POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO ...
Transcript of POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO ...
Noemí Tirado Bustillos
1
UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRÉS
MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS Y BIOMÉDICAS
MENCIÓN GENÉTICA TOXICOLÓGICA
POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA
GSTM1 Y LA GSTT1 COMO
MODIFICADORES DE RIESGO
MUTAGÉNICO EN AGRICULTORES
EXPUESTOS A PLAGUICIDAS
POSTULANTE: NOEMÍ SANDRA TIRADO BUSTILLOS
ASESORAS: MARÍA EUGENIA ASCARRUNZ G. MSc.
XIMENA AGUILAR M. MSc.
Noemí Tirado Bustillos
2
AGRADECIMIENTOS
Mis más sinceros agradecimientos a:
Institut de recherche pour le développement (IRD) por la beca de estudios otorgada dentro de la maestría. Todas las personas (agricultores, profesores y personal de salud) que participaron voluntariamente para la realización de este trabajo. Mis asesoras María Eugenia Ascarrunz y Ximena Aguilar por la colaboración y dedicación y principalmente por su amistad. Personal del Instituto de Genética, en especial a Ana Rada por colaborarme en la genotipificación de forma desprendida y desinteresada Profesora Catarina Takahashi por enviarme los primers para las pruebas de genotipificación y por su apoyo técnico Rafael Cervantes y Omar Huici del proyecto PLAGBOL por brindarme su colaboración para realizar las tomas de muestra de los participantes en el estudio Tribunal externo del documento escrito, Enrique Zamorano, Lucia Regina Ribeiro y Luz Stella Hoyos por sus valiosas sugerencias y contribuciones a este trabajo.
Noemí Tirado Bustillos
3
A mis queridos papás Hugo y Noemí
por su ejemplo de fortaleza y dedicación
y a mis amados Ferni, Stephie y Nathalie
por permitirme robarles el tiempo que le
pertenece para lograr realizaciones
profesionales
Noemí Tirado Bustillos
4
ABSTRACT Pesticides are one of the most frequently toxic chemicals found in the environment. Farmers exposed to pesticides suffer constant chronic exposure constitute a risk group, as was evident in the first study to assess genotoxic damage done these records showed the need for genetic susceptibility studies by determining the genotypes of biotransformation isoenzymes of pesticides and their relationship with the extent of damage to genetic material as modifiers of risk of future diseases such as cancer, In order to contribute to prevention policies in the health sector. In this paper we studied the frequency and the influence of polymorphisms of GSTM1 and GSTT1 on biomarkers of exposure and effect. In this study, 142 farmers and control subjects: 99 exposed and 43 not exposed to pesticides from four rural villages of the Department of La Paz. Cholinesterase levels were determined by a spectrophotometric method. The Micronucleus genotoxicity parameters in binucleated cells (MNBC) and sister chromatid exchanges (SCE) were evaluated from a culture of peripheral blood lymphocytes. Genotyping was performed from a blood sample from which genomic DNA was obtained and used the multiplex PCR method for determining GSTM1 and GSTT1 polymorphisms The frequency of SCE and MNBC and showed no statistically significant data, however to make the study found that people in the community of Palca there are higher values in the frequency of MN with a statistically significant difference in relation to Caranavi (p=0.000), the analysis showed SCE communities more in Caranavi Palca regarding statistically significant differences (p = 0.004). With regard to the cytogenetic parameters analyzed, the effect of GSTM1 null genotype frequency of micronuclei shows lower values than those of GSTM1 genotype positive but not statistically significant p = 0.075Escuchar Leer fonéticamente Regarding GSTT1 null genotype that showed a MN frequency equal to the positive GSTT1 genotype. The combination of polymorphisms GSTM1/GSTT1 showed that the null genotype frequency of MN has both slightly lower in relation to genotype both positive. The influence of GSTM1 null on SCE showed a slight increase in the frequency of this parameter, although no statistical significance, while the influence of GSTT1 null on SCE showed a slight decrease compared to GSTT1 positive individuals. The analysis of the magnitude of association between polymorphisms of GSTs and other factors in addition to exposure to pesticides showed that alcohol consumption is a significant risk factor The analysis for calculating the magnitude of association between polymorphisms of GSTs and genotoxic damage shows that people with absence of GSTM1 increased the risk 0.38 times more than present genotoxic damage in relation to the population having the gene. This analysis for the GSTT1 polymorphism showed no association.
Noemí Tirado Bustillos
5
RESUMEN
Los plaguicidas son uno de los químicos tóxicos más frecuentemente encontrados en el ambiente. Los agricultores que están expuestos a los plaguicidas, sufren una exposición crónica constante constituyendo un grupo de riesgo, como se pudo evidenciar en un primer estudio de evaluación de daño genotóxico realizado, estos antecedentes mostraron la necesidad de realizar estudios de susceptibilidad genética a través de la determinación de los genotipos de las isoenzimas de biotransformación de plaguicidas y su relación con la magnitud de daño al material genético como modificadores de riesgo de futuras enfermedades, como el cáncer, con el propósito de contribuir a las políticas de prevención del sector salud. En el presente trabajo se estudió la frecuencia y la influencia de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 sobre los biomarcadores de exposición y efecto. En este estudio participaron 142 agricultores y sujetos control: 99 expuestos y 43 no expuestos a plaguicidas de cuatro poblaciones rurales del Departamento de La Paz. Los niveles de colinesterasa se determinaron por un método espectrofotométrico. Los parámetros de genotoxicidad de Micronúcleos en células binucleadas (MNCB) e Intercambios entre cromátides hermanas (ICH) se evaluaron a partir de un cultivo de linfocitos de sangre periférica. La genotipificación se realizó a partir de una muestra de sangre de donde se obtuvo DNA geonómico y se utilizó el método de PCR multiplex para determinar los polimorfismos GSTM1 y GSTT1. La frecuencia de MNCB y de ICH no mostraron datos estadísticamente significativos, sin embargo al realizar el estudio por poblaciones se observó que en la comunidad de Palca existen valores superiores en la frecuencia de MN con una diferencia estadísticamente significativa en relación a Caranavi (p=0,000), el análisis por comunidades de ICH mostró mayor número de en Caranavi en relación a Palca con diferencias estadísticamente significativas (p=0,004). Con relación a los parámetros citogenéticos analizados, el efecto del genotipo GSTM1 nulo en la frecuencia de micronúcleos muestra valores inferiores a los del genotipo GSTM1 positivo aunque estadísticamente no significativos p=0,075. Respecto al genotipo GSTT1 nulo este presentó una frecuencia de MN igual al genotipo GSTT1 positivo. La combinación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 mostró que el genotipo nulo de ambos presenta frecuencia de MN ligeramente inferior en relación al genotipo positivo de ambos. La influencia del GSTM1 nulo sobre los ICH se mostró como un ligero incremento en las frecuencias de este parámetro, aunque sin significancia estadística, mientras que la influencia del GSTT1 nulo sobre los ICH se mostró con una ligera disminución en relación a los individuos GSTT1 positivos. El análisis para el cálculo de la magnitud de asociación entre polimorfismos de las GSTs y daño genotóxico, muestra que la población con ausencia del GSTM1 incrementa el riesgo 0.38 veces más de presentar daño genotóxico en relación a la población que tiene el gen. Este análisis realizado para los polimorfismos de la GSTT1 no mostró ninguna asociación. El análisis realizado sobre la magnitud de asociación entre polimorfismos de las GSTs y otros factores adicionales a la exposición a plaguicidas mostró que, el consumo de alcohol es un factor de riesgo significativo.
Noemí Tirado Bustillos
6
INDICE
Abreviaturas……………………………………………………………………………………. 9
Indice de Tablas ……………………………………………………………………………… 10
Indice de Figuras………………………………………………………………………………. 11
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………. 12
2. ANTECEDENTES……………………………………………………………………… 15
2.1. CONCEPTO DE PLAGUICIDA…………………………………………………. 15
2.2. CLASIFICACIÓN DE LOS PLAGUICIDAS…………………………………... 16
2.3. EFECTOS ADVERSOS AL MEDIO AMBIENTE……………………………. 21
2.4. MOVIMIENTO DE LOS PLAGUICIDAS EN EL MEDIO AMBIENTE…. 23
2.5. METABOLISMO DE LOS PLAGUICIDAS EN EL ORGANISMO……… 25
2.6. EFECTOS ADVERSOS A LA SALUD……………………………………….. 26
2.7. LA EXPOSICIÓN A PLAGUICIDAS EN BOLIVIA…………………………. 32
2.8. EFECTOS SOBRE EL MATERIAL GENÉTICO…………………………… 33
2.8.1. ESTUDIOS DE GENOTOXICIDAD………………………………………….. 33
2.9. BIOMONITORIZACIÓN DE POBLACIONES HUMANAS EXPUESTAS
A AGENTES GENOTOXICOS………………………………………………….
35
2.10. SUSCEPTIBILIDAD GENÉTICA A LOS PLAGUICIDAS………………… 36
2.11. BIOMARCADORES……………………………………………………………… 38
2.11.1. CLASIFICACION DE BIOMARCADORES……………………………… 38
2.11.2. BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN…………………………………. 39
2.11.3. BIOMARCADORES DE EFECTO……………………………………….. 40
2.11.4. BIOMARCADORES DE SUSCEPTIBILIDAD………………………….. 46
2.11.4.1. LAS GLLUTATION S TRANSFERASAS………………………………….. 49
2.11.5. LA IMPORTANCIA DE LA PREVENCIÓN EN ONCOLOGÍA……….. 52
2.11.6. LA EPIDEMIOLOGÍA MOLECULAR AL SERVICIO DE LA
Noemí Tirado Bustillos
7
VALORACIÓN DE RIESGO……………………………………………….
53
2.11.7. LOS SISTEMAS DE DEFENSA QUÍMICA…………………………….. 55
2.11.8. POLIMORFISMOS DE SUSCEPTIBILIDAD EN ONCOLOGÍA……… 56
3. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………………. 58
3.1. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN………………………………………….. 3.2. HIPOTESIS……………………………………………………………………...
59
59
4. OBJETIVOS………………………………………………………………………….. 60
5. MATERIAL Y MÉTODOS…………………………………………………………….
5.1.DISEÑO DE ESTUDIO……………………………………………………. 5.2. POBLACIÓN ESTUDIADA……………………………………………….. 5.3. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS ……………………………………. 5.3.1. ELABORACIÓN DE LA ENCUESTA………………………………… 5.3.2. EVALUACION DE LA INFORMACION DE LA ENCUESTA…….. 5.3.3. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD COLINESTERASA…….. 5.3.4. EVALUACION DE DAÑO GENTOXICO……………………………… 5.3.5. ENSAYO DE MN EN LINFOCITOS DE SANGRE PERIFERICA........................................................................... 5.3.6. INTERCAMBIO ENTRE CROMATIDES HERMANAS……………. 5.3.7. GENOTIPIFICACIÓN DE LAS GLUTATION S- TRANSFERASAS…………………………………………………………. 5.4. ANALISIS ESTADÍSTICO…………………………………………………
61
61
61
62
62
63
63
63
64
66
67
72
6. RESULTADOS………………………………………………………………………….
6.1.ANÁLISIS DEMOGRÁFICO………………………….…………………… 6.2.BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN…………………………………. 6.3. BIOMARCADORES DE EFECTO…………………………….…………
73
73
78
79
Noemí Tirado Bustillos
8
6.4. BIOMARCADORES DE SUSCEPTIBILIDAD INDIVIDUAL………..
6.4.1. ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS DE LA GSTM1 Y LA
GSTT1 CON NIVELES DE COLINESTERASA…………………….
6.4.2.ASOCIACIÓN DE LOS POLIMORFISMOS DE LA GSTM1 Y
GSTT1 CON EL DAÑO GENOTOXICO………………….…………..
6.4.3. REGRESIÓN LOGÍSTICA………………………………………………
7. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………………
8. CONCLUSIONES…………………………………………………………………………..
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………….
ANEXOS……………………………………………………………………………………
83
87
87
98
99
113
114
132
Noemí Tirado Bustillos
9
LISTA DE ABREVIATURAS
AC CBN CYP CYP450 CBPI DNA dNTP EDTA EPA GSTs GSTM1 GSTT1 %HFC IARC ICH INSO IDN MN MNBN OMS OPS PCR PLAGBOL PRI RFLP SCE TBE
Aberraciones cromosómicas Células binucleadas Citocromo P Citocromo P 450 Indice de proliferación con bloqueo de la citocinesis Desoxiribonucleid acid Desoxirribonucleotidos Etilen diamino tetracético Agencia de protección ambiental de EUA Glutation transferasas Glutation transferasa M1 Glutation transferasa T1 Porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios Agencia Internacional de Investigación del cáncer Intercambios entre cromatides hermanas Instituto Nacional de Salud Ocupacional Indice de duplicación nuclear Micronúcleos Micronucleos en células binucleadas Organización Mundial de la Salud Organización Panamericana de la Salud Polymerase Chain reaction Plaguicidas Bolivia Proliferativ rate index Restriction fragment length polymorfisms Sister Cromatid exchange Buffer de tris-acido bórico EDTA
Noemí Tirado Bustillos
10
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según tipo de plaga a Controlar ………………………………………………………………………….
5
Tabla 2. Clasificación toxicológica de los plaguicidas según OPS …………….. 6 Tabla 3. Plaguicidas no recomendados por ser extremadamente tóxicos…….. 8 Tabla 4. Efectos crónicos de algunos plaguicidas………………………………….. 20 Tabla 5. Tipos de biomarcadores y funciones de salud pública………………… 27 Tabla 6. Polimorfismo genéticos de las glutatión S-transferasas …………….. 39 Tabla 7. Frecuencia del polimorfismo de la GSTM1 en diferentes poblaciones.. 41 Tabla 8. Cebadores utilizados en la PCR múltiple para la detección de los genotipos GST estudiados ……………………………………………………
59
Tabla 9. Ciclos de amplificación de la PCR múltiple para GSTs………………. 60 Tabla 10. Análisis demográfico de la población estudiada………………………. 64 Tabla 11. Descripción poblacional expuestos y control………………………….. 65
Tabla 12. Valores de colinesterasa por comunidad………………………………… 67 Tabla 13. Daño citogenético en linfocitos de la población estudiada……………. 68
Tabla 14. Daño citogenético en linfocitos según comunidad……………………. 69 Tabla 15. Frecuencia de los genotipos para GSTM1 y GSTT1 en la población Estudiada……………………………………………………………………….
72
Tabla 16. Frecuencias genotípicas de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 en la población por comunidad ……………………………………………………
73
Tabla 17. Frecuencia de polimorfismos GSTM1/GSTT1 en la población por Comunidad………………………………………………………………………
75
Tabla 18. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con la frecuencia de MN en linfocitos……………..………
77
Tabla 19. Asociación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 con la frecuencia de MN en linfocitos………………………………………………………………
78
Tabla 20. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el IDN…………………………………………………………
79
Tabla 21. Asociación de los genotipos de GSTM1/GSTT1 con el IDN………….. 79 Tabla 22. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el número de ICH…………………………………………..
80
Tabla 23. Asociación de los polimorfismos de la GSTM1 / GSTT1 con los valores de ICH………………………………………………………………
81
Tabla 24. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el %HFC…………………………………………………….
82
Tabla 25. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 / GSTT1 y su asociación con el %HFC………………………………………..
83
Tabla 26. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y GSTT1 y daño genotóxico ……………………………………………………………………….
84
Tabla 27. Magnitud de asociación entre polimorfismos y daño mutagénico… 84 Tabla 28. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y otros factores de riesgo……………………………………………………………………………
85
Tabla 29. Magnitud de asociación entre polimorfimsos GSTT1 y otros factores de riesgo…………………………………………………………………………
86
Noemí Tirado Bustillos
11
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación de los plaguicidas según su peligrosidad………….. 7 Figura 2. Posibles mecanismos de transporte y transformación de plaguicidas………………………………....................................
12
Figura 3. Formación de micronúcleos………………………………………. 34 Figuras 4 a y b. Linfocitos binucleados con un MN………………....... 55 Figuras 5 a y b. Metafases con ICH…………………………………………. 56 Figura 6. Gel representativos de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1… 60 Figura 7. Distribución de la población estudiada…………………………. 63 Figura 8. Porcentaje de plaguicidas utilizados…………………………….. 64 Figura 9. Valores de colinesterasa distribuidos por comunidad………. 67 Figura 10. MNBN en la población agrupada por sexo…………………… 69 Figura 11. MNBN en la población distribuida por comunidad…………. 70 Figura 12. IDN en la población distribuido por comunidad…………….. 70 Figura 13. ICH en la población distribuido por comunidad……………. 71 Figura 14. %HFC en la población distribuido por comunidad…………. 71 Figura 15. PRI en la población distribuido por comunidad……………. 72 Figura 16. Frecuencias de los polimorfismos GSTM1 distribuidos por Comunidad………………………………………………………….
74
Figura 17.Frecuencias de los polimorfismos GSTT1 distribuidos por comunidad…………………………………………………………….
74
Figura 18. Frecuencias de la asociación de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 por comunidad…………………………………………..
75
Figura 19. Micronúcleos según genotipo GSTM1 nulo/positivo……… 77 Figura 20. %HFC según genotipo nulo/positivo…………………………. 82
Noemí Tirado Bustillos
12
1. INTRODUCCIÓN. Los plaguicidas son productos químicos tóxicos utilizados para prevenir,
destruir o controlar cualquier plaga, incluyendo vectores de enfermedades
humanas y animales, además de especies indeseadas de plantas que causen
daño a la producción, procesado, almacenamiento, transporte o
comercialización de los alimentos. (Jors, 2005)
Los plaguicidas se utilizan principalmente en agricultura, pero también
son de uso doméstico, se utilizan en campañas de salud sobre todo para
controlar o erradicar enfermedades producidas por vectores (fiebre amarilla y
malaria). Los plaguicidas se han utilizado por miles de años como sustancias
naturales, claros ejemplos son el azufre, piretro y nicotina. Desde 1930
empezó la producción industrial de plaguicidas sintéticos, en el Manual de los
plaguicidas del año 1994 se registraron más de 1285 ingredientes activos.
(Jors, 2005)
Los plaguicidas son uno de los químicos tóxicos más frecuentemente
encontrados en el ambiente. Aunque el uso de plaguicidas refuerza la
productividad de la cosecha, los humanos también pagan un precio por los
beneficios, traducidos en efectos sobre la salud. Alrededor del mundo, se ha
informado anualmente 3 millones de envenenamientos agudos y 220 000
muertes, aproximadamente, por la exposición a plaguicidas (Au y col, 1999).
Además, se ha descrito que los granjeros con exposición prolongada a bajas
dosis de plaguicidas eventualmente desarrollan a largo plazo efectos sobre la
salud; similares a aquellos que han recibido exposiciones agudas con altas
dosis, por ejemplo, las anormalidades del comportamiento neuronal, resultados
reproductivos adversos, y aumento de la incidencia de cáncer (leucemia,
linfoma no Hodking, y mieloma múltiple). Por consiguiente la exposición
crónica a plaguicidas puede causar serios efectos a la salud de los agricultores
expuestos que no tengan historia de envenenamiento agudo.
