Politechnika Gdańska, Inż Aminokwasy · Endogenne Warunkowo egzogenne* Egzogenne Arginina...

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: Podstawy Biotechnologii TECHNOLOGIA CHEMICZNA

Wykład 7 – Biotechnologie otrzymywania aminokwasów, witamin i polisacharydów

Aminokwasy

Ideogram kombu Bakterie Corynebacterium glutamicum

Początki biotechnologii wytwarzania aminokwasów – Japonia, 1957 – wyizolowaniebiotyno-zależnej bakterii C. glutamicum produkującej L-glutaminian



Aminokwasy

Aminokwasy białkowe



AminokwasyAminokwasy endo- i egzogenne dla człowieka i świnki morskiej

Endogenne Warunkowo egzogenne* Egzogenne

Arginina

Cysteina

Glutamina

Glicyna

Prolina

Tyrozyna

Histydyna

Izoleucyna

Leucyna

Metionina

Fenyloalanina

Treonina

Tryptofan

Walina

Alanina

Asparagina

Asparaginian

Glutaminian

Seryna

*w okresie niemowlęcym i w niektórych stanach chorobowych



Aminokwasy

Rynkowy obrót aminokwasami Zależność między wielkością produkcjia ceną aminokwasów

Politechnika Gdańska, Inżynieria BiomedycznaPrzedmiot: TECHNOLOGIA CHEMICZNA


Produkcja i zastosowanie najważniejszych aminokwasówPodstawy Biotechnologii Aminokwasy

Polepszacz smaku

Dodatek do pasz

Dodatek do pasz*

Dodatek do pasz

Dodatek do żywności, słodzik

Aspartam, polimery

Aspartam

Dodatek do żywności, farmaceutyki

Cysteina, farmaceutyki

Farmaceutyki

Słodzik, element budulcowy

Pasze, farmaceutyki

Farmaceutyki

Pestycydy, farmaceutyki

Farmaceutyki

Fermentacja

Fermentacja

Synteza chemiczna

Fermentacja

Synteza chemiczna

Kataliza enzymatyczna

Fermentacja

Redukcja cystyny, fermentacja

Ekstrakcja, fermentacja

Fermentacja, ekstrakcja


Fermentacja




Kwas L‐glutaminowy

L‐lizyna

D,L‐metionina

L‐treonina

Glicyna

Kwas L‐asparaginowy

L‐fenyloalanina

L‐cysteina

L‐cystyna

L‐arginina

L‐alanina

L‐tryptofan

L‐leucyna

L‐walina

L‐izoleucyna

1 200 000

600 000

550 000

40 000

16 000

14 000

13 000

4 500

3 500

2 000

1 500

1 200

1 200

1 000

500

Główne zastosowanieMetoda wytwarzaniaAminokwasSkala produkcji (tony/rok)

*pasze sojowe są ubogie w niektóre egzogenne aminokwasy, w tym L-Met i L-Lys



Aminokwasy

Szczepy bakteryjne produkujące aminokwasy są genetycznie zmodyfikowane

Nadprodukcję aminokwasów można osiągnąć dzięki:

- zwiększeniu przepuszczalności błony cytoplazmatycznej

- zmianom preferencji metabolicznych (zmiana kierunku syntezy w punktach rozgałęzienia szlaków

- dodatek prekursorów

- zmianę aktywności enzymów w obrębie szlaku biosyntezy

- zastosowanie mutantów auksotroficznych i regulatorowych

- konstrukcję szczepów metodami inżynierii genetycznej



AminokwasyKwas L-glutaminowy

Producenci: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum

Cechy producentów: duża aktywność dehydrogenazy glutaminianowejwydajne reakcje anaplerotycznemutanty o zwiększonej przepuszczalności błony

Procedury indukujące wydzielanie L-glutaminianu:

a) Hodowla w warunkach ograniczenia biotynyb) Dodatek penicylinyc) Dodatek lizozymud) Dodatek środków powierzchniowo-czynnyche) Zastosowanie mutantów auksotroficznych

wobec kwasu oleinowego i/lub glicerolu

Schemat sposobu działania technik indukujących wydzielanie L-glutaminianu



AminokwasyKwas L-glutaminowy

Schemat przepływu materiałów w zakładzie produkującym L- glutaminian

Produkt fermentacji - sól amonowa L-glutaminianuWyodrębnianie:

