. 15, 578–585 (2008)

49. Słońska A., Klimuszko D.: Bakteriocyny probiotycznych pałe-czek z rodzaju Lactobacillus. Post. Mikrobiol. 40, 87–96 (2010)

50. Smolarczyk R., Cichoń T., Szala St.: Peptydy – nowa klasa leków przeciwnowotworowych. Post. hig. Med. Dośw. 63, 360–368 (2009)

51. Spillman D.: Heparan sulphate: anchor for viral intruders? Bio-chimie, 83, 811–817 (2001)

52. Steiner H., Hulmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G.: Sequence and specificity of two antimicrobial proteins in insect immunity. Nature, 292, 246–248 (1981)

53. Territo M.C., Ganz T., Selsted M.E., Lehrer R.: Monocyte- -chemotactic activity of defensins from human neutrophils. J. clin. invest. 84, 2017–2020 (1989)

54. Uvell H., Engström Y.: A multilayered defense against infection: combinatorial control of insect immune genes. Trends Genet. 23, 342–349 (2007)


55. Valenti P., Antonini G.: Lactoferrin: an important host defence against microbial and viral attack. cell. Mol. Life sci. 62, 2576–2587 (2005)

56. Wachinger M., Brack-Werner R. i wsp.: Antimcrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human mmuno-deficiency virus 1 by suppressing viral gene expression. J. Gen. Virol. 79, 731–740 (1998) (praca jest dziełem 10 autorów)

57. Wang G., Watson K.M., Peterkofsky A., Buckheit R.W. Jr.: Identification of novel Human Immunodeficiency Virus type 1-inhibitory peptides based on the antimicrobial peptide data-base. Antimicrob. Agents chemother. 54, 1343–1346 (2010)

58. Wang W., Owen S.M., Rudolph D.L., Cole A.M., Hong T., Waring A.J., Lal R.B., Lehrer R.I.: Activity of α-defensins and θ-defensins against primary isolates of HIV-1. J. immunol. 173, 515–520 (2004)

59. Yang D., Oppenheim J.J. i wsp.: β-defensins: linking innate and adaptive immunity trough dendritic and T Cell CCR6. sci. 286, 525–528 (1999) (praca jest dziełem 11 autorów)

60. Yuant N.Y., Bayer A.S., Xiong Y.Q., Yeaman M.R.: Advances in antimicrobial peptide immunology. Biopolymers, 84, 435–458 (2006)


1. Wprowadzenie

Interleukiny (IL) tworzą jedną z grup cytokin, słu-żącą m.in. do komunikowania się komórek układu odpornościowego, które stanowią elementy odporności wrodzonej i nabytej [7]. Są to substancje o charakterze białkowym, produkowane głównie przez leukocyty, choć również przez inne elementy makroorganizmu np.: IL-33 produkowana jest przez fibroblasty, komórki endote- lialne, komórki tłuszczowe-adipocyty oraz przez komórki okrężnicy i szpiku kostnego [7, 20]. Do roku 2010 opi-sano 37 interleukin [7, 15, 16], które ze względu na ich różne cechy biologiczne, w tym zróżnicowanie mole-kularne i ich strukturę, zgrupowano w trzy rodziny [4]. Pierwsza – bez nazwy – obejmuje dwie podrodziny, to jest podrodzinę interleukiny 2, do której zalicza się IL-3-7, 9, 11-15, 21, 23, 30 oraz takie substancje jak CSF (colony-stimulating factor), LIF (leukemia inhibitory factor), prolaktynę oraz podrodzinę interferonów (IFN), która reprezentowana jest przez INF-α i INF-β. Drugą rodzinę tworzy IL-1 obejmująca: IL-1α, IL-1β oraz IL-18 wraz z ich pochodnymi, choć B u r g e r i wsp. [3], w oparciu o wysoce konserwatywną strukturę genów kodujących i homologię sekwencji aminokwasowych, zaliczyli do tej rodziny, oprócz wymienionych wcześ-niej IL-1α i IL-1β, także IL-1Ra (receptor antagonist), IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10 oraz IL-33. Natomiast do trzeciej rodziny zalicza się interleu-kinę 17A, B, C, D, F oraz IL-8, 25 (dawniej IL-17E) i 27, a także IL-31, 32 i 33. Znane są także kryteria podziału IL, oparte o strukturalne podobieństwo ich genów kodu-

jących [5], co spowodowało wyodrębnieniem wśród nich, dodatkowej nadrodziny IL-10, do której zaliczono IL-10 oraz IL-19, 20, 22, 24, 26, 28 i 29. Obecnie przyj-muje się [3,4,7], że rodzinę interleukiny 1 tworzą IL wcześniej wymieniane tj. IL-1α, IL-1β, IL-1Ra, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10, IL-18, IL-33, ale także IL-36 i IL-37 oraz SIGIRR (SIGIRR – single immunoglobulin IL-1 receptor-related molecule) – czło-nek rodziny IL-1R [12, 15, 16, 21].

2. charakterystyka interleukin zaliczanych do rodziny il-1

2.1. il-1α i il-1β oraz il-1ra

Ze względu na podobną aktywność biologiczną i przechodzenie sygnału przez ten sam receptor dla Il-1, u IL-1α (IL-1F1) i IL-1β (IL-1F2), opisywane są one często tylko jako jedna IL-1 [1, 3, 5, 19, 22]. Trzeba jednak stwierdzić, że różnią się one między sobą choćby miejs cem syntezy. IL-1α syntetyzowana jest przez monocyty, makrofagi, neutrofile, limfocyty, komórki glejowe, keratynocyty, komórki śródbłonka [3, 5, 21], natomiast IL-1β głównie przez monocyty – makrofagi [1, 19, 20, 21]. Nadto ta ostatnia (IL-1β), podobnie jak IL-18 i IL-33, wytwarzana jest w postaci prointerleukiny, która wskutek przekształceń, przy pomocy kaspazy 1, zmienia się w formę dojrzałą [1, 20, 21]. Dalsza róż-nica między nimi polega na tym, że IL-1α jest związana z błoną komórek produkujących ją i stąd oddziaływuje

* Autor korespondencyjny: Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet Szczeciński; ul. Felczaka 3c, 71-412 Szczecin; tel. (91) 444-16-05; e-mail: [email protected]

cytokiny z rodziny intErlEukiny 1

beata tokarz-deptuła*1, tymoteusz Miller1, Wiesław deptuła1

1 Katedra Mikrobiologii i Immunologii, Wydział Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet Szczeciński,71-412 Szczecin, ul. Felczaka 3c

Wpłynęło w kwietniu 2011 r.

1. Wprowadzenie. 2. Charakterystyka interleukin zaliczanych do rodziny IL-1. 2.1. IL-1α i IL-1β oraz IL-1Ra. 2.2. IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10. 2.3. IL-18. 2.4. IL-33. 2.5. SIGIRR. 2.6. IL-36 i IL-37. 3. Podsumowanie

The interleukin-1 family of cytokines

Abstract: Interleukins, proteins, forming of groups within cytokines, i.a. serve as communication links between the immune system cells, and form an important element of both innate and adaptive immunity. 15 cytokines belonging to the interleukin-1 family have been described and characterized which are related to inteleukins synthesis site and cooperation with other cytokines or factors playing significant role in immune system reaction.

1. Introduction. 2. Characteristics and significance of interleukin-1 family of cytokines. 2.1. IL-1α and IL-1β and IL-1Ra. 2.2. IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10. 2.3. IL-18. 2.4. IL-33. 2.5. SIGIRR. 2.6. IL-36 i IL-37. 3. Summary

słowa kluczowe: cytokiny, interleukiny, rodzina IL-1key words: cytokines, interleukins, IL-1 family

218 BEATA TOKARZ-DEPTUŁA, TYMOTEUSZ MILLER, WIESŁAW DEPTUŁA

ona na komórki będące w najbliższym sąsiedztwie, czyli działa lokalnie, natomiast IL-1β jest wydzielana do krwi i ma działanie ogólnoustrojowe [21]. Cytokiny te różną się także wkładem w tworzenie odpowiedzi immuno-logicznej, na skutek zróżnicowanej regulacji genów w czasie ich rozwoju oraz jako efekt reakcji na oddzia-ływanie środowiskowe [21]. Badania przeprowadzone na myszach knockout, wykazały istotny wpływ IL-1α na aktywność limfocytów T w alergii kontaktowej i udział jej w indukcji syntezy surowiczej IgE po immunizacji np.: albuminami [21]. Natomiast rola IL-1β w porów-naniu do IL-1α, w większym stopniu odpowiada za indukcję gorączki [21]. Wykazano, że w warunkach zdrowia makro organizmu, cytokiny te występują na niskim poziomie aktywności, zaś w warunkach choroby, ich aktywność wzrasta, co objawia się m.in. stanami gorączkowymi, wysypką, a nawet zapaleniem stawów [3, 5, 21]. Obie interleukiny pobudzają bazofile do wydzie-lania histaminy, co wzmaga efekt działania IL-18 i IL33, a także IgE [21]. Efektem wspólnego ich działania oraz IL-18, jest aktywacja komórek dendrytycznych (DC) manifestująca się zwiększoną ekspresją receptorów TNF, głównie TNFRSF4 (TNF receptor super family) (daw-niej OX40, CD134), TNFRDF5 (dawniej CD40) oraz czynnika przenoszącego sygnał aktywujący limfocyty (SLAM – signalling lymphocytic activation molecule) i IL-12 [21]. IL-1α i IL-1β wspomagają także odpowiedź komórek T oraz są jednymi z podstawowych substancji warunkujących powstawanie komórek Th17 [21, 23]. Syntetyzowane przez komórki MN oddziaływają bez-pośrednio na różnicowanie się limfocytów T naiwnych oraz limfocytów T pamięci [21]. Zwiększają one także ekspresję IL-2R, przez co aktywują ścieżki sygnalne, mające działanie antyapoptotycze, np. poprzez drogę NF-κB lub PI-3 kinazę, przez co dochodzi do zwiększe-nia proliferacji limfocytów efektorowych (Teff) i regu-latorowych (Treg) jak też wydzielania przez te ostatnie IL-17 [21]. Substancje te, pełnią również kluczową rolę w pobudzaniu limfocytów T pamięci do syntezy nie tylko IL-17 ale także IL-22 [21]. Wspomagają one, jak wspomniano, nie tylko rozwój limfocytów Th17, przez indukcję czynnika regulującego gen dla interferonu, ale także komórek Th2 [21]. Zaobserwowano również, że limfocyty Tγδ pod wpływem stymulacji IL-1α i β oraz IL-23, zwiększają syntezę IL-17 [21,23]. Także ich działanie wraz z IL-18 i 33 oraz IL-2 i IL-11, wzmac-nia różnicowanie limfocytów T poprzez STAT (signac transducers and activators of transcription) – których wymienia się sześć, od STAT1 do STAT6 [10], a które aktywowane przez wiele interleukin i czynniki wzrostu, pełnią ważne funkcje np. w powstawaniu stanu zapal-nego wątroby. W przypadku cytokin z rodziny IL-1, liczą się głównie STAT 3, 4 i 5, jako że poprzez STAT5 wzmacnia się różnicowanie komórek T w Th2, STAT3 – w Th17, zaś STAT4 w Th1 [10, 21]. Dowiedziono [21],

że kombinacja tych STAT i właściwych sygnałów dla IL-1R (receptor dla IL-1), prowadzi dodatkowo do zwiększenia ekspresji innych swoistych czynników transkrypcyjnych dla subpopulacji limfocytów T min. T-bet dla Th1, GATA3 dla Th2 oraz RORγt dla Th17 [21]. Dowiedziono również, że IL-1α i IL-1β w obecności immunoglobulin powierzchniowych i ligacji receptora CD40, silnie aktywują proliferację limfocytów B [19, 21]. Indukują one także ekspresję CD40L i OX40 (znany również jako TNFRSF4) na limfocytach [21], z tym że poprzez CD40L stymulują limfocyty B do proliferacji i zmiany syntetyzowanych klas Ig, zaś poprzez regula-cję OX40L pobudzają produkcję cytokin przez komórki Th2 [21]. W przypadku IL-1Ra (receptor antagonist – antagonista receptora dla IL-1), wykazano że wiążąc się z receptorem IL-1R1 [7, 14)] uniemożliwia łączenie się IL-1α i IL-1β oraz IL-1RAP (receptor dla tzw. białek pomocniczych) [1, 2, 21, 22]. Opisano także że IL-1α i β działa blokująco poprzez dwa receptory tj. znacznik IL-1R1 i IL-1R2 [1, 6, 21, 22]. Trzeba dodać, że bodź-cami indukującymi ekspresję IL-1Ra jest LPS, agre- gaty IgG, a także anty-zapalne cytokiny, takie jak IL-4 i 10 [8, 21]. Dowiedziono również, że antagonista dla IL-1Ra, może być pochodzenia zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowe [8, 21]. Wykazano, że w budowie IL-1R2 [1, 2, 6, 8, 21] występuje pozakomórkowy region, który jest podobny w swojej strukturze do IL-1R1, choć ma on krótszą domenę cytoplazmatyczną, która nie może pełnić funkcji sygnalizacyjnych, przez co receptor IL-1R2, działa jak „receptor-pułapka”. Biorąc pod uwagę możliwość słabego wiązania się IL-1R2 z IL-1Ra, należy stwierdzić, że antagoniści IL-1 raczej wzmacniają, niż anulują wzajemne działania [1, 6, 21]. IL-1R1 podobnie jak IL-1R2 ulegają ekspresji na komórkach produkują-cych IL-1α i IL-1β i ich główną rolą jest zapobieganie samoaktywacji tych komórek, przez IL-1 [21]. Zareje-strowano, że receptor IL-1R2 „zrzucony” z powierzchni komórki w postaci białka rozpuszczalnego, wykazuje także zdolności inhibicyjne, bo w wyniku oddziaływania z postacią rozpuszczalną IL-1RAP, zwiększa aktywność hamującą IL-1R2 i IL-1Ra [21].

2.2. il-1f5, il-1f6, il-1f8, il-1f9, il-1f10

Według informacji zawartej w Nature immunology [9] nazewnictwo IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, jest następujące IL-1F5 to IL-36Ra, IL-1F6 to IL-36α, IL-1F8 to IL-36β, a IL-1F9 to IL-36γ. Ich synteza zachodzi m.in. w keratynocytach, a także w monocytach [21], a w przy-padku IL-1F5, która wykazuje trójwymiarową struk-turę [21], produkcje jej stwierdzono także w komórkach łożyska, mózgu, grasicy i nerek [19]. Interleukiny 1F5, 1F6, 1F8, 1F9, wchodząc w interakcje z receptorem IL-1RL2 występującym na makrofagach i komórkach dendrytycznych, są zdolne do ich pobudzenia [21].

CYTOKINY Z RODZINY INTERLEUKINY 1 219

Nadto IL-1F6, IL-1F8 i IL-1F9 aktywują czynnik jądrowy NF-κB i cząsteczki MAPKs (kinazy aktywowane mio-genami), wpływając na ekspresję genów, podziały i róż-nicowanie komórek UO oraz ich apoptozę [12, 21, 23]. Działanie tych cytokin, regulowane jest przez antago-nistę receptora dla IL-1F5, analogicznego do IL-1Ra [21, 22]. W przypadku IL-1F9, dodatkowo wykazano, że zwiększa się jej synteza w obliczu stymulacji keraty-nocytów przez IL-1β, TNFα i IFNγ [6, 12], choć obraz taki zarejestrowano również w przypadkach łuszczycy oraz podczas infekcji HSV (herpes simplex virus), co dowodzi roli IL-1F9 również w procesach zapalnych skóry [12]. Odnośnie IL-1F10 wiadomo jedynie, że jest wydzielana tylko w warstwie podstawnej naskórka i w centrach rozrodczych migdałków, choć także pod-czas proliferacji limfocytów B [21]. Genomowa struk-tura i sekwencja aminokwasów IL-1F10, wskazują na bliższe pokrewieństwo do IL-1Ra i IL-1F5 niż do reszty rodziny IL-1, sugerując, że może pełnić przeciw-stawną rolę [13, 21].

2.3. il-18

Cytokina ta jest syntetyzowana przez wiele ko mórek UO, m.in. makrofagi, komórki Browicz-Kupffera oraz DC, keratynocyty i komórki nabłonkowe [3, 5, 6, 8, 21]. Jej aktywność jest regulowana przez białko roz-puszczalne IL-18BP, które wiąże IL-18 jako receptor „pułapkę”, uniemożliwiają jej wchodzenie w interakcje z receptorami na komórkach układu odpornościowego [21]. W warunkach zdrowia stężenie białka IL-18BP jest zwykle 20-krotnie wyższe niż stężenie IL-18, jed-nak podczas zapalenia, stosunek ten ulega zmianie, co przyczynia się do zwiększenia tych ostatnich stanów [21]. IL-18 głównie wzmaga odpowiedź immunolo-giczną warunkowaną komórkami Th2, dzięki temu, że indukuje i zwiększa syntezę IL-4 i IL-13 [21]. Wykazano, że IL-18 również pobudza komórki NK do produkcji INFγ, a po działaniu IL-12 zwiększa jego uwalnianie [3, 5, 6, 17, 21]. Zwiększa ona także cytotoksyczność komórek NK przez indukowanie zwiększonej ekspre-sji perforyn i ligandu FAS (FASL – zwanego również jako CD95L) [21]. Wraz z IL-33 aktywuje komórki NKT, które wykazują zwiększoną produkcję IL-4, 5, 13, GM-CSF oraz czynnika TNF [21, 22], a współdziałając z IL-12, indukują niezależną od antygenu ekspresję IFNγ [18, 21, 22]. Współdziałanie z IL-33, wzmaga siłę bójczą nie tylko komórek NKT, ale także i ko mórek NK, w infekcjach bakteryjnych i wirusowych [cyt. 21]. Dowiedziono, że IL-18 pobudza również limfocyty Th1 do proliferacji i wpływa na syntezę INFγ, jako, że recep-tor dla IL-18 (IL-18R), jest unikalnie wytwarzany przez Th1 w odpowiedzi na IL-12 [21,23]. Cytokina ta poprzez oddziaływanie stymulujące na limfocyty T naiwne i limfocyty Th1, wpływa na syntezę cytokin typu Th2 oraz

wykazuje supresorową aktywność wobec limfocytów Treg w modelu ksenoprzeszczepu [21]. Sugeruje to, że IL-18 dodatkowo oprócz aktywacji limfocytów T, oddziały-wuje na odpowiedź immunologiczną związaną z dzia-łaniem hamującym limfocytów Treg [21]. Zauważono także, że IL-18 w obecności IL-12 oddziaływując na Th, zwiększa swoją aktywność, co doprowadza do zwiększe-nia produkcji IFNγ i hamuje syntezę IgE [21, 26].

2.4. il-33

IL-33 (IL-1F11), w przeciwieństwie do innych człon-ków tej rodziny, nie jest syntetyzowany przez leuko-cyty, a obficie jest wytwarzana w wielu tkankach, m.in. wysokim śródbłonku naczyń włosowatych, mięśniach gładkich dróg oddechowych, centralnym układzie ner-wowym – w szczególności w astrocytach, kolonocy-tach okrężnicy, szpiku kostnym, natomiast w stanach chorobowych również w migdałkach i błonie maziowej stawów [7, 14, 20, 21, 24]. Jej struktura jest podobna do IL-18 [14]. Receptorem dla IL-33 jest glikoproteina ST2 (IL-1RL1 – podobna do IL-1R) [14, 20, 21, 24] – marker charakterystyczny dla limfocytów Th2 [14, 20, 21, 24] i stąd stymuluje ona limfocyty Th2 do produkcji IL-5 i IL-13 [13, 14]. Ze względu na ekspresję receptora ST2, IL-33 działa bezpośrednio na eozynofile, zwiększając ich przeżywalności i „przyczepność” oraz produkcję nad-tlenków i chemokin CXCL8 [3,5,21,24]. Współdziała-jąc z IL-3 i 5 oraz GM-CSF, wpływa mobilizująco na odpowiedź immunologiczną związaną z eozynofilami [19]. Stymuluje ona także komórki tuczne do produkcji np. IL-5 i 6 [19] i przyspiesza ich dojrzewanie oraz ich czas życia, a wraz z IL-25 i IL-23, wpływa na procesy immunosupresyjne komórek UO [23]. Indukuje ona degranulację komórek tucznych i w ten sposób może wywoływać anafilaksję, bez obecności specyficznego alergenu [21]. Także pomimo, że rola IL-33 związana jest z odpowiedzią typu Th2, wpływa ona na indukcję produkcji IFNγ przez komórki NK [21].

2.5. il-36 i il-37

IL-36 jak i IL-37 to cytokiny, które były wymie-niane wcześniej jako IL-1F7 [12, 15, 16, 22]. Są one syntetyzowane w większości tkanek, ale najwięk-szą ich produkcję obserwuje się w komórkach jąder, grasicy i macicy, jak również w makrofagach oraz komórkach nabłonkowych, z tym że w przypadku IL-37 dodatkowym miejs cem jej syntezy są makrofagi oraz komórki nabłonkowe w wyniku stymulacji min. Il-18, IL-1β, TNF i IFNγ [14, 16, 21]. Obecność IL-37 została stwierdzona również w komórkach plazma-tycznych migdałków oraz komórkach nowotworowych piersi [16]. Synteza IL-36 zachodzi w postaci niedoj-rzałej prointerleukiny, która pod wpływem kaspazy 1

220 BEATA TOKARZ-DEPTUŁA, TYMOTEUSZ MILLER, WIESŁAW DEPTUŁA

i 4, zostaje odszczepiona i powstaje w pełni aktywna IL-36 [11]. Natomiast w przypadku IL-37 stwierdzono, że występuje w postaci izoform, tj. IL-37a-e (IL-F7a--e) [16]. Aktywność biologiczna IL-36 i IL-37 , zwią-zana jest z supresją wrodzonej odpor noś ci immuno-logicznej poprzez współdziałanie z TGF-β poprzez sygnalne białko SMAD3 (białko modulujące aktywność TGF-β) [15, 16], co skutkuje zahamowaniem produkcji mediatorów prozapalnych takich jak IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12,TNFα, G-CSF i GM-CSF [11, 15, 16]. Wykazano również, że IL-18, IFN-γ, IL-1β, TNF i dinukleotyd CpG, powodują wzrost poziomu syntezy IL-37, choć IL-4 w połączeniu z GM-CSF istotnie ją hamują [16]. Przykładami oddziaływań IL-36 i IL-37, jest i to, że po wyciszeniu endogennej syntezy IL-36 i IL-37 w ludzkich komórkach krwi – PBMC (peripheral blond mononuc-lear cell), w czasie gdy poziom przeciwzapalnych cyto-kin (np. IL-10) pozostaje niezmieniony, obserwuje się wzrost poziomu IL-1α, IL-1β, IL-6, TNFα oraz GM-CSF [15, 16]. Natomiast w chwili wprowadzenia IL-36 do mysich lub ludzkich makrofagów, czy ludzkich komórek nabłonkowych płuc, obserwuje się całkowite zahamowa-nie produkcji IL-1α/β, IL-6, TNFα i GM-CSF [15, 16]. Udowodniono, że w makrofagach ludzkich właś ciwości supresyjne IL-36 i IL-37 zmniejszają się, gdy aktywność białka Smad3 zostaje zahamowana [15, 16]. Znaczący wpływ na powyższe interakcje ma TGF-β1, ponieważ jego niskie stężenia indukują endogenną IL-37. IL-36 i IL-37 wiążąc się z receptorami IL-18R, a także IL-18BP, zwiększają swoją zdolność do wzmacniania aktywności IL-18 [11, 16]. Wykazano, że IL-37 jest jedyną cytokiną wiążącą białko SMAD3, które po fosforylacji zostaje przeniesione do jądra komórkowego, co po związaniu z DNA, w komórkach DC i makrofagach powoduje zahamowanie ich aktywacji, w tym ich cytotoksyczność oraz stan ten zwiększa tolerancję limfocytów T [16].

2.6. sigirr

Cząsteczka ta zawiera jedną domenę immunoglo-bulinową powiązaną z IL-1R, zwana jest także TIR8 (Toll-IL-1R 8) i jest jednym z inhibitorów recepto-rów dla IL-1R [17, 21]. Cząsteczka SIGIRR wykazuje także rolę regulatorową, przez wytworzone kompleksy z receptorem dla IL-1, 18, 33 oraz IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9 oraz receptorów TLR (Toll-like receptor) [21]. Jest to cząsteczka o bardzo wysokiej ekspresji w komórkach nabłonkowych nerek pierwotnych i jelit oraz średniej ekspresji w splenocytach i komórkach dendrytycznych [17]. Natomiast stymulacja monocytów, makrofagów i keratynocytów, LPS prowadzi do zmniejszenia ekspre-sji SIGIRR, co wskazuje również na jej rolę w procesach zapalnych [21]. W przypadku braku SIGIRR, aktywność interleukin rodziny IL-1 jest bardziej uwydatniona, chociażby poprzez wzmożenie procesów zapalnych

[17, 21]. Wykazano też, że SIGIRR hamuje syntezę IL-1α i β, czego efektem jest osłabione powstawanie komórek Th17 [21].

3. podsumowanie

Cytokiny rodziny interleukiny 1 są produkowane przez komórki nabłonkowe (np. IL-18, IL-36, IL-37), śródbłonkowe (np. IL-1α, IL-33), dendrytyczne (np. IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9), glejowe (np. IL-1α, IL-33), makrofagi (np. IL-1α, IL-1β, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9), monocyty (np. IL-1α, IL-1β), neutrofile (np. IL-1α), limfocyty (np. IL-1α), keratynocyty (np. IL-1α, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-36, IL-37) i fibroblasty (np. IL-33). Interleu-kiny stwierdzono w tkance nabłonkowej, mięśniowej, oraz skórze i krwi (np. IL-1α, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10, IL-1β, IL-18, IL-33, IL-36 i IL-37) [3, 6–8, 14, 21], mózgu (np. IL-33, IL-1F5) [14, 19, 21], płucach (np. IL-33) [14, 21], grasicy (np. IL-36, IL-37, IL-1F5) [15, 16, 19,21], jądrach (np. IL-36, IL-37) [15, 16, 21], jajnikach (np. IL-36, IL-37) [15, 16, 21], macicy (np. IL-1F5, IL-36, IL-37) [14, 15, 19, 21], migdałkach (np. L-33, IL-1F10) [14, 21] oraz szpiku (np. IL-33) [7]. Stanowią one grupę cytokin pełniących fundamentalną rolę w układzie immunologicznym, jako że wykazują stymulujące działanie na UO oraz indukują procesy zapalne, chociażby poprzez pobudzanie limfocytów T i ich subpopulacji (Th1, Th2, Th17, Treg, Tγδ) (np. IL-1, IL-18), bazofili (komórek tucznych) (np. IL-1, IL-18, IL-33), eozynofili (np. IL-33), komórek dendrytycznych (np. IL-1, IL-18) oraz komórek NK i NKT (np. IL-18, IL-33). Cytokiny te, wykazują także działania supre-syjne na UO, co dotyczy szczególnie IL-36 i IL-37, które ograniczają odporność wrodzoną, hamując produkcję cytokin prozapalnych oraz hamując działanie IL-18, jak też zaktywowanych komórek DC i oraz makrofa-gów, a nadto hamują kinazę STAT1-4, receptor IL-1Ra, IL-1F10 (spokrewnienie z IL-1Ra- antagonistą receptora IL-1), SIGIRR (inhibicja działania IL-1) oraz IL-33 (np. poprzez IL-23 wobec DC).

piśmiennictwo)

1. Allan S.M., Tyrrell P.J., Rothwell N.J.: Interleukin-1 and neuro-nal injury. Nature rev. immunol. 5, 629–640 (2005)

2. Boutin H., Kimber I., Rothwell N.J., Pinteaux E.: The expan-ding interleukin-1 family and its receptors. Molec. Neurobiol. 27, 239–248 (2003)

3. Burger D., Dayer J.M., Palmer G., Gabay C.: Is IL-1 a good therapeutic target in the treatment of arthritis? Best Partice & res. clin. rheumatol. 20, 879–896 (2006).

4. Collinsom L.W., Vignali D.A.A.: Interleukin-35: odd one out or part of the family? immunol. rev. 226, 248–262 (2008)

CYTOKINY Z RODZINY INTERLEUKINY 1 221

5. Commins S.P., Borish L., Steinke J.W.: Immunologic messenger molecues: Cytokines, interferons, and chemokines J. Allergy clin. immunol. 125, 53–72 (2009)

6. Debets R., R.A. Kastelein i wsp.: Two novel IL-1 family mem-bers, IL-1d and IL-1e, functionas an antagonist and agonist of NF-kB activation through the orphan IL-1 receptor-related protein 2. J. immunol. 167, 1440–1446 (2001) (cytowana praca jest dziełem 11 autorów)

7. Deptuła W., Tokarz-Deptuła B., Stosik M.: Immunologia dla biologów – wydanie nowe. US Szczecin, Szczecin 2008.

8. Dewberry R.M., King A.R., Crossman C.D., Francis S.E.: Inter-leukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) modulates endothelial cell proliferation. FEBs Letters, 582, 886–890 (2008).

9. Dinarello C., C. Gabel i wsp.: IL-1 family nomenclature. Nature immunol. 11, 973 (2010) (cytowana praca jest dziełem 30 autorów).