Noemí Tirado Bustillos
13
Entre los diversos daños que puede sufrir el material genético, como
consecuencia de condiciones ambientales perjudiciales, están las mutaciones
puntuales y cromosómicas, que pueden propiciar la transformación celular. Si
tales alteraciones ocurren en proto-oncogenes o genes supresores de tumores,
involucrados en el crecimiento y diferenciación celulares, pueden propiciar el
desarrollo de cáncer en el órgano comprometido; contribuir al envejecimiento
prematuro, producir enfermedades vasculares, autoinmunes o degenerativas.
Si ocurren en la línea germinal, pueden originar problemas reproductivos
(infertilidad) y en la descendencia aumento de enfermedades genéticas, tanto
monogénicas como complejas. La evidencia toxicológica de la acción
mutagénica y carcinogénica de varios plaguicidas y la exposición ocupacional o
accidental de grandes poblaciones humanas a estos compuestos, han centrado
la atención de muchos estudios citogenéticos. En varios estudios que buscaron
evaluar el riesgo genético de exposición ocupacional se domostró una
asociación entre exposición ocupacional a plaguicidas y la presencia de
aberraciones cromosómicas y/o intercambios entre cromátides hermanas y/o
micronúcleos (Antonucci y De Sillus Colus, 2000; Au y col, 1999; Bolognesi y
col, 2003; Garaj-Vrhovac y Zeljesic, 2002; Paramjit y col, 2003; Pastor y col,
2001; Paz y Mino y col, 2002).
La susceptibilidad a la acción peligrosa de los químicos puede derivar de
las características genéticas o adquiridas del individuo. En el caso de
carcinógenos genotóxicos, puede asociarse susceptibilidad con diferencias
individuales, por ejemplo, ya sea, en la eficacia de metabolismo carcinogénico o
en la habilidad de reparar lesiones de ADN inducidas por el
carcinógeno.Algunos de los genes de susceptibilidad pueden tener ligeras
variaciones en su secuencia codificadora, es decir que son polimórficos. Si el
mismo alelo variante es heredado de ambos padres, el individuo es homocigoto
para este gen polimórfico, mientras que una combinación de alelos conduce a
heterocigocidad. (Marrs 1993; Vogel y col. 1997). En los heterocigotos, la
sensibilidad a los carcinógenos genotóxicos podría asociarse, por ejemplo, con
Noemí Tirado Bustillos
14
polimorfismo genético sutil que influye en los procesos de reparación del DNA,
aunque no se han encontrado tales rasgos todavía en la población humana.
Por otro lado, los estudios de diferencias individuales en metabolismo de
xenobióticos han revelado un número creciente de enzimas del polimorfismo
que están implicadas en el metabolismo de carcinógenos (Yasmashita, 1997;
Steenland, 1994).
La susceptibilidad genética a los efectos adversos de la exposición a
plaguicidas constituye un concepto nuevo e importante para futuros estudios y
aplicación, y puede representar la línea de corte de la investigación de los
efectos a salud de los plaguicidas. Puede ser un factor mediador para explicar
mecanismos para la salud de los trabajadores, variaciones en los resultados
entre grupos étnicos, y resultados de mezclas en estudios epidemiológicos. En
otras áreas de salud ambiental y evaluación de riesgo, los polimorfismos
genéticos han sido investigados como predictores de cáncer de pulmones en
fumadores (Cajas-Salazar y col., 2003), y la severidad del envenenamiento por
plomo en niños (Long y col., 2002). La búsqueda de metabolizadores lentos
genéticamente susceptibles ciertamente ofrece esperanza para prevenir el
cáncer en el futuro, educando a aquellos quienes son más susceptibles a
efectos a la salud por plaguicidas para limitar su exposición a estos
compuestos.
En Bolivia, la actividad agropecuaria representa uno de los principales
componentes de la economía. Este sector aporta el 21% del Producto Interno
Bruto contribuyendo con alrededor del 20% del total de las exportaciones.
Ocupa un poco más del 39% de la población económicamente activa,
abarcando una superficie cultivada por año agrícola de cerca de dos millones
de hectáreas. Durante los años 1997 y 1998, para una superficie de 1.241.621
has. (65 % de la superficie sembrada es dedicada al cultivo de la soya, arroz,
algodón, maíz, girasol, caña, tomate y papa), se utilizaron 6.762,88 toneladas
métricas, con un costo aproximado de 92.061 millones de dólares americanos.
Noemí Tirado Bustillos
15
En el año 2003 los registros de importación de insumos agropecuarios
mostraron un total de 17. 128. 402.79 kilogramos de los que alrededor de un
50% correspondieron a plaguicidas, sin tomar en cuenta la cantidad de ellos
que ingresan por la vía del contrabando, estimada en un 30% adicional. Este
importante uso de plaguicidas en Bolivia durante los últimos 40 años, se
traduce en la actualidad en la existencia de alrededor de 300 toneladas de
plaguicidas obsoletos encontrados a los largo del territorio, entre los que
figuran organoclorados, organofosforados, piretroides, ditiocarbamatos e
inorgánicos entre los principales, lo que implica un importante riesgo para la
salud. (Cervantes y col. 2006).
En vista de que en nuestro país los agricultores que están expuestos a
los plaguicidas, sufren una exposición crónica constante y además realizan
un manejo inadecuado de los mismos (sin normas de seguridad) constituyen
un grupo de riesgo, como se pudo evidenciar en un primer estudio de
evaluación de daño genotóxico realizado, estos antecedentes mostraron la
necesidad de realizar estudios de susceptibilidad genética a través de la
determinación de los genotipos de las isoenzimas de biotransformación de
plaguicidas y su relación con la magnitud de daño al material genético como
modificadores de riesgo de futuras enfermedades, como el cáncer, con el
propósito de contribuir a las políticas de prevención del sector salud.
2. ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO. 2.1 Concepto de plaguicida
Un plaguicida es cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a
prevenir, destruir o neutralizar una plaga, ya sea debida a insectos, roedores,
nemátodos, hongos, algas u otras formas de plantas terrestres o acuáticas,
animales, bacterias o virus.
Los plaguicidas no se restringen exclusivamente a un uso agrícola o
industrial, sino que también son importantes en sanidad, en la lucha contra
Noemí Tirado Bustillos
16
los vectores de enfermedades transmisibles y para combatir las especies que
interfieren en cualquier forma de producción, elaboración, almacenamiento,
transporte o comercialización de alimentos, productos agrícolas, madera y
derivados, entre otros. Muchos productos cotidianos del hogar son plaguicidas:
aerosoles y polvos para cucarachas y hormigas, repelentes de insectos de uso
personal, rodendicidas, matamoscas, collares antiparasitarios, detergentes
desinfectantes de baño, ropa, cocina, productos para saneamiento de piscinas,
etc.
2.2. Clasificación de los plaguicidas
Existen numerosas clasificaciones de los plaguicidas utilizados en la actualidad
y son complicadas debido a que constituyen un grupo muy heterogéneo.
2.2.1 Según el tipo de plaga que se quiere controlar
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según tipo de plaga a controlar
TIPO DE PLAGUICIDA ORGANISMO AL QUE INTERESA
CONTROLAR
Insecticida * Larvas de insectos, hormigas
Acaricida Ácaros
Avicidas Aves
Herbicidas Malezas
Nematicida Nemátodos
Molusquicida Moluscos
Rodenticida/Raticida Roedores
Bactericida / Bacteriostático Bacterias
Fungicida Hongos
*Son los más utilizados en la agricultura y en campañas de salud Pública. Modificado de Diagnóstico, tratamiento y prevención de intoxicaciones agudas por plaguicidas, PLAGBOL.
Noemí Tirado Bustillos
17
2.2.2. Según el grupo químico:
• Bipiridilos • Carbamatos • Compuestos organofosforados • Compuestos organoclorados • Compuestos organofosforados • Compuestos organomercuriales • Derivados del ácido fenoxiacético • Derivados del cloronitrofenol • Derivados cumarínicos • Piretrinas y piretroides • Tiocarbamatos y ditiocarbamatos • Triazinas • Otros
2.2.3. Clasificación Toxicológica de plaguicidas según la Organización
Mundial de la Salud (OMS, 1991)
La OMS ha recomendado, sujeta a actualizaciones periódicas, una clasificación
según su peligrosidad, entendiendo ésta como su capacidad de producir daño
agudo a la salud cuando se da una o múltiples exposiciones en un tiempo
relativamente corto. Esta clasificación se basa en la dosis letal media (DL50)
aguda, por vía oral o dérmica de las ratas. Sin embargo; un producto con un
baja dosis letal media (DL50) puede causar efectos crónicos por exposición
prolongada.
Tabla 2. Clasificación toxicológica de los plaguicidas según OPS
CLASE ORAL DERMICA SÓLIDOS* LIQUIDOS* SÓLIDOS* LIQUIDOS*
I a Extremadamente peligroso
Ib Altamente peligroso
II Moderadamente peligroso
III Ligeramente peligroso
5 o menos
5 a 50
50 – 500
Más de 500
20 o menos
20 – 200
200 – 2000
Más de 2000
10 o menos
10 – 100
100 – 1000
Más de 1000
40 o menos
40 – 400
400 – 4000
Más de 4000 *Estado físico del ingrediente o formulación que se clasifica. Fuente: International Programme of Chemical Safety. The WHO recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to classification 1990-1991. Geneva: IPCS. 1990 WHO/IPOCS/90
Noemí Tirado Bustillos
18
Ia Extremadamentetóxico
Ib Altamente tóxico
II Moderadamentetóxico
III Ligeramentetóxico
IV Menos tóxico
SU PELIGROSIDADES
EL COLORDE LA
ETIQUETA
Además de estas categorías existen otros tres grupos de plaguicidas:
a. Grupo V: incluye a aquellos productos que no implican un riesgo agudo
cuando se usan normalmente. Tienen un DL50 oral mayor o igual que
2000 mg/Kg en el caso de los sólidos y mayor o igual a 3000 mg/Kg en el
caso de líquidos.
b. Grupo VI: incluye a aquellos productos a los que no se les asigna
ninguna categoría por considerarlos obsoletos o discontinuados.
c. Grupo VII: incluye a los fumigantes gaseosos o volátiles. La clasificación
de la OMS no establece criterios para las concentraciones áereas en las
cuales pueda basarse la clasificación. La mayoría de estos compuestos
son de muy alta toxicidad y existen recomendaciones sobre límites de
exposición ocupacional en muchos países.
2.2.4. De acuerdo al grado de toxicidad
Esta clasificación es recomendada por la OMS y se refiere al riesgo o
peligrosidad del producto para la salud humana, una herramienta muy útil
para darse cuenta del peligro que representa el producto es el color de la
etiqueta (Huici, 2007).
Figura 1. Clasificación de los plaguicidas según su peligrosidad Fuente: Proyecto PLAGBOL
Noemí Tirado Bustillos
19
Tabla 3. Plaguicidas no recomendados por ser extremada o altamente tóxicos, según la clasificación de toxicidad aguda de la OMS
CLASE 1 A DE LA OMS (EXTREMADAMENTE
TÓXICO)
CLASE 1 B DE LA OMS (ALTAMENTE TÓXICO)
Aldicarb Óxido de arsénico Brodifacum Bromadialone Bromethalin Cianuro de calcio Captafol Clorfenvinfos Clormefos Clorfacinone Clortiofós Coumafós Crimidine CVP Cicloheximide DBCP Demefión O y S Demetón O y S Difenacum Difetialone Difolatan Dimefox Difacinone Disulfoton EPN Etoprop Etoprofós Etiltiometón Fanamifós Fensulfotión Flocoumafén Fonofós Fosthietán Hexaclorobenceno Leptrofós M74 Mbcp Mefosfolán
Aldoxicarb Aldrin Allyl alcohol Aminocarb Antu Azinphos ethyl Azinphos methyl Benfuracarb Bis (tributyltin) oxide Blasticidin S Bromophos ethyl Butocarboxim Cadusafos Calcium arsenate Carbofuran Carbophenotion 3-chloro-1,2´propanediol chloetocarb coumachlor coumatetralyl crotoxiphos DDVF DDVP Delnav Demeton-S-methyl Demeton-S-methylsulphón Dichlorvos Dicrotophos Dieldrin Dimetilan Dinoseb Dinoseb acetate Dinoterb Dioxathion DMTP DNBP DNBPA
Methiltriazothion Monocrotophos MPP Nicotine Nitrilacarb Omethoate Oxamyl Oxidometom-methyl Oxideporfós Paris green Pentachlorphenol Penylmercury Nitrate Pirimiphos ethyl Propaphos Propetaphos Sodium arsenite Sodium cyanite Strycnine TBYO Tefluthrin Thallium sulfate Thiofanox Thiomethon Thioxamil Triamiphos Triazophos Triazothion Vamidothion Warfarin Zinc phospide Efectos crónicos y ambientales Butachlor Campheclor Toxaphene Captán
Noemí Tirado Bustillos
20
Cloruro de mercurio Merkaptofós Metafós Mevinfós Paratión Metilparatión Fenilmercurio acetato Phorate Phosfolán Phosfamidón Prothoate Red squill Schradan Scilliroside Sodium fluoroacetate Sulfotep TEPP Terbufós Tiophós Thionazin Timet Tricloronat
DNOC EDDP Edifenphos Endrin ESP Famphur Fenthion Flucytrynate Fluoracetamide Formetanate Fosmethilan Furathiocarb Heptenophos Isazophos Isophenfos Isothioate Isoxathion Arsenato de plomo Mecarbam Oxido de mercurio Metamidophos Methidathion Methomyl Methyl-merkapto-phosteolovy Methyl-merkapto-phosoksid
Chordane y heptachlor Chlordimeform DDT Dimethoate Dinoseb EDB Ethylene bis dithiocarbamates (mancozeb, maneb, zineb, etc) haloxifop-ethoxyethil HCH BHC Lindane Mirex Nuarimol Prothiophos
2.2.5 La clasificación de oncogenicidad de la EPA (Environmental
Protection Agency de Estados Unidos) divide los plaguicidas en cinco
grandes categorías:
a) Conocido carcinógeno humano
b) Probable carcinógeno humano
c) Posible carcinógeno humano
d) No clasificado
e) Evidencia de no carcinógeno
La clasificación de IARC (International Agency for Research on Cancer)
es similar:
Noemí Tirado Bustillos
21
a) Grupo 1: carcinogénico en humanos
b) Grupo 2 a: probable carcinógeno en humanos
c) Grupo 2 B: posible carcinógeno en humanos
d) Grupo 3: no clasificable
e) Grupo 4: probablemente no carcinogénico en humanos
2.3. Efectos adversos al medio ambiente
Los plaguicidas producen graves daños al medio ambiente debido a las
propiedades de toxicidad, estabilidad y persistencia. Estas propiedades son las
que facilitan la contaminación de agua, suelo y aire unida a otros factores
como los propiciados por el hombre en su afán de dominio de la naturaleza e
industrialización; tal como ocurre en las siguientes formas de contaminación
(Cervantes, 2007):
1) Contaminación del agua
Puede producirse por la aplicación directa de plaguicidas a fin de utilizarlas
como cebo de peces, descarga de líquidos remanentes de la aplicación, desecho
de envases vacíos, inundación o desborde de ríos que alcanzan los lugares de
almacenamiento, desplazamiento de plaguicidas arrastrados por las lluvias
hacia los cauces, aplicaciones aéreas cercanas a los ríos y lagos y descarga de
residuos industriales. Esta contaminación ocasiona la pérdida de la flora y
fauna acuática, del recurso como fuente de agua y alimento y es causa de
intoxicaciones humanas y de animales (Castillo, 1995).
2) Contaminación del suelo
Por aplicación directa de plaguicidas en el suelo, goteo desde el vegetal, caída
desde el equipo aplicador, desecho de envases vacíos, arrastre por las gotas de
lluvia, derrame por accidente, contaminación de fuentes de agua, fototoxicidad
y por cadenas alimentarias. La evaluación del grado de contaminación del
suelo por plaguicidas es de particular importancia, debido a la transferencia de
estos contaminantes a los alimentos (Escriche, 1996). Muchos plaguicidas son
Noemí Tirado Bustillos
22
persistentes y poco degradables lo que les permite permanecer por muchos
años en el suelo. Esta contaminación afecta los microorganismos del suelo,
disminuye la descomposición de la materia orgánica, modifica la estructura de
los suelos, disminuye la fertilidad y finalmente favorece la erosión (García,
1997).
3) Contaminación del aire
Se produce por la aplicación aérea no controlada, pérdida durante el transporte
y durante la aplicación y por la evaporación de aguas contaminadas (ríos,
lagos, etc.). El movimiento del aire puede desplazar los contaminantes
atmosféricos desde sus sitios de origen a largas distancias, como las altas
concentraciones de insecticidas organoclorados y de PBC encontradas en
animales árticos y antárticos, procedentes de Centroamérica. Los plaguicidas
se volatilizan con facilidad durante la operación o inmediatamente después de
ella. (García, 1997).
4) Contaminación de los alimentos
La comunidad en general se expone continuamente a los plaguicidas debido a
la contaminación de los alimentos con estos productos. Pueden encontrarse
residuos de plaguicidas en los alimentos debido al uso excesivo de plaguicidas
en el sector agropecuario, la recolección de los productos agrícolas sin esperar
el intervalo de seguridad (o tiempo de carencia) entre la última aplicación de
plaguicida y la cosecha y por contaminación durante el almacenamiento,
transporte, expendio o la preparación de los alimentos (Castillo, 1995).
5) Resistencia de las plagas
Uno de los problemas más importantes que supone el uso continuo de
plaguicidas es la aparición de resistencias genéticas en los organismos que se
quieren combatir. Se estima que desde 1950, al menos 520 especies de
insectos y ácaros, 273 especies de malas hierbas, 150 enfermedades de
plantas, y 10 especies de roedores, han desarrollado resistencia genética a uno
Noemí Tirado Bustillos
23
o más plaguicidas (Miller, 1999). Probablemente los productos transgénicos
introducidos en el mercado hace pocos años, también creen resistencia.
2.4. Movimiento de los plaguicidas en el medio ambiente La manera en que se produzca la liberación de los plaguicidas al medio
ambiente, determinará su movimiento. La distribución inicial viene
condicionada por el método de aplicación, la cantidad del producto, la duración
y la frecuencia de aplicación. La topografía del terreno, el tipo y densidad de
vegetación, las condiciones del suelo y la proximidad de agua también son
factores importantes. Este conjunto de factores determinan la cantidad de
plaguicida que se distribuirá en aire, suelo, agua, plantas y animales. El
destino de los plaguicidas aplicados en recintos cerrados como los
invernaderos y edificios, será diferente de los aplicados en lugares abiertos.
Figura 2. Posibles mecanismos de transporte y transformación de plaguicidas en el ambiente Fuente: http://www.ine.gob.mx/dgicurg/plaguicidas/download/pytransporte.pdf.
Noemí Tirado Bustillos
24
Con el tiempo los plaguicidas pueden distribuirse en el lugar de aplicación,
moverse del lugar (aguas subterráneas, atmósfera, etc.), degradarse o persistir.
En la figura 2 se resumen esquemáticamente los movimientos de los
plaguicidas en el medio ambiente y sus posibles destinos. Es la forma en que
se mueven los plaguicidas en el medio ambiente, desde la fuente emisora del
plaguicida hasta los puntos donde existe exposición para el ser humano o
biota. Las características físicas y las condiciones climáticas del sitio de estudio
contribuyen al transporte de los contaminantes. Por consiguiente, es necesaria
la información acerca de la topografía, tipos de suelo y ubicación, tipo de
cubierta del suelo, precipitación anual, condiciones de temperatura, entre
otros, para poder estimar hacia donde pudiera desplazarse el plaguicida
aplicado.