- oddzielenie komórek bakteryjnych- przepuszczenie roztworu przez

kolumnę anionitową (uwolnionyamoniak jest oddzielany przez destylację i zawracany do fermentacji)

- wymywanie z żywicy jonowymiennej roztworem NaOH. Produkt w postaci glutaminianu monosodowego (MSG)

Japońskie zakłady Kyowa Hakko wytwarzające aminokwasy.Z prawej strony 7 fermentorów (240 m3 każdy) do produkcjikwasu L-glutaminowego



L-lizynaAminokwasy

Producent: Corynebacterium glutamicum

Szlak biosyntezy L-lizyny jest wieloetapowy. Dwa pierwsze etapy wspólne dla biosyntezy L-lizyny, L-treoniny, L-metioniny i L-izoleucyny.Szczepy producenckie – mutanty ze zminimalizowaną biosyntezą „konkurencyjną”, posiadające białko eksportujące L-lizynę. Wydajność ponad 170 g L-lizyny z dm3 pożywki.Skład pożywki: źródło węgla – melasa, sacharoza lub hydrolizat skrobiowy; źródło azotu – siarczan amonu lub amoniak; czynniki wzrostowe z roślinnych hydrolizatów białkowychProdukt fermentacji – siarczan L-lizyny

Wyodrębnianie produktu:- 98,5% chlorowodorek L-lizyny po zastosowaniu chromatografii jonowymiennej,

zatężenia i krystalizacji- 50% roztwór alkaliczny L-lizyny po oddzieleniu biomasy, alkalizacji, filtracji

i zatężeniu -granulowany preparat zawierający 50% siarczanu L-lizyny po suszeniu rozpyłowymbrzeczki fermentacyjnej i granulacji



Aminokwasy

L-tryptofan

Możliwa metoda fermentacyjna, ale szerzej stosowana biokonwersja z użyciemmutanta E. coli o dużej aktywności syntazy tryptofanowej

NH

(CHOH)2CH2OP

+

NH3+

HOH2C COO-

syntaza tryptofanowa

NHNH3

+

COO-

O



Aminokwasy

L-tryptofan

Schemat przepływowy biosyntezy L-tryptofanu metodą biotransformacji z użyciem L-seryny otrzymywanejz melasy oraz indolu



Wytwarzany metodą enzymatyczną z użyciem L-aspartazyprzez japońską firmę Tanabe Seiyaku Co Ltd.

aspartaza+ L

H2N

COOH

CH2COOHH

NH3 C CCOOHH

HHOOCkwas fumarowy kwas L-asparaginowy

W procesie przemysłowym stosuje się komórki E. coli zawierające aktywną aspartazę, immobilizowanena usieciowanym κ-karagenie.

Reakcja jest egzotermiczna, więc prowadzi się ją w kolumnach chłodzonych przeciwprądowo.Substrat – roztwór fumaranu amonu.Produkt końcowy jest oczyszczany przez krystalizację. Przekrój bioreaktora kolumnowego

stosowanego do produkcji kwasu L-asparaginowego

AminokwasyKwas L-asparaginowy



Witaminy



Witaminy

Biosynteza i metabolizmwitaminy D3

Cholekalciferol regulujemetabolizm Ca(II) w nerkach, jelitachi kościach

Niedobór witaminy D3u dzieci objawia się krzywicą



Witaminy

Witamina A1, jej prekursor i pochodne



WitaminyWiele witamin otrzymywanych jest na drodze syntezy mikrobiologicznej

Witamina A – otrzymywane są prekursory: α-, β- iγ-karoten. Drożdże Rhodotorula gracilis, grzyby Blakeslea trispora, glony Chlorophyceae.

Witamina D2 – kalciferol. Otrzymywana jest prowitamina – ergosterol z drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae.

Witamina B2 – 70% z biosyntezy. Producenci: Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii

Witamina B12 – wyłącznie biosynteza. Bakterie fermentacji propionowej.