10. Gao B.: Cytokines, STATs and liver disease. cell. Moll. immunol. 2, 92–100 (2005).

11. Kumar S., M.T. Lotze.: Interleukin-1F7B (IL-1H4/IL-1F7) is processed by caspaze-1 and mature IL-1F7B to the IL-18 recep-tor but does not induce INF-γ production. cytokine, 18, 61–71 (2002) (cytowana praca jest dziełem 13 autorów)

12. Kumar S., P.R. Young.: Identification and initial characteriza-tion of four novel members of the interleukin-1 family. J. Biol. chem. 275, 10308–10314 (2000) (cytowana praca jest dziełem 11 autorów)

13. Lin H., Ho A.S., Haley-Vicente D., Zhang J., Bernal-Fussell J., Pace A.M., Hansen D., Schweighofer K., Mize N.K., Ford J.E.: Cloning and characterization of IL-1HY2, a novel interleukin-1 family member. J. Biol. chem. 276, 20597–20602 (2001)

14. Nile C.J., Barksby E., Jitprasertwong P., Preshaw P.M., Taylor J.J.: Expression and regulation of interleukin-33 in human mono-cytes. immunology, 130, 172–180 (2009)

15. Nold M.F., Nold-Perty C.A., Zepp J.A., Bufler P., Palmer B.E., Dinarello C.A.: IL-36 (Formely IL-1F7) suppresses innate immu-nity by inhibiting inflammatory cytokines and dendritic cell acti-vation by association with SMAD 3. cytokine, 52, 3–4, (2010)

16. Nold M.F., Nold-Petry C.A., Zepp J.A., Palmer B.E., Bufler P., Dinarello C.A.: IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity. Nat. immunol. 11, 1014–1022 (2010)

17. Qin J., Qian Y., Yao J., Grace Q., Li X.: SIGIRR inhibits inter-leukin-1 receptor- and Toll-like receptor 4-mediated signaling through different mechanisms. J. Biol. chem. 280, 25233–25241 (2005)

18. Reilly C.E., Wands J.R., Brossay L.: Cytokine dependent and independent iNKT cell activation. cytokine, 51, 227–231 (2010)

19. Schmitz J., R.A. Kastelein.: IL-33, an interleukin-1-like cyto-kine that signals via the IL-1 receptor-related protein ST2 and induces T helper type 2-associated cytokines. immunity, 23, 479–490 (2005) (wyżej cytowana praca jest dziełem 11 autorów)

20. Seidelin J.B., Bjerrum J.T., Coskun M., Widjaya B., Vainer B., Nielsen O.H.: IL-33 is upregulated in colonocytes of ulcerative colitis. immunol. Lett. 128, 80–85, 2010

21. Sims J.E., Smith D.E.: The IL-1 family: regulators of immunity. Nature rev. immunology, 10, 89–102 (2010)

22. Smith D.E., Renshaw B.R., Ketchem R.R., Kubin M., Garka K.E., Sims J.E.: Four new members expand the interleukin-1 super-family. J. Biol. chem. 275, 1169–1175, (2000)

23. Sutton C.E., Lalor S.J., Sweeney C.M., Brereton C.F., Lavelle E.C., Mills K.H.G.: Interleukin-1 and IL-23 induce innate IL-17 production from gd T cells, amplifying Th17 responses and autoimmunity. immunity. 31, 331–341 (2009)

24. Swamy M., Jamora C., Havran W., Hayday A.: epithelial deci-sion markers: In serach of the “epimmunome”. Nature immu-nol. 11, 656–665 (2010)

25. Towne J.E., Garka K.E., Renshaw B.R., Virca G.D., Sims J.E.: Interleukin (IL)-1F6, IL-1F8, and IL-1F9 signal through IL-1Rrp2 and IL-1RAcP to activate the pathway leading to NF-κB and MAPKs. J. Biol. chem. 279, 13677–13688 (2004)

26. Yoshimoto T., Okamura H., Tagawa Y., Iwakura Y., Naka-nishi K.: Interleukin 18 together with interleukin 12 inhibits IgE production by induction of interferon-γ production from activated B cell. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 94, 3948–3953 (1997)


1. Wstęp

1.1. ogólna charakterystyka przeciedrobnoustrojowych peptydów

Istotnym elementem mechanizmów odpornościo-wych funkcjonującym zarówno u roślin, jak i zwierząt – bezkręgowych i kręgowców, są peptydy przeciw-drobnoustrojowe (AMP, antimicrobial peptides). Są one prawdopodobnie jednym z podstawowych i jednocześ-nie najbardziej prymitywnych mechanizmów obronnych.

AMP zostały opisane na początku lat osiemdziesią-tych XX wieku u żab i ropuch, u których bezpośrednio po zranieniu obserwowano wydzielanie substancji nisz-czących drobnoustroje. Substancje te nazwano magaini-nami. Następnie wykryto podobne substancje u innych gatunków zwierząt: cekropiny u ciem, tachyplezyny u krabów, tioniny u roślin i defensyny u ssaków. Od- krycie pokrewieństw strukturalnych i funkcjonalnych między tymi substancjami pozwoliło na wysunięcie

hipotezy, że AMP są jednym z najstarszych mechaniz-mów obronnych [80].

Do chwili obecnej opisano ponad 1500 przeciw -drob no ustrojowych peptydów. Dzięki dostępnym bazom danych można na bieżąco śledzić odkrycia w dziedzinie AMP. Informacje możemy znaleźć zarówno w specja-listycznych bazach danych, takich jak Antimicrobial Sequence Database (AMSDb) [http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/amsdb.html] i Antimicrobial Peptide database (APD) [http://aps.unmc.edu/AP/main.php], jak i w ogólnych bazach danych takich jak GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html], EMBL [http://www.ebi.ac.uk/embl/] i innych [63].

AMP są produkowane w wielu tkankach przez różne typy komórek roślin, grzybów i zwierząt oraz bak terii. Mają kilka wspólnych cech: są małymi peptydami o ładunku dodatnim. Znamy również peptydy anionowe i amfipatyczne. Peptydy te wykazują aktywność prze-ciwwirusową, przeciwbakteryjną, przeciwgrzybiczą oraz przeciwpasożytniczą. Oprócz niszczenia patogenów

dEfEnsyny – pEptydyo aktyWnoŚci przEciWbaktEryjnEj

Monika żyłowska1, agnieszka Wyszyńska1, Elżbieta katarzyna jagusztyn-krynicka*1

1 Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego, Zakład Genetyki Bakterii,ul. Miecznikowa 1, 02-096, Warszawa


1. Wstęp. 1.1. Ogólna charakterystyka antybakteryjnych peptydów. 1.2 Klasyfikacja antybakteryjnych peptydów. 1.3. Mechanizmy działania antybakteryjnych peptydów. 2. Charakterystyka defensyn. 2.1 Klasyfikacja, identyfikacja i struktura defensyn. 2.1.1 Defensyny α. 2.1.2. Defensyny β. 2.1.3. Defensyny θ. 2.1.4. Defensyny bezkręgowców. 2.1.5. Defensyny roślinne. 2.2 Biosynteza defensyn. 2.3. Struktura genetyczna i regulacja ekspresji genów kodujących defensyny. 2.4. Interakcje defensyn z błoną komórkową patogenu. 2.5. Modulacja działania układu immunologicznego przez defensyny. 2.6. Mechanizmy oporności bakterii na defensyny. 3. Podsumowanie

Antimicrobial peptides – defensins

Abstract: Numerous organisms produce antimicrobial peptides (AMP) as part of their innate immunity and host defense. Antimicrobial peptides are implicated in antibacterial as well as antifungal activity in phagocytes, inflammatory fluids and intestinal secretions. Among them, the most abundant and the best characterized are defensins. Most of them have been recently sequenced and their structures have been solved. Defensins are small (about 5 kDa), mainly basic, cystein – rich peptides. The global fold comprises an antiparallel β sheet and an α helix, which is stabilized by disulfide bridges. The mammalian defensins can be subdivided into three main classes according to their structural differences: α, β and, recently described, θ defensins. Several models have been recently proposed to explain the mechanism of bacterial membrane perturbation by defensins, leading to pore formation. This review describes recent findings in defensin biology focusing mainly on mammalian defensins.

1. Introduction. 1.1. Characterization of antimicrobial peptides. 1.2. Antimicrobial peptide classification. 1.2. Mechanism of antibacterial peptide activity. 2. Main features of defensins. 2.1. Defensin classification, structure and identification. 2.1.1. Defensins α. 2.1.2. Defensins β. 2.1.3. Defensins θ. 2.1.4 Invertebrate defensins. 2.1.4. Plant defensins. 2.2. Defensin biosynthesis. 2.4. Genetic organization and expression of gene encoding defensins. 2.4 Interaction between defensins and bacterial cell wall. 2.5. Influence of defensins on vertebrate immunological system. 2.6. Mechanisms of bacterial resistance to defensins. 3. Summary

słowa kluczowe: antybakteryjne peptydy, defensyny, oporność, patogeny, układ immunologicznykey words: antimicrobial peptides, defensins, immunological system, pathogens, resistance

* Autor korespondencyjny: Elżbieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka, Zakład Genetyki Bakterii, Wydział Biologii, UW; ul. Mieczni-kowa 1, 02-096 Warszawa; e-mail: [email protected]

224 MONIKA ŻYŁOWSKA, AGNIESZKA WYSZYŃSKA, ELŻBIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA

AMP mają zdolność do neutralizacji toksyn, wykazują aktywność chemotaktyczną, modulują działanie układu immunologicznego oraz indukują procesy angiogenezy i gojenia ran [7].

1.2. klasyfikacja antybakteryjnych peptydów

Klasyfikacja AMP przyjmuje jako kryterium po- działu ich sekwencję aminokwasową, liczbę mostków dwusiarczkowych oraz strukturę. Aktualnie najczęś- ciej stosowana jest klasyfikacja zaprezentowana przez B r o d g e n a, według którego możemy wśród tych pep-tydów wyróżnić pięć podgrup [5].

Do pierwszej z nich należą anionowe peptydy. Są one małe (726,1–823,8 Da) a dominującymi aminokwasami w ich sekwencji są kwas asparaginowy i kwas glutami-nowy. Produkowane są np. przez komórki nabłonkowe w milimolarnych stężeniach. W obecności cynku, który jest ich kofaktorem, wykazują aktywność wobec bak terii zarówno Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych. Do tej klasy peptydów należy m.in. dermicydyna, produko-wana w gruczołach potowych człowieka. Rozpuszcza się w pocie i po proteolitycznym procesowaniu do pep-tydu o długości 47 aminokwasów, jest razem z potem wydzielana na powierzchnię skóry. Oprócz właściwości bakteriobójczych dermicydyna ma również właściwości grzybobójcze, np. w stosunku do drożdżaka białego (candida albicans) [20].

Do drugiej podgrupy należy około 290 krótkich, kationowych peptydów o strukturze α-helisy. Zwykle ich długość nie przekracza 40 reszt aminokwasowych. W roztworach wodnych struktura wielu z tych pep-tydów jest zaburzona, natomiast w obecności trifluo-roetanolu, dodecylosiarczanu sodu (SDS) i lipidu A, cząsteczka przyjmuje właściwą konformację. Peptydy należące do tej klasy są aktywne wobec Gram-dodatnich i Gram-ujemnych bakterii. Przedstawicielami tej grupy są cekropiny: A i B. Po raz pierwszy opisano je u ćmy hyalophora cecropia, później stwierdzono ich obec-ność również u ssaków. Ich strukturę cechuje obecność dwóch α-helis, obie wykazują właściwości cytolityczne w stosunku do kilku linii komórek nowotworowych [40]. Innym przykładem jest pierwszy poznany pep-tyd przeciwdrobnoustrojowy, magainina zbudowany z 21–27 aminokwasów. Przedstawicielami tej podgrupy są również andropina, mellityna i ceratotoksyna owa-dów, dermaseptyna, bombinina, brewinina i buforyna II płazów, misguryna i pleurocydyna ryb oraz owispiryna, królicza katelicydyna CAP-18 (cationic antimicrobial peptide) i ludzka katelicydyna LL-37.

Trzecią podgrupę tworzy około 44 kationowych peptydów z dominującą liczbą takich aminokwasów jak: prolina, arginina, glicyna i tryptofan. Do tej klasy należy m.in. PR-39 (proline-arginine rich antibacte-rial peptide), peptyd izolowany z jelita cienkiego świń

i z neutrofili. Inne przykłady to: abaecyna bogata w pro-linę, drozomycyna i apidaecyna bogate w prolinę i argi-ninę, koleopterycyna i hymeoptaecyna owadów bogate w glicynę, oraz baktenecyna bogata w prolinę i argininę, profenina bogata w prolinę i fenyloalaninę, idolicydyna i histatyny ssaków bogate w tryptofan.

Kolejną podgrupę stanowią anionowe i kationowe peptydy zawierające reszty cysteinowe i mostki disul-fidowe [1–3]. Przykładem takich peptydów jest prote-gryna, 16-aminokwasowy peptyd z dwoma mostkami disulfi dowymi, izolowany z leukocytów świń. Do tej klasy należy również bardzo zróżnicowana grupa defensyn. Do tej pory opisano ok. 300 defensyn kręgowców (80 α-defensyn, około 190 β-defensyn, 5 defensyn θ), ok. 170 defensyn owadzich, ok. 60 defensyn roślinnych [http://defen-sins.bii.a-star.edu.sg/]. Inne peptydy należące do tej grupy to m.in. drozomycyna owadów, tachyplezyna sko-rupiaków oraz brewinina ssaków, która charakteryzuje się obecnością tylko jednego mostka disulfidowego [5].

Ostatnią podgrupę AMP stanowią anionowe i katio-nowe peptydy będące fragmentami większych białek. Mają one aktywność przeciwbakteryjną i są struktural-nie podobne do wcześniej opisanych peptydów, ale ich rola w odporności nie jest do końca poznana. Do tej klasy należy m.in. laktoferrycyna. Jest to peptyd obecny w neutrofilach, w mleku i w ślinie, powstały na skutek hydrolizy przez kwaśną peptydazę laktoferryny, białka wiążącego żelazo.

1.3. Mechanizmy działania przeciwbakteryjnych peptydów

AMP niszą komórki drobnoustroju głównie przez dezintegrację ich osłon komórkowych. Wiążą się z błoną komórkową patogenu dzięki oddziaływaniom elektro-statycznym między ujemnie naładowanymi lipidami błony komórkowej drobnoustroju a kationowymi pepty-dami. Aby dotrzeć do błony cytoplazmatycznej, peptyd musi „pokonać” zewnętrzne warstwy komórki – u bak-terii Gram-ujemnych błonę zewnętrzną i cienką warstwę peptydoglikanu, a u Gram-dodatnich grubą warstwę peptydoglikanu. Umożliwiają mu to ujemnie nałado-wane cząsteczki obecne w osłonach komórek bakteryj-nych, z którymi peptyd może oddziaływać – m.in. anio-nowe fosfolipidy i grupy fosforanowe lipopolisacharydu bakterii Gram-ujemnych oraz kwasy tejchojowe i lipo-tejchojowe wchodzące w skład peptydoglikanu bakterii Gram-dodatnich. Gdy peptyd zakotwiczy się w błonie cytoplazmatycznej drobnoustroju, następuje zmiana jego struktury a następnie wbudowanie do dwuwarstwowej fosfolipidowej błony cytoplazmatycznej. W niskim stę-żeniu peptydy są wbudowywane do błony równoległe, natomiast gdy ich stężenie wzrasta, zmieniają położenie na prostopadłe. W odpowiednio wysokim stężeniu i pro-stopadłej względem błony orientacji, peptydy zaczy-

DEFENSYNY – PEPTYDY O AKTYWNOŚCI PRZECIWBAKTERYJNEJ 225

nają tworzyć transmembranowe pory. W zależności od budowy peptydu możemy wyróżnić trzy mechanizmy niszczenia błon: „klepek beczki”, „pierścieniowy” i „dywanowy”. Istnieje również czwarty, rzadziej wystę-pujący mechanizm tworzenia „nieuporządkowanych pierścieniowych porów” [43].

W modelu „klepek beczki” biorą udział α-helikalne peptydy. Formują w centrum membrany wiązkę z kana-łem w środku. Od tej formy pochodzi nazwa mecha-nizmu działania – wiązka ta przypomina beczkę zbu-dowaną z klepek. Powstałe w błonie pory powodują wyciekanie składników cytoplazmy i spadek potencjału błonowego. W ten sposób niszczą błonę peptydy takie jak alametycyna i gramicydyna A [34].

Drugim mechanizmem niszczenia błon jest model „dywanowy”. W tym modelu peptydy kumulują się na powierzchni błony cytoplazmatycznej, nie przenikając przez nią. Peptydy oddziałują elektrostatycznie z hydro-filowymi głowami fosfolipidów pokrywając powierzch-nię błony jak dywan. Przy dużym stężeniu peptydów następuje destabilizacja błony, jej pęknięcie, obniżenie potencjału błonowego komórki i wyciekanie składników cytoplazmy. Jest to mechanizm podobny do działania detergentu. Tak działa np. cekropina [55].

Kolejnym mechanizmem jest model „pierścieniowy”. Peptydy wnikają między dwie warstwy błony i powo-dują, że pojedyncza warstwa fosfolipidowa zagina się do wewnątrz tworząc szczelinę, w której znajdują się głowy fosfolipidów i peptydy. Peptydy połączone są przez cały czas z polarnymi głowami lipidów, nawet podczas prze-nikania przez dwuwarstwową błonę. Ten mechanizm niszczenia błon jest reprezentowany przez magaininę, protegrynę i mellitynę [60].

Ostatnią ze strategii niszczenia błon jest mecha-nizm tworzenia „nieuporządkowanych pierścieniowych porów”. Ta modyfikacja porów pierścieniowych polega na tym, że ułożenie peptydów jest mniej restrykcyjne niż w modelu „pierścieniowym”. Peptydy nie ustawiają się zawsze prostopadle w stosunku do błony, tak jak to było w modelu „pierścieniowym”, ale mogą być zakotwiczone w błonie pod różnym kątem [43].

Pomimo wielu różnic, te cztery mechanizmy mają również cechy wspólne. Wszystkie one prowadzą do destabilizacji błony i utraty zdolności komórki do życia. Zaburzony zostaje potencjał błonowy, gradient pH, regulacja osmotyczna oraz zatrzymany proces oddy-chania. Lokalne stężenie peptydów w błonie jest około 10 000 razy wyższe niż ich stężenie w fazie wodnej [43].

Oprócz dezintegracji błony komórkowej, przeciw-drobnoustrojowe peptydy mogą zabijać komórki pato-genu w inny sposób. Wiele peptydów przekracza błonę cytoplazmatyczną i kumuluje się wewnątrz komórki. Peptydy te hamują syntezę kwasów nukleinowych poprzez wiązanie z DNA lub/i RNA, syntezę białek wpły-wając na aktywność ATPazową DnaK czy syntezę skład-

ników ściany komórkowej. Niektóre dodatkowo blokują aktywność innych enzymów [5, 6, 50].

Przedstawiona praca przeglądowa dotyczy jednej klasy AMP – defensyn.

2. charakterystyka defensyn

2.1. klasyfikacja, identyfikacja i struktura defensyn

Defensyny są małymi (3–5 kDa) peptydami przeciw-drobnoustrojowymi o strukturze β-harmonijki, zawie-rającymi zwykle sześć reszt cysteinowych połączonych trzema mostkami dwusiarczkowymi. Możemy wśród nich wyróżnić 5 grup: defensyny kręgowców, do których należą defensyny ssaków α-, β-, i θ- oraz defensyny bez-kręgowców i roślin. Obecnie znamy około 550 defensyn [www.defensins.bii.a-star.edu.sg].

Defensyny są wytwarzane przez różnorodne komórki wielu tkanek różnych organizmów. Defensyny α ziden-tyfikowano u królików, świnek morskich, szczurów, myszy i ludzi, natomiast defensyny β u bydła, owiec, kóz, świń, ptaków i ludzi.

Ludzkie defensyny α, HNP-1,2,3,4 są wytwarzane w granulach neutrofili, a defensyny HD-5,6, (human defensins) w komórkach Paneth’a oraz komórkach nabłonkowych dróg rozrodczych kobiet. Ludzkie defen-syny β charakteryzuje większa różnorodność miejsca wytwarzania. HBD-1 (human beta-defensin) jest syn-tetyzowana w komórkach nabłonkowych płuc i dróg moczowych, łożysku, nerkach, trzustce, tchawicy i pro-stacie, HBD-2 w komórkach nabłonkowych skóry, płuc, jelit i dróg moczowo-płciowych, HBD-3 w komórkach nabłonkowych nosa, migdałków, trzustki i oskrzeli oraz w ślinie i wydzielinie pochwowej a HBD-4 w jądrach, żołądku i macicy, płucach i nerkach [26, 62].

Defensyny θ wytwarzane są przez leukocyty i mono-cyty małp. U człowieka również zidentyfikowano gen, które mógłby potencjalnie kodować defensynę θ, ale w jego sekwencji nukleotydowej występuje przedwczes - ny kodon „stop”, co powoduje zahamowanie procesu translacji [47].

Defensyny bezkręgowców zostały wyizolowane z orga - nizmów nicieni, stawonogów i mięczaków, natomiast defensyny roślinne są wytwarzane przez wiele gatun- ków roślin.

Wszystkie defensyny charakteryzują się strukturą stabilizowaną przez mostki disulfidowe pomiędzy resztami cysteinowymi. W defensynach α i β występują 3 mostki disulfidowe – w przypadku defensyn α pomię-dzy cysteinami 1 i 6, 2 i 4 oraz 3 i 5, natomiast w przy-padku defensyn β pomiędzy cysteinami 1 i 5, 2 i 4 oraz 3 i 6. W defensynach θ również występują trzy mostki disulfidowe. Niektóre defensyny bezkręgowców są stabilizowane przez 3 mostki disulfidowe – pomiędzy


cysteinami 1 i 5, 2 i 4 oraz 3 i 6, natomiast inne charak-teryzują się obecnością 4 mostków łączących cysteiny 1 i 8, 2 i 5, 3 i 6, 4 i 7, tak jak u roślin [31].

2.1.1. defensyny αDefensyny α nazywamy również defensynami klasycz-

nymi. Są pierwszą odkrytą grupą defensyn. W 1980 roku L e h r e r wyizolował je z króliczych makrofagów, nieco później wykryto je również w króliczych granulocytach, a następnie w fagocytach innych ssaków, takich jak: świnki morskie, szczury, myszy i człowiek. Do chwili obecnej opisano około 80 defensyn α.

Ze względu na wiele interesujących funkcji, sta-rano się poznać strukturę tych peptydów. Wiele z nich zostało oczyszczonych i zsekwencjonowanych. U czło-wieka dokładnie scharakteryzowano sześć α-defensyn, z których cztery są odnajdywane głównie w ziarnach z granulocytów (HPN-1, HPN-2, HPN-3 i HPN-4) a pozostałe dwie w komórkach Paneth’a jelita cienkiego (HD-5 i HD-6).

Metodami krystalograficznymi i spektroskopowymi rozwiązano struktury kilku defensyn. Udokumentowano, że wszystkie klasyczne defensyny mają podobną kon-formację zawierającą trzypasmową strukturę β-kartki i pętlę łączącą te pasma. Struktura ta tworzy tzw. „szpilkę do włosów”. Ludzkie defensyny tworzą formy dimeryczne, które formują wąską część lejka. Szersza część lejka jest tworzona przez sześciopasmowe β-kartki połączone dwoma pętlami. Takie ułożenie multimetrów jest łatwe do uformowania w roztworze oraz korzystne w dwuwarstwowej błonie lipidowej. Fałdowanie tych peptydów jest procesem konserwowanym [29, 51].

Klasyczne defensyny są aktywne w stężeniu od 1 do 100 µg/ml przeciwko bakteriom, zarówno Gram--dodatnim jak i Gram-ujemnym, wirusom i grzybom. Aktywność przeciwbakteryjna i przeciwgrzybicza defensyn w granulocytach jest często hamowana przez białka osocza oraz kationy sodu i wapnia. Efekt działania jonów sodu polega na zahamowaniu niespecyficznych interakcji elektrostatycznych pomiędzy dodatnio nała-dowaną defensyną a ujemnie naładowaną błoną. Efekt hamującego działania wapnia jest częściej spotykany wobec bakterii Gram-ujemnych i polega na współza-wodnictwie o specyficzne miejsca wiążące zewnętrznej błony tych drobnoustrojów [21].

Ludzkie defensyny, pomimo wielu podobieństw strukturalnych, różnią się aktywnością wobec tych samych gatunków drobnoustrojów. Wykazano, że najsilniejszą bakteriobójczą aktywność spośród defensyn neutrofil-nych przeciwko staphylococcus aureus wykazuje defen-syna HNP-2 a najsłabszą HNP-4. Natomiast najsilniejszą aktywność przeciwko Escherichia coli i Enterobacter aero-genes wykazuje HNP-4, a najsłabszą HPN-1 i HPN-3. Defensyna HD-5, podobnie jak HNP-2, wykazywała wysoką aktywność wobec bakterii Gram-ujemnych,

a defensyna HD-6 wykazywała aktywność tylko wobec Bacillus cereus [17]. Co ciekawe, defensyny klasyczne mogą również stymulować adherencję niektórych bakterii do komórek wytwarzających te peptydy. Adhe- rencja heamophilus influenzae, Moraxella catarrhalis i Neisseria meningitidis do różnych typów komórek jest istotnie wyższa w obecności defensyn. Tak więc w nie-których przypadkach defensyny mogą działać nieko-rzystnie dla organizmu i brać udział w wywołaniu obja-wów chorobowych [24].

S a l z m a n i wsp. udowodnili, że α-defensyny wytwarzane przez komórki układu pokarmowego ssaków biorą udział w utrzymaniu homeostazy jelitowej. W jeli-cie cienkim człowieka dochodzi do ekspresji genów kodujących dwie α-defensyny: HD-5 i HD-6. Udo-kumentowano silną korelację pomiędzy poziomem α-defensyn a rodzajem limfocytów obecnych w jelitowej tkance limfatycznej. Zachowanie równowagi pomiędzy dwoma typami komórek T (helperowych i regulatoro-wych) jest niezbędna do prawidłowej regulacji odpo-wiedzi immunologicznej. W jej utrzymaniu biorą udział defensyny [59].

D e L e e u w i wsp. udowodnili, że defensyna HNP-1 wykazuje mechanizm działania inny niż perme-abilizacja błony komórkowej. Peptyd ten wiąże się do prekursora syntezy ściany komórkowej, lipidu II, przez co hamuje syntezę ściany komórkowej patogenu. Nisz-czenie w ten sposób komórek bakteryjnych zależy od poziomu lipidu II. Obecność inhibitorów syntezy ściany komórkowej, takich jak fosfomycyna, D-cykloseryna lub bacitracyna, znacząco obniża zdolność defensyny HNP-1 do zabijania patogenów. Mechanizm ten wyjaś-nia, dlaczego α-defensyny są dużo bardziej skuteczne wobec bakterii Gram-dodatnich niż defensyny β [14].

2.1.2. defensyny βDefensyny β, zbudowane 38–42 aminokwasów, od-

kryto na początku lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku. Peptydy te zidentyfikowano u bydła, owiec, kóz, świń, ptaków (kur i indyków) i ludzi. Pierwszą β-defen- syną odkrytą u ssaków był peptyd TAP (tracheal antymi-crobial peptide) wyizolowany z bydlęcej tkanki tchawicy przez Diamonda w 1991 roku. Peptyd ten wykazywał wła-ściwości bakteriobójcze wobec Gram-ujemnych i Gram--dodatnich bakterii oraz właściwości przeciwgrzybicze wobec drożdżaków z rodzaju candida [15]. U ludzi pierwszą β-defensynę odkryto w 1995 roku (HBD-1). Jej obecność stwierdzono w komórkach nabłonkowych tchawicy, oskrzeli, dróg oddechowych, przyusznicy, błony śluzowej policzków, języka i dziąseł także w jelicie cienkim, trzustce, nerkach, prostacie, jądrach, pochwie, macicy, jajowodach, łożysku i grasicy. Defensyna HBD-1 działa przeciwko bakteriom Gram-ujemnym [3]. Obec-nie znamy ok. 190 β-defensyn: 48 z nich to defensyny ludzkie. Rozwiązano struktury dwunastu z nich.


W sekwencjach aminokwasowych β-defensyn wystę- puje sześć reszt cysteinowych, których położenie jest konserwowane. Oprócz nich występuje niewiele innych konserwowanych reszt aminokwasowych: glicyna i glu-tamina. W 4 β-defensynach (HBD-1–4) człowieka odnotowano wysoką zawartość kationowych reszt lizyny i argininy, zgromadzonych w karboksyterminalnym fragmencie peptydu [52].

Rdzeń β-defensyn jest zbudowany z trzech β-har- monijek tworzących antyrównoległą β-kartkę. β-kartka jest oflankowana α-helikalnym segmentem o zróżnico-wanej długości. Orientacja α-helisy względem β-kartki jest stabilizowana przez mostki disulfidowe. Z powodu specyficznych połączeń pomiędzy resztami cysteino-wymi β-defensyny zostały uznane za oddzielną grupę defensyn. Część drugiej β-harmonijki, z konserwowa-nym motywem Gly-X-Cys, formuje strukturę zwaną β-wybrzuszeniem niezbędną dla prawidłowego zwijania i formowania struktury natywnej ssaczych defensyn [82].

Defensyny β formują oligomeryczne struktury, które odgrywają znaczącą rolę w ich aktywności biologicz-nej i funkcjonowaniu. Za pomocą metod krystalogra-ficznych zaobserwowano tworzenie oktamerów przez defensynę HBD-2. Oktamery tworzą cztery niekowa-lencyjnie połączone dimery, stabilizowane przez inter-akcje pomiędzy pierwszymi β-harmonijkami monome-rów. Defensyna HBD-1 tworzy słabo połączone ze sobą dimery, stabilizowane przez mostki solne, podobnie jak defensyna HBD-3, której symetryczne dimery oprócz mostków solnych są stabilizowane przez wiązanie hydrofobowe. Defensyna HBD-3 tworzy w roztworach stabilne dimery. Jej aktywność przeciwbakteryjna jest niezależna od obecności soli, w odróżnieniu od HBD-1, której aktywność zależy od stężenia NaCl [4, 30].

β-defensyny wykazują różne spektrum działania, najczęściej jednak wykazują aktywność przeciwko bakteriom Gram-dodatnim i Gram-ujemnym oraz droż-dżakom. Np. defensyna bydlęca TAP jest aktywna wobec takich gatunków bakterii jak E. coli, Pseudomo-nas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, s. aureus, oraz drożdżaków: c. albicans i c.tropicalis a jej minimalne stężenie hamujące wynosi 6–125 µg/ml w zależności od drobnoustroju. Podobnie inne defensyny mogą wyka-zywać aktywność wobec wielu drobnoustrojów, jednak niektóre wykazują przeciwbakteryjne działanie w niż-szym stężeniu a inne dopiero wtedy, gdy ich stężenie jest odpowiednio wysokie [45].

Badania dotyczące ludzkich defensyn β udoku-mentowały, że peptydy te wykazują większą aktywność wobec patogenów tlenowych niż wobec beztlenowych [36]. Niektóre badania wykazały również potencjalną przeciwbakteryjną aktywność syntetycznej defensyny HBD-4 wobec Burkholderia cepacia, bakterii opornej na działanie innych peptydów przeciwdrobnoustrojowych i antybiotyków.