Los plaguicidas pulverizados se pueden mover a través del aire y pueden
acabar en lugares muy lejanos, tanto en el suelo como en el agua. Los que se
aplican directamente sobre el suelo, pueden filtrarse a capas basales,
reabsorberse posteriormente por otras plantas o bien pasar a las aguas
subterráneas. Los plaguicidas que llegan a los acuíferos, ya sea porque se han
aplicado directamente o indirectamente (por las aguas subterráneas
contaminadas, por las pinturas de los barcos, o por la degradación del suelo,
etc.), aumentarán la concentración de los productos en el agua y en la
atmósfera a través de la evaporación. Esta lista incompleta de posibilidades
sugiere que el movimiento de los plaguicidas es muy complejo. Así, por
ejemplo, se encuentra DDT en lugares en donde nunca ha sido utilizado.
2.5. Metabolismo de los plaguicidas en el organismo El estado del conocimiento de la relación entre los plaguicidas y los organismos
vivos a nivel bioquímico y molecular es relativamente alto. Los plaguicidas son
metabolizados por varias enzimas, incluyendo el sistema de la monooxidasa
dependiente del citocromo P450. La flavin monooxidasa (FMO), prostaglandin
Noemí Tirado Bustillos
25
sintetasa, molibden hidrolasa, deshidrogenasa alcohólica y aldehídica,
esterasas y variedad de transferasas, especialmente la S- glutation esterasa.
Las enzimas involucradas en el metabolismo inicial de los plaguicidas parecen
ser en primer lugar la P450, seguida de la FMO.
Dependiendo del plaguicida (substrato) tanto la activación como la
detoxificación pueden darse con cualquiera de estas enzimas, no obstante la
P450 tiene una importancia adicional como un activador nucleofílico
sustituyente en moléculas como proteínas y ácidos nucleicos. Los plaguicidas
sirven también en el caso particular de P450 como inhibidores o inductores. Se
han caracterizado y secuenciado los nucleótidos y aminoácidos de unos 400
genes de P450. Debido a eso se conoce que el sistema P450 ha evolucionado en
tres direcciones, una para producir P450s para substratos específicos, otros
involucrados especialmente con el metabolismo xenobiótico tendientes a
metabolismo relativamente no específico, el último caso se refiere a
preferencias evidentes de substrato pero con posibilidades de trabajar sobre
algunos sustratos afines. Existen además isoenzimas específicas inductoras e
inhibidoras de P450.
Las FMOs y P450s, están localizadas en el retículo endoplásmico de las
células de vertebrados y están involucradas en la oxigenación de plaguicidas.
Las FMOs, originalmente descritas como una oxidasa de aminas, se conocen
actualmente como catalizadoras de la oxidación de muchos químicos orgánicos
y algunos inorgánicos. Estas son particularmente importantes en la oxidación
de heteroátomos, particularmente nitrógeno, sulfuro, fósforo y selenio en
moléculas orgánicas. (Bastiedas y col., 1999; Gómez y col., 2000).
2.6. Efectos adversos a la salud: toxicidad aguda y efectos a largo plazo La salud humana es afectada de diversas formas. La mayoría de la información
disponible sin embargo, se basa en estudios generalmente realizados con
animales.
Noemí Tirado Bustillos
26
2.6.1. Exposición y efectos:
La exposición de seres humanos a plaguicidas puede clasificarse de varias formas: ♦ aguda o crónica ♦ profesional o no profesional ♦ intencional o no intencional ♦ accidental o incidental ♦ potencial o real En cada una de estas clasificaciones, la exposición puede ser: ♦ oral ♦ respiratoria ♦ dérmica 2.6.1.1. Exposición aguda: Estas a su vez pueden ser clasificadas en:
♦ accidentales, profesionales o intencionales
♦ sistémicas o locales (dérmicos, oculares, etc)
En casos agudos, principalmente profesionales, la vía de exposición generalmente
es dérmica, a través de ropa contaminada. La vía respiratoria sigue en orden de
importancia. En los casos accidentales e incidentales, la vía más frecuente es la
oral.
- Exposición aguda accidental: La literatura reporta esta exposición en 5% de casos aproximadamente, aunque
refiere, tal como ocurre en Centroamérica, que esta proporción es mayor en
países en desarrollo. Los niños menores son los principales expuestos. Las
principales causas relacionadas con esta exposición son:
♦ plaguicidas almacenados en la vivienda sin restricción
Noemí Tirado Bustillos
27
♦ plaguicidas reenvasados en botellas sin señalización ♦ plaguicidas almacenados junto a alimentos ♦ plaguicidas usados con fines de control doméstico de vectores ♦ plaguicidas usados con fines de automedicación para control de
ectoparásitos ♦ uso de envases vacíos de plaguicidas para almacén o transporte de agua ♦ tratamiento de granos para semillas o conservación post-cosecha ♦ transporte de plaguicidas junto a alimentos.
- Exposición aguda profesional.
Se estima para el 60-70% de todas las exposiciones y puede afectar no sólo a
adultos en edad económicamente activa, sino también a menores de edad y a
ancianos, principalmente en el sector productivo agrícola.
Diferentes procesos profesionales están involucrados:
♦ Fabricantes ♦ Formuladores ♦ Vendedores ♦ Transportistas ♦ Mezcladores ♦ Cargadores ♦ Aplicadores ♦ Agricultores ♦ Obreros agrícolas ♦ Personal de limpieza
2.6.2. Toxicidad aguda. La toxicidad aguda se refiere a los efectos tóxicos observados con una exposición
única de corta duración (menos de 24 horas en animales de laboratorio). Los
efectos más estudiados son la capacidad letal y la sintomatología que aparece en
casos no letales.
La OMS recomienda la siguiente Clasificación de Plaguicidas conforme a su
toxicidad aguda. Observaciones a esta clasificación:
la peligrosidad se refiere al efecto agudo
Noemí Tirado Bustillos
28
no puede considerarse como definitiva son puntos de orientación complementaria distingue formas más y menos peligrosas del mismo plaguicida se basa principalmente en la toxicidad aguda oral y dérmica para las ratas
(DL 50)
La Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) tiene una
clasificación basada en el ingrediente activo y la DL 50 para ratas (oral, dérmica e
inhalada), así como la clasificación según la ocurrencia de efectos oculares
(opacidad corneal reversible, irreversible o sin irritación) y dérmicos (corrosivos,
irritantes severos, moderados o leves).
Otras clasificaciones también permiten medir la capacidad irritativa (negativa o
positiva) en piel y ojos y la capacidad de desencadenar reacciones alérgicas
(negativa, leve, moderada o severa).
2.6.3. Toxicidad crónica.
La toxicidad crónica se refiere a los efectos tóxicos observados (generalmente en
animales de experimentación) luego de administrarles el plaguicida por período
entre seis y veinticuatro meses, y al menos en tres dosis distintas. La toxicidad
crónica puede ser positiva o negativa.
Los principales efectos crónicos son:
a) Neurotoxicidad
b) Mutagenicidad
c) Oncogenicidad
d) Teratogenicidad
e) Efectos reproductivos
f) Otros efectos crónicos
La neurotoxicidad se refiere a los efectos tóxicos sobre el sistema nervioso central
o periférico, tales como neuropatías sensoriales, motoras, trastornos de la
conducta, etc. La literatura sobre las neuropatías retardadas ha aumentado
Noemí Tirado Bustillos
29
considerablemente, con aparición posterior a la exposición a organofosforados
(Hsieh y col., 2001; Wesseling y col., 2002). Las neuropatías y otros trastornos
neurológicos pueden encontrarse en personas expuestas a dosis bajas y
repetidas de organofosforados (exposiciones crónicas). Los síntomas incluyen
nerviosismo, fatiga, pérdida de memoria y depresión, además de otros. Muchos
de éstos aparecen aun sin que exista una disminución manifiesta de la
colinesterasa, aunque la exposición a organofosforados la gran mayoría de veces
va ligada a un descenso significativo en los niveles de colinesterasa sérica (Dyler
y col. 2001).
Últimos estudios reportan la relación de la exposición a plaguicidas con
enfermedades neurodegenerativas tales como el parkinson (Engel y col., 2001;
Woodward, 2001) y la enfermedad de Alzheimer (Gauthier y col., 2001).
La mutagenicidad se refiere a los cambios producidos en los genes capaces de
trasmitirse a través de la división celular. Si el daño es a nivel de las células
somáticas se puede ocasionar cáncer y si es en las células reproductoras puede
ocasionar malformaciones congénitas. Ej. dibromuro de etileno.
La oncogenicidad es la capacidad de una sustancia para producir cáncer. Existen
dos grandes clasificaciones: la de la EPA (Environmental Protection Agency de
Estados Unidos) y la de la IARC (International Agency for Research on Cancer)
La teratogenicidad es el efecto tóxico que conduce a malformaciones inducidas
durante el desarrollo del embrión (antes de las 20 semanas de gestación). Ej:
paraquat, zineb, benomyl.
Los efectos reproductivos son aquellos efectos tóxicos relacionados con las
alteraciones de la capacidad de reproducción de las especies e incluyen una
amplia gama: salud durante la gestación, fertilidad masculina y femenina,
gametogénesis, funciones genéticas, implantación, teratogénesis, toxicidad
Noemí Tirado Bustillos
30
perinatal y postnatal, problemas en el alumbramiento, efectos sobre la lactancia,
crecimiento, desarrollo y maduración sexual de los jóvenes, patología de la
descendencia, etc. Uno de los más conocidos en el país es el Nemagón (DBCP)
cuyo uso ya está prohibido y aún genera demanda de los trabajadores por las
secuelas de la exposición.
Tabla 4. Efectos crónicos de algunos
plaguicidas
Noemí Tirado Bustillos
31
2.7. La exposición a plaguicidas en Bolivia.
El uso de plaguicidas en Bolivia se remonta a la década de los años 50. Luego
de la revolución del año 1952 en que la propiedad de la tierra pasó a manos del
campesino, junto con la implementación de la denominada “marcha hacia el
oriente”, se produjo como consecuencia una importante migración a la
amazonía boliviana y el “comienzo” del uso de plaguicidas. Posteriormente
entre los años 1966 a 1975 la importación de plaguicidas creció de 188.000
kgs a 1.342.800 Kgs. En la década de los noventa se registró 160 productos de
los cuales 40% eran insecticidas, 25% fungicidas, 20 % herbicidas y 5%
nematicidas y rodenticidas.
La importación de plaguicidas fue incrementándose de manera importante
desde el año 1994 cuando el registro de ese año alcanzó las 2000 toneladas de
las que el 65% eran herbicidas, 23% insecticidas, 7% fungicidas y un 5%
destinado para otros usos, con un crecimiento anual del 12%. Para marzo de
1997 ingresaron legalmente a Bolivia 426 insumos agrícolas comerciales y en el
año 1999 se importó alrededor de 10.000 toneladas de plaguicidas. El registro
de agroquímicos para el 31 de diciembre de 2000 mostró 1084 productos de los
que 857 eran plaguicidas. En el año 2003 los registros de importación de
insumos agropecuarios mostraron un total de 17. 128. 402.79 kilogramos de
los que alrededor de un 50% correspondieron a plaguicidas, sin tomar en
cuenta la cantidad de ellos que ingresan por la vía del contrabando, estimada
en un 30% adicional.
Algunos otros datos ilustran mejor la situación en torno al uso de plaguicidas
en el país: En Bolivia, la actividad agropecuaria representa uno de los
principales componentes de la economía. Este sector aporta el 21% del
Producto Interno Bruto contribuyendo con alrededor del 20% del total de las
exportaciones. Ocupa un poco más del 39% de la población económicamente
activa, abarcando una superficie cultivada por año agrícola de cerca de dos
Noemí Tirado Bustillos
32
millones de hectáreas. Durante los años 1997 y 1998, para una superficie de
1.241.621 has. (65 % de la superficie sembrada es dedicada al cultivo de la
soya, arroz, algodón, maíz, girasol, caña, tomate y papa), se utilizó 6.762,88
toneladas métricas, con un costo aproximado de 92.061 millones de dólares
americanos. En la soya, por ejemplo, se utilizaron 3.820 toneladas de
plaguicidas. En Bolivia no se producen plaguicidas químicos, son importados
bajo ciertos reglamentos.
En síntesis, este importante uso de plaguicidas en Bolivia durante los
últimos 40 años, se traduce en la actualidad en la existencia de alrededor de
300 toneladas de plaguicidas obsoletos encontrados a lo largo del territorio,
entre los que figuran organoclorados, organofosforados, piretroides,
ditiocarbamatos e inorgánicos entre los principales, lo que implica un
importante riesgo para la salud. (Cervantes, 2007)
2.8 Efectos sobre el material genético.
El daño producido por los plaguicidas no solamente es evidente como
intoxicaciones, sino que también los productos pueden llegar a interactuar con el
material genético, dañándolo, y de no repararse este daño puede originar una
serie de efectos (cáncer, enfermedades degenerativas, abortos, descendencia con
alteraciones genéticas). Numerosos estudios han puesto de manifiesto
alteraciones cromosómicas en los individuos que están en contacto con
plaguicidas. En los estudios de los efectos genotóxicos de los plaguicidas, los
tests más frecuentemente utilizados para daño genético son las aberraciones
cromosómicas (AC) análisis realizado en linfocitos de sangre periférica.
2.8.1. Estudios de genotóxicidad. El estudio del potencial mutagénico (genotóxico) de los plaguicidas y de las
mezclas actualmente usados, en diferentes tipos de vida animal y vegetal y en
Noemí Tirado Bustillos
33
estudios en animales de laboratorio (in vivo), así como estudios en cultivos
celulares bacterianos y de mamíferos (in vitro) nos aproximan a manera de
cernidor a una medida del riesgo de cáncer en humanos. Así que en la última
década se han logrado nuevos conocimientos en el entendimiento del riesgo
carcinogénico de los plaguicidas, por ejemplo se sabe que derivados de bromo
causan sarcoma en el hombre. Diversos estudios epidemiológicos implican a
los plaguicidas como agentes causantes de cáncer en humanos (Blair, 1990),
(Blair y col., 1991), (Blair y col. 1985), (Brown y col., 1990).
En el artículo de revisión realizado por Bolognesi (2003), se describe una
asociación positiva entre la exposición a plaguicidas y aberraciones
cromosómicas en la mayoría de los estudios, de 22 estudios 11 encontraron
incremento estadísticamente significativo en la frecuencia de aberraciones
cromosómicas en grupos de expuestos a plaguicidas. Un estudio encontró una
significativa relación dosis-respuesta entre la frecuencia de MN y años de
exposición (Bolognesi y col., 1993) y otros tres estudios mostraron efectos
significativos de los plaguicidas en la frecuencia de MN. Cinco estudios
mostraron asociación significativa entre exposición a plaguicidas y cola
anormal en el ensayo del cometa, uno fue positivo para daño al DNA en sujetos
expuestos (Ramirez y col., 2002) y otro fue positivo para efectos sobre la
reparación del DNA de las células y presencia de dicéntricos. Dos estudios
mostraron que no existe efecto de los plaguicidas en aberraciones
cromosómicas y uno no mostró ningún efecto en micronúcleos considerando el
problema de toma de muestra que no fue al mismo tiempo que la exposición a
plaguicidas. (Gregio y col, 2000), (Hoyos y col., 1996), (Scarpato y col., 1996)
Se ha propuesto que el rango normal de ACs en la población es de 1%. Las
aberraciones cromosómicas han sido probadas como un biomarcador de riesgo
de cáncer para estudios prospectivos a largo plazo, por tanto queda establecido
que por lo menos algunos plaguicidas serían cancerígenos.
Estudios disponibles en la literatura científica que han evaluado el
potencial genotóxico en personas expuestas ocupacionalmente a mezclas de
Noemí Tirado Bustillos
34
plaguicidas, se han realizado esencialmente en rodeadores, floriculturistas,
trabajadores agrícolas y trabajadores productores de plaguicidas. Los
resultados fueron controversiales. Mientras que, estudios llevados a cabo en
trabajadores de fábricas de plaguicidas han demostrado genotoxicidad. (Sailaja
y col., 2006)
2.9. Biomonitorización de poblaciones humanas expuestas a agentes
genotóxicos.
Los efectos negativos sobre la salud humana producidos como consecuencia de
una exposición a un factor ambiental, pueden expresarse inmediatamente o
tardar años en manifestarse. Es en estos últimos en los que hay que prestar
atención para poder identificar el problema antes de la aparición de los
síntomas, ya que los individuos estarán expuestos a los agentes nocivos
durante mucho tiempo antes de que se manifiesten los efectos adversos. Aquí
intervienen los estudios de biomonitorización, que intentan establecer la
relación entre factores ambientales y enfermedad, detectando alteraciones
iniciales en fases todavía no malignas. Algunos estudios de biomonitorización
se basan en el análisis de los compuestos químicos o de sus metabolitos en
muestras de sangre, orina, pelo, etc. En el caso de los compuestos
genotóxicos, la biomonitorización se amplía al uso de ensayos de genotoxicidad
y mutagenicidad, para poder realizar una evaluación del daño al material
genético.
La biomonitorización, como parte del proceso de evaluación del riesgo genético,
presenta los siguientes objetivos: detectar la exposición a genotoxinas
ambientales y determinar sus efectos genotóxicos in vivo (Albertini, 1994).
2.10 Susceptibilidad genética a los plaguicidas, efectos a la salud
mediados por polimorfismos genéticos.
El proyecto Genoma Humano ha creado un nuevo y potencialmente un
poderoso método para estudiar mecanismos de susceptibilidad individual de
Noemí Tirado Bustillos
35
los efectos producidos por los plaguicidas a la salud. El mapeo de los genes ha
permitido la identificación de polimorfismos en individuos que están asociados
con metabolismo impar de xenobióticos, incluyendo drogas y plaguicidas. Sin
embargo, todas las rutas de detoxificación no están plenamente entendidas, el
proceso involucra tres sistemas principales: las enzimas citocromo P450,
glutatión S transferasas, y el sistema paroxone que metabolizan insecticidas
organofosforados. La herencia de un gen desfavorable “pobre metabolizador” y
versiones de estos genes han mostrado ser la causa de un incremento en la
activación o reducción de la detoxificación y eliminación de mutágenos
ambientales tales como los pesticidas. (Au y cols. 1999).
Se hipotetiza que, sujetos expuestos a plaguicidas, pobres metabolizadores
desarrollarían altos rangos de cáncer y otros efectos que los metabolizadores
normales. En un estudio de Bolognesi (2003) contiene una excelente revisión y
discusión de estudios de polimorfismos genéticos. Tres ejemplos de los
artículos que investigan la relación entre polimorfismos genéticos y
susceptibilidad genética son los siguientes:
- Infante-Rivard y col. (1999) estudiaron niños con leucemia linfocítica aguda
(ALL) quienes habían sido genotipados al nacimiento. Los niños con
polimorfismos de pobres metabolizadores que representaban justo sobre el
40% del grupo de estudio Montreal, tuvieron en general interacción odds
ratio (ORs) de 1.05 a 5.55 para ALL al ver expuestos a plaguicidas durante
el embarazo o la infancia. El más alto ORs (4.33 – 5.55) fue para los
expuestos a repelentes y roceadores para insectos fuera de la casa durante
el embarazo. Herbicidas empleados (principalmente 2,4 D) durante el
embarazo y la infancia, mostraron una interacción consistente con genes
pobres metabolizadores y fue asociada a un incremento al doble en el valor
de incidencia de leucemia en esta cohorte.