Ideowy schemat produkcji witaminy B2



Polisacharydy mikrobiologiczne

Egzopolisacharydy – produkowane jako metabolity wtórne i wydzielane pozakomórkowo) Obojętne: dekstran, skleroglukan, kurdlan, pululanKwasowe: ksantan, gellan, alginian (głównie glony)

Kolonie szczepu Pseudomonas mendocina produkujące alginian



Bakteryjne polisacharydy pozakomórkowe


Ksantan – wytwarzany przez Xanthomonas campestrisKudrlan – wytwarzany przez Agrobacterium, RhisobiumSkleroglukan – wytwarzany przez Sclerotium glucanium




Ksantan – Wytwarzany przez Xantomonas campestris. Stosowany jako dodatek do żywności: żelujący, stabilizujący, nadający lepkość. Składnik farb wodorozcieńczalnych, środek smarujący i stabilizujący zawiesiny płuczek wiertniczych w przemyśle naftowym.Główny producent – Kelco (USA)

Dekstran – glukan z wiązaniami głównie α(1→6). Wytwarzany przez enzym pozakomórkowyz Leuconostoc mesenteroides. Substrat – sacharoza.

Producent – Pharmacia. Zastosowanie – preparaty krwiozastępcze, adsorbent w opatrunkach, złoża chromatograficzne (m.in. Sephadex).

Skleroglukan – wytwarzany przez grzyby nitkowate Sclerotium. Rozpuszczalny w wodzie. Zastosowanie podobne jak ksantanu.

Kurdlan - wytwarzany przez bakterie Alcaligenes faecalis var. myxogenes. Nierozpuszczalny w wodzie. Tworzy żele po podgrzaniu zawiesiny do 55 °C. Środek żelujacy.

Pululan – glukan produkowany przez grzyb strzępkowy Aureobasideum pullulans. Do wyrobu foliibiodegradowalnych



Polisacharydy mikrobiologiczneProdukcja polisacharydów – hodowle okresowe, napowietrzane. Problememjest wzrost lepkości zawiesiny podczas produkcji egzopolisacharydu.

Schemat blokowy produkcji ksantanu



Oleje mikrobiologiczne

Lipidy zapasowe mająstrukturę triacylogliceroli




Mikroorganizmy olejodajne – wytwarzają i akumulują triacyloglicerole w ilościach przekraczających 20% suchej masy. Struktury różne, w tym z łańcuchami kwasów tłuszczowych nasyconych, nienasyconych, wielonienasyconych.

Szczególnie cenne:γ-linolowy 18:3n-6

arachidonowy (ARA) 20:4n-6

dokozaheksaenowy (DHA) 22:6n-6

Mieszanka ARA i DHA w odżywkach dla niemowląt

ARA i DHA nie występują w olejach roślinnych. Występują w olejach rybich, ale w towarzystwiekwasu eikozapentaenowego (EPA 20:5n-3), niekorzystnego dla niemowląt

Wytwarzane przez drobnoustroje. Technologia izolacji musi zapewniać jak minimallizacjęprocesów utleniania i rozkładu.




Komórki drożdży Apiatrichium curvatum wytwarzające i magazynujące duże ilości lipidów




Producenci olejów mikrobiologicznych bogatych w ARA – głównie grzyby strzępkowe, w tym Mortierella alpina. Trzy firmy: Suntory Co. Ltd w Japonii, Wuhan Alking Bioengineering w Chinach oraz DSM Food Specialities we Włoszech (95% światowej produkcji).

Producenci olejów mikrobiologicznych bogatych w DHA – glony Crypthecodinium cohniiOraz Schizochytrium (ten drugi zawiera też DPA 20:5n-6). Firmy: Martek Biosciences i Omega Tech Inc. z USA. Wykorzystywane szczepy mogące rosnąć w pożywce o niskim zasoleniu.



Proces akumulacji olejów w mikroorganizmach olejodajnych w hodowli okresowej





Schemat przedstawiający etapy procesu fermentacyjnego stosowanego do produkcji olejówmikrobiologicznych. Komórki po usunięciu ich z fermentora produkcyjnego są zbierane, suszonei na końcu ekstrahowane heksanem w celu oddzielenia oleju. Heksan usuwany przez destylacjęz parą wodną. Dalsza obróbka: RBD (rafinacja-odbarwianie-odwanianie)

Minimalizacja degradacji – szybkie przetwarzania, przechowywanie oleju i biomasy w niskiejtemperaturze i atmosferze azotu. Końcowy produkt – olej żółty (obecność karotenoidów) o przyjemnym smaku i zapachu. Dodatek antyoksydantów n(p. witamina E).

Politechnika Gdańska, Inż Aminokwasy · Endogenne Warunkowo egzogenne* Egzogenne Arginina...

Documents

Transcript of Politechnika Gdańska, Inż Aminokwasy · Endogenne Warunkowo egzogenne* Egzogenne Arginina...