2.1.3. defensyny θDefensyny θ są najpóźniej poznaną grupą defensyn.

Pierwszą defensynę z tej grupy, RTD1 (rhesus theta-defen-sin), obecną w leukocytach i monocytach rezusa (rhesus macaque), opisał zespół S e l s t e d a w 1999 roku [71]. Nieco później wykryto u rezusa obecność dwóch kolej-nych defensyn – RTD-1 i RTD-2. Defensyny RTD-1, -2 i -3 wykazują aktywność przeciwbakteryjną, przeciw-grzybiczą oraz przeciwwirusową. Peptydy te mają kolistą strukturę, powstającą przez połączenie dwóch 9-amino-kwasowych sekwencji pochodzących z prekursorów θ-defensyn. Budują je dwie antyrównoległe β-kartki połączone dwoma pętlami α. Defensyny θ wykazują aktywność w obecności NaCl, dwuwartościowych jonów oraz osocza, w odróżnieniu od defensyn α i β [73].

N g u y e n i wsp. prowadzili badania filogenetyczne, które ujawniły, że geny θ-defensyn występują u innych małp Starego Świata oraz u dwóch małp człekokształt-nych (gibon i orangutan). U ludzi, szympansów i goryli występuje pseudogen, którego prekursor mRNA zawiera przedwczesny kodon „stop” w sekwencji sygnałowej, przez co nie dochodzi do jego translacji [47].

Defensyny θ są również wytwarzane przez pawiana. Pięć tych defensyn zostało wyizolowanych i oczyszczo-nych (BTD1-5, babon theta-defensin). Analizy RT-PCR mRNA pochodzącego ze szpiku kostnego pawiana wykazały obecność trzech (u Papio Anubis) i czterech (u Theropitecus gelada) prekursorów mRNA. Defen-syny θ pawiana wykazały aktywność wobec bakterii Gram-ujemnych, Gram-dodatnich oraz drożdży [23].

Zespół S t e g e m a n n a wyizolował dwie θ-defensyny (PhTD-1, -3, papio hamadrys theta-defensin) z leu - kocytów pawiana płaszczowego (Papio hamadrys). Defen- syny te mają strukturę taką samą jak inne defensyny θ. Wykazują aktywność w stosunku do bakterii takich jak Listeria monocytogenes, metycylinooporne szczepy s. aureus, E. coli oraz drożdżaków c. albicans [69].

2.1.4. defensyny bezkręgowcówDefensyny bezkręgowców, wyizolowane z komórek

nicieni, stawonogów i mięczaków, pełnią kluczową rolę w odporności tych organizmów. Peptydy te są zbu-dowane z 38–45 reszt aminokwasowych, jednak sekwen-cja aminokwasowa defensyn u różnych gatunków jest odmienna. Obecnie znamy około 170 defensyn bez-kręgowców.

Peptydy te wytwarzane są przez komórki tłusz- czowe oraz komórki krwi – trombocyty. W strukturze trzeciorzędowej zawierają α-helisę połączoną pętlą z antyrównoległą β-kartką. U większości bezkręgow-ców struktura trzeciorzędowa defensyn jest stabili-zowana przez trzy mostki disulfidowe, jednak w nie- których występują cztery mostki, np. w defensynie MGD1 wyizolowanej z Mytilus galloprovincialis oraz drozomycynie wyizolowanej z Drosophilla melanogaster.


Duża zmienność sekwencji aminokwasowej defen-syn bezkręgowców wynika z różnorodności sekwencji aminokwasowej ich prekursorów oraz struktury intro-nów i eksonów. Ta wielka różnorodność jest skutkiem zmian defensyn w procesie ewolucji – wraz z ewolucją bezkręgowców ewoluowały defensyny przez nie produ-kowane [58].

Hemolimfa owadów nabywa właściwości przeciw-drobnoustrojowych po zranieniu owada lub penetracji przez drobnoustroje. Defensyny owadzie są dużą grupą peptydów odnajdywaną w hemolimfie różnych gatun-ków owadów. Większość defensyn owadzich ma aktyw-ność przeciwbakteryjną wobec bakterii gramdodatnich. Do zahamowania wzrostu tych bakterii dochodzi już w niskim stężeniu defensyn (1–100 µg/ml). Gram--ujemne bakterie, drożdżaki i grzyby strzępkowe są mniej wrażliwe na ich działanie. Zidentyfikowano także kilka defensyn o właściwościach przeciwgrzybiczych: termicyna z Pseudacanthotermes spiniger, drozomycyna z D. melanogaster, heliomycyna z heliothis verescens oraz gallerimycyna z larwy Galleria mellonella [2].

2.1.5. defensyny roślinneDefensyny roślinne są małymi peptydami, zbudo-

wanymi z 45–54 reszt aminokwasowych, zawierają-cymi charakterystyczny wzór zwinięcia stabilizowany czterema mostkami disulfidowymi. Pierwsza roślinna defensyna, γ-tionina, została wyizolowana z ziaren psze-nicy i jęczmienia w 1990 roku. Podobieństwo struktury γ-tioniny do defensyn ssaczych i owadzich pozwoliło zaklasyfikować ten peptyd do rodziny defensyn [11].

Struktura defensyn roślinnych jest podobna do struktur trzeciorzędowych ssaczych β-defensyn i defen-syn owadów – struktura β-kartki połączona równolegle z α-helisą.

W genomie Arabidopsis thaliana zidentyfikowano 13 genów potencjalnie kodujących defensyny. Okazało się, że wytwarzane jest tylko 11 peptydów. Dwa dodatkowe geny kodują białka o długości 122 i 129 ami-nokwasów, których karboksyterminalne domeny wy- kazują obecność konserwowanego wzoru reszt cysteinowych charakterystycznego dla wszystkich roślin-nych defensyn. Prawdopodobnie białka te są białkami fuzyjnymi [72].

Większość defensyn roślinnych hamuje wzrost wielu rodzajów grzybów, a niektóre również wykazują aktyw-ność przeciwbakteryjną. W odróżnieniu do defensyn bezkręgowców i ssaków, defensyny roślinne nie oddzia-łują bezpośrednio z fosfolipidami błony komórkowej. Ich działanie opiera się głównie na modulowaniu stę-żenia jednowartościowych i dwuwartościowych katio-nów we wnętrzu komórki. Przeciwgrzybiczą aktywność wykazują defensyny wyizolowane z dalii, rzodkiewki, żurawki, groszku i lucerny [8].

2.2. biosynteza defensyn

Dzięki sklonowaniu cDNA przedstawicieli wszyst-kich klas ludzkich defensyn wykazano, że wszystkie ich typy są syntetyzowane w postaci prepropeptydów, w których skład wchodzą: sekwencja sygnalna, sekwen-cja aminokwasowa propeptydu oraz sekwencja amino-kwasowa kodująca dojrzałe białko.

Defensyny α są produkowane w postaci prepropep-tydu zbudowanego z 90–100 reszt aminokwasowych, w którego skład wchodzą: prekursor aminokwasowy zawierający w N-terminalnym fragmencie około 19-ami-nokwasową sekwencję sygnalną, ok. 5-aminokwasowy anionowy propeptyd oraz ok. 30-aminokwasową, C-ter- minalną, kationową sekwencję aminokwasową kodującą dojrzały peptyd [13]. Biosynteza defensyn α ma miejsce w szpiku kostnym oraz w neutrofilowych komórkach prekursorowych. Dojrzałe neutrofile krążą w krwi w po- szukiwaniu odpowiedniej tkanki; w tym czasie nie zachodzi jeszcze synteza nowych defensyn. Podczas syntezy defensyn w komórkach szpiku kostnego, sekwencja sygna- łowa jest szybko usuwana, ale późniejsze procesowanie proteolityczne prepropeptydu do dojrzałej defensyny zajmuje wiele godzin, a końcowe proteolityczne roz-szczepienie ma miejsce już w dojrzałych granulach [75].

Struktura prekursora defensyn β jest prostsza. Pre-kursor jest zbudowany z aminokwasowej sekwencji sygnalnej, krótkiego propeptydu (może w ogóle nie być propeptydu) i C-terminalnej sekwencji aminokwasowej dojrzałej defensyny. Ich procesowanie również polega na obróbce proteolitycznej [20].

W biosyntezie defensyn θ biorą udział dwa prepro-petydy. W ich skład wchodzą aminokwasowe sekwencje sygnalne, sekwencja aminokwasowa propeptydu oraz dojrzałej defensyny. Prepropeptydy są zbudowane z ok. 90 aminokwasów, natomiast dojrzały peptyd, po obróbce proteolitycznej, z 9 aminokwasów. Podczas procesowa-nia dochodzi do połączenia C-terminalnych domen, w wyniku czego powstaje 18-aminokwasowy peptyd [71].

Analiza sekwencji aminokwasowych najbardziej powszechnych defensyn, wydedukowana z sekwencji nukleotydowej ich cDNA, wykazuje charakterystyczny rozkład aminokwasów – ujemny ładunek sekwencji aminokwasowej propeptydu neutralizuje dodatni ładu-nek sekwencji aminokwasowej dojrzałego peptydu. Ta obserwacja sugeruje, że propeptyd oddziałuje z dojrza-łym peptydem podczas biosyntezy defensyn, ułatwiając proces zwijania białka oraz zapobiegając nieprawidło-wym interakcjom z innymi białkami [44].

2.3. struktura genetyczna i regulacja ekspresji genów kodujących defensyny

Geny kodujące defensyny charakteryzują się bardzo różnorodną strukturą genetyczną i wieloma sposobami


regulacji kodujących je genów. Te wyizolowane ze szpiku zawierają trzy eksony, natomiast geny kodujące defen-syny występujące w komórkach Paneth’a zawierają dwa eksony. Fragment 5’ genów, nie podlegający translacji, oraz fragment kodujący sekwencję sygnalną są silnie konserwowane.

W obu grupach, propeptyd i dojrzała część defensyn są kodowane przez oddzielne eksony. Taka organizacja genetyczna może sprzyjać rekombinacji pomiędzy frag-mentem kodującym propeptyd i fragmentem kodują-cym dojrzałą defensynę, co skutkuje powstawaniem róż-nych peptydów w tych samych przedziałach komórki. Zmienność peptydów może być też wynikiem różnej obróbki potranslacyjnej, co prowadzi do powstawa-nia peptydów o różnym składzie aminokwasowym na N-końcu. Wszystkie geny kodujące klasyczne defensyny są zlokalizowane na chromosomie 8 [75].

W genomie człowieka odnaleziono około 40-stu re- gionów potencjalnie kodujących β-defensyny. Z powodu wysokiej częstości zachodzenia procesu duplikacji genów w skupiskach genów kodujących β-defensyny, możemy podejrzewać, że liczba tych genów jest nawet wyższa. Niektóre ze zidentyfikowanych genów to pseudogeny zawierające w mRNA przedwczesny kodon „stop”. Geny kodujące β-defensyny znajdują się na różnych chromo-somach: 8, 6, 20 [61]. Geny kodujące ludzkie β-defensyny mają podobną strukturę genetyczną. Zawierają dwa eksony i jeden intron. Jedynym wyjątkiem jest gen kodu-jący defensynę HBD-1, który zawiera trzy eksony i dwa introny. Pierwszy ekson koduje hydrofobową sekwencję sygnalną a w drugim zawarte są informacje o sekwencji aminokwasowej dojrzałego białka poprzedzonego krót-kim, anionowym propeptydem. Potranslacyjna obróbka obejmuje proteolityczne wycięcie sekwencji sygnalnej przez enzym elastazę lub proteinazę a następnie usu-nięcie N-końcowego propeptydu [74].

Regulacja ekspresji genów kodujących β-defensyny jest bardzo skomplikowana. Ekspresja defensyny HBD-1 może być konstytutywna lub indukowana obecnoś- cią lipopolisacharydu (LPS) lub interferonu gamma (IFN-γ) [16].

Poziom ekspresji genów kodujących defensynę HBD-2 w jelicie jest dużo niższy niż genów kodujących defensynę HBD-1, co sugeruje, że regulacja ekspresji musi przebiegać inaczej. Ekspresja hBD-2 jest stymu-lowana przez interleukinę 1α (IL-1α), interleukinę 1β (IL-1β), czynnik nekrozy nowotworów (TNF-α), izo-leucynę, 1,25-dihydroksywitaminę D, lipopolisacharyd oraz niektóre Gram-ujemne bakterie [16]. Transformu-jący czynnik wzrostu β1 (TGF-β1) również stymuluje transkrypcję i ekspresję hBD-2, ale tylko w komór-kach naczyń śródbłonka naczyniowego. W komórkach nabłonkowych jamy ustnej nie zaobserwowano stymu-lacji ekspresji genów kodujących tą defensynę przez czynnik TGF-β1 [38]. Udowodniono również, że eks-

presja hBD-2 w limfocytach B może być indukowana przez DNA zawierający motywy CpG. DNA, zawierający nie zmetylowane dinukleotydy cytozyny i guaniny, sty-muluje ekspresję hBD-2 w komórkach nabłonkowych układu oddechowego [28]. Indukcja ekspresji genów kodujących defensyny może również zachodzić po pobudzeniu receptorów TLR, które rozpoznają tzw. wzorce molekularne mikroorganizmów patogennych takie jak np. LPS, flagellinę czy lipoproteidy. Stymula-cja TLR4 indukuje ekspresję hBD-2 w odpowiedzi na infekcję chlamydia pneumoniae [9].

Podobnie regulowana jest ekspresja genu kodującego defensynę HBD-3, choć zaobserwowano wpływ na ten proces także transformowanego czynnika wzros tu α (TGF-α) oraz podobnego do insuliny czynnika wzrostu 1 (IGF-1) [66]. Ekspresję hBD-3 w keratynocytach sty-muluje histamina. Defensyna HBD-3 wiąże się z recep-torami na powierzchni komórek tucznych i wpływa na ich chemotaksję i degranulację, co w rezultacie prowadzi do uwolnienia histaminy. Uwolniona histamina akty-wuje syntezę HBD-3 poprzez oddziaływanie z recepto-rem H1 obecnym na powierzchni keratynocytów [33]. Poznane czynniki regulujące ekspresję genów kodu-jących defensynę HBD-4 są podobne do czynników wymienionych w przypadku hBD-2 i hBD-3 [66].

2.4. interakcje defensyn z błoną komórkową patogenu

Wszystkie defensyny mają zdolność do zabijania lub inaktywowania określonych gatunków bakterii, wiru-sów, grzybów lub pasożytów i są uważane za główne efektory odporności wrodzonej organizmu. Do niszczą-cego działania defensyn dochodzi w wakuolach fago-cytów, na powierzchni skóry i w komórkach nabłon-kowych, gdzie panuje niska siła jonowa. Selektywność działania peptydów jest uzależniona od różnic w budo-wie błony komórkowej patogenów [83].

Celem przeciwbakteryjnego działania defensyn jest błona komórkowa patogenów. Peptydy te oddziałują elektrostatycznie z błoną poprzez interakcje z ujemnie naładowanymi lipidami lub/i oddziaływanie defensyn jest determinowane przez potencjał transmembranowy błony. Jej struktura różni się od bogatych w fosfatydy-locholinę cytoplazmatycznych błon eukariotycznych i dzięki temu defensyny selektywnie działają tylko na błony komórkowe bakterii [79]. Wielu interesujących informacji dotyczących oddziaływań defensyn z błoną komórkową dostarczyły eksperymenty wykorzystujące sztucznie stworzone modele błon komórkowych lub pęcherzyki lipidowe.

K a g a n i wsp. analizowali oddziaływania króliczej defensyny NP-1 i ludzkiej HNP-1 wykorzystując dwu-warstwową błonę zbudowaną z lipidowej mieszaniny zawierającej w różnych ilościach cząsteczki fosfatydyle-tanoloaminy, fosfatydylocholiny oraz fosfatydyloseryny.


Udokumentowano, że wydajność permeabilizacji błony przez defensyny zależy od jej składu chemicznego [37].

Stosując jako model badawczy małe jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe zbudowane z mieszaniny dipalmi-tylofosfocholiny i dioleilofosfatydyloseryny analizowano interakcje z błoną α-defensyn (NP-2 i HNP-1). Wyka-zano, że badane peptydy powodują fuzję i lizę pęcherzy-ków na drodze oddziaływań zarówno elektrostatycznych jak i hydrofobowych. Udokumentowano także, zgodnie z poprzednio poczynionymi obserwacjami, że defensyny o zredukowanych wiązaniach dwusiarczkowych nie wykazują pełnej aktywności [19, 51].

W i m l e y i wsp. badali interakcje defensyny ludz-kiej HNP-2 z dużymi jednowarstwowymi pęcherzykami lipidowymi zbudowanymi z ujemnie naładowanego lipidu palmitylooleilofosfatydyloglicerolu. Udowodnili oni, że defensyna ta tworzy pierścieniowe pory uformo-wane w heksamer. Zarówno natywna, jak i zredukowana forma HNP-2 powoduje przeciekanie błony prowadzące do śmierci komórki, jednak mechanizm działania obu tych form nieco się różni i jest zależny od stężenia dime-rów peptydu wbudowanych w błonę [81].

2.5. Modulacja działania układu immunologicznego przez defensyny

Defensyny odgrywają istotną rolę zarówno we wro-dzonej, jak i nabytej odporności organizmu. We wro-dzonej odporności peptydy te głównie pełnią rolę cząs-teczek efektorowych, natomiast w odporności nabytej przyczyniają się do regulacji odpowiedzi immunologicz-nej w odpowiedzi na inwazję patogenów.

Defensyny α i β wywierają wpływ na odporność wro-dzoną. Ludzkie neutrofilne defensyny α wprowadzone do mysich makrofagów podwyższają ich zdolność do fagocytozy [32]. Defensyny α człowieka, królika i świnki morskiej oraz defensyny β indukują aktywację i degra-nulację komórek tucznych, co prowadzi do uwolnie-nia histaminy i prostaglandyny D2, które są mediato-rami stanu zapalnego [48]. HNP-1, -2 i -3 stymulują komórki tkanki nabłonkowej oskrzeli do transkrypcji genów interleukiny 8 (IL-8), aktywującej neutrofile [77]. Ludzkie defensyny α mogą zwiększać poziom produkcji czynnika nekrozy nowotworów (TNF) i interleukiny-1 (IL-1) oraz obniżać poziom produkcji interleukiny 10 (IL-10), która jest czynnikiem przeciwzapalnym, efektyw-nie limitującym produkcję czynników prozapalnych [10].

Defensyna HBD-3 wywołuje odwrotny efekt – działa przeciwzapalnie. Dowiedziono, że w obecności LPS, HBD-3 efektywnie hamuje akumulację czynników prozapalnych TNF-α i IL-6 w osoczu. Przeciwzapalny efekt działania HBD-3 nie jest zależny od IL-10 oraz od poziomu cAMP, ważnego czynnika kontrolującego układ immunologiczny. Zarówno cAMP jak i HBD-3 obniżają poziom czynnika TNF-α w komórce, ale obec-ność HBD-3 hamuje działanie cAMP, co sugeruje, że

cAMP i HBD-3 działają na zasadzie dwóch różnych mechanizmów. Obniżanie poziomu czynnika TNF-α w osoczu, indukowanego obecnością LPS, przez HBD-3 wskazuje, że HBD-3 może być ważnym czynnikiem kontrolującym proces zapalny i szok septyczny [63]. Co więcej, defensyny wzmacniają lub tłumią aktywację klasycznej ścieżki układu dopełnicza [76].

Defensyny jelitowe, HD-5 i HD-6, wytwarzane przez komórki Paneth’a w jelicie cienkim, odgrywają istotną rolę w zwalczaniu infekcji jelitowych. Znokautowane myszy z inaktywowanym genem kodującym matryli-zynę, metaloproteazę przekształcającą nieaktywne formy defensyn wytwarzanych przez te komórki do form aktywnych, były dużo bardziej wrażliwe na zakażenia bakteryjne i szybciej umierały po infekcji salmonella enterica sv. Typhimurium. Utwierdza to w przekona-niu, że α-defensyny pełnią ważną rolę w ochronie przed jelitowymi patogenami.

Defensyny HD-5 i HD-6 hamują rozwój choroby Leśniowskiego-Crohna – choroby zapalnej jelita. Uwal-nianie defensyn z komórek Paneth’a jest stymulowane obecnością glikolipidów ścian komórkowych bakterii [70]. U pacjentów ze stanem zapalnym końcowej części jelita cienkiego – jelita krętego, wykazano dużo niższy poziom defensyn HD-5 i HD-6.

Defensyny α działają chemotaktycznie na niedoj-rzałe komórki dendrytyczne, niedojrzałe limfocyty T oraz limfocyty T CD8. Natomiast defensyny β są bar-dziej selektywne i działają chemotaktycznie wyłącznie na komórki posiadające receptor CCR6, odpowiedzialny za chemotaksję chemokiny prozapalnej makrofagów – białka 3α (MIP-3α, macrophage inflammatory protein) oraz defensyn β [49].

2.6. Mechanizmy oporności bakterii na defensyny

Różnorodność defensyn produkowanych przez wiele ewolucyjnie odległych organizmów utrudnia pato-genom ochronę przed nimi. Drobnoustroje wykształ- ciły wiele mechanizmów oporności, pozwalających im uniknąć destrukcyjnej działalności niektórych prze-ciwbakteryjnych peptydów. Do tych strategii należy unikanie wiązania i wbudowywania peptydu w błonę oraz zmiany przepuszczalności błony cytoplazmatycz-nej. Najczęściej stosowaną strategią jest zmiana struktur osłon komórkowych.

Jednym z mechanizmów oporności wykształconych przez bakterie jest zamiana anionowych składników ściany komórkowej na składniki kationowe. Takiej strategii używa Gram-dodatni gronkowiec, s. aureus. Ujemny ładunek w ścianie komórkowej wytworzony przez kwasy tejchojowe jest modyfikowany przez wbudowywanie do osłon komórkowych D-alaniny transportowanej z cytoplazmy, przez produkty genów operonu dlt. Inaktywacja operonu dlt skutkuje zwięk-szeniem wrażliwości s. aureus na defensyny [54]. Ope-


ron dlt występuje również w genomach innych Gram--dodatnich patogenów np. Listeria monocytogenes [1] i streptococcus grupy B [56].

Estryfikacja kwasów tejchojowych także powoduje zmianę ładunku ujemnego na dodatni, przez dodanie grup aminowych. s. aureus modyfikuje błonę poprzez wbudowanie L-lizyny do fosfatydyloglicerolu, dzięki obecności genu mprF kodującego syntazę lizylofosfa-tydyloglicerolu (LPG), co również skutkuje wzrostem oporności na defensyny [53].

Bakterie Gram-ujemne „bronią się” przed defensy-nami poprzez modyfikację zewnętrznej błony komór-kowej. Modyfikacja ta polega na acylacji lipidu A lipopolisacharydu lub na redukcji płynności błony zewnętrznej wskutek oddziaływań hydrofobowych mię-dzy wzrastającą liczbą acylowanych cząsteczek lipidu A. W komórkach s. enterica genem odpowiedzialnym za acylację lipidu A jest gen pagP kodujący transferazę palmitynową [27]. Jego homologami są rcp, kodujący białko Rcp Legionella pneumophila [57] i htrB kodujący acylotransferazę heamophilus influenzae [68]. s. ente-rica sv. Typhimurium wykształciła również inny sposób obrony przed działaniem defensyn. Do fosforanowych grup w lipidzie A przyłączane są cząsteczki arabinozy, co redukuje oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy kationowymi peptydami a negatywnie naładowanymi fosforanami [25]. Ten mechanizm oporności wymaga aktywności dwuskładnikowego systemu regulatorowego PhoP-PhoQ. Dołączanie cząsteczek arabinozy do grup fosforanowych w lipidzie A jest również strategią obrony przed defensynami Proteus mirabilis, bakterii powodu-jącej infekcje dróg moczowych. [42].

Dowiedziono również, że „niszczenie” błony komór-kowej s. enterica sv. Typhimurium prowadzi do induk-cji regulonu σE , kontrolującego ekspresję wielu genów, między innymi genów zaangażowanych w mechanizmy oporności na defensyny [12].

Podobnie jest w przypadku bakterii Listeria monocy-togenes i L. ivanovii – termoregulowany czynnik trans-krypcyjny PrfA kontroluje ekspresję genów regulujących oporność bakterii na defensyny. W temp. 37°C pato-genne szczepy L. monocytogenes i L. ivanovii są oporne na bakteriobójcze działanie defensyn HD-1 i HD-2, natomiast szczepy niepatogenne są wrażliwe [39].

Mycobacterium marinum wytwarza specyficzne lipi-dowe składniki ściany komórkowej, występujące jedy-nie u prątków – kwasy mikolowe . Ich wytwarzanie jest zależne między innymi od obecności genu kasB (3-oxyl--(acyl carrier protein) synthase i). Badania wykorzystu-jące mutagenezę insercyjną wykazały, że mutanty z unie-czynnionym genem kasB wykazują większą wrażliwość na defensyny [22].

W komórkach niektórych Gram-ujemnych bak-terii oporność na defensyny związana jest z obecnością specyficznych białek błony zewnętrznej. W komórkach Yersinia enterocolitica oporność warunkowana jest obec-

nością plazmidu pYVe, który koduje między innymi wielofunkcyjną adhezynę A (YadA). Mutanty ze zno-kautowanym genem kodującym białko YadA wykazują wyższą wrażliwość na defensyny niż szczepy dzikie [78].

Inny rodzaj strategii wypracowanej przez mikro-organizmy polega na wytwarzaniu polisacharydowych otoczek. Przykładem może być występowanie otoczki komórek Klebsiella pneumoniae, która zapewnia bak-terii oporność na defensyny HNP-1 oraz HBD-1 i -2. Otoczka K. pneumoniae nie tylko chroni bakterię przez niszczącym działaniem peptydów, ale może również, prawdopodobnie na drodze przekazywania sygnału, hamować ekspresję genów β-defensyn HBD-1 i -2 w komórkach nabłonkowych układu oddechowego. Mutanty ze znokautowanymi genami kodującymi anty-gen O lipopolisacharydu wykazywały podobny poziom oporności jak dzikie patogeny, co utwierdza w przeko-naniu, że nie antygen O, a otoczka polisacharydowa ma największy wpływ na oporność K. pneumoniae. Bez-otoczkowe mutanty indukują wyższy poziom indukcji ekspresji β-defensyn niż typ dziki i są na nie dużo bar-dziej wrażliwe [46].

s. aureus wytwarza stafylokinazę, białko aktywujące plazminogen. Okazało się, że stafylokinaza również indukuje uwalnianie α-defensyn z leukocytów wielo-jądrzastych. Stafylokinaza wiąże się z α-defensynami, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania bakteriobój-czego działania defensyn. Stafylokinaza z zablokowanym miejscem wiążącym plazminogen zachowuje zdolność do neutralizacji działania defensyn, ale jedna mutacja punktowa w stafylokinazie – zmiana lizyny na alaninę w pozycji 74, skutkuje obniżeniem oporności o 50% [35]. streptococcus grupy A wykazuje podobny mecha-nizm oporności. Patogen ten wytwarza wielofunkcyjne białko M, które pokrywa powierzchnię komórki oraz jest jednym z istotnych czynników wirulencji. Białko M w obecności czynników przeciwbakteryjnych aktywuje sekrecję białka SIC (complement inhibitor protein) na zewnątrz komórki, które ma zdolność do wiązania się z α-defensynami i ich inaktywowania [18].

Kolejnym mechanizmem oporności na defensyny są pompy wyrzutowe (efflux pumps). h. influenzae wytwa-rza białka budujące pompę wyrzutową o aktywności zależnej od stężenia jonów K+, dzięki której możliwe jest aktywne usuwanie β-defensyn z komórki bakteryj-nej, przy równoczesnym pobieraniu jonów potasu do jej wnętrza [41].

Wiele innych patogenów również posiada pompy wyrzutowe, ale zapewniają one oporność na inne ro dzaje AMP, np. Neisseria gonorrhoeae posiada zależny od ener-gii system wyrzutowy MtrCDE, który warunkuje opor-ność na protegrynę-1 i ludzką katelicydynę LL-37 [65].

Patogeny mogą też modulować poziom ekspresji genów kodujących defensyny. shigella flexneri, Gram--ujemny patogen powodujący ciężkie zatrucia pokar-mowe wpływa na poziom ekspresji genów kodujących


AMP. W komórkach pobranych podczas biopsji odbyt-niczej pacjentów zarażonych tą bakterią stwierdzono bardzo niski poziom defensyny HBD-1 i katelidycyny LL-37. Sperandio i wsp. badali za pomocą techniki qRT--PCR (Quantitative reverse Transcription – Polymerase chain reaction) poziom ekspresji genów kilku AMP w dwóch różnych liniach komórkowych zainfekowa-nych dzikim i zmutowanym szczepem s. flexneri. Typ dziki modulował ekspresję genów kodujących HBD-3 i LL-37, natomiast mutant z inaktywowanym genem mxiE (gen kodujący czynnik transkrypcyjny MxiE), nie wpływał na ekspresję tych genów. Białka zależne od aktywatora MxiE są niezbędne dla procesu inwazji. Aktywator transkrypcji MxiE pośrednio wpływa na transkrypcję genów kodujących defensyny – zależne od niego cząsteczki efektorowe obniżają poziom eks-presji genów kodujących chemokiny, co prowadzi do zablokowania rekrutacji komórek dendrytycznych do zainfekowanego miejsca [67].

Mechanizmy oporności bakterii na defensyny kształ- towały się od milionów lat, dlatego istnieje tak wiele strategii wykorzystywanych przez różne gatunki bak-terii. Niektóre mikroorganizmy wykształciły kilka mechanizmów oporności, dzięki czemu są oporne na kilka rodzajów peptydów. Jednak gdy porównamy szyb-kość pojawiania się szczepów opornych na antybiotyki, które są powszechnie stosowane od niecałych 100 lat do szybkości pojawiania się szczepów opornych na defen-syny, które istnieją od milionów lat, możemy stwierdzić, że oporność bakterii na działanie tych peptydów kształ-tuje się bardzo powoli.

3. podsumowanie

Bardzo wiele organizmów, odległych ewolucyjnie, wytwarza defensyny, jednak ich rolę odkryto stosun ko- wo niedawno, około 30 lat temu. Od tamtego momentu rozpoczęto intensywne badania dotyczące ich struktury, mechanizmu działania, biosyntezy, regulacji ekspresji oraz czynników wpływających na ich aktywność.