Noemí Tirado Bustillos
36
- Hubble y col. (1998) compararon pacientes que habían tenido el subtipo de
demencia de la enfermedad de Parkinson con un grupo control de pacientes
con la enfermedad de Parkinson sin demencia. Los marcadores genéticos
para metabolizadores pobres fueron medidos en ambos grupos y se
encontró que estaban en igual frecuencia. Sin embargo, la ocurrencia del
gen de pobre metabolizador combinado con la exposición a plaguicidas fue
más común en el grupo de demencia (12%) que en los pacientes con
Parkinson sin demencia (2%). Este estudio sugiere un posible mecanismo
para los consecuentes hallazgos de estudios epidemiológicos de que la
exposición a plaguicidas es un factor de riesgo para el desarrollo de la
enfermedad de Parkinson (Hagmar y cols. 1998).
Au y colaboradores (1999) estudiaron granjeros de bananas en Costa
Rica, quienes habían estado previamente expuestos a dibromocloropropano
(DB CP), un plaguicida para banano conocido de causar reducción en el
recuento de esperma, y quienes fueron fuertemente expuestos a plaguicidas
para la agricultura en sus trabajos. Los trabajadores con polimorfismos de
pobres metabolizadores tenían un problema en la respuesta de reparación del
DNA, comparados con los trabajadores quienes fueron metabolizadores
normales. El estudio también encontró que los metabolizadores pobres fueron
significativamente no representados en el grupo de granjeros comparados con
los controles. Los autores especulan que los pobre metabolizadores pueden
elegir por ellos mismos no trabajar en agricultura debido a su susceptibilidad
incrementada a los efectos adversos a la salud por alta exposición a
plaguicidas.
2.11. Biomarcadores.
Los biomarcadores o indicadores biológicos se definen como una alteración del
organismo ya sea a nivel celular, bioquímico o funcional; producen cambios
Noemí Tirado Bustillos
37
biológicos, bioquímicos, fisiológicos o morfológicos importantes, los cuales son
causados por la exposición a xenobióticos presentes en el ambiente donde nos
desenvolvemos diariamente. Estos cambios pueden ser medidos y
proporcionan información sobre la cantidad de xenobiótico a la que está
expuesto y de la intensidad de la respuesta, así como la presencia de ciertas
enfermedades producidas por dichos xenobióticos. Los biomarcadores pueden
ser de exposición, de efecto y de susceptibilidad (Kendall y cols., 2001).
2.11.1 Clasificación de biomarcadores.
Tabla 5. Tipos de biomarcadores y funciones de salud pública
2.11.2. Biomarcadores de exposición.
Determinan la presencia de un agente o los metabolitos que se forman y que
interaccionan con las células blanco o moléculas del organismo. Se utilizan
para predecir la cantidad de xenobiótico a la que un individuo está expuesto,
Tipo de
Biomarcadores
De Vigilancia Screening medico Intervención
Exposición • Monitoreo Biológico
• Monitoreo ambiental
No aplicable • Variables Independientes
• Evaluación de riesgo
Efecto • Monitoreo de
efectos a la
salud
• Prevención
secundaria
• Variables dependientes
• Aproximación al riesgo
• Tratamiento
Susceptibilidad • Validación de
riesgo
• Evaluación
diagnóstico
• Aproximación al riesgo
Noemí Tirado Bustillos
38
también pueden indicar si la exposición es temprana o pasada, dependiendo de
la temporalidad del biomarcador.
Si el compuesto ha penetrado y ha interaccionado con el material genético
(mutágenos/ carcinógenos electrofílicos), se puede detectar por aductos en
proteínas (albúmina y hemoglobina) y en DNA (células de la línea blanca, orina
y tejidos), así como la formación de IC, reflejando una exposición primaria. Un
resultado positivo a este nivel no indica necesariamente consecuencias
adversas, ya que parte del daño genotóxico primario puede ser reversible. Para
detectar la exposición a plaguicidas se han utilizado diversos biomarcadores
tales como: la determinación directa del DDE (derivado del DDT) en tejidos de
peces (Mora y col., 2001); de hexaclorobenceno (HCB) y bifenilos policlorados
(PCB) en suero (Sala y col., 2001); disminución de los niveles de colinesterasa
(Anwar 1997). Maroni y col. 2000 revisa las distintas técnicas utilizadas para
detectar la exposición a los diferentes plaguicidas, ya sea midiendo
directamente el compuesto en cuestión (como los herbicidas fenoxiacéticos, que
casi no se metabolizan en mamíferos), o los metabolitos que se forman, tanto
en sangre como en orina.
2.11.2.1. Colinesterasa. La deficiencia congénita de colinesterasa sérica es una causa potencial
conocida de reacción prolongada a agentes bloqueantes neuromusculares tales
como la succinilcolina (Jensen y col., 1995). Pensamos que puede ser útil
incorporar este biomarcador a los trabajadores agricultores con el propósito de
monitorizar a aquellos que aplican insecticidas anticolinesterásicos
(organofosforados y carbamatos), especialmente para detectar a los que son
más susceptibles por presentar una baja actividad enzimática o una deficiencia
congénita de la colinesterasa sérica.
La actividad de colinesterasa en suero es medida por un método
espectrofotométrico, la colinesterasa se utiliza en el primer paso de la
Noemí Tirado Bustillos
39
reducción del potasio hexacianoferrato produciéndose un cambio en el color
que se puede medir con una variación debajo de 2,3% dentro del mismo
sistema de análisis. Las medidas se dan en KU/L (kilounidades por litro). La
variación individual normal es demasiado amplia, los resultados pueden ser
utilizados solamente de manera individual en el análisis de sangre de la
persona cuando no ha estado en contacto con los organofosforados por meses.
Pero para un nivel grupal la actividad de colinesterasa en suero se puede
comparar entre los diversos grupos, si se asume que los individuos se
distribuyen uniformemente dentro de los mismos. Sabemos que la actividad de
colinesterasa puede ser influenciada por el peso, sexo, edad, enfermedades
hepáticas, alcoholismo y uso de píldoras anticonceptivas. (Hernández y col.,
1998).
2.11.3. Biomarcadores de efecto.
Evalúa los efectos resultantes de la exposición a un xenobiótico sobre un
proceso bioquímico o fisiológico. Estos biomarcadores miden el daño que se ha
producido cuando el organismo ya lo ha procesado, pudiendo llegar a ser
permanentes en la célula, órgano u organismo. Los efectos ya fijados, reflejan
daños producidos por exposiciones pasadas, lo que los hace útiles para el
estudio de daño acumulativo. Si se quiere detectar un daño cromosómico, los
biomarcadores de efecto que se pueden utilizar incluyen las aberraciones
cromosómicas (AC), los micronúcleos (MN), y las roturas de DNA y, si se quiere
detectar un daño génico, se pueden analizar las mutaciones puntuales.
Los biomarcadores de efecto también pueden determinar cambios
cromosómicos o génicos en lugares específicos relacionados con el desarrollo de
alguna enfermedad. En tal caso, nos referimos a los biomarcadores de
enfermedades que constituyen manifestaciones tempranas o preclínicas, que se
presentan antes de que se establezca la enfermedad producida por la
exposición. Si hay daño cromosómico, se pueden buscar alteraciones
Noemí Tirado Bustillos
40
estructurales o numéricas específicas de la enfermedad en estudio, y si hay
daño génico, se pueden evaluar mutaciones en protooncogenes, en genes
supresores de tumores o en genes de reparación. Los biomarcadores de efecto
que entregan información específica de una enfermedad, se denominan
biomarcadores de riesgo. Los biomarcadores de riesgo y de enfermedad no
pueden identificar el tóxico que produjo el daño, pero si indican al investigador
que el daño ha ocurrido.
En los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas expuestas
a plaguicidas se ha usado diferentes biomarcadores de efecto, entre los que
podemos señalar los MN, CA, ICH, SCGE (Saleha y col, 2001, Pastor y col.,
2001 a y b), entre otros. Entre los diversos estudios de biomonitorización de
genotoxicidad por exposición a plaguicidas, se puede observar que hay estudios
que no encuentran incremento de daño, mientras que otros sí, y que la tarea
de vigilancia a poblaciones humanas expuestas a plaguicidas es una tarea
difícil por la diversidad de factores que entran en juego, especialmente en el
campo de la exposición ocupacional, en donde generalmente no se emplea un
único producto sino mezclas de varios de ellos.
2.11.3.1. Los micronúcleos.
El DNA puede ser alterado de manera espontánea o por acción de diversos
agentes. Muchas de estas alteraciones se traducen en roturas del DNA y en
pérdida de material genético. Estas anomalías pueden detectarse mediante
distintas técnicas moleculares y/o citogenéticas. Entre las técnicas
citogenéticas más utilizadas están las que permiten detectar los cambios
cromosómicos, tanto estructurales como numéricos. Así, para evaluar el riesgo
genético de poblaciones humanas expuestas a mutágenos, las técnicas más
frecuentemente usadas son las de AC y MN. El ensayo del MN es uno de los
ensayos de genotoxicidad más utilizado en la biomonitorización de poblaciones
humanas expuestas a agentes genotóxicos como es el caso de los plaguicidas
Noemí Tirado Bustillos
41
(Bolognesi y col., 2003; Garaj-Vrhovac, 2002; Ghita y col., 1999; Joksic y col.,
1997).
El ensayo de MN ha sido muy usado en la evaluación genotóxica in vitro de una
gran diversidad de mutágenos químicos, en diversos tipos celulares. El uso de
cultivos de linfocitos humanos que iniciaron Heddle y col. en 1976, permitió
por su parte, biomonitorizar una población in vivo y llevar a cabo el estudio
citogenético de cada individuo, pudiendo correlacionar las alteraciones
citogenéticas sufridas con la exposición a las substancias o agentes cuyos
efectos adversos se pretende evaluar.
Los micronúcleos pueden corresponder tanto a cromosomas enteros como a
fragmentos acéntricos que, al no orientarse correctamente durante la división
celular, quedan fuera de ambos núcleos hijos. Los MN tienen un aspecto
similar al del núcleo principal y se ven como pequeños núcleos en el
citoplasma de las células interfásicas. Entonces los MN pueden ser indicativos
de daño clastogénico o aneugénico.
La clastogenicidad ha sido relacionada con procesos de envejecimiento
prematuro, alteraciones vasculares e inducción de diversos tipos de cáncer
(Ames y Gold, 2000). Un aumento significativo de la frecuencia de MN que
contengan cromosomas enteros puede tener consecuencias negativas para la
salud humana dado que las aneuploidías, ya sean somáticas o germinales, se
han correlacionado con abortos espontáneos, retraso mental y carcinogénesis,
entre otras alteraciones (Hassold y col., 1996; Hagmar y col., 1998). El ensayo
de MN es uno de los pocos ensayos disponibles para analizar alteraciones
citogenéticas tempranas en tejidos epiteliales, antes de que ocurran cambios
malignos.
La frecuencia basal de MN depende del tipo celular. La frecuencia espontánea
de MN en linfocitos humanos, oscila entre 0 y 2.5% (Surrallés y Natarajan,
Noemí Tirado Bustillos
42
1997). También se sabe que esta frecuencia basal varía en diferentes etnias, y
según el sexo; en mujeres la frecuencia de MN es aproximadamente 1,4 veces
mayor a la de los hombres (Fenech, 1993) y que, a medida que aumenta la
edad, e independientemente del sexo, la frecuencia de MN también aumenta
(Fenech y Morley, 1986). Dependiendo de las características de cada estudio,
se pueden usar diferentes tipos celulares para aplicar el ensayo de MN.
Entre las ventajas del ensayo de MN se puede mencionar: el ser una técnica
simple, de fácil recuento y de tener un costo reducido. Tiene la habilidad de
valorar exposiciones prolongadas y se puede analizar un gran número de
células en poco tiempo. Posibilita el menor uso de animales de
experimentación. Entre las desventajas se puede mencionar: la existencia de
factores de confusión que modulan la frecuencia de MN como son la edad, el
sexo, etnia, técnicas de tinción, etc. (Fenech y Morley, 1986; Fenech, 1993;
Surrallés y col., 1995) los cuales deben ser considerados en el momento del
análisis. En los estudios de biomonitorización a veces es difícil interpretar los
datos debido a la gran variabilidad intra e interindividual que puede llegar a
ser de hasta un 67%, atribuible a un error experimental (Fenech y Neville,
1992), y otras veces debido a la tinción (Surrallés y col., 1995b). Otra
limitación del ensayo es que no permite determinar la exposición que causa
aberraciones inestables, ya que estas se pierden (Surrallés y col., 1997).
En el ensayo de micronúcleos llevado a cabo en linfocitos de sangre periférica
se pueden realizar dos tipos de cultivos diferentes. Por un lado, pueden
utilizarse linfocitos aislados, que representan un sistema de evaluación muy
sensible para el análisis del potencial genotóxico (Elhajouji y col., 1994;
Surrallés y col., 1995a), con la desventaja de que se necesitan mayores
volúmenes de muestra. Por otra parte, los cultivos de sangre completa tienen la
ventaja de que, al conservar los componentes del plasma, reflejan más
fielmente la situación in vivo. Esto se debe a que los eritrocitos y demás
componentes del plasma tienen un papel muy importante en la activación
Noemí Tirado Bustillos
43
metabólica de los promutágenos (Elhajouji y col. 1994, Surrallés y cols., 1995
a) y también en la degradación de potenciales agentes genotóxicos (Stocker y
Ames, 1987).
El uso de linfocitos humanos de sangre periférica permite hacer una evaluación
citogenética empleando células de larga duración que están circulando
constantemente por todo el cuerpo y que, en consecuencia, están en contacto
con los diversos xenobióticos y sus metabolitos. Por otro lado, los linfocitos son
fáciles de obtener y sólo se requiere una pequeña cantidad de sangre para
poder realizar el ensayo. Como la mayoría de los linfocitos están en estado no
proliferativo (G0), deben ser estimulados para que, al dividirse puedan formar
los MN. Durante el cultivo en presencia de fitohemaglutinina (PHA), un extracto
de porotos Phaseolus vulgaris, estimula eficazmente los linfocitos, logrando que
las células reingresen en el ciclo celular (G1, S, G2 y Mitosis) y se dividan. Por
otro lado, la cinética del crecimiento de los linfocitos humanos en cultivo está
bien conocida, lo que es importante tanto para la aplicación de la técnica como
para el análisis de los resultados.
Es conveniente que el ensayo de micronúcleos se aplique a células que han
experimentado sólo una división celular después de la exposición al agente
genotóxico ya que, los MN se pueden perder en divisiones sucesivas, lo que
conducirá a subestimar el daño genético inducido (Evans, 1988). Para facilitar
la evaluación, se utiliza un bloqueador de la citocinesis para obtener células
binucleadas (con una división) y detectar también células mononucleadas y
polinucleadas, las cuales no se incluyen en la evaluación debido a que, si no se
han dividido y son células dañadas no han tenido la oportunidad de expresar
daño, y si se han dividido más de una vez, pueden haber perdido material
genético sin que lo podamos detectar. En ambos casos se puede subestimar la
evaluación del daño.
Noemí Tirado Bustillos
44
El uso de la citocalasina B (cyt-B) fue propuesto por Fenech y Morley (1985)
ensamblaje de los microfilamentos de actina e impide la citocinesis sin afectar
la mitosis. Como resultado de la división celular en presencia de cyt-B, se
obtiene una célula binucleada, la cual será evaluada para detectar la presencia
de MN. En la figura 3 se presenta un esquema gráfico del ensayo de MN
usando cyt-B.
El ensayo de MN usando cyt-B detecta tanto la acción de los agentes
clastógenos como aneugénicos. Sin embargo, parece que puede existir cierta
interacción entre los agentes aneugénicos y la cyt- B, debido a que los MN
inducidos por agentes aneugénicos podrían verse alterados por la acción que la
cyt-B ejerce sobre los microfilamentos de actina (Antoccia y col., 1993). En tal
caso, la distancia entre los polos de la célula se acorta (Norppa y col. ,1993);
Falck y col.1997), favoreciendo que los cromosomas aislados queden dentro de
alguno de los núcleos hijos. Se debe tener en cuenta, pues, que al evaluar
agentes aneugénicos en presencia de cyt-B, se podría subestimar la frecuencia
de MN, dar resultados contradictorios o poco reproducibles.
Figura 3. Formación de micronúcleos debido a la pérdida de un cromosoma entero y fragmentos cromosómicos de tipo acéntrico en anafase mitótica. El esquema muestra el bloqueo de la Cyt-B y la consecuente obtención de células binucleadas.
Noemí Tirado Bustillos
45
En el presente trabajo se estudió la exposición a plaguicidas utilizando el
ensayo de micronúcleos en células binucleadas como biomarcador de efecto; a
continuación se detalla cómo se originan, su significado biológico y el uso de
linfocitos de sangre periférica donde se analizó su frecuencia.
2.11.3.2. Intercambios entre cromátides hermanas (ICH).
Cuando las células son cultivadas en presencia de bromodeoxiuridina (análogo
de la timina), que se incorpora de forma semiconservativa, se forman hebras
mixtas de DNA en el primer ciclo. Tras el segundo ciclo en presencia de BrdU
las dos cromátides estarán formadas: una por Timina-BrdU y la otra por BrdU-
BrdU. La visualización mediante colorantes fluorescentes como Hoechst 33258
más Giemsa, permite revelar las cromátides mono y bisustituidas con BrdU en
el segundo ciclo.
Esta prueba mide indirectamente los daños primarios (Sandverg y col., 1982),
Se considera que los intercambios entre cromátides hermanas (Sister
Chromatid Exchange, SCE) se forman como subproducto de la actividad
reparadora o sobre todo por errores en la replicación debido a alteraciones de
algunos nucleótidos del DNA. El aumento del daño primario se reporta como el
incremento en el número de ICH; la magnitud de respuesta es proporcional al
daño (Wolf y col., 1974)
El análisis de la frecuencia de ICH es una metodología citogenética bastante
sensible en estudios genotóxicos. La proporción entre la inducción de ICH y de
mutación o aberración cromosómica es diferente para los agentes químicos
probados. Los agentes probados muestran diferentes eficiencias de inducción y
cada tipo de lesión formada parece ser procesada diferentemente por la célula,
resultando en un tipo específico de daño.
Noemí Tirado Bustillos
46
2.11.4. Biomarcadores de susceptibilidad.
Se sabe que la respuesta tóxica puede variar de un organismo a otro, aunque
los individuos sean de la misma especie, etnia o sexo. Aunque las respuestas
de organismos de diferentes especies pueden ser similares a dosis similares,
esto no ocurre necesariamente. La toxicidad de una sustancia en el organismo
receptor está influenciada por factores genéticos (especie, cepa, sexo, individuo,
etc.) y fisiológicos (embarazo, edad, dieta, estado nutricional, estado hormonal,
estado de salud, etc.).