Defensyny są peptydami o ogromnym potencjale, który może być wykorzystany w niedalekiej przyszłości w terapiach przeciwbakteryjnych, wykazują bowiem nie tylko bezpośrednie, niszczące działanie wobec drobno-ustrojów, ale również działają na komórki układu immu-nologicznego, stymulując lub hamując ich aktywność i kontrolując nabytą odpowiedź immunologiczną orga-nizmu na infekcje. Trwają badania kliniczne dotyczące wielu defensyn. W 2005 roku duńska firma biotech-nologiczna Novozymes ogłosiła sensacyjne odkrycie pierwszego peptydu przeciw bakteryjnego, nazwanego Plectasin, występującego u grzyba, Pseudoplectania nigrella i wykazującego aktywność wobec wieloopor-nych szczepów bakterii Gram-dodatnich, m.in. wobec

streptococcus pneumoniae. Wykazano, że związek ten stosowany w terapii zapalenia płuc spowodowanego s. pneumoniae jest równie skuteczny jak penicylina i wankomycyna, a oprócz tego nie jest toksyczny [www.drugdevelopment-technology.com]. Również syntetycz-nea defensyna, o sekwencji aminokwasowej identycz-nej jak defensyna wytwarzana naturalnie przez klesz-cze wykazuje wysoką aktywność antybakteryjną wobec bakterii Gram-dodatnich i może znaleźć zastosowanie terapeutyczne. Prowadzone są też liczne badania, czę-sto z wynikami pozytywnymi, dotyczące zastosowania defensyn w terapiach przeciwnowotworowych.

piśmiennictwo

1. Abachin E., Poyart C., Pellegrini E., Milohanic E., Fiedler F., Berche P., Trieu-Cuot P.: Formation of D-alanyl-lipoteichoic acid is required for adhesion and virulence of Listeria mono-cytogenes. Mol. Microbiol. 43, 1–14 (2002)

2. Aerts A.M., Francois I.E., Cammue B.P., Thevissen K.: The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins. cell. Mol. Life. sci. 65, 2069–2079 (2008)

3. Bensch K.W., Raida M., Magert H.J., Schulz-Knappe P., Forssmann W.G., hBD-1: a novel beta-defensin from human plasma. FEBs Lett. 368, 331–335 (1995)

4. Boniotto M., Crovella S. i wsp.: A study of host defence peptide beta-defensin 3 in primates. Biochem. J. 374, 707–714 (2003)

5. Brogden K.A.: Antimicrobial peptides: pore formers or meta-bolic inhibitors in bacteria? Nat. rev. Microbiol. 3, 238–250 (2005)

6. Brotz H., Bierbaum G., Leopold K., Reynolds P.E., Sahl H.G.: The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II. Antimicrob. Agents. chemother. 42, 154–160 (1998)

7. Bulet P., Stocklin R., Menin L.: Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. immunol. rev. 198, 169–184 (2004)

8. Caaveiro J.M., Molina A., Gonzalez-Manas J.M., Rodriguez--Palenzuela P., Garcia-Olmedo F., Goni F.M.: Differential effects of five types of antipathogenic plant peptides on model mem-branes. FEBs Lett. 410, 338–342 (1997)

9. Carratelli R.C., Mazzola N., Paolillo R., Sorrentino S., Rizzo A.: Toll-like receptor-4 (TLR4) mediates human beta-defensin-2 (HBD-2) induction in response to chlamydia pneumoniae in mononuclear cells. FEMs immunol. Med. Microbiol. 57, 116–124 (2009)

10. Chaly Y.V., Paleolog E.M., Kolesnikova T.S., Tikhonov II, Petratchenko E.V., Voitenok N.N.: Neutrophil alpha-defensin human neutrophil peptide modulates cytokine production in human monocytes and adhesion molecule expression in endo-thelial cells. Eur. cytokine Netw. 11, 257–266 (2000)

11. Colilla F.J., Rocher A., Mendez E.: Gamma-Purothionins: amino acid sequence of two polypeptides of a new family of thionins from wheat endosperm. FEBs Lett. 270, 191–194 (1990)

12. Crouch M.L., Becker L.A., Bang I.S., Tanabe H., Ouellette A.J., Fang F.C.: The alternative sigma factor sigma is required for resistance of salmonella enterica serovar Typhimurium to anti--microbial peptides. Mol. Microbiol. 56, 789–799 (2005)

13. Daher K. A., Lehrer R. I., Ganz T., Kronenberg M.: Isolation and characterization of human defensin cDNA clones. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 85, 7327–7331 (1988)


14. de Leeuw E., Li C., Zeng P., Diepeveen-de Buin M., Lu W.Y., Breukink E., Lu W.: Functional interaction of human neutrophil peptide-1 with the cell wall precursor lipid II. FEBs Lett. 584, 1543–1548 (2010)

15. Diamond G., Zasloff M., Eck H., Brasseur M., Maloy W.L., Bevins C.L.: Tracheal antimicrobial peptide, a cysteine-rich peptide from mammalian tracheal mucosa: peptide isolation and cloning of a cDNA. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 88, 3952–3956 (1991)

16. Duits L.A., Ravensbergen B., Rademaker M., Hiemstra P.S., Nibbering P.H.: Expression of beta-defensin 1 and 2 mRNA by human monocytes, macrophages and dendritic cells. immuno-logy, 106, 517–525 (2002)

17. Ericksen B., Wu Z., Lu W., Lehrer R.I.: Antibacterial activity and specificity of the six human {alpha}-defensins. Antimicrob. Agents. chemother. 49, 269–275 (2005)

18. Frick I.M., Akesson P., Rasmussen M., Schmidtchen A., Bjorck L.: SIC, a secreted protein of streptococcus pyogenes that inactivates antibacterial peptides. J. Biol. chem. 278, 16561–16566 (2003)

19. Fujii G., Selsted M.E., Eisenberg D.: Defensins promote fusion and lysis of negatively charged membranes. Protein. sci. 2, 1301–1312 (1993)

20. Gallo R.L., Nizet V.: Endogenous production of antimicrobial peptides in innate immunity and human disease. curr. Allergy Asthma rep. 3, 402–409 (2003)

21. Ganz T.: Defensins: antimicrobial peptides of vertebrates. c. r. Biol. 327, 539–549 (2004)

22. Gao L-Y., Laval F., Lawson E.H., Groger R.K., Woodruff A., Morisaki J.H., Cox J.S., Daffe M., Brown E.J.: Requirement for kasB in Mycobacterium mycolic acid biosynthesis, cell wall impermeability and intracellular survival: implications for therapy. Mol. Microbiol. 49, 1547–1563 (2003)

23. Garcia A.E., Osapay G., Tran P.A., Yuan J., Selsted M.E.: Isola-tion, synthesis, and antimicrobial activities of naturally occur-ring theta-defensin isoforms from baboon leukocytes. infect. immun. 76, 5883–5891 (2008)

24. Gorter A.D., Hiemstra P.S., de Bentzmann S., van Wetering S., Dankert J., van Alphen L.: Stimulation of bacterial adherence by neutrophil defensins varies among bacterial species but not among host cell types. FEMs immunol. Med. Microbiol. 28, 105–111 (2000)

25. Groisman E.A., Parra-Lopez C., Salcedo M., Lipps C.J., Heffron F., Resistance to host antimicrobial peptides is neces-sary for salmonella virulence. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 89, 11939–11943 (1992)

26. Guani-Guerra E., Santos-Mendoza T., Lugo-Reyes S.O., Teran L.M.: Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease. clin. immu-nol. 135, 1–11 (2010)

27. Guo L., Lim K.B., Gunn J.S., Bainbridge B., Darveau R.P., Hackett M., Miller S.I.: Regulation of lipid A modifications by salmonella typhimurium virulence genes phoP-phoQ. science, 276, 250–253 (1997)

28. Han S.H., Kim Y.E., Park J.A., Park J.B., Kim Y.S., Lee Y., Choi I.G., Kwon H.J.: Expression of human beta-defensin-2 gene induced by CpG-DNA in human B cells. Biochem. Biophys. res. commun. 389, 443–448 (2009)

29. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D.: Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of mem-brane permeabilization. science, 251, 1481–1485 (1991)

30. Hoover D.M., Chertov O., Lubkowski J.: The structure of human beta-defensin-1: new insights into structural properties of beta--defensins. J. Biol. chem. 276, 39021–39026 (2001)

31. Hughes A.L.: Evolutionary diversification of the mammalian defensins. cell. Mol. Life. sci. 56, 94–103 (1999)

32. Ichinose M., Sawada M.: Enhancement of phagocytosis by calcitonin gene-related peptide (CGRP) in cultured mouse peritoneal macrophages. Peptides, 17, 1405–1414 (1996)

33. Ishikawa T., Kanda N., Hau C.S., Tada Y., Watanabe S.: Hista-mine induces human beta-defensin-3 production in human keratinocytes. J. Dermatol. sci. 56, 121–127 (2009)

34. Jenssen H., Hamill P., Hancock R.E.: Peptide antimicrobial agents. clin. Microbiol. rev. 19, 491–511 (2006)

35. Jin T., Bokarewa M., Foster T., Mitchell J., Higgins J., Tarkow-ski A.: staphylococcus aureus resists human defensins by pro-duction of staphylokinase, a novel bacterial evasion mecha-nism. J. immunol. 172, 1169–1176 (2004)

36. Joly S., Maze C., McCray P.B., Jr., Guthmiller J.M.: Human beta-defensins 2 and 3 demonstrate strain-selective activity against oral microorganisms. J. clin. Microbiol. 42, 1024–1029 (2004)

37. Kagan B.L., Selsted M.E., Ganz T., Lehrer R.I.: Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 87, 210–214 (1990)

38. Kawsar H.I., Ghosh S.K., Hirsch S.A., Koon H.B., Weinberg A., Jin G.: Expression of human beta-defensin-2 in intratumoral vascular endothelium and in endothelial cells induced by trans-forming growth factor beta. Peptides. 31, 195–201 (2010)

39. Lopez-Solanilla E., Gonzalez-Zorn B., Novella S., Vazquez--Boland J.A., Rodriguez-Palenzuela P.: Susceptibility of Listeria monocytogenes to antimicrobial peptides. FEMs Microbiol. Lett. 226, 101–105 (2003)

40. Mader J.S., Hoskin D.W.: Cationic antimicrobial peptides as novel cytotoxic agents for cancer treatment. Expert. opin. investig. Drugs. 15, 933–946 (2006)

41. Mason K.M., Munson R.S., Jr., Bakaletz L.O.: A mutation in the sap operon attenuates survival of nontypeable haemophilus influenzae in a chinchilla model of otitis media. infect. immun. 73, 599–608 (2005)

42. McCoy A.J., Liu H., Falla T.J., Gunn J.S.: Identification of Pro-teus mirabilis mutants with increased sensitivity to antimicro-bial peptides. Antimicrob. Agents. chemother. 45, 2030–2037 (2001)

43. Melo M.N., Ferre R., Castanho M.A.: Antimicrobial peptides: linking partition, activity and high membrane-bound concen-trations. Nat. rev. Microbiol. 7, 245–250 (2009)

44. Michaelson D., Rayner J., Couto M., Ganz T.: Cationic defen-sins arise from charge-neutralized propeptides: a mechanism for avoiding leukocyte autocytotoxicity? J. Leukoc. Biol. 51, 634–639 (1992)

45. Miyasaki K.T., Lehrer R.I.: Beta-sheet antibiotic peptides as potential dental therapeutics. int. J. Antimicrob. Agents. 9, 269–280 (1998)

46. Moranta D., Regueiro V., March C., Llobet E., Margareto J., Larrate E., Garmendia J., Bengoechea J.A.: Klebsiella pneu-moniae capsule polysaccharide impedes the expression of beta-defensins by airway epithelial cells. infect. immun. 78, 1135–1146 (2010)

47. Nguyen T.X., Cole A.M., Lehrer R.I.: Evolution of primate theta-defensins: a serpentine path to a sweet tooth. Peptides, 24, 1647–1654 (2003)

48. Niyonsaba F., Someya A., Hirata M., Ogawa H., Nagaoka I.: Evaluation of the effects of peptide antibiotics human beta--defensins-1/-2 and LL-37 on histamine release and prosta-glandin D(2) production from mast cells. Eur. J. immunol. 31, 1066–1075 (2001)

49. Oppenheim J.J., Biragyn A., Kwak L.W., Yang D.: Roles of anti-microbial peptides such as defensins in innate and adaptive immunity. Ann. rheum. Dis. 62, 17–21 (2003)


50. Otvos L., Jr., OI., Rogers M.E., Consolvo P.J., Condie B.A., Lovas S., Bulet P., Blaszczyk-Thurin M.: Interaction between heat shock proteins and antimicrobial peptides. Biochemistry, 39, 14150–14159 (2000)

51. Pardi A., Zhang X.L., Selsted M.E., Skalicky J.J., Yip P.F.: NMR studies of defensin antimicrobial peptides. 2. Three-dimensio-nal structures of rabbit NP-2 and human HNP-1. Biochemistry, 31, 11357–11364 (1992)

52. Pazgier M., Hoover D.M., Yang D., Lu W., Lubkowski J.: Human beta-defensins. cell. Mol. Life. sci. 63, 1294–1313 (2006)

53. Peschel A., van Strijp J.A. i wsp.: staphylococcus aureus resi-stance to human defensins and evasion of neutrophil killing via the novel virulence factor MprF is based on modification of membrane lipids with l-lysine. J. Exp. Med. 193, 1067–1076 (2001)

54. Peschel A., Otto M., Jack R.W., Kalbacher H., Jung G., Gotz F.: Inactivation of the dlt operon in staphylococcus aureus confers sensitivity to defensins, protegrins, and other antimicrobial peptides. J. Biol. chem. 274, 8405–8410 (1999)

55. Powers J.P., Hancock R.E.: The relationship between peptide structure and antibacterial activity. Peptides, 24, 1681–1691 (2003)

56. Poyart C., Pellegrini E., Marceau M., Baptista M., Jaubert F., Lamy M.C., Trieu-Cuot P.: Attenuated virulence of streptococ-cus agalactiae deficient in D-alanyl-lipoteichoic acid is due to an increased susceptibility to defensins and phagocytic cells. Mol. Microbiol. 49, 1615–1625 (2003)

57. Robey M., O’Connell W., Cianciotto N.P.: Identification of Legionella pneumophila rcp, a pagP-like gene that confers resi-stance to cationic antimicrobial peptides and promotes intra-cellular infection. infect. immun. 69, 4276–4286 (2001)

58. Rodriguez de la Vega R.C., Possani L.D.: On the evolution of invertebrate defensins. Trends. Genet. 21, 330–332 (2005)

59. Salzman N.H., Bos N.A. i wsp.: Enteric defensins are essential regulators of intestinal microbial ecology. Nat. immunol. 11, 76–83 (2009)

60. Sato H., Feix J.B.: Peptide-membrane interactions and mecha-nisms of membrane destruction by amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biochim. Biophys. Acta, 1758, 1245–1256 (2006)

61. Schutte B.C., Mitros J.P., Bartlett J.A., Walters J.D., Jia H.P., Welsh M.J., Casavant T.L., McCray P.B., Jr.: Discovery of five conserved beta-defensin gene clusters using a computational search strategy. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 99, 2129–2133 (2002)

62. Schwaab M., Gurr A., Hansen S., Minovi A.M., Thomas J.P., Sudhoff H., Dazert S.: Human beta-Defensins in different states of diseases of the tonsilla palatina. Eur. Arch. otorhinolaryngol. 267, 821–830 (2010)

63. Seebah S., Suresh A., Zhuo S., Choong Y. H., Chua H., Chuon D., Beuerman R., Verma C.: Defensins knowledgebase: a manually curated database and information source focused on the defensins family of antimicrobial peptides. Nucleic. Acids. res. 35, D265–268 (2007)

64. Semple F., Webb S., Li H.N., Patel H.B., Perretti M., Jackson I.J., Gray M., Davidson D.J., Dorin J.R.: Human beta-defensin 3 has immunosuppressive activity in vitro and in vivo. Eur. J. immu-nol. 40, 1073–1078 (2010)

65. Shafer W.M., Qu X., Waring A.J., Lehrer R.I.: Modulation of Neisseria gonorrhoeae susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the resistance/nodulation/division efflux pump family. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 95, 1829–1833 (1998)

66. Sorensen O.E., Cowland J.B., Theilgaard-Monch K., Liu L., Ganz T., Borregaard N.: Wound healing and expression of

antimicrobial peptides/polypeptides in human keratinocytes, a consequence of common growth factors. J. immunol. 170, 5583–5589 (2003)

67. Sperandio B., Regnault B., Guo J., Zhang Z., Stanley S.L., Jr., Sansonetti P.J., Pedron T.: Virulent shigella flexneri subverts the host innate immune response through manipulation of antimicrobial peptide gene expression. J. Exp. Med. 205, 1121–1132 (2008)

68. Starner T.D., Swords W.E., Apicella M.A., McCray P.B., Jr.: Susceptibility of nontypeable haemophilus influenzae to human beta-defensins is influenced by lipooligosaccharide acylation. infect. immun. 70, 5287–5289 (2002)

69. Stegemann C., Tsvetkova E.V., Aleshina G.M., Lehrer R.I., Kokryakov V.N., Hoffmann R.: De novo sequencing of two new cyclic theta-defensins from baboon (Papio hamadryas) leuko-cytes by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spec-trometry. rapid. commun. Mass. spectrom. 24, 599–604 (2010)

70. Tanabe H., Ayabe T., Bainbridge B., Guina T., Ernst R.K., Darveau R.P., Miller S.I., Ouellette A.J.: Mouse paneth cell secretory responses to cell surface glycolipids of virulent and attenuated pathogenic bacteria. infect. immun. 73, 2312–2320 (2005)

71. Tang Y.Q., Yuan J., Osapay G., Osapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., Selsted M.E.: A cyclic antimicrobial peptide pro-duced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins. science, 286, 498–502 (1999)

72. Thomma B.P., Cammue B.P., Thevissen K.: Plant defensins. Planta, 216, 193–202 (2002)

73. Tran D., Tran P., Roberts K., Osapay G., Schaal J., Ouellette A., Selsted M.E.: Microbicidal properties and cytocidal selectivity of rhesus macaque theta defensins. Antimicrob. Agents. chemo-ther. 52, 944–953 (2008)

74. Valore E.V., Ganz T.: Laboratory production of antimicro-bial peptides in native conformation. Methods Mol. Biol. 78, 115–131 (1997)

75. Valore E.V., Ganz T.: Posttranslational processing of defensins in immature human myeloid cells. Blood, 79, 1538–1544 (1992)

76. van den Berg R.H., Faber-Krol M.C., van Wetering S., Hiem-stra P. S., Daha M.R.: Inhibition of activation of the classical pathway of complement by human neutrophil defensins. Blood, 92, 3898–3903 (1998)

77. Van Wetering S., Mannesse-Lazeroms S.P., Dijkman J.H., Hiemstra P.S.: Effect of neutrophil serine proteinases and defen-sins on lung epithelial cells: modulation of cytotoxicity and IL-8 production. J. Leukoc. Biol. 62, 217–226 (1997)

78. Visser L.G., Hiemstra P.S., van den Barselaar M.T., Ballieux P.A., van Furth R.: Role of YadA in resistance to killing of Yersinia enterocolitica by antimicrobial polypeptides of human gra-nulocytes. infect. immun. 64, 1653–1658 (1996)

79. Weinberg A., Krisanaprakornkit S., Dale B.A.: Epithelial anti-microbial peptides: review and significance for oral applica-tions. crit. rev. oral. Biol. Med. 9, 399–414 (1998)

80. Wiechula B.E., Tustanowski J.P., Martirosian G.: Antimicrobial peptides. Wiad. Lek. 59, 542–547 (2006)

81. Wimley W.C., Selsted M.E., White S.H.: Interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of multimeric pores. Protein. sci. 3, 1362–1373 (1994)

82. Xie C., Prahl A., Ericksen B., Wu Z., Zeng P., Li X., Lu W.Y., Lubkowski J., Lu W.: Reconstruction of the conserved beta--bulge in mammalian defensins using D-amino acids. J. Biol. chem. 280, 32921–32929 (2005)

83. Yang D., Biragyn A., Kwak L.W., Oppenheim J.J.: Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends immunol. 23, 291–296 (2002)


1. Wiadomości ogólne i klasyfikacja wirusa odry

Odra jest wysoce zaraźliwą chorobą wysypkową wieku dziecięcego. Pomimo opracowania skutecznej szcze-pionki nadal jest jedną z głównych przyczyn zachorowań i zgonów u dzieci w krajach rozwijających się. W 1954 r. A n d e r s i P e e b l e s dokonali pomyślnej izolacji wirusa będącego przyczyną tych zachorowań [14]. Wirus pochodził z materiału pobranego od 11-letniego chłopca z USA, Davida Edmonstona, od nazwiska którego pochodzi nazwa prototypowego szczepu wirusa odry.

Wirus odry (MeV) należy do rodziny Paramyxoviri-dae, podrodziny Paramyxovirinae, rodzaju Morbillivirus. W odróżnieniu od innych paramyksowirusów MeV nie posiada neuraminidazy [42]. Filogenetycznie MeV jest najbliżej spokrewniony z wirusem księgosuszu bydła (rinderpest Virus – RPV), z którego prawdopodobnie wyewoluował w wyniku bliskich kontaktów człowieka z udomowionym bydłem [24].

Wirus odry (MeV) jest antygenowo stabilny i wszyst-kie jego szczepy należą do jednego serotypu. Różnico-wanie odbywa się na podstawie cech genetycznych.

Do tej pory wyróżniono 8 grup (A-H) obejmujących 23 genotypy [78]. Analiza sekwencyjna końca COOH genu nukleoproteiny, stanowi podstawę do zakwalifi-kowania izolatu klinicznego do jednego z nich. Nie-które z genotypów (B1, E, F, G1, D1) określa się jako nieaktywne, co oznacza, że szczepy reprezentatywne dla nich nie były izolowane od co najmniej 15 lat. Wszyst-kie szczepy szczepionkowe MeV należą do genotypu A. W Europie krążą szczepy należące do genotypów D4, D5 i D6 [78]. Nie stwierdzono istnienia biologicznych różnic pomiędzy wirusami różnych genotypów – ani w klinicznym przebiegu choroby, ani rodzaju powi- kłań. Różnicowania genetyczne MeV ma znaczenie dla śledzenia jego transmisji i stanowi ważne narzędzie epidemiologii molekularnej [78].

2. przebieg kliniczny odry

Do zakażenia wirusem odry dochodzi na drodze kro- pelkowej. Okres inkubacji, od momentu zakażenia do wystąpienia typowych objawów trwa zwykle 9–14 dni.

* Autor korespondencyjny: Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny; 00-791 Warszawa, ul. Chocimska 24; tel. (22) 542 12 30; e-mail: [email protected]

Wirus odry – rEakcjE odpornoŚcioWEzWiązanE z naturalnyM zakażEniEM

oraz odpoWiEdzią poszczEpiEnną

agnieszka częścik*1, agnieszka trzcińska1, joanna siennicka1

1 Zakład Wirusologii, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny ul. Chocimska, 24 00-791 Warszawa


1. Wiadomości ogólne i klasyfikacja wirusa odry. 2. Przebieg kliniczny odry. 3. Budowa wirusa odry i funkcje białek. 4. Białka receptorowe i mechanizm zakażenia. 5. Odpowiedź immunologiczna w przebiegu naturalnego zakażenia wirusem odry. 5.1. Odpowiedź wrodzona. 5.2. Odpowiedź humoralna. 5.3. Odpowiedź komórkowa. 5.4. Immunosupresja związana z zakażeniem MeV. 5.5. Pamięć immunologiczna. 6. Problemy związane ze szczepieniem przeciwko odrze. 6.1. Szczepionka przeciwko odrze. 6.2. Odpowiedź indukowana w wyniku szczepienia. 7. Podsumowanie

Measles Virus - immune response to natural infection and vaccination

Abstract: Despite the development of an effective vaccine, measles, a highly contagious disease, is still an important cause of morbidity and mortality, especially in developing countries. This paper presents the characteristics of the immune response in the course of natural measles virus infection and the response induced by vaccination. The elements of innate, humoral and cellular response, as well as immunosuppression due to infection with MeV and mechanisms for the acquisition of immune memory are described. Particular attention is paid to the determinants of postvaccination response rates. We focus also on the problem of passive transfer of antibodies during pregnancy and the consequences of inadequate immunization of infants born to mothers vaccinated against measles

1. General information and classification of measles virus. 2. The clinical course of measles. 3. Structure and function of measles virus proteins. 4. Receptor proteins and the mechanism of infection. 5. The immune response in the course of natural infection with measles. 5.1. Innate Response. 5.2. Humoral response. 5.3. Cellular response. 5.4. Immunosuppression due to infection MeV. 5.5. Immunological memory. 6. Problems associated with vaccination against measles. 6.1. Measles vaccine. 6.2. Postvaccination response. 7. Summary

słowa kluczowe: Wirus odry, odporność, odpowiedź poszczepiennakey words: Measles virus, immunity, postvaccination response

236 AGNIESZKA CZĘŚCIK, AGNIESZKA TRZCIŃSKA, JOANNA SIENNICKA

Pierwotnie wirus zakaża komórki układu oddechowego, po czym 5–7 dnia od zakażenia dochodzi do wiremii. W okresie inkubacji mogą wystąpić objawy prodro-malne takie jak kaszel, katar, gorączka. W wyniku wire-mii dochodzi do rozprzestrzenienia się wirusa w orga-nizmie i wystąpienia wysypki. W początkowej fazie choroby wysypka ma charakter gruboplamisty. Wykwity skórne są różowe, zlewające się, zlokalizowane na twa-rzy i czole, które z czasem obejmują całą powierzchnię ciała. Po kilku dniach wysypka zmienia kolor na cegla-sty i łuszczy się. [20, 24]. Objawem patognomonicznym odry jest pojawienie się na błonie śluzowej policzków na wysokości dolnych zębów trzonowych białawych prze-barwień tzw. plamek Koplika. Zakaźność chorego poja-wia się na około dwa dni przed wystąpieniem objawów i utrzymuje do czwartego dnia po wystąpieniu wysypki. Powikłania w przebiegu odry występują rzadko i dotyczą w szczególności osób z niedoborami odporności. Do najczęstszych powikłań należą zapalenia płuc będące wynikiem nadkażeń bakteryjnych oraz zapalenie mózgu (1 na 1 000 przypadków zachorowań), a także zapale-nie mięśnia sercowego i ucha środkowego. Najcięższym a jednocześnie najrzadszym (1 na 1 000 000 przypadków zachorowań) powikłaniem jest podostre stwardniające zapalenie mózgu (SSPE), które może wystąpić nawet po 15 latach od momentu zakażenia [27, 59, 60].

3. budowa wirusa odry i funkcje białek

Genom wirusa odry zbudowany jest z jednonicio-wego, niesegmentowanego RNA o ujemnej polarności. Genom o długości od 15 do 19 kpz zawiera 6 ułożo-nych liniowo genów [42]. Organizację genomu MeV przedstawiono na rys. 1. Wielkość pleomorficznej cząs-

matrycy genomowego RNA. Jako pierwsze jest transkry-bowane białko N, które razem z białkami L i P tworzy kompleks replikacyjny. Pomimo tego, że białko P, będące kofaktorem polimerazy, jest wydajnie syntetyzowane w zakażonej komórce, to jedynie niewielka jego ilość wchodzi w skład budowy wirionu. Gen białka P zawiera informacje kodujące co najmniej dwa inne białka – C i V. Jakkolwiek ani białko C ani V nie są niezbędne do replikacji wirusa, to stwierdzono, że oba, poprzez inter-akcje z białkami komórkowymi mają wpływ na regula-cję transkrypcji i replikacji. Składniki osłonki wirionu, hemaglutynina (H) i białko fuzyjne (F), są syntetyzo-wane na rybosomach, transportowane poprzez reti-kulum endoplazmatyczne, glikozylowane w aparacie Golgiego i stają się integralnymi białkami błony plazma-tycznej. Białko M jest syntetyzowane na rybosomach cytoplazmatycznych i transportowane do błony komór-kowej [30]. W dalszym etapie replikacji, w wyniku akumulacji nowozsyntetyzowanych białek wirusowych następuje replikacja genomowego RNA. Najpierw zachodzi synteza komplementarnego RNA o dodatniej polarności, który następnie stanowi matrycę dla geno-mowego RNA o ujemnej polarności. Białko rdzenia (M) poprzez interakcję z glikoproteinami powierzchniowymi ma wpływ na proces zlewania się zakażonych komórek, oraz uwalniania dojrzałych wirionów. Białko fuzyjne (F) odpowiada za fuzję wirusa z błoną komórki gospodarza, penetrację i hemolizę. Pośrednicząc w zlewaniu się zaka-żonych komórek i tworzeniu syncytiów, odgrywa istotną rolę w rozprzestrzenianiu się zakażenia. Główną funk-cją hemaglutyniny (H) jest udział w procesie adsorpcji w wyniku interakcji z receptorami komórkowymi [42].

4. białka receptorowe i mechanizm zakażenia

Zidentyfikowano co najmniej dwa białka komórkowe będące receptorami dla wirusa odry: CD46 i CD150. CD46 wykazuje ekspresję na wszystkich komórkach jądrzastych człowieka, szczególnie licznie występując

Rys. 2. Budowa cząsteczki wirusa odry

Rys. 1. Organizacja genomu wirusa odry

teczki wirusa odry określono na 100–300 nm. Wirion zbudowany jest z nukleokapsydu, na który składa się kwas nukleinowy wirusa z owiniętym spiralnie wokół niego białkiem – nukloproteiną (N). Z nukleokapsy-dem związane są dwa inne białka – fosfoproteina (P) i duże białko (L). Nukleokapsyd otoczony jest leżą-cym bezpośrednio pod osłonką białkiem rdzenia – matrix (M). W osłonce umiejscowione są dwie gliko-proteiny powierzchniowe: hemaglutynina (H) i białko fuzyjne (F). Schemat budowy cząsteczki wirusa odry przedstawiono na rys. 2.

W wyniku fuzji osłonki wirusa z błoną komórkową, nukleokapsyd wraz z polimerazą RNA jest uwalniany do cytoplazmy, gdzie ma miejsce cykl replikacyjny wirusa. Pierwszym etapem replikacji jest synteza mRNA na

WIRUS ODRY – REAKCJE ODPORNOŚCIOWE ZWIĄZANE Z NATURALNYM ZAKAŻENIEM ORAZ ODPOWIEDZIĄ POSZCZEPIENNĄ 237

w części wierzchołkowej komórek nabłonkowych. Trzy z pięciu domen tego białka wykazują zdolność wiązania komponenty C3b lub C4b układu dopełniacza, nato-miast dwie, najbardziej zewnętrznie położone, wyka-zują powinowactwo do hemaglutyniny wirusa odry. Białko CD150/SLAM (signaling Lymphocyte Activation Molecule) jest obecne na powierzchni komórek immu-nologicznie czynnych. Hemaglutynina wirusa odry oddziaływuje z jedną z dwóch wysoce glikozylowanych domen molekuły SLAM. Badania nad różnymi recep-torami wykazały, że podczas gdy większość szczepów szczepionkowych MeV efektywnie wykorzystuje CD46 jako białko receptorowe, to szczepy dzikie z reguły nie czynią tego [16, 99]. Późniejsze badania dowiodły, że większość hemaglutynin może wiązać zarówno CD46 jak i CD150, jakkolwiek powinowactwo H w stosunku do CD150 jest wyższe [46].

Związanie hemaglutyniny (H) z receptorem komór-kowym indukuje zmiany w budowie konformacyjnej zarówno białka H jak i białka fuzyjnego F. Hydrofobowy peptyd fuzyjny znajdujący się wewnątrz F ulega ekspo-zycji i włączany jest do błony komórkowej. Wynikiem tego procesu jest zmniejszenie dystansu między osłonką wirusa i błoną komórkową, co umożliwia ich fuzję [100]. Zakażenie MeV skutkuje również fuzją błon sąsiadują-cych komórek, w wyniku czego powstają wielojądrzaste komórki olbrzymie, syncytia, dające charakterystyczny dla wirusa odry obraz efektu cytopatycznego (rys. 3).

5. odpowiedź immunologiczna w przebiegu naturalnego zakażenia wirusem odry

Odra u osób immunokompetentnych w większości przypadków kończy się eliminacją wirusa z organizmu. Eliminacja (clearance) jest możliwa dzięki efektyw-nemu działaniu wielu elementów odpowiedzi immu-nologicznej. Całkowita eliminacja patogenu jest jednak procesem długotrwałym, trwającym kilka tygodni. Świadczy o tym chociażby fakt, że o ile zakaźne cząstki wirusa udaje się wyizolować jedynie w okresie trwania wysypki, to wirusowe RNA jest wykrywane nawet po kilku tygodniach od jej ustąpienia [89]. Za sku-teczność reakcji odpornościowej odpowiedzialne są zarówno jej elementy swoiście rozpoznające patogen, jak i te związane z odpowiedzią nieswoistą. Znanym fenomenem zakażenia MeV jest związana z nim im mu-nosupresja.

5.1. odpowiedź wrodzona

Pierwszymi elementami reakcji odpornościowej aktywowanymi w efekcie zakażenia MeV są te, związane z odpowiedzią nieswoistą. Jak we wszystkich infekcjach rozprzestrzeniających się drogą kropelkową, działanie różnego rodzaju barier zapewne ma znaczenie, jakkol-wiek w przypadku MeV pierwszoplanową rolę przypi-suje się takim czynnikom jak interferony (IFN), układ

Rys. 3. Efekt cytopatyczny wirusa odry (MeV), szczep Edmonston. A) komórki VeroSlam niezakażone,B) komórki VeroSlam po 24 h od zakażenia MeV, C) komórki VeroSlam po 354 h od zakażenia MeV,

D) komórki VeroSlam po 48 h od zakażenia MeV (zdjęcia autorów)


dopełniacza, komórki NK oraz reakcje związane z pobu-dzeniem receptorów Toll-like.

Zakażenie wirusem odry, podobnie jak inne zaka-żenia wirusowe, skutkuje produkcją interferonów. W badaniach in vitro stwierdzono, że dzikie szczepy MeV słabiej stymulują syntezę IFN niż szczepy szcze-pionkowe [57]. in vivo obserwowano znaczny wzrost poziomu IFN w surowicy między 8 a 11 dniem po podaniu szczepionki [71], przy czym nie obserwowano takiego wzrostu w przebiegu naturalnego zakażenia [82]. Kolejnym ważnym elementem wczesnej odpowie-dzi immunologicznej są komórki NK. Opisywano jed-nak, że w przypadku zakażenia wirusem odry ich udział w reakcjach obronnych może być mniejszy niż ma to miejsce w innych zakażeniach wirusowych [23]. Należy jednak zauważyć, że badania in vivo dotyczące udziału IFN i komórek NK były przeprowadzane na próbkach pozyskanych od osób chorych na odrę w okresie trwa-nia wysypki. W związku z tym nie można wykluczyć dużego znaczenia tych elementów reakcji odpornościo-wej we wcześniejszych fazach zakażenia [24]. Ważną rolę w reakcji przeciwzakaźnej pełni układ dopełniacza. Stwierdzono, że podczas zakażenia MeV dochodzi do jego aktywacji drogą alternatywną, to jest niezależną od przeciwciał [84], a w procesie tym bierze udział białko fuzyjne F wirusa [10]. Z kolei reakcja związana ze sty-mulacją receptora/rów Toll-like (TLR) może prowadzić do jednego z ciekawszych zjawisk związanych z zakaże-niem MeV, a mianowicie immunosupresją [28]. Spośród cytokin indukowanych w wyniku pobudzenia TLRs, IL-12 jest kluczową cytokiną związaną z przesunięciem odpowiedzi w kierunku fenotypu Th1, natomiast IL-10 pełni funkcje supresyjne i jest jedną z głównych cyto-kin odpowiedzi typu Th2. Stwierdzono, że w trakcie odry przeważa odpowiedź typu Th2, wyrażona poprzez wydłużoną obecność zwiększonego poziomu IL-10 w surowicach osób chorych na odrę, trwającego nawet przez kilkanaście tygodni po ustąpieniu wysypki [51]. Nie jest wykluczone, że do zwiększonej produkcji IL-10 dochodzi na skutek pobudzenia TLR4 [26].

5.2. odpowiedź humoralna

Wirusowo swoiste przeciwciała obecne są na wykry-walnym poziomie w momencie pojawienia się wysypki. Wraz z rozwojem choroby ich poziom znacznie wzrasta. Po 72 godzinach od pojawienia się wysypki u 77% cho-rych wykrywa się anty-MeV IgM. Natomiast w 11 dniu choroby 100% pacjentów wykazuje ich obecność. Pod-wyższony poziom przeciwciał klasy IgM utrzymuje się przez około 3 tygodnie [24]. Anty-MeV IgG wykrywane są w stosunku do przeciwciał klasy IgM nieco później (rys. 4). Szczyt ich produkcji przypada na 3–4 tydzień trwania choroby i po przebyciu naturalnego zakażenia obecne są w surowicach ozdrowieńców do końca życia.

Wiadomo, że przechorowanie odry i nabyta w jej trakcie odporność daje trwałą ochronę. Świadczą o tym obser-wacje poczynione w trakcie epidemii mającej miejsce na Wyspach Owczych w 1846 r. Na odrę zachorowało wtedy blisko 100% izolowanej od reszty świata społecz-ności, wśród której nie notowano epidemii od 65 lat. Nie zachorowały jedynie osoby w wieku powyżej 65 lat, odporne na odrę w wyniku jej przechorowania w trakcie poprzedniej epidemii [59].

Wszystkie białka wirusowe wykazują właściwości antygenowe, jednak większość anty-MeV IgG skiero - wana jest przeciwko nukleoproteinie (N). Silne właści - wości immunogenne wykazują również białka powierzchniowe wirusa: hemaglutynina (H) i białko fuzyjne (F), natomiast niewielkie – białko rdzenia (M). Stwierdzono przy tym, że odpowiedź ze strony IgG i IgA jest wyższa dla białka fuzyjnego niż dla hemaglutyniny [13]. Właści-wości neutralizujące zakaźność cząstek wirusa posiadają przeciwciała dla H i w mniejszym stopniu dla F [45], a poziom przeciwciał (IgM, IgG i IgA) swoistych dla H i F koreluje z poziomem dla nukleoproteiny [13].

Pomiaru poziomu przeciwciał neutralizujących można dokonywać przy użyciu takich testów jak np. łysinkowy test neutralizacji (PRN, plaque reduction neutralizing assay), odczyn zahamowania hemaglu-tynacji (OZHA) bądź testy ELISA. Te ostatnie, pod warunkiem zastosowania jako frakcji antygenowej białek warunkujących syntezę przeciwciał neutrali-zujących, lub odpowiednie wystandaryzowanie testu w stosunku do standardu międzynarodowego [94]. Zgodnie z danymi WHO, za chroniący przed zakaże-niem poziom swoistych przeciwciał neutralizujących przyjmuje się 200 mIU/ml [94]. W najczęściej, używa-nych w rutynowej diagnostyce testach ELISA, frakcję antygenową stanowią białka otrzymane z supernatantu bądź lizatu uzyskanego w wyniku namnażania wirusa w hodowli komórkowej. W tak skonstruowanych testach pomiarowi podlegają przeciwciała swoiste dla wszyst-

Rys. 4. Dynamika odpowiedzi immunologicznej na zakażeniewirusem odry


kich, strukturalnych i niestrukturalnych białek wirusa. Dlatego też w celu ustalenia poziomu ochronnego prze-ciwciał należy dokonać standaryzacji testu [31].

Jakość odpowiedzi humoralnej związana jest z awid-nością przeciwciał oraz podklasami IgG. W ostrej fazie zakażenia wirusem odry dochodzi głównie do produkcji przeciwciał podklas IgG1 i IgG3. W późniejszym okre-sie obserwuje się stopniowy zanik IgG3, które stają się praktycznie niewykrywalne w fazie ozdrowieńczej, przy jednoczesnym wzroście IgG4 [13]. Zdolności neutra-lizujące przeciwciał związane są głównie ze swoistymi dla hemaglutyniny wirusa przeciwciałami IgG1 i IgG3 [57]. Wysoka awidność jest związana z lepszą ochroną. Stwierdzono, że przeciwciała anty-MeV osiągają wyso-kie powinowactwo w procesie dojrzewania zachodzą-cym w okresie 3–6 miesięcy od zakażenia [13]. Poza możliwością neutralizowania zakaźności cząstek wirusa, równie istotną cechą przeciwciał jest ich awidność.

5.3. odpowiedź komórkowa

Podczas gdy obecność wirusowo swoistych przeciw-ciał redukuje ryzyko zakażenia, to sprawne działanie odpowiedzi komórkowej jest niezbędne dla efektyw-nej eliminacji wirusa z zakażonego organizmu. O roli odpowiedzi komórkowej w przebiegu odry świadczą obserwacje dotyczące dzieci z agammaglobulinemią, które skutecznie eliminowały zakażenie i ustanawiały odporność. Natomiast u dzieci z anomaliami w zakresie funkcjonowania limfocytów T przebieg odry był cięż-szy i znacznie częściej związany z powikłaniami [6, 56]. Pojawienie się swoistej odpowiedzi odpornościowej zbiega się w czasie z wystąpieniem charakterystycz-nych dla odry objawów klinicznych: wysypki, gorączki, zapalenia spojówek [25] (rys. 4). W obrębie komórek nabłonkowych w zmianach skórnych stwierdzane są nacieki limfocytów T, zarówno CD4+ jak i CD8+ [70].

Izolacja zakaźnych cząstek wirusa z komórek krwi obwodowej (PBMC) praktycznie jest możliwa jedy-nie w okresie trwania wysypki. Po upływie kilku dni wiremia jest eliminowana, ale wirusowe RNA pozo-staje obecne na wykrywalnym poziomie (w PBMC, komórkach układu oddechowego, moczu) nawet kilka tygodni po wyzdrowieniu [76]. Pierwszoplanową rolę w procesie eliminacji wirusa przypisuje się limfocytom T. Stwierdzono, że zmniejszenie CD8+ u makaków skutkuje wydłużeniem okresu wiremii i obecnością wirusa na wyższym poziomie [70]. Po eliminacji zakaźnego wirusa liczba aktywowanych komórek CD8+ oraz poziom IFNγ gwałtownie się obniżają. Znacznie wolniej zani-kają wirusowo swoiste CD4+ [25, 34, 63]. We wczesnej fazie reakcji odpornościowej obserwuje się przewagę cytokin charakterystycznych dla profilu Th1 (IFNγ, IL-2). W późniejszym okresie następuje przesunięcie odpowiedzi w kierunku Th2, co wyraża się wzmożoną

syntezą takich cytokin jak, IL-4, IL10, IL-13. Domi-nację profilu Th2 obserwuje się przez kilka tygodni po eliminacji wirusa i ustąpieniu wysypki [23, 25, 51]. Przy braku sprawnie działającej odpowiedzi komór- kowej nie obserwuje się wysypki a zakażenie wirusem odry może prowadzić do śmiertelnych postaci zapalenia płuc lub mózgu [24].

5.4. immunosupresja związana z zakażeniem MeV

Odra była pierwszą chorobą, w trakcie której zaob-serwowano zwiększoną wrażliwość na inne zakażenia. Na związek odry z immunosupresją zwrócono uwagę w kontekście wykonywania prób tuberkulinowych. W czasie trwania epidemii odry zaobserwowano, że reakcje związane z testem skórnym są zahamowane i występują dopiero po kilku tygodniach od ustąpienia wysypki i całkowitym wyzdrowieniu [25]. Stwierdzono również, że przyczyną zgonów dzieci chorych na odrę było głównie zapalenie płuc na tle zakażeń powodo-wanych przez takie patogeny jak adenowirusy, herpe-swirusy i bakterie z rodzaju Klebsiella i Pseudomonas. U dzieci tych, częściej niż u innych, obserwowano lim-fopenię i ograniczenie warstwy korowej węzłów chłon-nych i śledziony [5]. Obecnie uważa się, że główną przyczyną zwiększonej wrażliwości na nadkażenia jest związana z MeV immunosupresja, której przejawami są limfopenia, zahamowanie proliferacji limfocytów obwo-dowych oraz wspomniane już przesunięcie profilu cyto-kin w kierunku Th2 [25, 79].

Limfopenia obserwowana w czasie trwania wysypki może być związana z interakcją między wirusem a jego receptorem – cząsteczką CD150/SLAM i aktywowaną w ten sposób apoptozą [64, 92]. Natomiast przyczyn obniżonej proliferacji limfocytów upatruje się w nie-dostatecznej produkcji IL-2. Dodanie rekombinowanej IL-2 do hodowli limfocytów pobranych od pacjentów chorych na odrę wywołuje spontaniczną proliferację i poprawia odpowiedź na działanie mitogenów [22]. Zahamowanie proliferacji limfocytów T wiązane jest również z bezpośrednim wpływem białek powierzch-niowych wirusa (H i F) na zatrzymanie cyklu komór-kowego w fazie G0/G1 [25, 80]. Duży wkład w poznanie zjawiska immunosupresji związanej z zakażeniem wiru-sem odry może wnieść opracowany model zwierzęcy – myszy SLAM knock-in, u których jedną z domen cząsteczki SLAM zastąpiono odpowiednią domeną cząsteczki ludzkiej. U zwierząt tych, krzyżowanych z myszami knock-out w zakresie genu dla receptora interferonu i zakażanych MeV, obserwowano obecność zjawisk analogicznych do tych występujących u ludzi: limfopenię, zahamowanie proliferacji limfocytów T i produkcji przeciwciał, zwiększoną syntezę IL-4 i IL-10 oraz supresję kontaktowej nadwrażliwości [36].


5.5. pamięć immunologiczna

Komórki pamięci generowane w wyniku zakaże-nia posiadają potencjał do wytworzenia silnej reakcji w przypadku ponownego zetknięcia się z patogenem. Populacja limfocytów T pamięci jest heterogenna a róż-nice dotyczą zarówno fenotypu, funkcji oraz dystrybu-cji w tkankach. Ponadto komórki te mogą podlegać różnorodnym zmianom w trakcie fazy spoczynkowej [90, 29]. W przebiegu odry, podobnie jak w innych ostrych zakażeniach wirusowych, generowane limfo-cyty T posiadają silne właściwości efektorowe, dzięki którym następuje eliminacja wirusa. Wytwarzane są również komórki pamięci mające zapewnić długotrwałą ochronę. Odmiennie wygląda to w przypadku zakażeń chronicznych, gdzie limfocyty T tracą swoje efektorowe właściwości przed wytworzeniem komórek pamięci [29]. Opracowanie nowych technik takich jak metoda ograniczonych rozcieńczeń (Limiting dilution analysis), ELISPOT (Enzyme-linked immunospot assay), technika wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin (intracellu-lar cytokine staining) czy metoda tetramerów (Peptide – Mhc class i tetramer staining) pozwoliło na pełniej-sze poznanie procesów związanych z generowaniem pamięci immunologicznej [93, 87]. N a n a n i wsp. [56] opisali metodę ilościowego oznaczania swoistych dla wirusa odry limfocytów T pamięci. W układzie autolo-gicznych komórek: APC (unieśmiertelnione limfocyty B i komórki dendrytyczne zakażone MeV) i PBMC ozna-czano populacje limfocytów CD4 i CD8 reagujące syn-tezą INFγ. Stwierdzono, że liczebności komórek pamięci dla MeV po naturalnym zakażeniu były porównywalne z tymi obserwowanymi dla wirusów wywołujących zakażenia chroniczne i latentne (EBV, CMV, HIV), co potwierdza istnienie długotrwałej pozakaźnej pamięci immunologicznej [56]. Stosując równie czułe metody do wykrywania rzadkich populacji komórek pamięci, O v s y a n n i k o v a i wsp. [65] oceniali zdolność osób w wieku 15–25 lat, seronegatywnych i seropozytywnych w wyniku szczepienia przeciwko odrze, do odpowie-dzi na MeV poprzez określenie proliferacji wirusowo--swoistych limfocytów T. Chociaż stwierdzono, że odsetek komórek CD4 jak i CD8 był znacząco niższy u osób seronegatywnych to potwierdzono obecność wirusowo-swoistej odpowiedzi komórkowej będącej wynikiem szczepienia u osób seronegatywnych [65]. Z drugiej strony stwierdzono, że liczba MeV-swoistych poszczepiennych CD4 ulega z czasem obniżeniu, przy niezmienionym poziomie przeciwciał i komórek CD8 [58]. Zaobserwowano również, że osoby po naturalnym zakażeniu wykazują wyższy odsetek MeV-swoistych CD4 w porównaniu z osobami szczepionymi [58]. Bio-rąc pod uwagę, że komórki CD4 pełnią kluczową rolę w procesie syntezy przeciwciał jak również generowa-nia i podtrzymywania funkcji cytotoksycznych limfo-

cytów CD8 to pozostaje zagadką jak przeciwciała i CD8 są utrzymywane po obniżeniu się liczby limfocytów pamięci CD4 [29].

6. problemy związane ze szczepieniem przeciwko odrze

Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) odra jest jedną z głównych przyczyn zgonów wśród dzieci na świecie. W wyniku wprowadzenia szczepień osiągnięto znaczący spadek liczby przypadków śmiertel-nych – o 77% na przestrzeni lat 1999–2008 [95]. Odno-towano również ograniczenie liczby zachorowań. I tak na przykład w Polsce, wprowadzenie szczepień ochron-nych skutkowało spadkiem zachorowań o 99,95% w okresie od 1974 do 2002 roku. Sukcesy osiągnięte w wyniku wprowadzenia szczepień leżały u podstaw wdrożenia przez WHO planu strategicznego, który zakładał eliminację zachorowań na odrę w państwach Regionu Europejskiego do roku 2010.

Pomimo spektakularnej poprawy sytuacji epidemio-logicznej, epidemie odry w Europie nadal mają miej-sce. W latach 2006–2007 odnotowano ponad 12 tysięcy zachorowań, z czego większość (85%) zgłoszeń pocho-dziła z pięciu państw: Rumunii, Niemiec, Wielkiej Bry-tanii, Szwajcarii i Włoch [54]. Znacząca większość tych przypadków powodowana była przez rodzime szczepy wirusa odry, natomiast źródłem ponad 60% pozosta-łych zakażeń były szczepy zawleczone z innych krajów europejskich [4].

Chociaż większość przypadków odry dotyczy osób nieszczepionych, to zachorowania odnotowywane są rów- nież wśród osób z udokumentowaną historią szczepień. W 2006 r. w Polsce na 120 zarejestrowanych przypad-ków, 44 dotyczyło osób szczepionych – 26 jedną dawką i 18 dwiema dawkami [9]. Analizując różnorodne przyczyny nieskuteczności szczepienia nie można jed-noznacznie wykluczyć wpływu zmienności wirusa, pomimo, że wirus odry uważany jest za antygenowo stabilny patogen. W latach 2005–2006 w Europie odnotowano krążenie szczepów wirusa należących do 9 różnych genotypów z czego wynika, że różnorodność szczepów izolowanych w Europie jest wysoka.

6.1. szczepionka przeciwko odrze

Opracowanie żywej atenuowanej szczepionki prze-ciwko odrze nastąpiło wkrótce po izolacji wirusa. W 1963 r. żywa, atenuowana szczepionka zawierająca szczep Edmonston B uzyskany przez E n d e r s a i wsp. [15] na drodze wielokrotnego pasażowania wirusa odry w różnych hodowlach komórkowych, została zareje-strowana w USA. Podanie tej szczepionki bardzo czę-sto jednak wiązało się z wystąpieniem niepożądanych odczynnów poszczepiennych – NOPS (wysypka i go-


rączka przekraczająca 39,5°C). Odsetek NOPS malał przy jednoczesnym podaniu małych dawek swoistej immunoglobuliny [37, 38]. W tym samym roku zareje-strowano w USA zabitą szczepionkę przeciwko odrze, którą opracowano na drodze inaktywacji wirusa odry formaliną [7]. Szczepionka inaktywowana miała jednak liczne wady. U 15% osób przy zetknięciu z dzikim szcze-pem dochodziło do zakażenia prowadzącego do rozwoju odry o atypowym przebiegu, który charakteryzował się wyższą i dłużej trwającą gorączką, nietypowymi zmia-nami skórnymi, zapaleniem płuc o ciężkim przebiegu w porównaniu z odrą u osób nieszczepionych [55]. Uzy- s kiwana w wyniku szczepienia odporność była krótko-trwała, poziom przeciwciał spadał gwałtownie, a osoby szczepione ponownie stawały się wrażliwe na zakażenie [17, 74]. Wśród wielu hipotez dotyczących wyjaśnienia patogenezy atypowej odry wymienia się między innymi brak produkcji przeciwciał dla białka fuzyjnego (F), co prowadziło do niekontrolowanego rozprzestrzeniania się wirusa z komórki do komórki pomimo produkcji przeciwciał dla hemaglutyniny (H) [48]. Badania na rezusach wykazały, że szczepionka inaktywowana nie indukowała odpowiedzi ze strony cytotoksycznych komórek T, a syntetyzowane przeciwciała o niskiej awidności nie mogły neutralizować zakażenia dzikim szczepem wirusa odry [72]. W 1967 r. zaprzestano sto-sowania tej szczepionki w USA, a potem w Europie [33].

W połowie lat 60-tych w USA, Japonii, Jugosławi, ZSRR i Chinach opracowano nowe szczepy szczepion-kowe. Otrzymano je poprzez dalszą atenuację szczepu Edmonston (AIK-C), szczepu Edmonston A (Schwarz) i szczepu Edmonston B (Moraten i Edmonston- Zagreb) lub niezależnych izolatów wirusa odry: Tanabe (CAM-70), Leningrad (Leningrad-16) i Shanghai (Shan-ghai-191) [81, 88, 94].

Większość obecnie używanych na świecie szczepio-nek przeciwko odrze wywodzi się ze szczepu Edmon-ston, w tym zarejestrowana w 1965 r. szczepionka ze szczepem Schwarz i zarejestrowana w 1968 r. szcze-pionka ze szczepem Moraten [33, 77]. Stosowane obec-nie żywe, atenuowane szczepionki przeciwko odrze należą do szczepionek bezpiecznych. Wirus szczepion-kowy nie jest wydalany do środowiska, a NOPS o ile występują, mają łagodny charakter [33]. Oprócz szcze-pionki monowalentnej w chwili obecnej powszechniej stosuje się szczepionki skojarzone, szczególnie w kra-jach rozwiniętych, gdzie na stałe zostały one umiesz-czone w kalendarzu szczepień. Szczepionki skojarzone zawierają oprócz atenuowanego szczepu wirusa odry, atenuowane szczepy wirusa różyczki i świnki lub wirusa różyczki i ospy wietrznej.

Stosowane schematy szczepień różnią się w poszcze-gólnych krajach. W Polsce po raz pierwszy szczepienia przeciwko odrze wprowadzono w 1974 roku [31, 61]. Zgodnie z obowiązującym kalendarzem szczepień szcze-

pionkę podaje się dzieciom w 13–14 miesiącu życia. Od 1991 r. wprowadzono 2 dawkę szczepionki podawaną dzieciom w wieku 7 lat. W 2005 r. zastąpiono monowa-lentną szczepionkę przeciwko odrze szczepionką sko-jarzoną (odra-świnka-różyczka) i przesunięto podanie 2 dawki z 7 na 10 rok życia. Obecnie w ramach Pro-gramu Szczepień Ochronnych w Polsce stosowane są wyłącznie szczepionki skojarzone.

Otrzymanie skutecznej i bezpiecznej szczepionki przeciwko odrze nie zakończyło prac nad szczepion-kami tzw. „nowej generacji”. Celem tych prac jest wyeliminowanie problemów związanych z obecnie stosowaną szczepionką, takich jak: 1) niska skutecz-ność u dzieci poniżej 12 miesiąca życia, spowodowana niedojrzałością systemu immunologicznego i interak-cji z przeciwciałami matczynymi [18, 91]; 2) obecność tzw. „okienka immunologicznego” czyli wrażliwości na zakażenie wirusem w okresie pomiędzy utratą prze-ciwciał matczynych a nabyciem odporności w wyniku szczepienia [50]; 3) niemożność podania szczepionki osobom z obniżoną odpornością ze względu na wysokie ryzyko powikłań; 4) niski poziom swoistych przeciw-ciał klasy IgA indukowanych w wyniku podania szcze-pionki, który nie zabezpiecza przed namnażaniem się dzikiego szczepu wirusa w błonach śluzowych górnych dróg oddechowych; 5) konieczność zachowania łańcu-cha chłodniczego zarówno przed, jak i po rozpuszczeniu szczepionki (szczepionka atenuowana, szczególnie po rozpuszczeniu traci swoje właściwości immunogenne w podwyższonej temperaturze) [50].

Do tej pory opracowano wiele nowych eksperymen-talnych szczepionek różnego typu: szczepionki DNA, tzw. „szczepionki genowe” [35, 67, 68]; szczepionki rekombinowane i podjednostkowe, zawierające np. pep-tydy z białek H i F [12] lub białko H [96]; szczepionki wektorowe, np. wirus krowianki z ekspresją białek H, F i/lub N wirusa odry [12]. Opracowanie nowej szcze-pionki, która nie wymagałaby zachowania tzw. łańcu-cha chłodniczego, a jej podanie nie wymagałoby igły i strzykawki, oraz która mogłaby być z powodzeniem stosowana u dzieci poniżej 6 miesiąca życia mogłoby usprawnić i wzmocnić kontrolę nad odrą w wielu częś-ciach świata.

6.2. odpowiedź indukowana w wyniku szczepienia

Odpowiedź immunologiczna po podaniu szczepionki zabitej była inna niż po podaniu szczepionki atenuowa-nej, ponieważ w procesie inaktywacji ulegała zniszcze-niu immunogenność białka fuzyjnego F (patrz 6.1).

Szczepionka atenuowana indukuje zarówno odpo-wiedź ze strony przeciwciał neutralizujących, jak i od- powiedź komórkową, jakościowo podobną do tej indu-kowanej w wyniku naturalnego zakażenia, chociaż poziomy wytworzonych przeciwciał są niższe [39, 65],


a odporność jest mniej trwała niż ta uzyskana w wyniku naturalnego zakażenia [52, 53, 73]. Przeciwciała klasy IgM pojawiają się w surowicy osób szczepionych w 2 tygodniu po szczepieniu i utrzymują się do 4 tygo-dnia, osiągając szczyt w 3 tygodniu. Przeciwciała klasy IgG pojawiają się również w 2 tygodniu, osiągając szczyt w 3–4 tygodniu po szczepieniu, ale poziom ich wraz z upływem czasu ulega obniżeniu [33]. Utrata prze-ciwciał jest szybsza w przypadku immunizacji później opracowanymi szczepionkami niż w przypadku pierw-szych atenuowanych szczepionek przeciwko odrze czy po naturalnym zakażeniu [40]. Również odpowiedź komórkowa indukowana po szczepieniu jest słabiej wyrażona niż ta po naturalnym zakażeniu wirusem odry. W pierwszym etapie aktywowane są komórki CD8, ważne dla procesu eliminacji wirusa z organizmu, a następnie komórki CD4, które zanikają z czasem [58]. Istnieje wiele czynników determinujących poszcze-pienną odpowiedź odpornościową:• Wiek osoby szczepionej – prawdopodobieństwo uzy-

skania serokonwersji oraz poziom indukowanych przeciwciał są determinowane przez poziom istnie-jących przeciwciał matczynych i dojrzałość układu odpornościowego dziecka w chwili szczepienia [19, 75]. Wyniki badań przeprowadzonych przez Jana-szek i Ślusarczyka [32] sugerują, że poziom przeciw-ciał przekazywanych przez matkę jest uzależniony od tego w jaki sposób matka uzyskała przeciwciała, tzn. czy w wyniku naturalnego zakażenia wirusem odry (matki urodzone przed rokiem 1969) czy w wyniku szczepienia (urodzone po 1975 roku). Poziom prze-ciwciał u osób szczepionych jest niższy niż u osób, które uzyskały przeciwciała w wyniku naturalnego zakażenia [41]. Niższy poziom przeciwciał przeciwko odrze u kobiet szczepionych ma znaczący wpływ na zanik odporności u nieszczepionych niemowląt [44, 83]. Wynika z tego jeden z problemów związanych ze szczepieniem przeciwko odrze, a mianowicie wysoki odsetek zachorowań wśród niemowląt poniżej pierw-szego roku życia. Sytuacja taka miała miejsce w Polsce podczas epidemii w latach 1997–1998, kiedy to zapa-dalność na odrę wśród dzieci poniżej 1 roku życia była 4,5 razy wyższa niż w populacji ogólnej [32]. Zacho-rowania wśród małych dzieci są dość niebezpieczne i zwiększają ryzyko rozwoju podostrego stwardnia-jącego zapalenia mózgu w późniejszym okresie życia [1, 49]. Rekomendowany wiek szczepienia różni się regionalnie i jest wynikiem wypracowanej równowagi pomiędzy optymalnym wiekiem dla uzyskania sero-konwersji a prawdopodobieństwem zakażenia wiru-sem odry przed okresem szczepienia [8].