Los biomarcadores de susceptibilidad identifican aquellas diferencias
interindividuales que hacen que un individuo sea más susceptible o responda
de manera diferente, con un mayor riesgo para la salud, frente a diferentes
exposiciones ambientales. La capacidad de reparación del daño genético
también está determinada genéticamente y aquellos individuos deficientes en
los mecanismos de reparación sufrirán mayores niveles de daño genético
irreversible, incluso frente a exposiciones de baja intensidad. Otros
indicadores de susceptibilidad que deber ser considerados son las diferencias
inmunológicas (Richeldi y col., 1993) y factores nutricionales, tales como las
deficiencias en folato (Branda y col., 1991) o vitamina C (Aidoo y col., 1994),
que pueden incidir en la existencia de mayor daño genético.
Se ha demostrado que distintos genes polimórficos como los que codifican para
el citocromo P450, las glutatión S transferasas (GST) y los genes PON son
algunos de los responsables del metabolismo de los plaguicidas (Sultatos,
1992, 1994; Furlong y col., 2000). De los loci que codifican estas enzimas
metabolizadoras existen múltiples alelos, lo que supone una susceptibilidad
individual delante de una exposición a un compuesto. El estudio de Au y col.,
(1999), sugiere que los agricultores que presentan el alelo favorable (menor
metabolización) o nulo, presentan más efectos biológicos adversos.
Noemí Tirado Bustillos
47
Las enzimas conocidas como citocromo P450 son una familia multigénica,
formada por diversas monooxigenasas monoméricas que catalizan el
metabolismo oxidativo de la mayoría de los compuestos químicos endógenos
(esteroides, ácidos grasos, etc.) y xenobióticos (tóxicos, fármacos, etc.).
Participan en la fase I del metabolismo, normalmente haciendo más hidrofílicos
a los sustratos y facilitando su excreción. Así, por ejemplo, éstas se han
relacionado con la decodificación de organofosforados (Eaton, 2000; Tang y
col., 2001); aunque algunas veces, dependiendo de su isoforma, pueden actuar
de activadores de procarcinógenos, transformando los compuestos en
electrofónicos y altamente reactivos con el DNA (Tang y col., 2001).
Las glutatión S transferasas, son otro grupo de enzimas polimórficas, que
intervienen en la detoxificación de los metabolitos electrofílicos originados en la
fase I del metabolismo, glutatión reducido (GSH) a la molécula, minimizando su
potencial tóxico (Smith y col., 1995). Las enzimas más estudiadas de esta
familia son la GSTM1 y la GSTT1. Ambas presentan variantes genotípicas
nulas que determinan la ausencia total de la enzima. Por otra parte Hayes y
Pulford (1995) sugirieron que la deficiencia en una isoenzima GST se podrían
compensar con otras isoformas y rutas metabólicas alternativas. Esto podría
ser la respuesta a numerosos resultados conflictivos sobre la asociación de los
polimorfismos de las GST s y la predisposición al cáncer (Hirvonen, 1997).
Los genotipos nulos GSTM1 y GSTT1 se han asociado con incrementos en la
frecuencia de algunos cánceres (Rebbeck, 1997; Toruner y col., 2001; Kerb y
col., 2002; Zheng y col., 2001), con un mayor incremento de daño citogenético
(Šram, 1998; Au y col., 1999) y con una acción genotóxica in vitro de algunos
compuestos (Norppa y col.,1995; Ollikainen y col., 1998) y, aunque existe
mucha controversia al respecto, es útil utilizarlos como biomarcadores de
predisposición, de ser posible junto con otros biomarcadores de susceptibilidad
metabólica, ya que las posibles interacciones pueden aportar mayor
información y reflejar mejor la realidad.
Noemí Tirado Bustillos
48
La susceptibilidad individual frente a los compuestos xenobióticos, en este caso
los plaguicidas, está determinada por la existencia de los polimorfismos
genéticos involucrados en su metabolismo. Esto supone diferentes capacidades
enzimáticas en diversas rutas metabólicas y, por lo tanto, explica que las
personas reaccionen de manera diferente, en iguales condiciones, frente a una
misma exposición. En este estudio se analizaron dos genes polimórficos que
codifican las GSTs, que se han postulado que participan en el metabolismo de
los plaguicidas (Scarpato y col., 1996; Coles, 1990; Eaton, 2000; Canalle y col.,
2004).
2.11.4.1. Las glutatión S- transferasas (GST).
Las glutatión S tansferasas (GST) constituyen una familia de proteínas
diméricas multifuncionales que catalizan la conjugación entre los glutationes
reducidos (GSH) electrofónicos y neutrofílicos. Su función primaria es la de
detoxificar los compuestos electrofílicos capaces de unirse al DNA, típica
reacción metabólica de fase II (Pickett y Lu, 1989). Las GSTs también catalizan
una serie de reacciones que implican al GSH, incluyendo la reducción del
hidroperóxido orgánico (Mannervik, 1985), las cuales juegan un papel
importante en la protección de los tejidos frente al estrés oxidativo.
Las enzimas GST se dividen en proteínas solubles y proteínas de membrana;
entre ellas, no hay ninguna relación estructural. La mayoría de estudios se
centran en las GST solubles ya que se sabe que presentan variantes alélicas
con consecuencias funcionales. Para su estudio, se han clasificado en nueve
clases agrupadas en cinco familias, α (GSTA), µ (GSTM), π (GSTP), θ (GSTT) y Ω
(GSTO) (Rushmore y Pickett, 1993; Mannervick, 2003). En la tabla 1 se
presentan de forma ordenada los diferentes polimorfismos genéticos conocidos
de las GSTs, entre los que se detalla la información de los polimorfismos
estudiados en esta tesis.
Noemí Tirado Bustillos
49
Todas las GSTs solubles están formadas por dos subunidades de la misma
clase, que pueden ser iguales o diferentes. Todas las GSTs tienen diferentes
perfiles de afinidad por los substratos y, aunque existe un pequeño
solapamiento entre ellos, cada una de estas subunidades es importante al
definir la capacidad de detoxificar en el tejido diana, es por ello que la
presencia o ausencia de una GST en particular o la modificación de su
eficiencia catalítica es significativa (Mannevick, 2003). A continuación se
analizan en mayor detalle los polimorfismos que se han estudiado en este
trabajo, correspondiente a las clases GSTM1 y GSTT1.
Tabla 6. Polimorfismos genéticos de las glutatión S- transferasas (GSTs)
Familia Clase Polimorfismos conocidos
Mutación
GSTM1
GSTM2
GSTM3
GSTT1
GSTT2
GSTP1
GSTO1
GSTO2
GSTO3
GSTM1*A
GSTM1*B
GSTM1
GSTT1*0
GSTP1*A
GSTP1*B
Por clasificar
Por clasificar
Por clasificar
Alelo salvaje
Situación de base C534G
Cambio de AA Lis 172 Asp
Deleción del gen
Deleción del gen
Alelo salvaje
Transición A118G en exón 5’
Cambio de aminoácido Ile105/val
(Cambio *B)+
Transición C341T C
Cambio de aminoácido
Ala 114/val
Noemí Tirado Bustillos
50
En la familia GSTµ se distinguen tres clases, M1,M2 y M3. La más estudiada es
la clase GSTM1, debido a que entre sus polimorfismos existe la completa
deleción del gen, lo que provoca la ausencia total de la enzima. El gen que
codifica para la GSTM1 se encuentra en el cromosoma 1 (1p13.3). Existen tres
variantes del gen GSTM1, la GSTM1* A es el alelo salvaje, la GSTM1*B. difiere
de la *A sólo en una base del exón 7 que codifica monómeros que puedan
generar enzimas homodiméricas y heterodiméricas de efectividad catalítica
muy similar in vitro (Mannervik y col., 1992; Hayes y Pluford, 1995), en este
caso ocurre la sustitución de base C534G, que conlleva un cambio de
aminoácido Lis172Asp. Finalmente la GSTM1*O es la deleción total del gen lo
que provoca una ausencia de la actividad enzimática (Smith y col. 1995;
Tsuchida, 1997; Taningher y col. 1999).
Las deleciones de GSTM1, tanto en homocigosis como en heterocigosis, se han
asociado con un aumento de susceptibilidad al cáncer debido a una
detoxificación deficiente. El genotipo homocigoto para el alelo nulo de GSTM1
(-/-), se denomina genotipo nulo GSTM1. La frecuencia de individuos con
genotipo nulo es de aproximadamente 50% en la población caucásica
(Seidegard y col., 1988) y varía entre 30% y el 90% en diferentes grupos étnicos
(Lin y col., 1994; Rebbeck 1997). El impacto de la deleción de este gen en la
salud humana puede ser muy importante debido a la frecuencia con que se
presenta en las distintas poblaciones.
En la familia GSTθ existen dos clases descritas, la GSTT1 y la GSTT2. Ambas
clases comparten el 55% de la secuencia de aminoácidos y sus estructuras son
similares, aunque presentan diferentes afinidades por los sustratos. La clase
polimórfica es la GSTT1, razón por la cual es más estudiada, se encuentra
localizada en el cromosoma 22 (22q11.23). Los individuos homocigotos para el
alelo nulo presentan la ausencia total de la función de la proteína (Smith y col.,
1995; Tsuchida 1997 y Taningher y col. 1999). En un estudio realizado por
Garte y col. (2001), se analizaron todos los datos publicados sobre enzimas del
Noemí Tirado Bustillos
51
metabolismo determinándose las frecuencias alélicas de las diferentes
variantes, y en diferentes poblaciones ya que estos valores pueden variar en
función de la etnia (Chen y col., 1996). En él se concluyó que la frecuencia de
los homocigotos para el alelo GSTT1*O (deleción completa del gen) era de 19.7
en la población caucásica y de 47, 0 en la población asiática (Garte y col.,
2001).
La GSTM1 y la GSTT1 detoxifican tanto los productos de muchas reacciones
catalizadas por el citocromo, como los lípidos y peróxidos resultantes del estrés
oxidativo (Mannevik y Danielson 1988; Picket y Lu 1989; Ketterer y col., 1992;
Berhane y col., 1997), lo que sugiere una acción coordinada. Tanto la actividad
GSTM1 como GSTT1 pueden verse completamente suprimidas en algunos
individuos debido a que pueden presentar la deleción completa del gen en
ambos casos ( M1- y T1-) (Seidegard y col., 1988; Pemble y col. 1994).
Los individuos con genotipo nulo para GSTT1 como para GSTM1 son
particularmente sensibles a los cancerígenos químicos. Chen y colaboradores
(1996) estudiaron poblaciones caucásicas y afroamericanas determinando que
la prevalencia del genotipo nulo para GSTM1 era mayor en los caucásicos
(53,5% Vs. 27,6%), mientras que la del genotipo nulo para GSTT1 era mayor en
los afroamericanos (24,1% vs. 15,0%). Sin embargo, no se encontraron
diferencias étnicas para el doble genotipo nulo. Otros estudios realizados en el
mismo año (Abdel-Rahman y col., 1996) encontraron resultados similares en
poblaciones estadounidenses y egipcias, en donde la prevalencia del genotipo
nulo para GSTM1 fue de 51% y 44%, para GSTT1 fue de 15% y 14,7%, y para
el doble genotipo nulo fue de 6,3% y 8,8%, respectivamente.
Noemí Tirado Bustillos
52
Tabla 7. Frecuencia del polimorfismo de la GSTM1en diferentes Poblaciones. Población n GSTM1 Nulo (%) GSTM1 positivo (%) Referencia
Caucásicos
Chilenos
Japoneses
Chinos
164
58
452
244
55.5
43
53
50
44.5
57
47
50
Bailey y cols., 1998
Quiñones y col.,1999
Kihara y col.,1995
Lan y col., 2000
2.11.5. La importancia de la prevención en oncología Las terapias sólo tienen una modesta efectividad en la reducción de las tasas
de mortalidad debidas al cáncer. Entre los hombres europeos, sólo cuatro tipos
relativamente infrecuentes (testículos, laringe, pene y enfermedad de
Hodgkin´s) presentan unas tasas de supervivencia que exceden el 50%. En
mujeres la situación es mejor, ocho tipos (mama, cervix, cuerpo uterino,
laringe, cavidad oral, vagina, enfermedad de Hodgkin´s y leucemia linfoide
crónica) tienen unas tasas de supervivencia por encima de este nivel (Berrino y
col., 1995).
En Europa, las cifras de incidencia ajustadas a la edad se incrementaron en un
8,7% entre 1970 y 1990 en hombres y decrecieron en este periodo un 1,4 % en
mujeres. La prevención es claramente la mejor estrategia para reducir la
mortalidad. En los países industrializados se ha estimado en un 50% el
número de casos de cáncer que podrían prevenirse (Tomatis 1997).
Existe un amplio consenso en cuanto a que la mayoría de los cánceres son el
resultado de la exposición a agentes producidos por la gente y a exposiciones
ambientales (humo del tabaco, contaminantes químicos en el aire, agua,
Noemí Tirado Bustillos
53
alimentos, drogas; radiaciones; componentes dietarios, radón y agentes
infecciosos). El riesgo frente a estos carcinógenos está condicionado por
factores: genéticos, edad, sexo, estado inmunitario, enfermedades preexistentes
y nutrición.
2.11.6. La Epidemiología Molecular al servicio de la valoración del riesgo
personal en Medicina Preventiva.
El conocimiento de las interacciones entre los agentes presentes en el medio
ambiente y el hombre se ha ido adquiriendo sobre todo en la última década
gracias a la Epidemiología Molecular mediante el análisis de biomarcadores de
exposición y daño presentes en células, tejido y fluidos corporales. Ejemplos de
estos biomarcadores son: A.-Los aductos, productos que se forman como
consecuencia de la unión covalente al ADN de las moléculas reactivas
(carcinógenos o especies reactivas). B.-Los cambios en genes claves (oncogenes
o genes supresores) que actúan disparando o bloqueando procesos básicos de
la fisiología celular como la división, diferenciación, apoptosis o los que se
heredan en genes que afectan la metabolización de carcinógenos o reparación
del ADN.
La epidemiología molecular tiene la ventaja de ser directamente relevante
para evaluar el riesgo humano, a diferencia de otros modelos experimentales en
animales que requieren la extrapolación a humanos. En contraste con la
epidemiología tradicional que centra su atención en la incidencia y mortalidad
como punto final, la epidemiología molecular tiene el potencial de
constituir una llamada de aviso o advertencia. Señala los efectos preclínicos
de la exposición y de una susceptibilidad aumentada. Proporciona una gran
oportunidad para advertir del peligro a tiempo de poder intervenir en el curso
de la enfermedad.
Noemí Tirado Bustillos
54
Una clase especial de interacción entre la exposición a agentes externos y
factores del hospedador, está representada por las interacciones entre genes y
ambiente, incluidos los polimorfismos metabólicos. Cuando hablamos de
polimorfismos metabólicos nos referimos a las variaciones en la secuencia de
ADN de los genes que codifican enzimas de metabolización. Estas variaciones
en la secuencia originan proteínas con actividades variables que dan lugar a
diferentes capacidades en la metabolización por parte de subgrupos de
población o por individuos aislados.
Desgraciadamente, los métodos actuales de evaluación de los riesgos
ambientales no tienen en cuenta estos factores. Aunque las agencias estatales
como la EPA suelen utilizar criterios conservadores de valoración del riesgo (en
función de los niveles de exposición), estos criterios subestiman el riesgo frente
a ciertos carcinógenos ambientales al considerar que todos los individuos en
una población tienen la misma respuesta biológica a dosis específicas de
agentes causales.
Actualmente se ha cuestionado y demostrado científicamente la no
homogeneidad de la población. Extrapolando la variación observada en el
hombre en algunos índices de susceptibilidad (metabolismo de carcinógenos y
daño genético) a una exposición dada, una persona puede ser de 10 a varios
cientos de veces más susceptible al cáncer que otra. Esta información tiene
obvias implicaciones para el asesoramiento del riesgo frente al cáncer.
2.11.7. Los sistemas de defensa química.
Son los grandes desconocidos en medicina a diferencia del sistema
inmunitario. Para cumplir esta misión el hombre y la mayoría de los seres vivos
disponemos del sistema del Citocromo P450 cuya misión es actuar sobre
sustancias químicas exógenas, convirtiéndolas en formas solubles, fácilmente
excretables, evitando que se acumulen en los organismos alcanzando
Noemí Tirado Bustillos
55
concentraciones letales o tóxicas. En el curso de la evolución ha sido necesario
que las especies desarrollaran unos sistemas de defensa química que les
permitiese adaptarse y sobrevivir al hábitat diferente y con disponibilidades
dietarias muy diversas. Por ello en estas familias de genes de metabolización de
xenobióticos hay una gran variabilidad interindividual e interespecies en sus
estructuras y funciones
Dado que muchos carcinógenos son sustratos de enzimas de metabolización
podemos asumir que los humanos tenemos una capacidad variable para
activar o inactivar carcinógenos. Muchos de los genes hoy conocidos son
polimórficos y existen numerosas variantes alélicas relevantes para el fenotipo
en la población. Podemos señalar que los polimorfismos en las enzimas de
metabolización son casi la regla más que la excepción y constituyen un factor
decisivo en la supervivencia de las especies.
Numerosos estudios han demostrado que la variabilidad en el metabolismo de
carcinógenos es un factor de riesgo en la carcinogénesis química. Los
miembros más importantes de estos sistemas son además del citocromo P450,
la familia de las Glutatión S-transferasas y la N-acetil transferasa, entre otros.
A medida que los avances tecnológicos están facilitando su estudio y análisis,
va siendo mayor el número de circunstancias y patologías en los que son
relevantes.
Así por ejemplo se conoce su importancia en mujeres embarazadas fumadoras,
por sus repercusiones sobre el bajo peso al nacer, ciertas malformaciones y
tumores infantiles. También se ha descrito su importancia en patologías
cardiovasculares, colitis ulcerosa, glaucoma, etc.
2.11.8. Polimorfismos de susceptibilidad metabólica en oncología La incorporación del análisis genético de polimorfismos metabólicos en la
Noemí Tirado Bustillos
56
epidemiología del cáncer es de particular interés porque:
A.-Permite la identificación de subpoblaciónes de sujetos que son más
susceptibles al cáncer inducido por agentes químicos
B.-El análisis de los polimorfismos es importante con relación a bajos niveles
de exposición. Este conocimiento condiciona por una parte el proceso de
evaluación del riesgo, y por otra el establecimiento de unos límites tolerables de
exposición (que tenga en cuenta la sensibilidad individual) y por tanto el
establecimiento de unas pautas de seguimiento y diagnóstico diferenciadas en
función de los genotipos de riesgo.
La susceptibilidad genética podemos considerarla como un espectro que abarca
un rango intermedio de situaciones entre dos extremos. En uno, tenemos las
enfermedades monogénicas de elevada penetrancia (Ej. mutaciones heredadas
en los genes APC o BRCA1, en los cánceres hereditarios de colon o mama y
ovario). En estos casos los riesgos acumulados a lo largo de la vida entre los
portadores de mutaciones es muy alto (50-90%), sin embargo tales mutaciones,
son raras en la población general, por lo que sólo una pequeña fracción de los
cánceres en cuestión puede ser atribuida a caracteres heredados.
El otro extremo está representado por los polimorfismos metabólicos: en este
caso, nos encontramos con mutaciones muy frecuentes (del orden del 40-50%
de la población, como es el caso de los alelos acetiladores lentos de NAT-2 y el
GSTM1nulo en la raza caucásica), con un incremento leve del riesgo. El riesgo
individual se incrementa en una pequeña fracción pero el número de cánceres
atribuibles a estas características genéticas es alto.
Estos conceptos podemos aplicarlos a otras patologías tanto crónicas
(cardiovasculares, neurodegenerativas e inflamatorias) como en agudas
(toxicidad ocupacional o ambiental).