• Droga podania szczepionki – pozaparenteralne poda-nie szczepionki (np. donosowo w postaci aerozolu) mogłoby pozwolić na lokalną replikację wirusa szcze-pionkowego w nabłonku układu oddechowego bez

interakcji z matczynymi przeciwciałami, tym samym stwarzając możliwość obniżenia wieku immunizacji. Stwierdzono, że podanie szczepionki w postaci aero-zolu jest skuteczne w podwyższaniu istniejącej odpo-wiedzi immunologicznej (przeciwciała), stymuluje powstanie przeciwciał wydzielniczych IgA, ale jed-nocześnie pierwotna odpowiedź immunologiczna na szczepionkę podaną w takiej postaci jest niższa niż po podaniu podskórnym [43, 97, 98].

• Współistniejące choroby, np. ostre zachorowania, immunosupresja, choroby wieku dziecięcego, zakaże-nie HIV, ciężkie upośledzenie odpowiedzi komórko-wej. Szczepionka atenuowana nie jest zalecana u osób z niską liczbą komórek CD4 z powodu możliwości rozwinięcia progresywnego zakażenia [3, 21, 85, 86].

• Cechy osobnicze – genetyczne uwarunkowania mające wpływ na odpowiedź immunologiczną w zakresie roz-poznawania antygenów przez limfocyty, sygnali za - cji międzykomórkowej, produkcji cytokin, procesu przełączania między izotypami przeciwciał [58]. W stosunku do zakażenia wirusem odry stwierdzono zwią-zek polimorfizmu genów dla HLA, cytokin, recepto-rów cytokinowych i receptorów komórkowych dla MeV z poziomem wirusowo-swoistych przeciwciał i poziomem limfoproliferacji [11, 65].

• Dawka – wielkość i ilość dawek. Skuteczność pojedyn- czej dawki szczepionki przeciwko odrze u dzieci jest szacowana na 80–95% [19]. Podanie drugiej dawki powoduje znaczny wzrost poziomu przeciw ciał IgG (booster) przy jednoczesnym braku lub nieznacz-nej odpowiedzi ze strony przeciwciał IgM [66, 69]. Dwukrotne szczepienie ma na celu zmniejszenie od- setka dzieci nie zaszczepionych oraz osób, u których nie stwierdzono serokonwersji po pierwszym szcze-pieniu. Badania wykazały, że zapobieganie trans-misji endemicznej odry nie jest możliwe w krajach, w których w programie szczepień przewidziano tylko jedną dawkę szczepionki, nawet jeżeli wyszczepial-ność populacji osiągnęłaby 100%. Niski odsetek osób, które pozostają wrażliwe na zakażenie wirusem odry (w wyniku niepowodzenia 1 szczepienia) z czasem ulegałby kumulacji [47]. Każda dawka obecnie stoso-wanych szczepionek zawiera nie mniej niż 1000 dawek zakaźnych (103TCID50) silnie osłabionego wirusa odry. Stosowana w przeszłości szczepionka o wysokim mia-nie (>104,7TCID50), zawierająca atenuowany szczep Edmonston-Zagreb, charakteryzowała się wysokim odsetkiem uodparnianych niemowląt w wieku 4–6 mie- sięcy i uzyskała rekomendację WHO do stosowania u dzieci w 6 miesiącu życia lub nieco starszych w tych krajach, gdzie duża liczba zgonów dzieci przed 9 mie-siącem życia była związana z odrą. W krótkim okresie zaobserwowano jednak związek pomiędzy immuni-zacją szczepionką o wysokim mianie a zwiększoną umieralnością wśród szczepionych dzieci na skutek


powszechnie występujących infekcji (malaria, bie-gunka, zakażenia górnych dróg oddechowych). Zja-wisko to tłumaczono immunosupresją powodowaną przez szczep szczepionkowy o wysokim mianie [1]. Z tego powodu szczepionka tego typu została zdys-kwalifikowana i utraciła rekomendacje WHO.

7. podsumowanie

Mimo opracowania skutecznej szczepionki prze-ciwko odrze oraz wdrożenia przez WHO planu elimi-nacji odry, epidemie nadal zdarzają się w wielu krajach. Niepowodzenie planu zakładającego eliminację do 2010 r. zachorowań na odrę w regionie europejskim ma wiele przyczyn, m.in. związanych z charakterem odpowiedzi immunologicznej na to zakażenie. W paź-dzierniku 2010 r., organizacja FAO ogłosiła eradykację wirusa księgosuszu (rinderpest-Virus) [62]. Jest to wia-domość bardzo znacząca dla powodzenia planu elimina-cji wirusa odry, ponieważ wirus księgosuszu, podobnie jak wirus odry, należy do rodzaju Morbillivirus. Mając na uwadze bliskie pokrewieństwo obu tych wirusów, informacja ta sugeruje, że eliminacja wirusa odry jest również możliwa.

Praca finansowana w ramach projektu MNiSW NN 404 107938

piśmiennictwo

1. Aaby P., Anderson M., Knudsen K.: Excess mortality after early exposure to measles. Int. J. Epidemiol. 22, 156–162 (1993)

2. Aaby P., Jensen H., Simondon F., Whittle H.: High-titer measles vaccination before 9 months of age and increased female mor-tality: do we have an explanation? semin. Pediatr. infect. Dis. 14, 220–232 (2003)

3. Angel J.B., Walpita P., Lerch R.A., Sidhu M.S., Masurekar M., DeLellis R.A., Noble J.T., Snydman D.R., Udem S.A.: Vaccine--associated measles pneumonitis in an adult with AIDS. Ann. intern. Med. 129,104–106 (1998)

4. European Centre for Disease Prevention and Control.: Annual epidemiological report on communicable diseasses 2009, ECDC, Stockholm, 2009.

5. Beckford A.P., Kaschula R.O., Stephen C.: Factors associated with fatal cases of measles. A retrospective autopsy study. s. Afr. Med. J. 68, 858–63 (1985)

6. Burnet F.M.: Measles as an index of immunological function. Lancet, 292, 610–613 (1968)

7. Carter C.H., Conway T.J., Cornfeld D., Iezzoni D.G., Kempe C.H., Moscovici C., Rauh L.W., Vignec A.J., Warren J.: Serologic response of children to in-activated measles vaccine. JAMA, 179, 848–853 (1962)

8. Cutts F.T., Grabowsky M., Markowitz L.E.: The effect of dose and strain of live attenuated measles vaccines on serological responses in young infants. Biologicals, 23, 95–106 (1995)

9. Czarkowski P., Cielebąk E., Dacka P., Kondej B.: Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2006 roku. Wydawnictwo NIZP--PZH, Warszawa, 2007.

10. Devaux P, Christiansen D, Plumet S, Gerlier D.: Cell surface activation of the alternative complement pathway by the fusion protein of measles virus. J. Gen. Virol. 85, 1665–1667 (2004)

11. Dhiman N., Ovsyannikova I.G., Cunningham J.M., Vierkant R.A., Kennedy R.B., Pankratz V.S., Poland G.A., Jacobson R.M.: Associations between measles vaccine immunity and single--nucleotide polymorphisms in cytokine and cytokine receptor genes. J. infect. Dis. 195, 21–29 (2007)

12. El Kasmi K.C., Muller C.P.: New strategies for closing the gap of measles susceptibility in infants: towards vaccines compati-ble with current vaccination schedules. Vaccine, 19, 2238–2244 (2001)

13. El Mubarak H.S., Ibrahim S.A., Vos H.W., Mukhtar M.M., Mustafa O.A., Wild T.F., Osterhaus A.D., de Swart R.L.: Measles virus protein-specific IgM, IgA, and IgG subclass responses during the acute and convalescent phase of infection. J. Med. Virol. 72, 290–298 (2004)

14. Enders J.F., Peebles T.C.: Propagation in tissue cultures of cyto-pathogenic agents from patients with measles. Proc. soc. Exp. Biol. Med. 86, 277–286 (1954)

15. Enders J.F.: Measles virus: historical review, isolation and beha-vior in various systems. Am. J. Dis. child. 103, 282–287 (1962)

16. Erlenhöfer C., Duprex W.P., Rima B.K., ter Meulen V., Schnei der-Schaulies J.: Analysis of receptor (CD46, CD150) usage by measles virus. J. Gen. Virol. 83, 1431–1436 (2002)

17. Fulginiti V., Kempe C.H.: Measles exposure among vaccine recipients. Am. J. Dis. child. 106, 62–73 (1963)

18. Gans H.A., Arvin A.M., Galinus J., Logan L., DeHovitz R., Maldonado Y.: Deficiency of the humoral immune response to measles vaccine in infants immunized at age 6 months. JAMA, 12, 527–532 (1998)

19. Gans H.A., Yasukawa L.L., Alderson A., Rinki M., DeHovitz R., Beeler J., Audet S., Maldonado Y., Arvin A.M.: Humoral and cell-mediated immune responses to an early 2-dose measles vaccination regimen in the United States. J. infect. Dis. 190, 83–90 (2004)

20. Gershon A.A.: Measles Virus (w) Principles and practice of infectious diseases., red. G.L. Mandell, J.E. Bennett, R. Dolin, Elsevier Churchill Livingstone, Philadelphia, 2005, s. 2031.

21. Goon P., Cohen B., Jin L., Watkins R., Tudor-Williams G.: MMR vaccine in HIV-infected children – potential hazards? Vaccine, 19, 3816–3819 (2001)

22. Griffin D.E., Moench T.R., Johnson R.T., Lindo de Soriano I., Vaisberg A.: Peripheral blood mononuclear cells during natural measles virus infection: cell surface phenotypes and evidence for activation. clin. immunol. immunopathol. 40, 305–312 (1986)

23. Griffin D.E., Ward B.J., Jauregui E., Johnson R.T., Vaisberg A.: Natural killer cell activity during measles. clin. Exp. immunol. 81, 218–224 (1990)

24. Griffin D.E.: Measles Virus (w) Fields Virology, red. D.M. Knip, P.M. Howley, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Baltimore, New York, London, Buenos Aires, Hong Kong, Sydney, Tokyo, 2007, s. 1552.

25. Griffin D.E.: Measles virus-induced suppression of immune responses. immunol. rev. 236, 176–189 (2010)

26. Gringhuis S.I, den Dunnen J., Litjens M., van Het Hof B., van Kooyk Y., Geijtenbeek T.B.: C-type lectin DC-SIGN modu-lates Toll-like receptor signaling via Raf-1 kinase-dependent acetylation of transcription factor NF-kappaB. immunity, 26, 605–616 (2007)

27. Gut W., Naruszewicz-Lesiuk D.:Analysis of the correlation between measles and subacute sclerosis panencephalitis (SSPE) before and after introduction of vaccination in Poland. Przegl. Epidemiol. 46, 295–301 (1992)

28. Hahm B.: Hostile communication of measles virus with host innate immunity and dendritic cells. curr. Top. Microbiol. immunol. 330, 271–287 (2009)

29. Halwani R., Doroudchi M., Yassine-Diab B., Janbazian L., Shi Y., Said E.A., Haddad E.K., Sékaly R.P.: Generation and


maintenance of human memory cells during viral infection. Springer Semin. immunopathol. 28, 197–208 (2006)

30. Horikami S.M, Moyer S.A.: Structure, transcription, and repli-cation of measles virus (w) Measles virus, red. V. ter Meulen, M.A. Billeter, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo, Hong Kong, Barcelona, Budapest, 1995, s. 35.

31. Janaszek W., Gut W., Gay N.J.: The epidemiology of measles in Poland: prevalence of measles virus antibodies in the popula-tion. Epidemiol. infect. 125, 385–392 (2000)

32. Janaszek W., Ślusarczyk J.: Immunity against measles in popula-tions of women and infants in Poland. Vaccine, 21, 2948–2953 (2003)

33. Janaszek-Seydlitz W.: Szczepionka przeciwko odrze (w) Wakcy-nologia, red. W. Magdzik, D. Naruszewicz-Lesiuk, A. Zieliński, α-medica press, Bielsko-Biała, 2007, s. 412

34. Jaye A., Herberts C.A., Jallow S., Atabani S., Klein M.R, Hooger-hout P., Kidd M., van Els C.A., Whittle H.C.,: Vigorous but short-term gamma interferon T-cell responses against a domi-nant HLA-A*02-restricted measles virus epitope in patients with measles. J. Virol. 77, 5014–5016 (2003)

35. Kaslow D.C.: A potential disruptive technology in vaccine deve-lopment: gene-based vaccines and their application to infectious diseases. Trans. r. soc. Trop. Med. hyg. 98, 593–601 (2004)

36. Koga R, Ohno S, Ikegame S, Yanagi Y.: Measles virus-indu-ced immunosuppression in SLAM knock-in mice. J. Virol. 84, 5360–5367 (2010)

37. Krugman S., Giles J.P., Jacobs A.M., Friedman H.: Studies with live attenuated measles-virus vaccine. Comparative clinical, antigenic, and prophylactic effects after inoculation with and without gamma-globulin. Am. J. Dis. child. 103, 353–363 (1962)

38. Krugman S., Giles J.P., Jacobs A.M., Friedman H.: Studies with a further attenuated live measles-virus vaccine. Pediatrics, 31, 919–928 (1963)

39. Krugman S.: Present status of measles and rubella immuniza-tion in the United States: a medical progress report. J. Pediatr. 78, 1–16 (1971)

40. Krugman S.: Present status of measles and rubella immuniza-tion in the United States: a medical progress report. J. Pediatr. 90, 1–12 (1977)

41. Krugman S.: Further-attenuated measles vaccine: characteris-tics and use. rev. infect. Dis. 5, 477–481 (1983)

42. Lamb R.A., Griffin D.E.: Paramyxoviridae: the viruses and their replication (w) Fields Virology, red. D.M. Knip, P.M. Howley, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Baltimore, New York, London, Buenos Aires, Hong Kong, Sydney, Tokyo, 2007, s. 1552.

43. Low N., Kraemer S., Schneider M., Restrepo A.M.: Immuno-genicity and safety of aerosolized measles vaccine: systematic review and meta-analysis. Vaccine, 26, 383–398 (2008)

44. Maldonado Y.A., Lawrance E.C., de Hovitz R., Hartzell A., Albrecht P.: Early loss passive measles antibody in infants of mothers with vaccine-induced immunity. Pediatrics, 96, 447–450 (1995)

45. Malvoisin E., Wild F.: Contribution of measles virus fusion protein in protective immunity: anti-F monoclonal antibodies neutralize virus infectivity and protect mice against challenge. J. Virol. 64, 5160–5162 (1990)

46. Massé N., Barrett T., Muller C.P., Wild T.F., Buckland R.: Identi-fication of a second major site for CD46 binding in the hemag-glutinin protein from a laboratory strain of measles virus (MV): potential consequences for wild-type MV infection. J. Virol. 76, 13034–13038 (2002)

47. Meissner H.C., Strebel P.M., Orenstein W.A.: Measles vaccines and the potential for worldwide eradication of measles. Pedia-trics, 114, 1065–1069 (2004)

48. Merz D.C., Scheid A., Choppin P.W.: Importance of antibodies to the fusion glycoprotein of paramyxoviruses in the prevention of spread of infection. J. Exp. Med. 151, 275–288 (1980)

49. Miller C., Farrington C.P., Harbert K.: The epidemiology of subacute sclerosing panacephalitis in England and Wales 1970–1989. int. J. Epidemiol. 21, 998–1006 (1992)

50. Mitragotri S.: Immunization without needles. Nat. rev. immu-nol. 5, 905–916 (2005)

51. Moss W.J., Ryon J.J., Monze M., Griffin D.,E.: Differential regu-lation of interleukin (IL)-4, IL-5, and IL-10 during measles in Zambian children. J. infect. Dis. 186, 879–887 (2002)

52. Mossong J., Nokes D.J., Edmunds W.J., Cox M.J., Ratnam S., Muller C.P.: Modeling the impact of subclinical measles trans-mission in vaccinated populations with waning immunity. Am. J. Epidemiol. 150, 1238–1249 (1999)

53. Mossong J., O’Callaghan C.J., Ratnam S.: Modelling antibody response to measles vaccine and subsequent waning of immu-nity in a low exposure population. Vaccine, 19, 523–529 (2000)

54. Muscat M., Bang H., Wohlfahrt J., Glismann S., Mølbak K.: Measles in Europe: an epidemiological assessment. Lancet, 373, 383–389 (2009)

55. Nader P.R., Horwitz M.S., Rousseau J.: Atypical exanthem fol-lowing exposure to natural measles: eleven cases in children previously inoculated with killed vaccine. J. Pediatr. 72, 22–28 (1968)

56. Nanan R., Rauch A., Kämpgen E., Niewiesk S., Kreth H.W.: A novel sensitive approach for frequency analysis of measles virus-specific memory T-lymphocytes in healthy adults with a childhood history of natural measles. J. Gen. Virol. 81, 1313–1319 (2000)

57. Naniche D., Yeh A., Eto D., Manchester M., Friedman R.M, Oldstone M.B.: Evasion of host defenses by measles virus: wild- type measles virus infection interferes with induction of Alpha/Beta interferon production. J. Virol. 74, 7478–7484 (2000)

58. Naniche D., Garenne M., Rae C., Manchester M., Buchta R., Brodine S.K., Oldstone M.B.: Decrease in measles virus-specific CD4 T cell memory in vaccinated subjects. J. infect. Dis. 190, 1387–1395 (2004)

59. Naniche D.: Human Immunology of Measles Virus Infection. curr. Top. Microbiol. immunol. 330, 151–171 (2009)

60. Naruszewicz-Lesiuk D., Iwińska-Buksowicz B., Wieczorkie-wicz M., Kulczycki J., Gut W.: Subacute sclerosing panencepha-litis (SSPE) in Poland in 1996–1999. Phase VII of epidemiologic studies. Neurol. Neurochir. Pol. 5, 877–885 (2000)

61. Naruszewicz-Lesiuk D.: Odra (w) Choroby zakaźne i ich zwal-czanie na ziemiach polskich w XX wieku, red. J. Kostrzewski, W. Magdzik, D. Naruszewicz-Lesiuk, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa, 2001, s. 281.

62. Normie D.: Rinderpest, deadly for cattle, joins smallpox as vanquished disease. science, 330, 435 (2010)

63. Ohga S., Miyazaki C., Okada K., Akazawa K., Ueda K.: The inflammatory cytokines in measles: correlation between serum interferon-gamma levels and lymphocyte subpopulations. Eur. J. Pediatr. 151, 492–496 (1992)

64. Okada H., Kobune F., Sato T.A., Kohama T., Takeuchi Y., Abe T., Takayama N., Tsuchiya T., Tashiro M.: Extensive lymphopenia due to apoptosis of uninfected lymphocytes in acute measles patients. Arch. Virol. 145, 905–920 (2000)

65. Ovsyannikova I.G., Dhiman N., Jacobson R.M., Vierkant R.A., Poland G.A.: Frequency of measles virus-specific CD4+ and CD8+ T cells in subjects seronegative or highly seropositive for measles vaccine. clin. Diagn. Lab. immunol. 10, 411–416 (2003)

66. Ozanne G., d’Halewyn M.A.: Secondary immune response in a vaccinated population during a large measles epidemic. J. clin. Microbiol. 30, 1778–1782 (1992)


67. Pan C.H., Nair N., Adams R.J., Zink M.C., Lee E.Y., Polack F.P., Singh M., O’Hagan D.T., Griffin D.E.: Dose-dependent pro-tection against or exacerbation of disease by a polylactide gly-colide microparticle-adsorbed, alphavirus-based measles virus DNA vaccine in rhesus macaques. clin. Vaccine immunol. 15, 697–706 (2008)

68. Pasetti M.F., Resendiz-Albor A., Ramirez K., Stout R.,Papania M., Adams R.J., Polack F.P., Ward B.J., Burt D., Chabot S., Ulmer J., Barry E.M., Levine M.M.: Heterologous prime-boost strategy to immunize very young infants against measles: pre--clinical studies in rhesus macaques. clin. Pharmacol. Ther. 82, 672–685 (2007)

69. Pebody R.G., Gay N.J., Hesketh L.M., Vyse A., Morgan-Capner P., Brown D.W., Litton P., Miller E.: Immunogenicity of second dose measles-mumps-rubella (MMR) vaccine and implications for serosurveillance. Vaccine, 20, 1134–1140 (2002)

70. Permar S.R., Klumpp S.A., Mansfield K.G., Kim W.K., Gorgone D.A., Lifton M.A., Williams K.C., Schmitz J.E., Reimann K.A., Axthelm M.K., Polack F.P., Griffin D.E., Letvin N.L.: Role of CD8(+) lymphocytes in control and clearance of measles virus infection of rhesus monkeys. J. Virol. 77, 4396–4400 (2003)

71. Petralli J.K., Merigan T.C., Wilbur J.R.: Circulating interferon after measles vaccination. N. Engl. J. Med. 273, 198–201 (1965)

72. Polack F.P., Hoffman S.J., Crujeiras G., Griffin D.E.: A role for nonprotective complement-fixing antibodies with low avidity for measles virus in atypical measles. Nat. Med. 9, 1209–1213 (2003)

73. Pütz M.M., Bouche F.B., de Swart R.L., Muller C.P.: Experimen-tal vaccines against measles in a world of changing epidemio-logy. int. J. Parasitol. 33, 525–545 (2003)

74. Rauh L.W., Schmidt R.: Measles immunization with killed virus vaccine. serum antibody titers and experience with exposure to measles epidemic. Am. J. Dis. child. 109, 232–237 (1965)

75. Redd S.C., King G.E., Heath J.L., Forghani B., Bellini W.J., Markowitz L.E.: Comparison of vaccination with measles--mumps-rubella vaccine at 9, 12, and 15 months of age. J. infect. Dis. 189, 116–122 (2004)

76. Riddell M.A., Moss W.J., Hauer D., Monze M., Griffin D.E.: Slow clearance of measles virus RNA after acute infection. J. clin. Virol. 39, 312–317 (2007)

77. Rota J.S., Wang Z.D., Rota P.A., Bellini W.J.: Comparison of sequences of the H, F, and N coding genes of measles virus vaccine strains. Virus res. 31, 317–330 (1994)

78. Rota P.A., Featherstone D.A., Bellini W.J.: Molecular epide-miology of measles virus. curr. Top. Microbiol. immunol. 330, 129–150 (2009)

79. Schneider-Schaulies S., Schneider-Schaulies J.: Measles virus--induced immunosuppression. curr. Top. Microbiol. immunol. 330, 243–69 (2009)

80. Schnorr J.J., Seufert M., Schlender J., Borst J., Johnston I.C., ter Meulen V., Schneider-Schaulies S.: Cell cycle arrest rather than apoptosis is associated with measles virus contact-mediated immunosuppression in vitro. J. Gen. Virol. 78, 3217–3226 (1997)

81. Schwarz A.J.: Immunization against measles: development and evaluation of a highly attenuated live measles vaccine. Ann. Paediatr. 202, 241–252 (1964)

82. Shiozawa S., Yoshikawa N., Iijima K., Negishi K.: A sensitive radioimmunoassay for circulating alpha-interferon in the plas ma of healthy children and patients with measles virus infection. clin. Exp. immunol. 73, 366–369 (1988)

83. de Serres G., Joly J.R., Fauvel M., Meyer F., Mâsse B., Boulianne N.: Passive immunity against measles during the first 8 months of life of infants born to vaccinated mothers or to mothers who sustained measles. Vaccine, 5, 620–623 (1997)

84. Sissons J.G., Oldstone M.B., Schreiber R.D.: Antibody-inde-pendent activation of the alternative complement pathway by

measles virus-infected cells. Proc. Natl. Acad. sci. UsA, 77, 559–562 (1980)

85. de Swart R.L., Kuiken T., Fernandez-de Castro J., Papania M.J., Bennett J.V., Valdespino J.L., Minor P., Witham C.L., Yüksel S., Vos H., van Amerongen G., Osterhaus AD.: Aerosol measles vaccination in macaques: preclinical studies of immune responses and safety. Vaccine, 24, 6424–6436 (2006)

86. de Swart R.L., LiCalsi C., Quirk A.V., van Amerongen G., Nodelman V., Alcock R., Yüksel S., Ward G.H., Hardy J.G., Vos H., Witham C.L., Grainger C.I., Kuiken T., Greenspan B.J., Gard T.G., Osterhaus A.D.: Measles vaccination of macaques by dry powder inhalation. Vaccine, 25, 1183–1190 (2007)

87. Turlej E.: Współczesne metody detekcji cytokin – real time PCR, ELISPOT oraz technika wewnątrzkomórkowego bar-wienia cytokin. Post. hig. Med. Dośw. 63, 213–224 (2009)

88. Ueda S.: Development of measles vaccines in Japan. Vaccine, 27, 3230–3231 (2009)

89. van Binnendijk R.S., van den Hof S., van den Kerkhof H., Kohl R.H., Woonink F., Berbers G.A., Conyn-van Spaendonck M.A., Kimman T.G.: Evaluation of serological and virological tests in the diagnosis of clinical and subclinical measles virus infections during an outbreak of measles in The Netherlands. J. infect. Dis. 188, 898–903 (2003)

90. Verhoeven D., Teijaro J.R., Farber D.L.: Heterogeneous memory T cells in antiviral immunity and immunopathology. Viral immunol. 21, 99–113 (2008)

91. de Vries R.D., Stittelaar K.J., Osterhaus A.D., de Swart R.L.: Measles vaccination: new strategies and formulations. Expert. rev. Vaccines, 7, 1215–1223 (2008)

92. Vuorinen T., Peri P., Vainionpää R.: Measles virus induces apoptosis in uninfected bystander T cells and leads to gran-zyme B and caspase activation in peripheral blood mononuc-lear cell cultures. Eur. J. clin. invest. 33, 434–442 (2003)

93. Walker J.M., Slifka M.K.,: Longevity of T-cell memory follo-wing acute viral infection. Adv. Exp. Med. Biol. 684, 96–107 (2010)

94. World Health Organization: Module 7: Measles (w) Glo-bal Programme for Vaccines and Immunization. Expanded Programme on Immunization. The Immunological Basis for Immunization Series, WHO, Genewa 1993.

95. World Health Organization: Global reductions in measles mortality 2000–2008 and he risk of measles resurgence. Weekly Epidemiol. record, 84, 505–516 (2009)

96. Webster D.E., Cooney M.L., Huang Z., Drew D.R., Ramshaw I.A., Dry I.B., Strugnell R.A., Martin J.L., Wesselingh S.L.: Suc-cessful boosting of a DNA measles immunization with an oral plant-derived measles virus vaccine. J. Virol. 76, 7910–7912 (2002)

97. Wong-Chew R.M., Islas-Romero R., García-García M.de L., Beeler J.A., Audet S., Santos-Preciado J.I., Gans H., Lew-Yasu-kawa L., Maldonado Y.A., Arvin A.M., Valdespino-Gómez J.L.: Induction of cellular and humoral immunity after aerosol or subcutaneous administration of Edmonston-Zagreb measles vaccine as a primary dose to 12-month-old children. J. infect. Dis. 189, 254–257 (2004)

98. Wong-Chew R.M., Islas-Romero R., García-García M. de L., Beeler J.A., Audet S., Santos-Preciado J.I., Gans H., Lew-Yasu-kawa L., Maldonado Y.A., Arvin A.M., Valdespino-Gómez J.L.: Immunogenicity of aerosol measles vaccine given as the primary measles immunization to nine-month-old Mexican children. Vaccine, 24, 683–690 (2006)

99. Yanagi Y., Ono N., Tatsuo H., Hashimoto K., Minagawa H.: Measles virus receptor SLAM (CD150). Virology, 299, 155–161 (2002)

100. Yanagi Y., Takeda M., Ohno S., Seki F.: Measles virus receptors and tropism. Jpn. J. infect. Dis. 95, 1–5 (2006)


1. Wstęp

Rodzaj Pichia jest drugim, co do wielkości rodza-jem drożdży, obejmującym ponad 100 gatunków tych mikroorganizmów. Jest silnie zróżnicowany zarówno filogenetycznie, jak i fenotypowo, należą do niego gatunki wykształcające spory w kształcie kapelusza, część szczepów jest w stanie asymilować azotany jako źródło azotu, wszystkie zawierają ubichinon typu 7,8 lub 9 [15, 27].

Bardzo długo drożdże należące obecnie do rodzaju Pichia nie były jednoznacznie sklasyfikowane, używano wielu synonimów na określenie ich nazwy m.in. han-senula, Endomyces, saccharomyces, Mycoderma. Było to spowodowane zróżnicowaniem genetycznym rodzaju

i poszczególnych szczepów. Dopiero dokładniejsze badania nad sekwencją podjednostek 18S i 26S rRNA oraz 26S rDNA, a także przeprowadzenie elektroforetycznego kariotypowania pozwoliły zakwalifikować poszczególne szczepy do jednego rodzaju [27].

Drożdże z rodzaju Pichia naturalnie wystepują w wielu środowiskach, najczęściej można ja znaleźć na rozkładających się roślinach, owocach, ziarnach zbóż oraz produktach spożywczych z wysoką zawartością cukru. Mogą żyć w symbiozie z owadami bytującymi na roślinach. Często spotyka się je także w surowym mleku i serach [31].

Pod względem budowy Pichia są typowymi droż-dżami, ich komórki mogą mieć różnorodną wielkość oraz okrągły, owalny lub szpiczasty kształt w zależności

P U B L I K A C J E M E T O D Y C Z N E I S T A N D A R D Y

* Autor korespondencyjny: Uniwersytet Rolniczy; ul. Balicka 122, 30-149 Kraków; tel.: +48 12 662 47 97; fax: +48 12 662 47 98; e-mail: [email protected]

znaczEniE przEMysŁoWE drożdżyz rodzaju PIchIa

paweł satora1*, Michał Wiśniewski1

1 Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, Uniwersytet Rolniczy, ul. Balicka 122, 30-149 Kraków


1. Wstęp. 2. Pichia pastoris jako producent białek rekombinowanych. 3. Biosynteza wybranych związków i enzymów przez szczepy Pichia. 4. Znaczenie drożdży z rodzaju Pichia w produkcji bioetanolu z surowców ligninocelulozowych. 5. Drożdże Pichia w procesie fermentacji wybranych produktów spożywczych. 6. Znaczenie i wykorzystanie toksyn killerowych wytwarzanych przez różne gatunki drożdży Pichia. 7. Wykorzystanie modyfikowanych szczepów Pichia pastoris do produkcji ludzkich glikoprotein. 8. Podsumowanie

industrial significance of Pichia yeasts

Abstract: In this article, significance and possibile applications of Pichia yeasts are presented. High diversity of Pichia species contributes to their widespread use in different branches of traditional as well as modern industry.

For the sake of relatively rapid growth, easiness of post-translational modification and low immunogenicity, Pichia strains are applied in various domains of biotechnology. Low nutritional requirements, possibility of control of protein secretion by modification of carbon source as well as relatively simple purification of obtained products mates Pichia strains very good recombinant protein producers. Thanks to xylose and L-arabinose fermentation ability, strains of Pichia genus along with other yeasts are applied for efficient bioethanol production from plant materials. In the food industry, they are used in the spontaneous fermentation of different products, such as cacao and olives. Pichia yeasts can synthesize aroma compounds and antioxidants which delay oxidation of lipids. Killer toxins secreted by some species of Pichia are utilised in the elimination of food and raw material spoilage caused by other mycotoxic fungi, and of their carcinogenic metabolites.

In the pharmaceutical industry Pichia yeasts are used for antimicrobial production. They facilitate either the synthesis of human glycoproteins or drugs based on these compounds.

Of course it is only part of this genus potential. Still a number of research is being carried out to improve the known processes and to find new application for these microorganisms.

1. Introduction. 2. Pichia pastoris as recombinant protein producer. 3. Biosynthesis of selected compounds and enzymes by Pichia strains. 4. Pichia yeasts application for the bioethanol production using lignocellulosic materials. 5. Pichia yeast application in the fermentation processes of selected food. 6. Significance and application of killer toxins secreted by different Pichia strains. 7. Applications of modified strains of Pichia pastoris for human glycoprotein production. 8. Summary

słowa kluczowe: Pichia, białka rekombinowane, bioetanol, toksyny killerowekey words: Pichia, recombinant proteins, bioethanol, killer toxins

248 PAWEŁ SATORA, MICHAŁ WIŚNIEWSKI

od gatunku. Mogą rozmnażać się zarówno wegetatywnie przez pączkowanie, jak i generatywnie przez wytwarza-nie askospor [15].

Drożdże z rodzaju Pichia mają zdolność przeprowa-dzania fermentacji alkoholowej, zarówno w środowisku tlenowym, jak i beztlenowym. Mogą brać udział w fer-mentacji różnych napojów i produktów spożywczych. Podczas wyżej wymienionego procesu produkują dużo związków odpowiedzialnych za aromat. Jednym z nich jest octan etylu, nadający octowy posmak. Niewielka ilość lotnych związków pozytywnie wpływa na aromat, a sam octan etylu ma właściwości przeciwgrzybiczne. Jednak zbyt duże nagromadzenie powstałych aroma-tów pogarsza smak i zapach fermentowanego produktu. Niektóre gatunki drożdży z rodzaju Pichia, jak P. stipitis mają zdolność fermentacji ksylozy do etanolu. Pentoza ta to główny składnik biomasy roślinnej, która jako obfita, tania i łatwo odnawialna, stanowi świetny suro-wiec do produkcji etanolu [11, 15, 31, 32].

Zdecydowana większość drożdży z rodzaju Pichia to mezofile, a ich optymalna temperatura wzrostu, w zależności od gatunku zawiera się pomiędzy 24, a 40°C. Do tej grupy możemy zaliczyć jeden ze szcze-pów Pichia anomala, którego optimum temperaturowe wynosi 35–37°C. Wśród wielu gatunków drożdży Pichia można znaleźć także psychrofile i termofile. Przykładem gatunku zimnolubnego może być Pichia membranifa-ciens, drożdże które często spotkać można w żywności przechowywanej w warunkach chłodniczych, natomiast gatunek P. polymorpha zaliczany jest do termofili, ponie-waż jego optymalna temperatura wzrostu przekracza 50°C. Optymalne pH dla drożdży z rodzaju Pichia mieści się pomiędzy 4,5, a 5,5, podobnie jak w przypadku więk-szości drożdży, choć przy tak dużej ilości gatunków są i takie których optimum pH jest zupełnie inne. Dobrym tego przykładem jest P. membranifaciens, który może rozwijać się nawet w zakresie pH 1,3–1,7 [15].

Liczne gatunki z rodzaju Pichia mają zdolność wytwarzania toksyn killerowych. Mechanizm ich tworzenia i działania może być różny uzależniony od szczepu. Toksyny te najczęściej te działając na ścianę komórkową innych mikroorganizmów powodują powstanie w niej porów, następnie wyciek materiału komórkowego, a w konsekwencji śmierć komórki. Tok-syny killerowe zapewniają drożdżom Pichia ochronę i zmniejszają konkurencję ze strony innych mikroorga-nizmów [22, 29, 36, 37].

2. Pichia pastoris jako producent białek rekombinowanych

Wraz z rozwojem nowoczesnej technologii mikro-organizmy są coraz częściej wykorzystywane w wielu dziedzinach. Jedną z najbardziej dynamicznie rozwija-

jących się dziedzin nauk jest biotechnologia, zajmująca się m.in. produkcją białek rekombinowanych, w których wytwarzaniu biorą udział bakterie i drożdże.

Druga grupa mikroorganizmów jest stosowana znacz nie częściej, ponieważ łączy zalety zarówno pro-kariotycznych, jak i eukariotycznych systemów eks-presyjnych. Drożdże charakteryzują się dość szybkim wzrostem oraz osiągają większą, niż bakterie biomasę. Kolejnym aspektem przemawiającym na ich korzyść jest zdolność do przeprowadzania posttranslacyjnych mody-fikacji białek, co u niektórych z nich jest warunkiem ich prawidłowego funkcjonowania. Ponadto drożdże w przeciwieństwie do bakterii mają zdolność do sekre-cji wytworzonych białek. Jest to bardzo ważne, ponie-waż pozwala ominąć niektóre etapy produkcji, takie jak śmierć komórek producenta czy oczyszczanie otrzy-manego białka [14, 46].

Obecnie jednym z najczęściej wykorzystywanych w produkcji białek rekombinowanych gatunków droż-dży jest szczep Pichia pastoris. Jego optimum tempe-raturowe wynosi około 30°C, jest metylotrofem (orga-nizmem zdolnym do wykorzystywania metanolu jako jedynego źródła węgla i energii). Jedną z najważniejszych zalet P. pastoris jest bardzo wydajny system ekspresyjny. W porównaniu z najczęściej stosowanymi w przemyśle drożdżami saccharomyces cerevisiae zapewnia nawet do 100 razy wyższy poziom ekspresji klonowanych genów. Ponadto tworzy trwałe rekombinatny, ma zdol-ność przeprowadzania modyfikacji posttranslacyjnych, takich jak glikozylacja, tworzenie mostków disiarczko-wych oraz przyłączanie kwasów tłuszczowych. Łatwo przeprowadza się na nim manipulacje genetyczne, ma stabilne wektory plazmidowe, a sekrecja wytworzonych w komórkach białek jest bardzo wydajna, niekiedy może przekraczać nawet 10 g/l pożywki pohodowlanej [12].

Fakt, że P. pastoris może wzrastać także na innych substratach niż metanol, umożliwia kontrolę ekspresji klonowanego genu poprzez zmianę źródła węgla w po- żywce na której są one hodowane, a dzięki temu także nadzór rozpoczęcia wytwarzania przez nie białka. Pro-dukowane białko jest zazwyczaj toksyczne dla komórek i ogranicza ich wzrost, dlatego możliwość wpływania na to kiedy zacznie ono być produkowane pozwala na swobodny przyrost biomasy drożdży nim rozpocznie się jego synteza. Metabolizm metanolu przeprowadzany w komórkach drożdży P. pastoris wymaga obecności enzymów katalizujących jego poszczególne etapy. Naj-ważniejsze z nich to oksydaza alkoholowa AOX1 (kata-lizująca przemianę metanolu do formaldehydu), dehy-drogenaza mrówczanowa FLD1 (katalizujące utlenianie formaldehydu do kwasu mrówkowego) oraz syntaza dihydroksyacetonu DHAS (katalizująca kondensację aldehydu mrówkowego z ksylulozo-5-fosforanem). Pod kontrolę promotorów regulujących produkcję wyżej wymienionych enzymów wprowadzane są geny mające

ZNACZENIE PRZEMYSŁOWE DROŻDŻY Z RODZAJU PichiA 249

ulec ekspresji, co umożliwia także kontrolę ekspresji genu klonowanego poprzez zmianę źródła węgla w po- żywce [12, 31, 46].

Produkcja białek rekombinowanych z udziałem P. pa s toris jest prowadzona w reaktorach okresowych. Wyróżniamy dwa typy szczepów P. pastoris, które różnią się własnościami biochemicznymi (kinetyką utylizacji metanolu) i w związku z tym hodowane są na różne sposoby. W przypadku szczepu wolno metabolizują-cego metanol (Muts) używana jest mieszanina glicerolu (główne źródło węgla i energii) i metanolu (induktor ekspresji genu białka), a stężenie metanolu jest utrzy-mywane na niskim poziomie. Jeżeli natomiast mamy do czynienia ze szczepem szybko metabolizującym metanol (Mut+), wtedy jest on głównym źródłem węgla i energii dla komórek (aktualnie ten typ służy do pro-dukcji ponad 400 różnych białek). Produkcja białek rekombinowanych najczęściej składa się z czterech eta-pów. Pierwszy służy uzyskaniu jak największej biomasy komórek. W etapie tym produkcja białka jest zatrzy-mywana, aby nie przeszkadzało ono we wzroście droż-dży. W tym celu prowadzi się hodowlę na glicerolu jako źródle węgla. W kolejnej fazie produkcji nadal dostarcza się glicerolu, w celu jeszcze większego przyrostu masy komórek, jednocześnie wprowadza się metanol, który jest induktorem. Z czasem zmniejsza się ilość podawa-nego glicerolu, a zwiększa stężenie metanolu. Ostatnia faza to faza, w której jest produkowane najwięcej białka rekombinowanego, co wymaga ciągłego dostarczania metanolu. Wytworzone białko jest wydalane przez droż-dże na zewnątrz komórki, więc nie ma problemu z jego późniejszym izolowaniem i oczyszczaniem [9, 47].

P. pastoris jest doskonałym układem do produkcji białek rekombinowanych. Jedyną wadą tych drożdży jest optimum temperaturowe wzrostu na poziomie 30°C, a w przypadku syntezy niektórych białek (głównie ssa-ków i ludzi) korzystniejsza może być nieco wyższa tem-peratura (ok. 36°C) [46].

3. biosynteza wybranych związków i enzymów przez szczepy Pichia

Kolejnym zastosowaniem przedstawicieli rodzaju Pichia jest synteza różnego rodzaju związków, takich jak cukry czy enzymy, których produkcja na drodze chemicznej lub enzymatycznej wymaga dużych kosztów.

Jedną z substancji biosyntezowanych przez drożdże Pichia jest arabitol. Jest to rozpuszczalny w wodzie poliol, o wzorze C5H12O5, jego masa molowa wynosi 152,14 g/mol, temperatura topnienia 103°C. Arabitol ze względu na swoje właściwości może być stosowany w przemyśle spożywczym jako niskokaloryczny i dobrze tolerowany przez diabetyków słodzik. Ponadto może być wykorzy-stywany jako składnik jadalnych polew, stabilizator wil-

gotności lub w przemyśle farmaceutycznym jako kom-ponent leków. Mimo swojego szerokiego zastosowania arabitol był używany tylko w niewielkim stopniu, ze względu na trudną dostępność i wysokie koszty produk-cji. Arabitol metodą chemiczną otrzymuje się poprzez transformacje arabinozy w obecności katalizatora Ru/C, w temperaturze 250°C i ciśnieniu wodoru w wysokości 100 barów. Są to warunki drastyczne, źle wpływające na jakość powstałego związku, a dodatkowo użycie rutenowego katalizatora powoduje wzrost i tak bardzo wysokich kosztów produkcji. Przemiany komórkowe arabinozy prowadzone przez różne mikroorganizmy są dużo tańsze niż metody chemiczne, jednak w ich końco-wej fazie nie zawsze otrzymujemy arabitol (może wcho-dzić do cyklu Krebsa lub ulegać przemianie do etanolu). Jednymi z niewielkiej grupy organizmów zdolnych do syntezy arabitolu są dwa gatunki drożdży z rodzaju Pichia – P. guilliermondii i P. stipitis, z czego pierwszy mikroorganizm wykazuje większą wydajność w pro-dukcji tego związku – odpowiednio 0,43 i 0,33 g·g–1. Sama biosynteza jest bardzo prosta. Rozpoczyna się od L-arabinozy (cukru wchodzącego w skład hemiceluloz), która w komórkach drożdży pod wpływem enzymu – reduktazy aldozy, przekształcana jest do L-arabitolu. Następnie jest on wydzielany przez komórki do środo wi- ska hodowlanego. W przypadku szczepu P. guilliermon-dii NRRL Y-2075 proces ten przebiega z zadowalającą wydajnością (w temperaturze 34°C i pH 4,0–0,71 g·g–1) i przy niskim nakładzie kosztów [25, 35].

Drożdże z rodzaju Pichia uczestniczą również w pro-dukcji proteinazy K. Ma ona zdolność do rozkładu kera-tyny, o czym informuje litera „K” w nazwie związku. Proteinaza K rozkłada białka niespecyficznie, odcinając najczęściej reszty aminokwasów hydrofobowych i aro-matycznych. Hydroliza białka najlepiej zachodzi przy pH 7,5–12, w obecności dużych stężeń jonów wapnio-wych. Enzym działa zarówno w niskich, jak i wysokich temperaturach (do 70°C) oraz w środowisku detergen-tów i związków denaturujących. Ze względu na zdolność do hydrolizy białek i braku aktywności nukleolitycznej, jest szeroko stosowany podczas izolowania i oczyszcza-nia DNA i RNA. Mikroorganizmem wykorzystywanym do produkcji proteinazy K jest P. pastoris. Gatunek ten nie ma jednak naturalnej zdolności do biosyntezy tego związku, dlatego gen odpowiedzialny za wytwarzanie enzymu wprowadza się do jego systemu ekspresji białek na drodze biotechnologicznej. Gen ten został zamplifi-kowany techniką łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR), a następnie wklonowany do odpowiednich plazmidów ekspresyjnych, które zostały użyte do transformacji P. pastoris. Rekombinowane szczepy drożdży hoduje się w bioreaktorach z pożywką zawierającą YNB (Yeast Nitrogen Base), metanol lub glicerol oraz niezbędne aminokwasy, przy silnym napowietrzaniu w 30°C. Po około 4–5 dniach hodowli osiąga się maksymalną ilość


rekombinowanego enzymu. Otrzymaną proteinazę K oddziela się od komórek drożdży Pichia, oczyszcza przy użyciu chromatografii jonowymiennej, a następnie zagęszcza metodami ultrafiltracji lub diafiltracji. Bada-nia właściwości enzymu produkowanego przez szczep P. pastoris wykazały, że nie różni się on od tego samego preparatu dostępnego na rynku, otrzymanego innymi metodami. Zarówno aktywność, jak i termostabilność rekombinowanej proteinazy K w porównaniu z innymi enzymami tego typu stosowanymi w przemyśle była identyczna [7].

Drożdże z rodzaju Pichia mają także swój udział w produkcji termostabilnej β-D-galaktozydazy, enzymu katalizującego rozpad wiązań O-glikozydowych [45]. Najczęściej stosuje się go do hydrolizy wiązań β-1,4-glikozydowych w laktozie. Rozpad tego disacharydu prowadzi do powstania D-glukozy i D-galaktozy. β-D-galaktozydazę wykorzystuje się głównie w przemyśle mleczarskim do produkcji mleka o niskiej zawartości laktozy, idealnego produktu dla osób nie tolerujących tego dwucukru. Ponadto mleko z rozłożoną na cukry proste laktozą stosuje się w produkcji jogurtów, ponie-waż przyspiesza to fermentacje i eliminuje konieczność ich słodzenia. Swoje zastosowanie mleko bezlaktozowe znajduje także w produkcji lodów, gdzie pozwala na wyeliminowanie tzw. piaszczystości, której powodem jest krystalizacja laktozy. β-D-galaktozydazę stosuje się w produkcji twarogu, ponieważ skraca ona czas potrzebny na skrzepnięcie mleka [13, 45]. Również sery wyprodukowane z surowca z dodatkiem tego enzymu charakteryzują się szybszym czasem dojrzewania. Wiele organizmów ma zdolność do syntezy β-D-galaktozydazy. W zależności od tego skąd pochodzi może różnić się masą cząsteczkową, optymalnym pH czy też tempera-turą, stabilnością itp. Najlepszym źródłem tego enzymu są mikroorganizmy, które produkują β-D-galaktozydazę o różnych właściwościach, a niektóre nawet syntezują kilka jej odmian. Przewaga drożdży Pichia w stosunku do innych mikroorganizmów polega na możliwości łatwej modyfikacji ich genów oraz możliwości stwo-rzenia rekombinowanego szczepu zdolnego do wytwa-rzania termostabilnej β-D-galaktozydazy. Zdolność tą ma bardzo mało mikroorganizmów, które w większości są termofilami. Termostabilna β-D-galaktozydaza cha-rakteryzuje się zwartą strukturą cząstek, ułatwiającą jej immobilizację na złożu stałym, co pozwala na sto-sowanie jej w procesach ciągłych. Ponadto zastosowa-nie termostabilnego enzymu pozwala na jednoczesne wytwarzanie produktu i jego cieplną obróbkę, co jest bardzo pożądane w przemyśle spożywczym. Mody-fikacji systemu ekspresyjnego poddawany jest szczep P. pastoris, a wprowadzany gen pochodzi od hiperter-mofilnego mikroorganizmu Pyrococcus woesei. Zabieg ten pozwala na uzyskanie rekombinowanego gatunku P. pastoris zdolnego do biosyntezy termostabilnej

β-D-galaktozydazy, z dużo większą wydajnością, niż w przypadku bakterii od której pochodzi gen. Po wyizo-lowaniu enzym oczyszcza się i zagęszcza po czym jest gotowy do użycia w przemyśle [45].

4. znaczenie drożdży z rodzaju Pichia w produkcji bioetanolu z surowców ligninocelulozowych

Wraz z rozwojem cywilizacyjnym rośnie zapo-trzebowanie na energię. Zmniejszenie zasobów paliw naturalnych oraz coraz większy popyt na ten surowiec powodują, że jego cena stale rośnie. Największe zapo-trzebowanie jest na paliwa płynne, wykorzystywane jako źródło energii w większości maszyn i urządzeń stoso-wanych w gospodarce. Czynniki te powodują poszuki-wanie łatwo dostępnych i odnawialnych surowców do produkcji paliw płynnych oraz coraz większe zainte-resowanie metodami ich przetwarzania w celu otrzy-mania taniego źródła energii. Takim właśnie źródłem są surowce rolnicze, które mogą służyć do produkcji biopaliwa i bioetanolu. Paliwo roślinne w niedalekiej przyszłości może zastąpić olej napędowy pozyskiwany z ropy naftowej, której zasoby bardzo szybko maleją, powodując szybki wzrost jej cen. Także etanol roślinny obecnie stosowany jako dodatek do benzyny, już nie-długo może je całkowicie zastąpić. Nic więc dziwnego, że poszukuje się nowych i bardziej wydajnych metod ich wytwarzania. Jedną z takich metod jest otrzymywanie bioetanolu z surowców roślinnych. Zdecydowaną więk-szość, bo aż 93% etanolu otrzymuje się dzięki fermenta-cji mikrobiologicznej. Głównym składnikiem biomasy roślinnej oprócz skrobi jest ligninoceluloza, składająca się z celulozy, hemiceluloz oraz ligniny. Po obróbce wstępnej celuloza scukrzana jest do β-D-glukozy, nato-miast hemicelulozy rozkładane są zarówno do heksoz, jak i do pentoz. Niestety większość z mikroorganiz- mów przetwarza na etanol tylko cukry sześciowęglowe, nie posiadając zdolności fermentacji pentoz, takich jak ksyloza i L-arabinoza, co powoduje, że cały proces jest mało ekonomiczny [17, 40, 41].

Idealnym rozwiązaniem byłby gatunek zdolny do fermentacji wszystkich składników biomasy roślinnej i odporny na powstały produkt, niestety w środowisku naturalnym taki mikroorganizm nie istnieje. Szczep P. stipitis ma zdolność fermentacji ksylozy i L-arabi-nozy do etanolu, niestety jest mało odporny na jego duże stężenie w otoczeniu (powyżej 40 g/dm3), co jest czynnikiem ograniczającym pełne wykorzystanie tego mikroorganizmu [1]. Z kolei inne drożdże bardzo często używane do produkcji alkoholu etylowego – s. cerevi-siae, nie mają zdolności rozkładu pentoz. W celu uzyska-nia na tyle wydajnej metody wytwarzania bioetanolu, by mógł on konkurować z paliwami otrzymywanymi z ropy naftowej próbuje się stosować dwie strategie.


Pierwsza z nich jest częściej stosowana i polega na genetycznej modyfikacji drożdży s. cerevisiae, poprzez wprowadzanie genów odpowiedzialnych za fermenta-cję pentoz [4]. Geny pochodzą od szczepu P. stipitis. Pierwszy z nich XYL1 koduje ksylulozoreduktazę, która redukuje ksylozę do ksylitolu, drugi natomiast o nazwie XYL2 odpowiada za wytwarzanie dehydrogenazy ksyli-tolu, przekształcającą ksylitol do ksylulozy. W ten spo-sób dzięki genom pochodzącym od drożdży z rodzaju Pichia otrzymujemy rekombinowany szczep s. cerevi-siae zdolny do fermentacji cukrów pięcio- i sześcio-węglowych w warunkach ograniczonego natleniania. W badaniach porównujących efektywność fermentacji przez mutanty i tradycyjne szczepy wykazano, że gatu-nek zmodyfikowany genetycznie był lepszy od tradycyj-nych drożdży, produkując 0,65 g/dm3/h etanolu, podczas gdy szczep nie modyfikowany tylko 0,37 g/dm3/h. Mimo zadowalających wyników, nadal trwają prace nad zwięk-szeniem efektywności fermentacji modyfikowanego szczepu drożdży s. cerevisiae [10, 26, 41].

Drugą strategią jest zastosowanie kultury mieszanej drożdży s. cerevisiae oraz P. stipitis, które razem fer-mentują pentozy i heksozy [10, 18, 33]. Wydawać by się mogło, że jest to idealne połączenie, prowadzące do pro-stej i wydajnej produkcji etanolu z surowca roślinnego. Niestety, proces ten napotyka na różne trudności. Po pierwsze, zastosowane drożdże nie mogą działać na sie-bie antagonistycznie oraz wytwarzać toksyn killerowych, które były by szkodliwe dla drugiej z kultur. Po drugie, szczep P. stipitis do wzrostu potrzebuje odpowiedniej ilości tlenu. Niestety większą jego część wykorzystuje szczep s. cerevisiae, który bardzo szybko buduje swoją biomasę, co w rezultacie prowadzi do zahamowania roz-woju drożdży Pichia i eliminacji ich z hodowli. Trzecim problemem jest diauksyczny wzrost P. stipitis, oznacza-jący sekwencyjne wykorzystanie cukrów z pożywki – w pierwszej kolejności do zwiększenia swojej biomasy wykorzystywane są heksozy, a dopiero po ich wyczerpa-niu rozpoczyna się fermentację pentoz. Połączenie tego faktu z bardzo szybkim przyrostem szczepu s. cerevi-siae sprawia, że drożdże Pichia są wypierane z hodowli zanim zdążą przetworzyć znajdujące się w podłożu cukry pięciowęglowe [28].

Przeprowadzone badania wykazały, że szczepy nie hamują wzajemnego wzrostu i nie wytwarzają toksyn killerowych, co daje możliwość swobodnego łączenia obu gatunków. Rozwiązanie pozostałych problemów wymagało jednak ingerencji człowieka w przeprowa-dzany proces. Dzięki mutagenizacji zmniejszono zna-cząco szybkość wzrostu drożdży s. cerevisiae w warun-kach tlenowych. Mikroorganizmy te hodowano na pożywce zawierającej YPG oraz bromek etydyny. Ety-dyna to związek chemiczny stosowany do interkalacji DNA (tworzenie się stabilnych kompleksów pomiędzy DNA, a planarnymi ligandami). Bromek etydyny ma

mutagenny wpływ na mitochondrialne DNA, odpowie-dzialne za syntezę enzymów biorących udział w proce-sie oddychania tlenowego. W rezultacie wyhodowano szczepy upośledzone oddechowo, które w porównaniu z wyjściowym gatunkiem charakteryzowały się dużo wolniejszym przyrostem biomasy, ale szybkim wyko-rzystywaniem glukozy z pożywki. Wystarczyło to do uzyskania stabilnego wzrostu drożdży s. cerevisiae, rów-nomiernie ze szczepem P. stipitis w warunkach odpo-wiedniego dla nich natlenienia. Ponadto dość szybkie wykorzystanie heksoz z podłoża, wymusiło wykorzys-tanie przez drożdże Pichia ksylozy jako podstawowego źródła węgla, a co za tym idzie zwiększenie wydajności jej fermentacji [24].

5. drożdże Pichia w procesie fermentacji wybranych produktów spożywczych

Fermentację produktów spożywczych z udziałem drożdży stosuje się od bardzo dawna. Z biegiem lat proces ten był poddawany modyfikacjom i udoskona-lany w celu zwiększenia jego wydajności. Zdolność do fermentacji posiada wiele gatunków drożdży, ale tylko niektóre z nich stosowane są w przemyśle. Większość win produkowanych na świecie to wynik działalności szczepów szlachetnych, które charakteryzują się dość dużą odpornością na powstały etanol oraz wytwarzają mniejszą ilość ubocznych produktów fermentacji.

Drożdże z rodzaju Pichia to mikroorganizmy dzikie, naturalnie bytujące na owocach i posiadające zdolność przeprowadzania procesu fermentacji alkoholowej. Nic więc dziwnego, że są one zaangażowane w naturalną fermentację zacierów i moszczów owocowych. Szczepy Pichia szczególną aktywność wykazują na początku pro-cesu, wraz z innymi drożdżami spoza rodzaju saccharo-myces rozpoczynają fermentację. Ich aktywność w miarę upływu czasu maleje, ze względu na coraz większe stę-żenie etanolu, na który są wrażliwe. W zależności od szczepu, podczas fermentacji drożdże z rodzaju Pichia produkują podwyższone ilości związków tiolowych [2], fenolowych [34] oraz inne substancje odpowiedzialne za aromat, takie jak octan etylu [16]. Generalnie przyjmuje się, że obecność w winach poniżej 150 mg/l octanu etylu pozytywnie wpływa na aromat wina [38], jednocześnie związek ten wykazuje działanie przeciwgrzybiczne. Zbyt duże stężenie octanu etylu powoduje pojawienie się nieprzyjemnego octowego posmaku. Dlatego pomimo, że w niektórych krajach (np. Indie) dzikie szczepy z rodzaju Pichia stosowane są w tradycyjnej fermenta-cji win owocowych, to w Europie, w przemysłowej jego produkcji są raczej uważane za mikroorganizmy dzikie i niepożądane [8, 16, 39].

Drożdże z rodzaju Pichia posiadają również zdol-ność do wytwarzania toksyn killerowych. W ostatnich


latach tego typu organizmy coraz częściej stosowane są w winiarstwie. Wykorzystuje się zdolność ich toksycz-nego działania na drożdże dzikie, zapewniając stabil- ność biologiczną powstającemu produktowi. Znajdują one także zastosowanie jako kultury starterowe do produkcji wina i piwa, a ich właściwości pozwalają sku-tecznie zwalczać zakażenia spowodowane przez szkod-liwą mikroflorę [42].

Szczepy Pichia wykorzystywane są podczas trady-cyjnej fermentacji kakao. Należą one do naturalnej mikroflory ziaren kakaowca, a co za tym idzie uczest-niczą także w procesie ich przetwarzania. Strączki kakao są zbierane i rozłamywane, aby wydobyć z nich osadzone w miąższu ziarna. Na początku są one jałowe, ale w momencie rozłamywania zostają zakażone róż-norodnymi mikroorganizmami z owadów, rąk robotni-ków, środków transportu itp. Otaczający ziarna miąższ poddawany jest procesowi fermentacji, którego celem jest wydobycie związków odpowiedzialnych za barwę i smak. Początkowe warunki beztlenowe, niskie pH i wysokie stężenie cukru w miąższu sprzyjają działal-ności drożdży (m.in. z rodzaju Pichia) oraz bakterii mle-kowych, które fermentują zawarte w nim cukry odpo-wiednio do alkoholu etylowego i kwasu mlekowego oraz innych komponentów. Powstały w ten sposób etanol, w miarę powstawania warunków tlenowych, utleniany jest przez bakterie octowe do kwasu octowego. Oprócz drożdży z rodzaju Pichia, w procesie tym biorą udział także inne gatunki drożdży, m.in. s. cerevisiae, Schizo-saccharomyces pombe, candida krusei oraz Kloeckera apiculata. Podczas fermentacji drożdże rozmnażają się dosyć gwałtownie i są w stanie przetrwać dalsze etapy, takie jak suszenie lub przechowywanie. Późniejsza obróbka ziarna polega na jego czyszczeniu, a następnie ogrzewaniu w celu oddzielenia łuski. W wywołanej tym procesem wysokiej temperaturze dochodzi do zmniej-szenia liczby pozostałych jeszcze na ziarnie mikroorga-nizmów, głównie drożdży i innych grzybów. Następnie ziarna są oddzielane od łusek i poddawane procesowi palenia. Upalone ziarna mieli się na masę kakaową [23].