Noemí Tirado Bustillos
57
Conocemos algunos polimorfismos que están asociados con el cáncer pero no
con el metabolismo de sustancias carcinogénicas endógenas o exógenas por
ejemplo el complejo de múltiple resistencia a drogas (Md complejo), gen del
factor de necrosis tumoral beta (TNF-beta), el receptor de la vitamina D o genes
implicados en los mecanismos de reparación del ADN. (Brüske-Hohfeld, 2000).
Noemí Tirado Bustillos
58
3. JUSTIFICACIÓN.
Actualmente existen numerosos organismos internacionales dedicados a la
prospección de agentes genotóxicos y estimación de su consiguiente riesgo
poblacional, especialmente la "International Agency for research on Cancer
(IARC)" de la Organización Mundial de la Salud, la "International Commission
for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens (ICPEMC)" y
la "U.S. Environmental Protection Agency (EPA). La base de datos de estos
organismos, y la literatura mundial sobre el tema son extraordinariamente
densas.
La adecuación de la problemática genotóxica de nuestro país al estado actual
de la ciencia a nivel mundial debe ser una dimensión urgente en las políticas
científicas bolivianas, a la vez que se puedan comenzar a realizar aportes desde
nuestro país, que se centren en aquellos problemas que más nos atañan. En
este sentido, existen una serie de sustancias en nuestro medio ambiente de
especial incidencia poblacional.
Los plaguicidas son uno de los químicos tóxicos más frecuentemente
encontrados en el ambiente. Aunque el uso de pesticidas refuerza la
productividad de la cosecha, los humanos también pagan un precio por los
beneficios. Alrededor del mundo, aproximadamente 3 millones de
envenenamientos agudos y 220.000 muertes por la exposición a pesticidas se
ha informado anualmente. Además, granjeros con exposición prolongada a
bajas dosis de pesticidas eventualmente desarrollarán en el futuro efectos a la
salud similares a aquellos que han recibido exposiciones agudas con altas
dosis, por ejemplo, las anormalidades del comportamiento neuronal, resultados
reproductivos adversos, y aumento de la incidencia de cáncer (por ejemplo
leucemia, linfoma no Hodking, y mieloma múltiple. Por consiguiente la
exposición crónica a plaguicidas puede causar serios efectos a la salud de los
agricultores expuestos que no tengan historia de envenenamiento agudo.
Noemí Tirado Bustillos
59
En vista de que en nuestro país los agricultores que están expuestos a los
plaguicidas, sufren una exposición crónica constante y además realizan un
manejo inadecuado de los mismos (sin normas de seguridad) constituyen un
grupo de riesgo, por tanto se ve la necesidad de realizar estudios para
determinar los genotipos de las isoenzimas de biotransformación de
plaguicidas y su relación con la magnitud de daño al material genético como
modificadores de riesgo de futuras enfermedades como el cáncer con el
propósito de contribuir a las políticas de prevención del sector salud.
3.1. Pregunta de investigación. ¿Serán modificadores de riesgo los polimorfismos de las isoenzimas GST en
relación a la frecuencia de los biomarcadores de efecto en agricultores
expuestos a plaguicidas?
3.2. Hipótesis.
Los genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y de la GSTT1 afectan a las
frecuencias de parámetros de genotoxicidad (MN e ICH) en individuos
expuestos a mezclas de estos contaminantes, junto a la magnitud de
exposición a plaguicidas.
Noemí Tirado Bustillos
60
4. OBJETIVOS.
4.1. OBJETIVO GENERAL.
Evaluar la influencia de los polimorfismos genéticos del gen de la glutatión S-
transferasa, GSTM1 y GSTT1 como modificadores de riesgo mutagénico en
trabajadores agrícolas expuestos a plaguicidas.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1. Establecer el posible efecto genotóxico de los plaguicidas mediante las
técnicas de micronúcleos (MN) y de intercambios entre cromátides
hermanas (ICH) en linfocitos de sangre periférica.
2. Identificar el efecto citotóxico de los plaguicidas mediante la determinación
del Indice de duplicación nuclear (IDN).
3. Determinar los valores de colinesterasa sérica como biomarcador de
exposición.
4. Determinar el genotipo a través de las isoformas de las enzimas GSTs
(GSTM1 y GSTT1).
5. Establecer la variabilidad genética de los genotipos GST como modificadores
de riesgo mutagénico por exposición a plaguicidas.
6. Establecer la asociación de los polimorfismos con el riesgo mutagénico y
genotóxico.
7. Determinar la existencia de factores modificadores de efecto, confundentes o
protectores.
Noemí Tirado Bustillos
61
5. MATERIAL Y MÉTODOS.
5.1. DISEÑO DEL ESTUDIO.
Se realizó un estudio de casos y controles anidado en un estudio de corte
transversal.
5.2 POBLACION ESTUDIADA.
Las muestras y los datos para el estudio se recogieron de 4 municipios del
departamento de La Paz, Bolivia (mapas en anexo 3), en estas regiones es
conocida la importancia del uso de plaguicidas en la agricultura debido a la
producción de cosechas tales como vegetales, flores y tomates para la venta en
la ciudad de La Paz y para la exportación al país vecino, Perú. Los dos
municipios cerca del la ciudad de La Paz, Palca y Mecapaca, tienen un clima
templado debido a su localización de 2,500 a 3,500m sobre nivel del mar. Los
otros dos municipios Caranavi y Guanay tienen un clima subtropical, y se
sitúan en la región de los Yungas a una altitud de 500 a 2,000m sobre nivel del
mar, forman un puente de valles de la meseta central de Bolivia ' el Altiplano '
4,000m sobre el nivel del mar.
La población analizada en este estudio ha sido de 142 personas, divididas en
dos grupos de expuestos y controles, que se diferencian en su exposición a
plaguicidas. Así mismo se clasificó en dos grupos: casos (personas expuestas o
no expuestas con daño genotóxico) y controles (personas expuestas o no
expuestas sin daño genotóxico).
5.2.1. Grupo expuesto.
Los individuos expuestos son agricultores residentes de las comunidades de
Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca. Este grupo está formado por un total de
Noemí Tirado Bustillos
62
99 personas, de las cuales 76.9 % son hombres y 42.7% mujeres. La edad
media del grupo expuesto es de 37años.
5.2.2. Grupo control.
El grupo control consta de 43 personas no expuestas a plaguicidas, residentes
de las mismas comunidades Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca. Este grupo
está compuesto de 23,1% hombres y 52,8% mujeres, con una edad promedio
de 34 años.
5.2.3. Grupo caso.
El grupo caso consta de aquellas personas expuestas o no a plaguicidas que
presentaron daño genotóxico en por lo menos una prueba de la batería de
ensayos empleados.
5.2.4. Grupo control.
Los controles fueron definidos como aquellas personas expuestas o no a
plaguicidas que no presentaron daño genotóxico con ninguna de las pruebas
empleadas.
5.3. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS Y APLICACIÓN DE LA
ENCUESTA.
Las personas que aceptaron participar en el estudio fueron informadas
adecuadamente de los objetivos y metodología del mismo y consultadas acerca
de su interés y libre voluntad en colaborar, antes de obtener su consentimiento
por escrito.
5.3.1. Elaboración de la encuesta.
Para obtener la información, tanto individual como general, de las personas
incluidas en el estudio, se realizó una encuesta diseñada con la finalidad de
obtener información detallada acerca de los antecedentes y características
personales de cada participante. En líneas generales la encuesta recoge
Noemí Tirado Bustillos
63
información que incluye: datos personales, actividades laboral actual y previa,
otras actividades (chaqueo), dieta, estilo de vida (consumo de tabaco, de
alcohol, té, café, mate de coca), exposición a agentes físicos y químicos y
antecedentes familiares y de salud. En el anexo 4 se presenta una copia de la
encuesta.
5.3.2. Evaluación de la información de la encuesta.
Las encuestas fueron codificadas juntamente con las muestras, luego se
introdujo la información en una base de datos y posteriormente se procedió al
análisis.
5.3.3. Determinación de la actividad colinesterasa.
La actividad de colinesterasa en suero fue medida en el laboratorio del INSO
por un método espectrofotométrico, cuyo fundamento se basa en que la
colinesterasa se utiliza en el primer paso de la reducción del potasio
hexacianoferrato produciéndose un cambio en el color que se puede medir con
una variación debajo de 2,3% dentro del mismo sistema de análisis. Las
medidas se dan en KU/L (kilounidades por litro). La variación individual
normal es demasiado amplia, los resultados pueden ser utilizados solamente
de manera individual en el análisis de sangre de la persona cuando no ha
estado en contacto con los organofosforados por meses. Pero para un nivel
grupal la actividad de colinesterasa en suero se puede comparar entre los
diversos grupos, si se asume que los individuos se distribuyen uniformemente
dentro de los mismos. Sabemos que la actividad de colinesterasa puede ser
influenciada por el peso, sexo, edad, enfermedades hepáticas, alcoholismo y
uso de píldoras anticonceptivas.
5.3.4. Evaluación de daño genotóxico.
5.3.4.1. Obtención y preparación de las muestras.
Las muestras de sangre se obtuvieron mediante punción venosa usando tubos
vacutainer con Heparina como anticoagulante (Becton Dickinson Lakes. NJ)
Noemí Tirado Bustillos
64
previamente identificados con el código de los donantes; los tubos se
transportaron al Instituto de Genética en el transcurso de 24 horas y se realizó
los cultivos y preparaciones de acuerdo a protocolo estandarizado que se
detalla a continuación.
5.3.5. Ensayo de MN en linfocitos de sangre periférica.
5.3.5.1. Protocolo.
Después de homogenizar la muestra, se agregaron 0,5 mL de sangre total a 4,5
mL de medio de cultivo RPMI 1640, suplementado con 10% de suero bovino
fetal, 1% de una solución de antibiótico antimicótico (SIGMA), los linfocitos se
estimularon con 1% de fitohemaglutinina (PHA) Gibco. Los cultivos se
incubaron a 37º C durante 72 h, lo que corresponde a dos ciclos celulares.
Pasadas las 44 h de cultivo se agregó citocalasina B (Sigma) a una
concentración final de 6µg/mL. Se ha demostrado que esta concentración
permite detener la citocinesis de forma óptima, obteniendo mejores valores del
índice de división celular y una mejor estima de la frecuencia de MN, al evitarse
la sobrevaloración ya que se puede diferenciar con mayor precisión las células
correspondientes a la segunda división mitótica (Surrallés y col. 1994). Pasadas
las 72 horas de incubación, los cultivos se centrifugaron a 800 r.p.m durante 8
min. Después de aspirar el sobrenadante, las células fueron sometidas a
choque hipotónico mediante una solución de KCl 0,075 M a 37º C, agitando
enérgicamente en el vórtex; de esta manera se eliminan los hematíes
preservando el citoplasma de los leucocitos, luego se incubó a 37º C durante 5
min. Después de centrifugar nuevamente los tubos en las mismas condiciones
y eliminar el sobrenadante, se procedió a la fijación de células con una
solución de metanol y ácido acético fría en proporción de 5:1 (vol/vol), recién
preparada, agregándola suavemente para evitar precipitados celulares. Se
centrifugó nuevamente para eliminar el sobrenadante, repitiendo el proceso
dos veces o más hasta que el botón celular quedó suficientemente limpio.
Noemí Tirado Bustillos
65
El botón celular se resuspendió en una pequeña proporción de la solución de
fijación y se goteó sobre portaobjetos limpios y fríos. Las preparaciones se
dejaron secar a temperatura ambiente para luego ser teñidas con una solución
de Giemsa al 6% (Merck) en tampón Sörensen (pH 6.8) durante 12 minutos.
Una vez teñidas, las placas fueron examinadas para determinar la frecuencia
de MN. Los portaobjetos de todos los individuos, tanto expuestos como
controles, se codificaron en ciego por una tercera persona antes de su análisis
para evitar al máximo la subjetividad en el recuento. En la figura 4 se
presentan dos imágenes en las que se puede observar con claridad, linfocitos
binucleados con MN.
De cada individuo se analizaron 1000 células binucleadas con el citoplasma
bien conservado. La observación de los núcleos se realizó con microscopio
óptico (Leitz Laborlux D, Alemania) con el objetivo de 1000 aumentos.
a b
Figuras 4 a y b. Linfocitos binucleados con un MN Fuente: elaboración propia
También se procedió a determinar el parámetro conocido como índice de
división nuclear con bloqueo de la citocinesis (IDN), para detectar efectos de
citotoxicidad. El IDN o CBPI (cytokinesis block proliferation index) se calculó
mediante la siguiente fórmula:
Noemí Tirado Bustillos
66
IDN = [M1 + 2M2 + 3(M3+M4)]/N
Donde M1 a M4 representan el número de células con uno a cuatro núcleos
respectivamente, y N es el número total de células contadas. Las células con
tres y cuatro núcleos se han considerado equivalentes y correspondientes a la
tercera división mitótica (Surrallés y col., 1995).
5.3.6. Intercambio entre cromátides hermanas (ICH).
5.3.6.1 Protocolo. Los linfocitos fueron incubados en medio RPMI-1640 (Sigma), suplementado
con 1.5% penicilina-estreptomicina (5000 IU/ml–5000 g/ml, respectivamente y
1% l-glutamina (Sigma), 5’-bromo-deoxyuridine (BrdU) (Sigma) (20 uM) y
Phytohaemagglutinine (PHA) 2,5 mg/ml, en la oscuridad por 72 h en estufa a
37ºC y las metafases fueron bloqueadas durante las 2 últimas horas con
colchicina. Los ICH fueron preparados de acuerdo a protocolos convencionales.
Las células fueron colectadas por centrifugación, resuspendidas en una
solución hipotónica precalentada a 37ºC (0.075 M KCl) por 15 min y fijadas en
una solución fría de metanol y ácido acético (3:1 v/v). El botón celular se
resuspendió en una pequeña proporción de la solución de fijación y se goteó
sobre portaobjetos limpios y fríos. Las placas de vidrio fueron secadas al aire
y teñidas con Giemsa al 6% en buffer Sörensen a pH 6.8, de acuerdo al método
propuesto por Perry y Wolf (1974). Las placas de cada cultivo fueron
randomizadas y evaluadas a doble ciego, observándose ICH/célula en 30
metafases en segunda división por cada individuo.
El índice de proliferación celular (PRI) fue calculado con la fórmula
PRI = 1M1 + 2M2 + 3M3
100
Donde M1, M2 y M3 son metafases de primera, segunda y tercera división
respectivamente.
Noemí Tirado Bustillos
67
El análisis del % HFC fue realizado de acuerdo a Carrano y Moore. Una célula
con alta frecuencia de intercambios (HFC) fue definida como una célula que
presenta un número mayor a 10 ICH/célula.
a b Figuras 5 a y b. Metafases con intercambios entre cromátides hermanas Fuente: Elaboración propia
5.3.7. Genotipificación de las glutatión S-tansferasas
5.3.7.1 Obtención y preparación de las muestras.
Para el análisis de los genotipos de las GSTs se obtuvieron muestras de sangre
de cada uno de los individuos que participaron en el estudio. Las muestras
fueron recogidas mediante punción venosa en tubos vacutainer con EDTA
(etilen diamino – tetra acético), previamente identificados con el código de cada
uno de los donantes. Las muestras fueron transportadas al Instituto de
Genética en un tiempo no mayor a 24 horas donde se realizó la extracción del
DNA y el análisis. La identificación de los genotipos GSTM1 y GSTT1 se hizo
simultáneamente mediante una prueba de PCR múltiple, siguiendo el protocolo
de Abdel – Rahman y col. (1996).
Noemí Tirado Bustillos
68
5.3.7.2 Protocolo.
Extracción de DNA:
A partir de la muestra de sangre periférica de cada individuo con
anticoagulante EDTA, se realizó la extracción con el Kit de Promega Wizard
Genomic DNA purification de acuerdo al siguiente protocolo:
- A un volumen de 300 µl de sangre se adicionó 900 µl de solución
de lisis en un tubo de microcentrífuga de 1,5ml.
- Previamente se agitó el tubo suavemente hasta mezclar la sangre,
luego se transfirió la sangre a un tubo conteniendo la solución de
lisis de células. Se invirtió el tubo 5-6 veces para mezclar.
- Se incubó la mezcla por 10 min. a temperatura ambiente
(invirtiendo 2-3 veces durante la incubación) para lisar las células
rojas. Se centrifugó a 14,000 x g durante 20 seg. a temperatura
ambiente.
- Se removió y descartó lo más que se pudo de sobrenadante sin
mezclar el precipitado blanco. Aproximadamente 50-100 µl del
líquido residual quedó en el tubo de 1,5 ml.
- Se agitó en vórtex el tubo vigorosamente hasta que las células
blancas estuvieran resuspendidas ( 10-15 segundos)
- Se añadió la solución de lisis de núcleos 300 µl al tubo
conteniendo las células resuspendidas, pipeteando la solución 5-6
veces para lisar las células blancas, la solución se tornó muy
viscosa.
- Se añadió opcionalmente la solución de RNasa 1,5 µl para lisar el
núcleo o mezclar la muestra invirtiendo el tubo 2-5 veces. Incubar
la mezcla a 37ºC por 15 min, luego enfriar a temperatura
ambiente.
- Se adicionó la solución de precipitación de proteínas 100 µl para
lisar el núcleo y se mezcló vigorosamente por 10–20 segundos. Se
hicieron visibles pequeños cúmulos de proteínas después de agitar.
Noemí Tirado Bustillos
69
- Se centrifugó a 14,000 x g por 3 min. A temperatura ambiente.
Para obtener un pellet café oscuro de proteínas.
- Se transfirió el sobrenadante limpio a un tubo de 1,5 ml
conteniendo 300µl de isopropanol a temperatura ambiente.
- Suavemente se mezcló la solución por inversión hasta que las
hebras blancas de DNA se hicieron visibles.
- Nuevamente se centrifugó a 14,000 x g por 1 min. A temperatura
ambiente. Hasta que el DNA se hiciera visible como una masa
blanca.
- Se decantó el sobrenadante y se añadió un volumen igual de etanol
al 70% al DNA precipitado. Suavemente se invirtió el tubo varias
veces para lavar el pellet de DNA. Se centrifugó como en el paso
anterior.
- Cuidadosamente se aspiró el etanol utilizando una pipeta pasteur
teniendo el cuidado de no remover o aspirar el pellet de DNA. Se
invirtió el tubo y se colocó sobre un papel absorbente para secar el
pellet durante 10–15 min.
- Finalmente se adicionó la solución de rehidratación 100µl al tubo
para rehidratar incubando a 65ºC por 1 hora.
- Posteriormente se almacenó los tubos conteniendo el DNA a 2-8ºC
hasta su procesamiento.
PCR Multiplex:
El PCR multiplex se realizó en un volumen final de 25 µl conteniendo 100 ng
de DNA genómico, 100 ng de cada primer, 2 mM de dNPTPs, 2.5 µl de buffer
para PCR 10X (1X: 200 mM Tris HCl, 500 mM KCl, pH 8,4), 2,0 mM de MgCl 2,
y 1.25 U de DNA taq polimerasa (Gibco - invitrogen). Los primers que se
utilizaron (GSTM1 y GSTT1) en la PCR, la secuencia de los mismos, la longitud
de los productos amplificados en pares de bases (pb) y la secuencia del control
interno (exón 7 del gen CYP1A1), se detallan en la tabla 8.