Innym produktem spożywczym, w którego natural-nej fermentacji uczestniczą drożdże z rodzaju Pichia są oliwki stołowe. Podobnie jak w przypadku kakao, fer-mentacja oliwek przebiega z udziałem mikroorganiz-mów naturalnie na nich występujących. Owoce surowe charakteryzują się dość ostrym smakiem, przeznaczone do bezpośredniego spożycia zrywa się z drzewa oliw-nego jeszcze w stanie niedojrzałym, a następnie pod-daje procesowi fermentacji (przebiegającej w słonej zalewie) w celu złagodzenia smaku oraz nadania pożą-danej barwy. Pomimo, że w przemysłowej fermentacji oliwek, główne znaczenie mają szlachetne szczepy głów-nie s. cerevisiae, drożdże z rodzaju Pichia pełnią inne ważne role. Udowodniono, że wyizolowany podczas fermentacji szczep P. anomala produkuje bioaktywne

antyoksydanty, przyczyniając się do opóźnienia pro-cesu utleniania substancji tłuszczowych. Ponadto droż-dże z rodzaju Pichia ze względu na aktywność killerową oraz dość dobrą przeżywalność w wodnych roztworach NaCl (do 8%) wykorzystuje się jako naturalny czynnik kontroli fermentacji oraz eliminacji szkodliwych mikro-organizmów. Jest to bardzo ważne w technologii spo-żywczej, ponieważ pozwala na częściowe ograniczenie dodatku soli i konserwantów [3].

6. znaczenie i wykorzystanie toksyn killerowych wytwarzanych przez różne gatunki drożdży Pichia

Niektóre gatunki drożdży mają zdolność wytwarza-nia tzw. toksyn killerowych, białek które ułatwiają szcze-pom w zasiedlaniu nowych środowisk, a także w walce o składniki odżywcze. Odkrycie tego zjawiska miało miejsce na początku lat 60-tych w drożdżach s. cerevi-siae, wkrótce cechę killerową wykryto także u innych rodzajów, m.in. candida, hansenula, Kloeckera, Kluy-veromyces, rhodotorula, sporidiobolus, Torulopsis oraz Zygosaccharomyces. Toksyny wydzielane przez poszcze-gólne gatunki różnią się między sobą rozmiarem cząs-tek, strukturą kodujących je genów, mechanizmem działania i uśmiercania komórek wrażliwych, a także odpornością na enzymy proteolityczne oraz substancje chemiczne. Stwierdzono także różnice u poszczególnych szczepów w mechanizmie oporności na produkowaną przez siebie toksynę [29].

Zjawisko killerowe odkryto także u drożdży z rodzaju Pichia. Dokładny mechanizm ich tworzenia i dzia-łania nie jest jeszcze do końca poznany. Stwierdzono, że toksyny działają na ścianę komórkową ofiary, powo-dując powstawanie w niej otworów, wyciek materiału komórkowego, a co za tym idzie śmierć mikroorga-nizmu. Każdy element ściany komórkowej może stać się potencjalnym receptorem dla białek killerowych. Przyjmuje się, że niektóre toksyny produkowane przez przedstawicieli rodzaju Pichia, wykazują aktywność β-1,3-glukanazy i powodują hydrolizę β-1,3-glukanów znajdujących się w ścianach komórkowych wrażliwych szczepów drożdży. Prowadzi to do powstania porów w ścianie komórkowej, wycieku zawartości komórki i jej śmierci [22].

Produkowane przez różne szczepy Pichia toksyny killerowe charakteryzują się odmiennymi właściwoś-ciami, a ich produkcja uzależniona jest również od składu pożywki hodowlanej. Toksyny produkowane przez szczep P. anomala charakteryzują się dość dużą termo stabilnością i są aktywne w szerokim zakresie pH. Optymalnie działają w środowisku kwaśnym (ok. 4,5), a dezaktywacji ulegają dopiero w pH ponad 7. Natomiast białka killerowe wydzielane przez drożdże P. membrani-faciens, wykazują dużo mniejszą odporność na zmiany


środowiska. Udowodniono, że ich optimum tempe-raturowe wynosi 20°C, ale już przy 25°C ich aktyw-ność maleje, nawet o 70%. Podobnie zjawisko dotyczy odczynu pH, toksyny killerowe tego gatunku bardzo dobrze działają przy pH 4, lecz już przy 4,5 następuje drastyczny spadek ich aktywności. Przy pH 6 białka nie wykazują już żadnego działania [36].

Toksyny killerowe produkowane przez szczep Pichia i inne drożdże znajdują coraz szersze zastosowanie w różnych gałęziach przemysłu. W technologiach spo-żywczych drożdże produkujące tego typu białka mogą służyć do sterowania procesem fermentacji, mogą być wykorzystywane jako kultury starterowe w produk-cji wina lub piwa, a także zwalczać zakażenia mikro-biologiczne. Ponadto wykorzystuje się je w produkcji win musujących, w celu przyspieszenia autolizy ko- mórek drożdży podczas wtórnej fermentacji. W medy-cynie białka killerowe znajdują zastosowanie jako leki przeciwgrzybiczne [29].

Coraz częściej szczepy drożdży killerowych stosuje się podczas przechowywania warzyw i owoców, które są szczególnie narażone na zakażenia mikrobiologiczne oraz do ochrony roślin przed chorobami spowodowa-nymi zakażeniami grzybowymi. Do zwalczania pleśni najczęściej stosuje się środki chemiczne tzw. fungicydy. Niektóre gatunki grzybów mikroskopowych są jed-nak odporne na powyższe substancje, czego przykła-dem mogą być niektóre szczepy grzyba Botrytis cine-rea, okreś lanego mianem „szarej pleśni”. Jak niedawno odkryto, grzyb ten jest jeednak wrażliwy na toksyny killerowe wytwarzane przez drożdże z rodzaju Pichia, w tym najbardziej na te wydzielane przez P. stipitis. Spo-śród 18 szczepów różnych szczepów drożdży użytych przez Wa g n e r a [43] do zwalczania „szarej pleśni” na owocach jabłoni, po 5 dniach hodowli najlepsze rezul-taty uzyskano właśnie z udziałem szczepu P. stipitis. Hamował on rozwój grzyba, aż o 98,5%. Pozostałe testo-wane szczepy również wykazywały dość wysoki poziom ochrony, jednakże tylko w początkowej fazie badań. Po 10 dniach działanie ochronne drożdży malało, choć nadal hamowały one rozwój martwicy owoców i wzrost grzybni. Wciąż najsilniej oddziaływał szczep P. stipitis, w którego przypadku plamy nekrotyczne były mniejsze od kontrolnych o 82%. W pozostałych kombinacjach hamowanie nekrozy wynosiło od 35 do 43 %, a na pla-mach pojawiała się pleśń [37, 44].

Innym poważnym problemem zagrażającym ludziom, którego źródłem może być żywność są mikotoksyny. Najgroźniejsze z nich to aflatoksyny, wytwarzane przez pleśnie z rodzaju Aspergillus, głównie szczepy A. fla-vus i A. parasiticus. Aflatoksyny mogą pojawiać się na roślinach jeszcze przed zbiorem. Zakażenie może rów-nież nastąpić później jeśli dopuści się do zawilgocenia, które jest idealnym środowiskiem do rozwoju pleśni wytwarzających te mikotoksyny. Aflatoksyny mają silne

działanie kancerogenne, ponadto mogą powodować poważne uszkodzenia nerek, wątroby oraz centralnego układu nerwowego. Obecnie nie ma całkowicie skutecz-nej metody zapobiegającej rozwojowi pleśni produku-jących aflatoksyny, dlatego wiele państw wprowadziło rygorystyczne normy odnośnie ich zawartości w żyw-ności oraz paszach [30].

Toksyczne właściwości mikotoksyn produkowanych przez pleśnie z rodzaju Aspergillus oraz brak skutecz-nej strategii eliminującej zagrożenie występowania ich w wielu produktach, zmusiły naukowców do badań nad metodą chroniącą surowce i żywność przed tymi sub-stancjami. Rozwiązaniem tego problemu mogą okazać się drożdże z gatunku P. anomala. Badania wykazały, że szczep ten skutecznie hamuje rozwój grzyba A. flavus, który jest głównym producentem aflatoksyn. Obserwa-cje wykazały, że drożdże P. anomala już w stosunkowo niewielkiej ilości (1:1) hamują wzrost pleśni o 70,6%, natomiast gdy są obecne w przewadze (50:1) ograniczają rozrost grzybni A. flavus w porównaniu z próbą kon-trolną, nawet o 99,5%. Wstępne testy tej metody, prze-prowadzane poza laboratorium, dały niezwykle obiecu-jące rezultaty. Spryskanie drzew pistacjowych żywymi komórkami P. anomala pozwoliło na zmniejszenie ilości patogennego grzyba żyjącego na zebranych później pista- cjach, aż o 97% w stosunku do owoców nie poddanych opryskowi. Wykorzystanie drożdży Pichia w walce z pleś-nią A. flavus – głównym producentem aflatoksyn, daje więc bardzo obiecujące wyniki i możliwe, że już w nie-długim czasie będzie stosowane na szerszą skalę [20, 21].

7. Wykorzystanie modyfikowanych szczepów Pichia pastoris do produkcji ludzkich glikoprotein

Drożdże z rodzaju Pichia stały się ostatnio bardzo ważne w przemyśle farmaceutycznym, wiąże się z nimi duże nadzieje w zakresie nowoczesnej, taniej produkcji wielu zaawansowanych leków. Wszystko to za sprawą szczepu P. pastoris, który, jak niedawno odkryto, po odpowiedniej modyfikacji ma zdolność wytwarzania ludzkich glikoprotein [5].

Glikoproteiny to białka związane kowalencyjnie z oli gosacharydami. Licznie występują u roślin, zwierząt i ludzi, gdzie mogą pełnić wiele ważnych funkcji. Wcho-dzą w skład płynów ustrojowych i białek błonowych, mogą pełnić także funkcję receptorów na powierzchni komórek i brać udział w przekazywaniu sygnałów z i do komórki. Głównymi przedstawicielami glikoprotein są przeciwciała i substancje grupowe krwi, białka surowicy, różne enzymy (np. glukoamylaza) oraz hormony biał-kowe. Ze względu na liczne funkcje jakie mogą pełnić w organizmie są głównymi składnikami wielu ważnych farmaceutyków jak np. leki przeciwzakrzepowe, hormo-nalne, wspomagające odporność czy szczepionki [5, 43].


Dotychczas ludzkie glikoproteiny wytwarzane były tylko laboratoryjnie, przez komórki ssaków, ponieważ tylko w nich dochodziło do prawidłowej ich syntezy. Był to proces skomplikowany i kosztowny, ze względu na sposób późniejszego izolowania powstałych glikopro-tein. Najłatwiejszą i najbardziej opłacalną metodą ich otrzymywania była by więc produkcja przy udziale zmo-dyfikowanych mikroorganizmów – bakterii lub drożdży. Problem w tym, że te pierwsze nie mają zdolności syn-tezy glikoprotein, a drożdże wytwarzają ludzkie białko, ale w sposób inny niż organizm ludzki, dołączają do niego cukry. Problem został rozwiązany poprzez mody-fikację drożdży P. pastoris. Wyłączono ich własny sys-tem odpowiedzialny za przyłączanie oligosacharydów do produkowanych białek, a do ich komórek wszcze-piono fragmenty DNA odpowiedzialne za syntezę pięciu enzymów. Enzymy te nadzorowały przyłączanie cukrów do białek, w taki sposób, że w efekcie otrzymywaliśmy glikoproteiny identyczne do produkowanych przez orga-nizm ludzki. Dodatkową zaletą tej metody, jest fakt, że szczep P. pastoris wytwarza bardzo duże ilości gliko-pro tein – z jednego litra hodowli można uzyskać nawet kilka gramów leku. Ponadto rosną one na najprost-szych pożywkach, a produkowane białko wydzielają na zewnątrz komórek do podłoża na którym są hodowane. Dzięki temu izolacja i oczyszczanie otrzymanych gli-koprotein jest niezwykle łatwa, co sprawia, że proces ten jest o wiele tańszy. Jeżeli metodę tą uda się zastoso- wać na szerszą skalę, to niektóre leki na bazie ludzkich glikoprotein mogą stać się tańsze nawet kilkadziesiąt razy [5, 6, 19].

8. podsumowanie

Celem pracy było przedstawienie znaczenia i sposo-bów wykorzystania drożdży z rodzaju Pichia. Okazuje się, że ich ogromna różnorodność gatunkowa, sprawia, że znajdują one zastosowanie w wielu gałęziach trady-cyjnego i nowoczesnego przemysłu.

Świetnie sprawdzają się w różnych dziedzinach bio- technologii, ze względu na dużą szybkością wzrostu, łatwość prowadzonych z ich udziałem modyfikacji posttranslacyjnych, niską immunogennością. Niskie wymagania pokarmowe, możliwość kontroli wytwa-rzanego białka poprzez modyfikowanie źródła węgla oraz stosunkowo proste oczyszczanie otrzymanego produktu, sprawiają, że są z powodzeniem stosowane do produkcji białek rekombinowanych. Dzięki zdol-ności do fermentacji ksylozy i L-arabinozy, szczepy Pichia wspólnie z innymi drożdżami wykorzystuje się do wydajnej fermentacji bioetanolu z surowców roślin-nych. W przemyśle spożywczym biorą udział w natu-ralnej fermentacji różnych produktów, jak kakao czy oliwki. Mają zdolność wytwarzania związków odpo-

wiedzialnych za aromat, rybonukleotydów i nukleoty-dów stosowanych jako wzmacniacze smaku oraz anty-oksydantów opóźniających proces utleniania tłuszczy. Można z ich pomocą sterować procesem fermentacji oraz walczyć ze szkodliwą mikroflorą żywności. Dzięki zdolności do wytwarzania toksyn killerowych, drożdże z rodzaju Pichia stosuje się do eliminacji szkodliwych pleśni mikotoksynotwórczych, a pośrednio ich kance-rogennych metabolitów.

W przemyśle farmaceutycznym wykorzystywane są do produkcji leków antybakteryjnych i przeciwgrzybicz-nych. Dzięki przedstawicielom rodzaju Pichia łatwiejsza stała się również produkcja glikoprotein i leków wytwa-rzanych na ich bazie.

To wszystko tylko mała część możliwości drożdży z rodzaju Pichia. Wciąż trwają badania mające na celu udoskonalenie już znanych i znalezienie nowych zasto-sowań dla tych mikroorganizmów. Wiąże się z nimi wiele nadziei w zakresie nowoczesnych technologii w różnych gałęziach światowego przemysłu.

Praca badawcza finansowana w ramach tematu „Wykorzysta-nie toksyn killerowych drożdży z rodzaju Pichia do zwalczania zakażeń grzybowych w winiarstwie” (nr N N312 211336) w latach 2009–2011 jako projekt badawczy.

piśmiennictwo

1. Agbogbo F.K., Coward-Kelly G., Torry-Smith M., Wenger K., Jeffries T.W.: The Effect of Initial Cell Concentration on Xylose Fermentation by Pichia stipitis. Appl. Biochem. Biotechnol. 137–140, 653–662 (2007)

2. Anfang N., Brajkovich M., Goddard M.: Co-fermentation with Pichia kluyveri increases varietal thiol concentrations in Sauvig-non Blanc. Aust. J. Grape Wine res. 15, 1–8 (2009)

3. Arroyo-López F.N., Querol A., Bautista-Gallego J., Garrido--Fernández A.: Role of yeasts in table olive production. int. J. Food Microbiol. 128, 189–196 (2008)

4. Bengtsson O., Hahn-Hägerdal B., Gorwa-Grauslund M.F.: Xylose reductase from Pichia stipitis with altered coen-zyme preference improves ethanolic xylose fermentation by recombinant saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels, 2, 9 (2009)

5. Bretthauer RK.: Genetic engineering of Pichia pastoris to huma-nize N-glycosylation of proteins. Trends Biotechnol. 21, 459–462 (2003)

6. Bretthauer R.K., Castellino F.J.: Glycosylation of Pichia pastoris – derived proteins. Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 193–200 (1999)

7. Burkiewicz A., Dąbrowski S., Barski P.: Polska rekombinowana proteinaza K. Post. Biochem. 53, 327–328 (2007)

8. Chavan P., Mane S., Kulkarni G., Shaikh S., Ghormade V., Nerkar D.P., Shouche Y., Deshpande M.V.: Natural yeast flora of different varieties of grapes used for wine making in India. Food Microbiol. 26, 801–808 (2009)

9. Chen Ch., Wu P., Huang Ch., Cheng K.: A Pichia pastoris fermentation strategy for enhancing the heterologous expres-sion of an Escherichia coli phytase. Enzyme Microb. Tech. 35, 315–320 (2004)


10. Chandrakant P., Bisaria V.S.: Simultaneous bioconversion of cellulose and hemicellulose to ethanol. crit. rev. Biotechnol. 18, 295–331 (1998)

11. Chmielewska J., Dziuba E.: 2003. Respiratory deficient mutants of xylose-fermenting yeast – obtainment and features. Electron. J. Pol. Agric. Univ. 6 (02), #1.

12. Cieśliński H., Filipowski P., Kur J., Lass A., Wanarska M.: Hodowla mikroorganizmów rekombinowanych – produkcja białek w komórkach drożdży Pichia pastoris. (w) Podstawy mikrobiologii przemysłowej. Ćwiczenia laobratoryjne, red. H. Cieśliński, P. Filipowski, J. Kur, A. Lass, M. Wanarska, Wyd. Politechniki Gdańskiej, Gdańsk, 2007, s. 52–58.

13. Dagbagli S., Goksungur Y.: Optimization of β-galactosidase production using Kluyveromyces lactis NRRL Y-8279 by response surface methodology. Electron. J. Biotechnol. 11, (2008)

14. Daly R., Hearn M.T.W.: Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engi-neering and production. J. Mol. recognit. 18, 119–138 (2005)

15. Deak T.: Classification of Yeasts (w) Handbook of Food Spo-ilage Yeast. Taylor & Francis Group, New York, 2008, s. 13–36.

16. Fredlund E., Druvefors U.A., Olstorpe M.N., Passoth V., Schnürer J.: Influence of ethyl acetate production and ploidy on the anti-mould activity of Pichia anomala. FEMs Microbiol. Lett. 238, 133–137 (2004)

17. Grajek W., Gumienna M., Lasik M., Czarnecki Z.: Perspektywy rozwoju technologii produkcji bioetanolu z surowców skrobio-wych. Przem. chem. 87, 1094–1101 (2008)

18. Grootjen D.R.J., Meijlink L.H.H.M., van der Lans R.G.J.M., Luyben K.Ch.A.M.: Cofermentation of glucose and xylose with immobilized Pichia stipitis and saccharomyces cerevisiae. Enzyme Microb. Tech. 12, 860–864 (1990)

19. Hamilton S.R., Bobrowicz P., Bobrowicz B., Davidson R.C., Li H., Mitchell T., Nett J.H., Rausch S., Stadheim T.A., Wisch-newski H., Wildt S., Gerngross T.U.: Production of complex human glycoproteins in yeast. science, 29, 1244–1246 (2003)

20. Hua S.S.T., Brandl M.T., Hernlem B., Eng J.G., Sarreal S.B.L.: Fluorescent viability stains to probe the metabolic status of afla-toxigenic fungus in dual culture of Aspergillus flavus and Pichia anomala. Mycopathologia, 24, 26–32 (2010)

21. Hua S.S.T.: Progress in prevention of aflatoxin contamina-tion in food by preharvest application of a yeast strain, Pichia anomala WRL-076, (w) Modern Multidisciplinary Applied Micro biology: Exploiting Microbes and Their Interactions, red. A. Mendez-Vilas, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Niemcy, 2008, s. 322–326.

22. İzgü F., Altınbaya D., Acun T.: Killer toxin of Pichia anomala NCYC 432; purification, characterization and its exo-β-1,3-glucanase activity. Enzyme Microb. Tech. 39, 669–676 (2006)

23. Jespersen L., Nielsen D.S., Honholt S., Jakobsen M.: Occurrence and diversity of yeasts involved in fermentation of West African cocoa beans. FEMs Yeast res. 5, 441–453 (2005)

24. Kordowska-Wiater M., Targoński Z.: Wykorzystanie upośle-dzonych oddechowo mutantów saccharomyces cerevisiae do łącznej fermentacji glukozy i ksylozy wspólnie z drożdżami Pichia stipitis. Biotechnologia, 39, 94–102 (1997)

25. Kordowska-Wiater M., Targoński Z., Jarosz A.: Biotransforma-cja L-arabinozy do arabitolu przez drożdże z rodzaju Pichia i candida. Biotechnologia, 80, 177–188 (2008)

26. Kulikowska D., Klimowski K.: Produkcja bioetanolu z odpa- dów lignocelulozowych – możliwości i ograniczenia. Gaz, Woda i Technika sanitarna, 2, 24–28 (2008)

27. Kurtzman C.P., Fell J.W.: The yeasts, a taxonomic study. Elsevier Science. Amsterdam, 1998.

28. Laplace J.M., Delgenes J.P., Moletta R. Navarro J.M.: Effects of culture conditions on the co-fermentation of a glucose and

xylose mixture to ethanol by a mutant of saccharomyces diasta-ticus associated with Pichia stipitis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39, 760–763 (1993)

29. Marquina D., Santos A., Peinado J. M.: Biology of killer yeasts. int. Microbiol. 5, 65–71 (2002)

30. Michałek M.: Mikotoksyny – zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Oddział Laboratoryjny Higieny Żywności i Żywie-nia, Kraków, 2009.

31. Mishra S., Singh R.: Yeast Genetics and Biotechnological Appli-cations (w) Yeast Biotechnology: Diversity and Applications, red. T. Satyanarayana, G. Kunze, Springer Verlag, New York, 2009, s. 324–355

32. Passoth V., Fredlund E., Druvefors U., Schnürer J.: Biotech-nology, physiology and genetics of the yeast Pichia anomala. FEMs Yeast res. 6, 3–13 (2005)

33. Rouhollah H., Iraj N., Giti E., Sorah A.: Mixed sugar fermenta-tion by Pichia stipitis, sacharomyces cerevisiae, and an isolated xylose fermenting Kluyveromyces marxianus and their cocul-tures. Afr. J. Biotechnol. 6, 1110–1114 (2007)

34. Sáez J.S., Lopes C.A., Kirs V.C., Sangorrín M.P.: Enhanced vola-tile phenols in wine fermented with saccharomyces cerevisiae and spoiled with Pichia guilliermondii and Dekkera bruxellensis. Lett. Appl. Microbiol. 51, 170–176 (2010)

35. Saha B. C., Bothast R. J.: Production of L-arabitol from L-ara-binose by candida entomaea and Pichia guilliermondii. Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 299–306 (1996)

36. Santos A., Marquina D.: Killer toxin of Pichia membranifaciens and its possible use as a biocontrol agent against grey mould disease of grapevine. Microbiology, 150, 2527–2534 (2004)

37. Santos A., Sanchez A., Marquina D.: Yeasts as biological agents to control Botrytis cinerea. Microbiol. res. 159, 331–338 (2004)

38. Satora P., Sroka P., Duda-Chodak A., Tarko T., Tuszyński T.: The profile of volatile compounds and polyphenols in wines produced from dessert varieties of apples. Food chem. 111, 513–519 (2008)

39. Satora P., Tuszyński T., Walczyk W.: Ogólna charakterystyka wybranych szczepów drożdży i pleśni wyizolowanych z sadu śliwkowego. XXXIII Sesja Naukowa KTiChŻ PAN, Lublin 2002.

40. Sybirny A., Sybirny W., Puchalski C.: Biopaliwowy etanol z lignocelulozy (biomasy roślinnej): osiągnięcia, problemy, perspektywy. Post. Nauk rolniczych, 4, 15–23 (2007)

41. Sybirny W., Puchalski C., Sybirny A.: Metaboliczna inżynieria drobnoustrojów do konstruowania wydajnych producentów bioetanolu z lignocelulozy. Biotechnologia, 79, 38–54 (2007)

42. Tood B. E. N., Fleet G. H., Henschke P. A.: Promotion of Auto-lysis Through the Interaction of Killer and Sensitive Yeasts: Potential Application in Sparkling Wine Production. Am. J. Enol. Viticult. 51, 65–72 (2000)

43. Vaalburg W., Hendrikse N.H., Elsinga P.H., Bart J., van Waarde A.: P-glycoprotein activity and biological response. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207, 257–260 (2005)

44. Wagner A., Kordowska-Wiater M., Hetman B.: Wpływ wybra-nych szczepów drożdży na rozwój szarej pleśni na owocach jabłoni. Post. ochron. roślin, 46, 625–628 (2006)

45. Wanarska M., Kur J.: β-D-galaktozydazy – źródła, właściwości i zastosowanie. Biotechnologia, 71, 46–62 (2005)

46. Wanarska M., Hildebrandt P., Kur J.: Drożdżowe systemy eks-presyjne jako narzędzie nowoczesnej mikrobiologii przemysło-wej. Post. Mikrobiol. 47, 249–256 (2008)

47. Zhang W., Hywood Potter K.J., Plantz B.A., Schlegel V.L., Smith L.A., Meagher M.M.: Pichia pastoris fermentation with mixed-feeds of glycerol and methanol: growth kinetics and production improvement. J. ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 210–215 (2003)

inforMacja dla autoróWo opłatach za prace publikowane w postępach Mikrobiologii

Uprzejmie informujemy PT Autorów PM, że zgodnie z decyzją Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów z dnia 6 lutego 2007 roku oraz z dnia 2 marca 2011 r. wprowadzono zasady płatności za prace przyjmowane do druku w naszym piśmie. Autorzy manuskryptów proszeni są o wnoszenie opłat w wysokości 250 PLN + VAT 23% – razem 307,50 PLN za każdy artykuł na konto Zarządu Głównego Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów:

bank pekao s.a. 18 1240 5992 1111 0000 4774 7434.

Opłatę można wnosić indywidualnie, po otrzymaniu informacji po zaakceptowaniu pracy do druku. W imieniu Autorów opłatę może wnosić sponsorująca instytucja, fundacja itp. Wtedy Autorzy zobowiązani są do złożenia w Redakcji wraz z manuskryptem pisemnego zobowiązania się do opłaty za publikację po otrzymaniu faktury VAT. Należy dodatkowo:

l Przesyłać dane do wystawienia faktury VAT (NIP, nazwa i adres instytucji lub osoby fizycznej) na nr faksu (022) 841-29 49, lub drogą pocztową na adres siedziby Zarządu PTM: 00-725 Warszawa ul. Chełmska 30/34.l Do dowodu wpłaty lub zobowiązania zapłaty dołączać informacje zawierające tytuł pracy i nazwisko autora korespondencyjnego.

XXVii zjazd polskiEgo toWarzystWa MikrobiologóW

5–8 września 2012 r. Lublin

W dniach 5–8.09.2012 r. odbędzie się XXVII Zjazd Polskiego Towarzystwa Mikrobiologóworganizowany przez Lubelski Oddział Polskiego Towarzystwa Mikrobiologów.

Miejsce obrad:

Uniwersytet Medyczny w Lublinie. Collegium Maius Lublin ul. Jaczewskiego 4.

SZCZEGÓŁOWE INFORMACJE DOTYCZĄCE ZJAZDUUKAŻĄ SIĘ NA STRONIE INTERNETOWEJ

www.microbiology.pl i w Postępach Mikrobiologii

W imieniu Komitetu Organizacyjnego XXVII Zjazdu Polskiego Towarzystwa Mikrobiologówprof. dr hab. Maria Kozioł-Montewka

Errata

Prawidłowy tytuł pracy Ł. Dziewita i D. Bartosika opublikowanej w zeszycie 2 (tom 50) 2011 na stronie 87–96 powinien brzmieć:

„genomy prokariotyczne w świetle analiz genomicznych”

Na str. 92, II kolumna, wiersz 16 od góryjest: ranspozony, powinno być transpozony

Autorów i czytelników przepraszamy

spis trEŚci

J. M. Ł o ś, G. Wę g r z y n – Enterokrwotoczne szczepy Escherichia coli (EHEC) i bakteriofagi kodujące toksyny Shiga . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

S. R y n a n s, T. D z i e c i ą t k o w s k i, G. M ł y n a r c z y k – Zakażenia ludzkimi poliomawirusami osób poddanych immunosupresji . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

B. D e r a - To m a s z e w s k a – Plazmidy i bakteriofagi występujące u bakterii salmonella . . . . . . . . . . . . . . 201M. M i z e r s k a - D u d k a, M. A n d r e j k o, M. K a n d e f e r - S z e r s z e ń – Przeciwwirusowe peptydy

kationowe człowieka i owadów . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209B. To k a r z - D e p t u ł a, T. Miller, W. D e p t u ł a – Cytokiny z rodziny interleukiny 1 . . . . . . . . . . . . . . . . 217M. Ż y ł o w s k a, A. W y s z y ń s k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Defensyny – peptydy o aktyw-

ności przeciwbakteryjnej . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223A. C z ę ś c i k, A. T r z c i ń s k a , J . S i e n n i c k a – Wirus odry – reakcje odpornościowe związane

z naturalnym zakażeniem oraz odpowiedzią poszczepienną . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235P. S a t o r a, M. W i ś n i e w s k i – Znaczenie przemysłowe drożdży z rodzaju Pichia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247

contEnts

J. M. Ł o ś, G. Wę g r z y n – Enterohemorrhagic strains of Escherichia coli (EHEC) and Shiga toxin- encoding bacteriophages . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

S. R y n a n s, T. D z i e c i ą t k o w s k i, G. M ł y n a r c z y k – Polyomavirus diseases of immunosuppressed patients . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

B. D e r a - To m a s z e w s k a – Plasmids and bacteriophages harboured by salmonella . . . . . . . . . . . . . . . . . 201M. M i z e r s k a - D u d k a, M. A n d r e j k o, M. K a n d e f e r - S z e r s z e ń – Antiviral cationic peptides

from human and insects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209B. To k a r z - D e p t u ł a, T. Miller, W. D e p t u ł a – The interleukin-1 family of cytokines . . . . . . . . . . . . . 217M. Ż y ł o w s k a, A. W y s z y ń s k a, E. K. J a g u s z t y n - K r y n i c k a – Antimicrobial peptides

– defensins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223A. C z ę ś c i k, A. T r z c i ń s k a , J . S i e n n i c k a – Measles Virus - immune response to natural

infection and vaccination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 235P. S a t o r a, M. W i ś n i e w s k i – Industrial significance of Pichia yeasts . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247

POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW · ENTEROKRWOTOCZNE SZCZEPY EschErichiA coLi (EHEC) I...

Documents

Transcript of POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW · ENTEROKRWOTOCZNE SZCZEPY EschErichiA coLi (EHEC) I...