Noemí Tirado Bustillos
70
Tabla 8. Cebadores utilizados en la PCR múltiple para la detección de
los genotipos GST estudiados
Gen Cebador Secuencia Pb
GSTM1
GSTM1
GSTT1
GSTT1
CYP1A1
CYP1A1
Directo
Reverso
Directo
Reverso
Directo
Reverso
5’ GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC 3’
5’ GTTGGGCTCAAATATACGGTGG 3’
5’ TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 3’
5’ TCACCGGATCATGGCCAGCA 3’
5’ GAACTGCCACTTCAGCTGTCT 3’
5’ CAGCTGCATTTGGAAGTGCTC 3’
480
215
312
Condiciones de la reacción: la desnaturalización inicial 95º por 5 min.
seguidos de 30 ciclos del desnaturalización seguidos de 30 ciclos de
desnaturalización a 94º por 2 min, templado del cebador a 59ºC por 1 min, y
polimerización a 72º por 1 min. Esto seguido de un paso de extensión final a
72º C por 4 min.
Los productos del PCR se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al
2% 3:1 teñidos con bromuro de etidio (0.5µg/ml). La presencia o ausencia de
los genes de GSTM1 y GSTT1 se detectó por la presencia o ausencia de una
banda en 480 pb y una banda en 215 pb respectivamente. Una banda a 312 pb
(CYP1A1) documentó una amplificación existosa.
Noemí Tirado Bustillos
71
Tabla 9. Ciclos de amplificación de la PCR multiplex para GSTs
Ciclos Temperatura Tiempo
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
Hibridación x 30
Extensión
Extensión final
95ºC
94ºC
59ºC
72ºC
72ºC
5min
2 min.
1 min.
1 min.
4 min.
M 1 2 3 4
480 bp
Figura 6. Gel representativo de los polimorfismos GSTM1 Y GSTT1 M: Marcador de peso molecular de 50 bp.; 1 muestra GSTM1 + GSTT1-; 2 muestra GSTM1 +/ GSTT1 +; 3 muestra GSTM1 - /GSTT1 + y 4: muestra.GSTM1 - /GSTT1 – Fuente: Elaboración propia
Control Interno: siempre el exón 7
del gen CYP1A1 312 bp
GSTM1: 480 bp sólo el normal
GSTT1: 215 bp sólo el normal
215 bp
312 bp
Noemí Tirado Bustillos
72
5.4 ANÁLISIS ESTADÍSTICO.
Se realizó un análisis descriptivo e inferencial a través de un diseño de casos y
controles anidado en estudio de corte transversal. Para realizar el análisis
estadístico de los datos obtenidos en el estudio, primero se confeccionó una
base de datos completa incluyendo tanto los datos obtenidos a través de la
encuesta, como los resultados de los análisis de las muestras procesadas en el
laboratorio. La base de datos se confeccionó utilizando el paquete estadístico
SPSS versión 11.5. Para determinar la normalidad de los datos, se aplicó la
prueba no paramétrica de Kolmogórov- Smirnóv.
Para determinar la significancia estadística de los resultados, en el caso de que
la variable tuviera una distribución normal de los datos, se ha aplicado la
prueba de t de Student para la comparación de medias de dos grupos
independientes y, en caso de que los datos no presentaron una distribución
normal, se utilizó la prueba de Mann Whitney para la comparación de medias
de dos grupos independientes y Kruskal Wallis para la comparación de medias
de más de dos grupos independientes. En ambos casos el nivel de confianza
empleado fue el 95%. Para la determinación del factor de riesgo (OR) de la
presencia o ausencia de los polimorfismos en relación al daño genotóxico se
clasificó la población en dos grupos, casos y controles.
Noemí Tirado Bustillos
73
6. RESULTADOS.
6.1 ANALISIS DEMOGRÁFICO.
Los datos poblacionales que se presentan han sido obtenidos a partir del
análisis de las encuestas efectuadas a cada una de las personas incluidas en
el estudio. El modelo de encuesta aplicada se adjunta en Anexo 1.
Del análisis se obtuvo la descriptiva poblacional de cada uno de los grupos de
estudio, y luego se efectuó el análisis con los resultados obtenidos de los
procedimientos de parámetros de genotoxicidad y genotipificación.
La base de datos para este análisis se realizó con el programa SPSS versión
11.5.
Después de hacer el análisis de las distintas variables, se ha considerado que
los posibles factores de confusión a tener en cuenta en este estudio son los
siguientes: la edad, el sexo, consumo de mate de coca. Dado que la incidencia
de cáncer entre familiares podría se un indicador de cierta sensibilidad frente a
la exposición a agentes genotóxicos, la variable “familiar con cáncer” indica los
casos de parientes directos que hayan sufrido la enfermedad. También se han
tomado en cuenta en el estudio el hábito de fumar, el consumo de alcohol, el
consumo de hojas de coca (acullico) y el chaqueo.
6.1.2. Descripción poblacional.
En la figura 7 se representa la distribución general de la población de estudio
por localidad: Caranavi (33,8%), Guanay (12,7 %), Mecapaca (8,5%) y Palca
(41,5%).
Noemí Tirado Bustillos
74
34%
13%
42%
9% 2%
CARANAVI GUANAY PALCA M ECAPACA OTROS
Figura 7. Distribución de la población estudiada
De las 142 personas que participaron en el estudio, 99 (70%) fueron de
ocupación agricultores, el 30% restante fue personal de salud y educación. El
25,4% fue del sexo femenino y el 74,6% del sexo masculino; el 27% tienen
hábito tabáquico; el 41,8% consume bebidas alcohólicas. Sólo el 23% ha sido
sometido alguna vez a rayos X. El 42,1% chaquean. El 57,1 % mastica hojas de
coca y el 42,1% consume mate de coca. Un porcentaje muy bajo 4,3% tiene
antecedentes familiares de cáncer (Tabla 10)
Noemí Tirado Bustillos
75
Tabla 10. Análisis demográfico de la población estudiada
Variable %
Ocupación Agricultor 70
No agricultor 30
Sexo Femenino 25,4
Masculino 74,6
Hábito tabáquico
Si 27
No 73
Consumo de
alcohol
Si 41,8
No 58,2
Masticadores de
coca
Si 57,1
No 42,8
Nº Chaqueos/Año 1 vez al año 72,9
2 veces al año 18,8
Familiares con
cáncer
Si 4,3
No 94,3
Del total de trabajadores agrícolas, el 49,2% utilizaron organofosforados, el
9,8% y 8,8 % fungicidas y piretrinas o piretroides respectivamente (Fig. 8).
Figura 8. Porcentaje de plaguicidas utilizados
1 9 , 0 0 1 7 , 0 0
9 5 , 0 0
1 2 , 0 0
5 0 , 0 0
9,8 8,8
49,2
6,225,9
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
%
Nº
personas
Noemí Tirado Bustillos
76
6.1.3. Análisis demográfico en los grupos expuesto y control.
Tabla 11. Descripción poblacional expuestos y control
Población Control Expuesto
Nº de personas
Edad:
años
Sexo:
Hombres
Mujeres
Habito de fumar:
Fumador
No fumador
Consumo de alcohol
Si
No
Masticación de coca
Si
No
Familiar con cáncer
Si
No
43
34 ± 1,83
24 (55,8%)
19 (44,2%)
15 (35,7%)
27 (64,3%)
25 (59,5%)
17 (40,5%)
21 (50%)
21 (50%)
2 (4,8%)
40 (95,2%)
99
37± 1,24
82 (82,8%)
17 (17,2%)
39 (40,6%)
57 (59,4%)
56 (57,7%)
41 (42,3%)
58 (60,4%)
38 (39,6%)
4 (4,2%)
92 (95,8%)
Se analizaron 142 muestras de sangre de trabajadores agrícolas y controles
(grupo expuestos 99 personas y el grupo control 43 personas). Los datos
descritos a continuación han sido extraídos de las encuestas aplicadas.
Edad: No existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos
analizados en función a la variable edad.
Noemí Tirado Bustillos
77
Sexo: En ambos grupos existen hombres y mujeres. En la población control
hay un 44,2 % de mujeres y un 55,8% de hombres, mientras que en el grupo
de expuestos un 17,2% son mujeres y un 82,8% son hombres. A pesar de que
en el grupo de expuestos existen mayor porcentaje de hombres existe un
porcentaje apreciable de mujeres que utilizan plaguicidas.
Consumo de alcohol: En la población estudiada de controles el 59,5%
consumen alcohol, similar porcentaje al del grupo de expuestos 57,7%.
Consumo de mate de coca: en cuanto al consumo de mate de coca no existe
diferencias entre los individuos de los dos grupos. En el grupo de expuestos
42,7% consumen mate de coca mientras que el grupo control 40,5%.
Masticación de hojas de coca (Acullico): La población en general que matica
hojas de coca está en un 57.1%. No encontrándose diferencias significativas
entre los grupos de expuestos con un 60,4% y los controles en un 50%.
Hábito de fumar: para el análisis de esta variable, la población se ha dividido
en fumadores y no fumadores. El grupo de expuestos presenta un 35,7% de
fumadores, mientras que el grupo control un mayor porcentaje 40,6%.
Cáncer entre familiares: En cuando a la incidencia de cáncer entre familiares
más cercanos tenemos que en el grupo de expuestos 4,8% tienen un familiar
con cáncer y en el grupo control un porcentaje similar 4,2%.
6.2 BIOMARCADORES DE EXPOSICIÓN.
6.2.1 Determinación de Colinesterasa.
La toma de muestras de sangre y la determinación de la actividad de
colinestera fueron realizadas por el personal del laboratorio del Instuto
Nacional de Salud Ocupacional (INSO). Los resultados no mostraron
diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de expuestos y
controles en los niveles de colinesterasa determinados. Con valores de
0,388±0,078 en el grupo de controles y 0,403±0,077 en el grupo de expuestos.
En la tabla 12 y en la figura 9 se muestran los valores de colinesterasa
distribuidos por comunidad, observándose diferencias estadísticamente
significativas.
Noemí Tirado Bustillos
78
Tabla 12. Valores de Colinesterasa por comunidad
12561848N =
Comunidad
MecapacaPalcaGuanayCaranavi
Co
lin
est
era
sa s
eri
ca
.6
.5
.4
.3
.2
Figura 9. Valores de colinesterasa distribuidos por comunidad. Kruskal Wallis, Caranavi vs. Guanay p = 0.000, Caranavi Vs. Palca p=0,04, Caranavi vs. Mecapaca. p= 0,05, Guanay vs. Mecapaca p = 0.000, Palca Vs. Mecapaca p= 0,01
Comunidad X ± ES
Caranavi
Guanay
Palca
Mecapaca
0,397 ± 0,004
0,364 ± 0,006
0,375 ± 0,007
0,417 ± 0,011
Noemí Tirado Bustillos
79
6.3. BIOMARCADORES DE EFECTO BIOLÓGICO
6.3.1 MNs e ICHs en linfocitos
Se utilizaron los ensayos de micronúcleos (MN) y de intercambios entre
cromátides hermanas (ICH) de sangre periférica para evaluar el daño
citogenético en la población, el primero con el objeto de determinar un posible
efecto de rotura o mala segregación cromosómica durante la división celular y
el segundo para determinar daño primario al DNA.
En la tabla 13 se pueden observar las medidas de las variables citogenéticas
evaluadas.
Tabla 13. Daño citogenético en linfocitos de la población estudiada
Total Controles ( 30) Expuestos (60)
MN / 1000 BN
IDN
Nº ICH/metafase
%HFC
PRI
3,33 ± 0,51
1,94 ± 0,04
11,20 ± 0,91
50,45 ± 9,16
2,37 ± 0,11
2,86 ± 0,34
1,87 ± 0,04
10,74 ± 0,45
43,86 ± 3,57
2,30 ± 0,03
Al analizar la varible MNBN en la población total separada por sexo se pudo ver
que la población de mujeres presenta mayor frecuencia de daño citogenético
con un valor estadísticamente significativo (p=0,026), datos que se observan en
la figura 10.
Noemí Tirado Bustillos
80
6623N =
masculinofemenino
MN
BN
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
117
Figura 10. MNBN en la población agrupada por sexo p= 0,026
En la tabla 14 se observan los datos de los biomarcadores citogenéticos
analizados por comunidad donde se observan diferencias estadísticamente
significativas entre las comunidades.
Tabla 14. Daño citogenético en linfocitos según Comunidad
Biomarcador de efecto
Caranavi Guanay Mecapaca Palca
MNBN
IDN
ICH
%HFC
PRI
2,38±0,472*
1,85±0,081‡
11,98±0,68¶
55,07±4,84♣
2,35±0,04
3,63±0,366
1,86 ±0,096
2,23±0,21†
59,11±14,62♠
2,23±0,21
1,50±0,327
1,78±0,055
8,64±1,05
25,11±13,3
1,87±0,5
3,70±1,367*
1,97±0,029‡
2,30±0,21¶†
33,61±4,37♣♠
2,309±0,05
*p= 0,001; ‡ p = 0,01; ¶ p = 0,004; † p = 0,042; ♣ p = 0,001; ♠p= 0,032; p= 0,035; p=0,03; U de Mann Whitney diferencias estadísticamente significativas entre poblaciones
Noemí Tirado Bustillos
81
Al analizar la variable MNBN en la población separada por comunidades
(Figura 11) se puede ver que la comunidad de Palca presenta mayor frecuencia
de MN (p=0,035) en relación a Caranavi.
8401032N =
Comunidad
MecapacaPalcaGuanayCaranavi
MN
/10
00
BN
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
Figura 11. MNBN en la población distribuida por comunidad. Kruskal Wallis, p =0,001 En la figura 12 se puede apreciar los valores de IDN observándose una
diferencia estadísticamente significativa entre Palca y Caranavi.
8401032N =
Comunidad
MecapacaPalcaGuanayCaranavi
IDN
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
.5
Figura 12. IDN en la población distribuida por comunidad. Kruskall Wallis, p= 0,01
*
*
* *
Noemí Tirado Bustillos
82
Los valores de ICH, %HFC y PRI se muestran en la siguientes gráficas (Figuras
13, 14 y 15) agrupados por comunidad.
236436N =
Comunidad
MecapacaPalcaGuanayCaranavi
INT
ER
CA
MB
IOS
EN
TR
E C
RO
MĮT
IDE
S H
ER
MA
NA
S
30
20
10
0
Figura 13. ICH en la población distribuida por comunidad. Kruskal Wallis, * p= 0,004, ‡ p=0,042
236436N =
Comunidad
MecapacaPalcaGuanayCaranavi
% H
FC
120
100
80
60
40
20
0
-20
Figura 14. %HFC en la población distribuida por comunidad. Kruskal Wallis, * p=0,001, ‡ p= 0,032
* * ‡
‡
*
*
‡
‡
Noemí Tirado Bustillos
83
236435N =
Comunidad
MecapacaPalcaGuanayCaranavi
PR
I
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
Figura 15. PRI en la población distribuida por Comunidad Kruskal Wallis * p=0,035, ‡ p=0,03
6.4 BIOMARCADORES DE SUSCEPTIBILIDAD INDIVIDUAL.
El análisis de los polimorfismos genéticos se llevó a cabo sobre un total de 142
personas utilizando la técnica de PCR multiplex. En la tabla 15 se muestran
las frecuencias de los distintos genotipos para los genes GSTM1 y GSTT1
observados en la población total estudiada.
* ‡
*
‡
Noemí Tirado Bustillos
84
Tabla 15. Frecuencia de los genotipos para GSTM1 y GSTT1 en la
población estudiada
Genotipo Alelo Frecuencia %
GSTM1
M+
M-
87
55
61,4%
38,6%
GSTT1 T+
T-
58
84
40,8%
59,2%
La población estudiada en este trabajo cuenta con 55 personas que presentan
deleción del gen GSTM1, lo que representa un 38,6% del total de la población.
Estos datos concuerdan con frecuencias encontradas en estudios realizados en
poblaciones caucásicas (Gapar y col., 2002), donde reportan que un 38 – 62%
de las poblaciones presentan la deleción del gen GSTM1.
Para el genotipo GSTT1 un 40.8% de la población presenta el genotipo salvaje y
un 59,2% presenta la deleción del gen.
La frecuencia de los diferentes genotipos para el polimorfismo GSTT1, que se
observan en la tabla 16 fueron los siguientes: de la GSTT1 presente 61,3% y de
la GSTT1 nula 38,7.
Noemí Tirado Bustillos
85
Tabla 16. Frecuencias genotípicas de los polimorfismos de la GSTM1 Y
GSTT1 en la población por comunidad
Caranavi Guanay Mecapaca Palca (%) (n) (%) (n) (%) (n) (%) (n) Genotipo
GSTM1 nulo 35,7 (17) 38,9 (7) 25 (3) 43,8 (28)
GSTM1 positivo 64,6 (31) 61,1 (11) 75 (9) 56,3 (36)
GSTT1 nulo 60,4 (29) 72,2 (13) 58,3 (7) 54,7 (35)
GSTT1 positivo 39,6 (19) 27,8 (5) 41,7 (5) 45,3 (29)
En las figuras 16 y 17 se muestran gráficamente las frecuencias genotípicas de
los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 respectivamente distribuidos por
comunidad.
GSTM1
positivonulo
Fre
cu
en
cia
(%
)
80
60
40
20
0
Comunidad
Caranavi
Guanay
Palca
Mecapaca
75
25
57
43
61
39
64
36
Figura 16. Frecuencias de los polimorfismos GSTM1 distribuidos por Comunidad.
Noemí Tirado Bustillos
86
GSTT1
positivonulo
FR
EC
UE
NC
IA (
%)
80
60
40
20
0
Población
Caranavi
Guanay
Palca
Mecapaca
42
58
45
55
28
72
40
60
Figura 17. Frecuencias de los polimorfismos GSTT1 distribuidos por Comunidad.
En la tabla 17 se puede observar la asociación de las frecuencias de los
genotipos heterocigoto y homocigoto de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 en
la población por comunidad. Destacandose que en las comunidades de
Caranavi y Palca existen frecuencias similares de los genes nulos de GSTM1 y
GSTT1.
Tabla 17. Frecuencia de polimorfismos GSTM1/GSTT1 en la población
por Comunidad
GSTM1/GSTT1 Caranavi Guanay Palca Mecapaca
N % N % N % N %
+/+ 15 31.3 3 16.7 16 25.0 3 25.0
+/- 17 35.4 8 44.4 20 31.3 6 50.0
-/- 12 25.0 6 33.3 15 23.4 1 8.3
-/+ 4 8.3 1 5.6 13 20.3 2 16.7
Total 48 100 18 100 64 100 12 100
Noemí Tirado Bustillos
87
31.3
35.4
25.0
8.3
16.7
44.4
33.3
5.6
25.0
31.3
23.4
20.325.0
50.0
8.3
16.7
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
CARANAVI GUANAY PALCA MECAPACA
+/+
+/-
-/-
-/+
Figura 18. Frecuencias de la asociación de los polimorfismos GSTM1 y GSTT1 por comunidad
6.4.1. Asociación de la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y
la GSTT1 con los niveles de colinesteresa en sangre
Para conocer si la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y de la GSTT1
en individuos expuestos a plaguicidas podían modificar los niveles de
colinesterasa en sangre se aplicó la prueba t de Student la misma que reveló
que no existen diferencias estadísticamente significativas para GSTM1 (p=0,44)
ni para GSTT1 (p=0,13), donde los individuos con genotipos GSTM1 y GSTT1
nulos tenían niveles similares del biomarcador de exposición en relación a los
individuos que presentaron el genotipo positivo.
Noemí Tirado Bustillos
88
6.4.2. Asociación de la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y
la GSTT1 con el daño genotóxico
Para determinar si la presencia de los polimorfismos de la GSTM1 y la GSTT1
podían modificar de alguna forma el daño genotóxico en individuos expuestos a
plaguicidas se trabajoó con las poblaciones de expuestos y controles.
6.4.2.1 Micronúcleos
Al evaluar la asociación de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 con el daño
genotóxico en sujetos expuestos se observó que la presencia del genotipo
GSTM1 (positivo) presentó una frecuencia de MN superior en relación al
genotipo GSTM1 nulo, aunque estadísticamente no significativo (p=0,075). Por
otro lado el genotipo GSTT1 nulo presentó una frecuencia de MN igual al
genotipo GSTT1 positivo. Los resultados se muestran en la tabla 18 y se
representan en figura 19.
Tabla 18. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su
asociación con la frecuencia de MN en linfocitos
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1a
Nulo
Positivo
GSTT1a
Nulo
Positivo
33
56
53
36
2,48
3,34
3,04
3,00
0,44
0,37
0,37
0,45
0,075
0,9
aMann-Whitney; nivel de significancia p = 0,075
ET:Error Típico
Noemí Tirado Bustillos
89
5633N =
GSTM1
positivonulo
MN
BN
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
161
179
221
22213712195
117
Figura 19. Micronúcleos según genotipo GSTM1 nulo/ positivo U de Mann Whitney p = 0.075
Tabla 19. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la
GSTM1 y GSTT1 con la frecuencia de MN en linfocitos
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1/GSTT1a
Nulo/nulo
Positivo/Positivo
GSTM1/GSTT1a
Positivo/positivo
Nulo/Positivo
21
24
24
11
2,38
3,17
3,17
2,91
0,58
0,59
0,59
0,68
0,240
0,84
a Prueba de Kruskal-Wallis. NS. ET.: Error Tipico
Noemí Tirado Bustillos
90
Se consideró la combinación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 (Tabla 19).
El resultado de la combinación nulo/nulo muestra que la media es ligeramente
inferior en relación al positivo/positivo aunque estadísticamente no
significativa. Mientras que los individuos que presentan positivo/positivo
presentan una frecuencia ligeramente superior comparada con los individuos
que presentan el genotipo nulo/positivo no significativa estadísticamente.
6.4.2.2. Índice de duplicación nuclear (IDN). Tabla 20. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su
asociación con el índice de duplicación nuclear
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1a
Nulo
Positivo
GSTT1a
Nulo
Positivo
33
56
53
36
1,96
1,86
1,90
1,89
0,77
0,28
0,50
0,38
0,310
0,27
aMann-Whitney; Ns.
ET:Error Tipico
En el caso del IDN se observó que en los individuos con el genotipo GSTM1
nulo los valores estaban ligeramente incrementados en relación a los
individuos GSTM1 positivo pero sin diferencia estadística. Lo mismo se puede
observar al analizar los individuos con el genotipo GSTT1 nulo en relación a los
que presentan el genotipo GSTT1 positivo (Tabla 21).
Noemí Tirado Bustillos
91
Tabla 21. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la
GSTM1 y GSTT1 con el IDN
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1/GSTT1a
Nulo/nulo
Positivo/Positivo
GSTM1/GSTT1a
Positivo/positivo
Nulo/Positivo
21
24
24
11
1,95
1,85
1,85
1,95
0,11
0,04
0,04
0,07
0,88
0,09
a Prueba de Kruskal-Wallis ET.: Error Tipico
Al evaluar la combinación de los polimorfismos GSTM1/GSTT1 (nulo/nulo) se
observó que la media es ligeramente inferior en relación al GSTM1/GSTT1
(positivo/positivo), valores estadísticamente no significativos. Mientras que los
individuos que presentan GSTM1/ GSTT1 (positivo/positivo) presentan una
frecuencia ligeramente superior comparado con los individuos que presentan el
genotipo GSTM1/GSTT1 (nulo/positivo) no significativo estadísticamente.
6.4.2.3 Intercambios entre cromátides hermanas (ICH). Los individuos con genotipo GSTM1 nulo mostraron un incremento en el
número de intercambios comparado con los individuos GSTM1 positivo. Al
evaluar el polimorfismo de la GSTT1 se observó que los individuos con genotipo
GSTT1 nulo presentan un número de intercambios menor en relación a los
individuos GSTT1 positivo pero estadísticamente no significativa. (Tabla 22)
Noemí Tirado Bustillos
92
Tabla 22. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su asociación con el número de ICH
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1a
Nulo
Positivo
GSTT1a
Nulo
Positivo
31
45
42
34
11,38
10,44
10,58
11,13
0,65
0,52
0,56
0,60
0,11
0,18
aMann-Whitney; NS. ET:Error Tipico
El resultado obtenido al evaluar el efecto de los polimorfismos GSTM1 nulo con
los del GSTT1 nulo muestra que no existen diferencias en el número de
intercambios en relación a los genotipos GSTM1 positivo con el GSTT1 positivo.
(Tabla 23)
Tabla 23. Asociación de los genotipos de los polimorfismos
de la GSTM1/ GSTT1 con los valores de ICH
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1/GSTT1a
Nulo/nulo
Positivo/Positivo
GSTM1/GSTT1a
Positivo/positivo
Nulo/Positivo
19
23
23
11
11,01
11,20
11,20
10,98
0,71
0,80
0,81
0,90
0,94
0,92
a Prueba de Kruskal-Wallis. NS ET.: Error Tipico
Noemí Tirado Bustillos
93
6.4.2.4 Porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios. En el caso del porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios se
observó que en los individuos con el genotipo GSTM1 nulo los valores estaban
incrementados en relación a los individuos GSTM1 positivo con una asociación
significativa (p=0.05). Mientras que al analizar los individuos con el genotipo
GSTT1 nulo en relación a los que presentan el genotipo GSTT1 positivo se
observó un efecto contrario, sin embargo no fue estadísticamente significativo
(Tabla 24, figura 20).
Tabla 24. Genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 y GSTT1 y su
asociación con el %HFC
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1a
Nulo
Positivo
GSTT1a
Nulo
Positivo
31
45
42
34
52,34
40,06
42,56
48,18
5,39
4,15
4,46
5,08
0,05
0,334
aMann-Whitney; p=0.05 ET:Error Tipico,
Noemí Tirado Bustillos
94
Figura 20. Porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios según genotipo GSTM1 nulo/ positivo. P=0,05
Al analizar la combinación de los polimorfismos, se pudo constatar que en
individuos que presentan los genes GSTM1/GSTT1 (nulo/nulo) los valores del
%HFC están aumentados en relación a los individuos GSTM1/GSTT1
(positivo/positivo), aunque el efecto no fue estadísticamente significativo.
Mientras que los individuos GSTM1/GSTT1 (positivo/positivo) presentaron un
%HFC menor en relación a los individuos GSTM1/GSTT1 (nulo/positivos). Los
resultados se muestran en la tabla 25.
4531N =
GSTM1
positivonulo
% C
élu
las
co
n a
lta f
recu
en
cia
de i
nte
rcam
bio
s
120
100
80
60
40
20
0
-20
Noemí Tirado Bustillos
95
Tabla 25. Asociación de los genotipos de los polimorfismos de la GSTM1 / GSTT1 con los valores de %HFC
Polimorfismo n Media E.T p
GSTM1/GSTT1a
Nulo/nulo
Positivo/Positivo
GSTM1/GSTT1a
Positivo/positivo
Nulo/Positivo
19
23
23
11
50,13
46,43
46,43
51,84
6,24
5,87
5,87
10,15
0,64
0,64
a Prueba de Kruskal-Wallis. NS. ET.: Error Tipico
Tabla 26. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 GSTT1 y daño genotóxico Caso Control Total
GSTM1
Nulo
Positivo
Total
25 (46,3%)
33 (38,4%)
58
29 (53,7%)
53 (61,6%)
82
54
86
140 (100%)
GSTT1
Nulo
Positivo
Total
34 (40,5%)
24 (41,4%)
58
50 (59,5%)
34 (58,6%)
82
84
58
142 (100%)
GSTM1 Odds ratio (OR): 1,385 (IC: 0,695 – 2,758); GSTT1 Odds ratio (OR): 0,963 (IC: 0,488 – 1,902)
Noemí Tirado Bustillos
96
Tabla 27. Magnitud de asociación entre polimorfismos y daño Mutagénico Factor GSTM1 OR IC 95%
Nulo Positivo
ICH
Menor a 10
Mayor a 10
9
49
36
48 0,245 0.107 – 0,563
MN
Menor a 2
Mayor a 2
21
12
25
31 2,17 0,897 – 5,250
IDN
Menor a 1
Mayor a 1
16
42
20
64 1,219 0,568 – 2,617
Noemí Tirado Bustillos
97
Tabla 28. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y otros factores de riesgo FACTOR GSTM1 OR IC 95%
Nulo Positivo
EXPOSICIÓN A PLAGUICIDAS
Expuesto
No expuesto
38
16
59
27 1,920 0,439 – 1,930
EDAD
Menor a 40
Mayor a 40
32
16
52
24 0,923 0,427 – 1,995
OCUPACIÓN
Agricultor
No agricultor
39
15
59
27 0,190 0,562 – 2,518
HÁBITO DE FUMAR
Fumador
No fumador
26
27
28
57 1,960 0,970 – 3,961
CONSUMO DE ALCOHOL
NO
SI
24
29
34
52 1,266 0,633 – 2,529
SEXO
Femenino
Masculino
12
42
24
62 0,738 0,333– 1,636
COMUNIDAD
Altiplano
Yungas
30
24
45
41 1,139 0,575 – 2,256
CHAQUEO
NO
SI
29
25
38
48 1,465 0,740– 2,903
RADIOGRAFÍA POR RAYOS X
NO
SI
40
11
65
21 1,175 0,513– 2,692
Noemí Tirado Bustillos
98
Tabla 29. Magnitud de asociación entre polimorfismos GSTT1 y otros factores de riesgo Factor GSTT1 OR IC 95%
Nulo Positivo
EXPOSICIÓN A PLAGUICIDAS
Expuesto
No expuesto
24
60
19
39 0, 821 0,398 – 1,694
EDAD
Menor a 40
Mayor a 40
49
25
35
17
0,952 0,448 – 2,022
OCUPACIÓN
Agricultor
No agricultor
60
24
40
18
1,125
0,542 – 2,335
HÁBITO DE FUMAR
Fumador
No fumador
30
53
25
32 0,725 0,364 – 1,443
CONSUMO DE ALCOHOL
NO
SI
42
41
17
41 2,471 1,214 – 5,028
SEXO
Femenino
Masculino
21
63
15
43 0,956 0,443– 2,059
COMUNIDAD
Altiplano
Yungas
42
42
34
24 0,706 0,359 – 1,387
CHAQUEO
NO
SI
38
46
30
28 0,771 0,394– 1,508
RADIOGRAFÍA POR RAYOS X
NO
SI
67
15
40
17 1,898 0,855– 4,213
Noemí Tirado Bustillos
99
6.4.3 Regresión logística.
Para determinar la existencia de factores que se asocian con los polimorfismos
GSTM1 y la exposición a plaguicidas se realizó el análisis de regresión logística,
los resultados obtenidos se resumen en la tabla 30. Estos resultados nos
muestran que de los factores analizados, el chaqueo muestra asociación
estadísticamente significativa (p = 0,03), el IDN muestra una asociación
estadísticamente marginal (p = 0,07), el número de intercambios entre
cromátides hermanas y el porcentaje de células con alta frecuencia de
intercambios dieron valores con significación estadística p=0,043 y p=0,044
respectivamente.
Noemí Tirado Bustillos
100
Tabla 30. Regresión logística de polimorfismos GSTM1 y GSTT1
con co-variables.
GSTM1 Error
Standard
z p Nivel de
significancia
GSTT1
MN1000BN
Colinesterasa
Ant. Familiar
Edad
Sexo
Chaqueo
Mast. Coca
Alcohol
IDN
ICH
%HFC
PRI
Exp. N.Exp.
Fumar
2.8354
0.4473
6.45e-10
1.77e+09
0.0561
11.8124
0.0697
0.0802
10.0352
0.0498
0.0623
0.1602
16.3964
9.2940
0.6978
0.358
0.486
- 0.940
0.014
- 0.148
0.630
- 2.156
-1.575
1.048
- 1.798
- 2.027
2.013
0.792
0.578
- 0.523
0.720
0.627
0.347
0.989
0.882
0.529
0.031
0.115
0.295
0.072
0.043
0.044
0.429
0.563
0.601
NO
NO
NO
NO
NO
NO
P < 0.05
NO
NO
Casi p <0.1
P < 0.05
P < 0.05
NO
NO
NO
Noemí Tirado Bustillos
101
7. DISCUSION.
La población de este estudio fue seleccionada por sus características
particulares de trabajo, que se destacan por una intensa actividad agrícola y
por tanto un uso indiscriminado y manejo inadecuado de los plaguicidas
especialmente en las poblaciones rurales, que supone un alto nivel de
exposición, debido a que comienzan sus labores agrícolas a temprana edad,
además por los resultados del primer estudio de riesgo genotóxico (Ascarrunz y
col, 2006; Jors y col. 2007) en sujetos expuestos a plaguicidas, donde se
observó una elevada frecuencia de ICH, MN, AC y parámetros del cometa, por
lo tanto, aumento de la probabilidad de que los trabajadores agrícolas
expuestos a estos agentes tengan daño genotóxico.
Las poblaciones de Caranavi, Guanay, Palca y Mecapaca, por sus
características netamente agrícolas, han merecido la implementación de un
programa de salud educativo para los trabajadores agrícolas y personal médico
y paramédico, con el propósito de concienciar en el uso adecuado y en el
reconocimiento y tratamiento de intoxicaciones por plaguicidas, trabajo
coordinado y ejecutado por PLAGBOL.
De las 4 poblaciones estudiadas, la de Palca fue la que participó en mayor
porcentaje (42%), luego Caranavi provincia de nor Yungas (34%), Guanay
(13%) y Mecapaca (9%), el 2% restante corresponde a individuos que trabajan
en esas localidades pero que viven en la ciudad de La Paz.
Los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas laboralmente
expuestas a diferentes agentes, constituye en la actualidad el objetivo de
numerosos estudios. Cualquier exposición a productos peligrosos debe ser
evitada en la medida de lo posible. Los individuos que, debido a su trabajo,
están en contacto directo con productos tóxicos o genotóxicos ven
incrementada la probabilidad de sufrir efectos adversos sobre la salud y, es por
Noemí Tirado Bustillos
102
ello, que han sido y son el objeto de estudio de numerosas investigaciones,
principalmente epidemiológicas y toxicológicas.
No todas las investigaciones sobre exposiciones a agentes potencialmente
peligrosos se traducen en un incremento de daño o en alteraciones
inmunológicas o bioquímicas. Así, por ejemplo en el estudio de Surrallés y col.,
1997, no se observa un aumento de las anomalías cromosómicas. A pesar de
que la exposición de los individuos sea a benceno, un reconocido agente
clastogénico y carcinogénico en humanos.
Los estudios de biomonitorización de poblaciones agrícolas, de los que se tiene
constancia por su publicación en revistas científicas especializadas, se vienen
realizando desde principios de los años 70. Como era de esperar, existe una
elevada diversidad de resultados dependiendo del biomarcador analizado y de
la población estudiada.
Los agricultores que participaron en este estudio utilizaron 27 plaguicidas
diferentes, de los cuales, 5 son altamente tóxicos (AT), 6 moderadamente
tóxicos (MT), 10 ligeramente tóxicos (LT) y 6 no clasificados. Asimismo, se
observó que los agricultores utilizaron generalmente mezclas complejas de
plaguicidas cuyos componentes no fueron identificados (Ver Anexo 1).
Comparando con otros estudios, podemos observar que en el trabajo de
Bolognesi (2003), los agricultores utilizaron alrededor de 23 productos,
mientras que en el trabajo de Scarpato y col. (1996), utilizaron más de 100
productos y en las poblaciones estudiadas por Carbonell y col. (1993), fueron
64. Los hallazgos de estos estudios demostraron que el número de plaguicidas
empleados no influye en los resultados encontrados entre las poblaciones
agrícolas expuestas a plaguicidas en relación a los controles, ya que,
independientemente del número de plaguicidas, estas poblaciones presentaron
daño genotóxico.
Noemí Tirado Bustillos
103
Aunque se ha comprobado que el nivel de exposición y el uso de varios
plaguicidas por separado producen genotoxicidad de forma significativa, en
poblaciones ocupacionalmente expuestas (Balagi y col, 1993; Bolognesi, 2003),
la información científica sobre el efecto genotóxico de mezclas complejas es
reducida.
Según datos de la encuesta aplicada, las poblaciones participantes en este
estudio, utilizaron mezclas de plaguicidas (68%) de los tres grupos (herbicidas,
insecticidas y fungicidas). Entre los más frecuentemente empleados están los
organofosforados (49,2%): Altamente tóxicos (AT): Tamaron (Metamidophos),
Clorados, Monodrin (Monocotrophos); extremadamente tóxicos (ET): Perfection
(Dimetoato), Folidol (Parathión etílico), Nuvacron (Monocotrophos);
moderadamente tóxicos: Baytex (fenthion), Curacron (profenophos), Mapex (Ver
Anexo 1). Este tipo de plaguicidas actúan en el organismo inhibiendo la
actividad enzimática de la acetilcolinestarasa por fosforilación, enzima que
tiene la función de hidrolizar la neurotransmisión de la acetilcolina, lo que
provoca un aumento de la acetilcolina y por lo tanto una actividad eléctrica y
estimulación continua y aumentada en las neuronas, produciendo efectos
tóxicos agudos en el organismo. El Parathion es inhibidor irreversible de la
colinestarasa, en la mayoría de los países es el plaguicida que causa el mayor
número de intoxicaciones agudas notificadas (Obiols, 1998)
Los agricultores estudiados, también utilizaron Piretroides (8,8%) como: Karate
(Lambdacyhalotrina), Biltz (Alphacypermetrina) que son altamente tóxicos,
Ambusch (Permetrina) clasificado como levemente tóxico; carbamatos como el
Baygon y clorados entre otros, como el Mirex. La Permetrina, como piretroide
sintético es considerada estrógeno ambiental, ya que teóricamente los
plaguicidas son disruptores de la función hormonal normal y que pueden
interferir en cualquier etapa de regulación del sistema endocrino tales como los
Noemí Tirado Bustillos
104
mecanismos que involucran la producción hormonal y los niveles de los
receptores en tejido blanco (Carpenter y col., 2002).
El programa PLAGBOL, en las mismas poblaciones del presente estudio,
a través de la encuesta, mostró que la mayoría de los agricultores no utilizan
protección personal ni hábitos higiénicos para el manejo de los plaguicidas, ya
que el 73 % de los productores manejan estos plaguicidas de forma empírica,
realizando mezclas indebidas, sin respetar las dosis adecuadas o
recomendadas (86 %), sin equipos de protección personal (80%) y lo más
preocupante es que el 94 % de los agricultores utilizan plaguicidas muy tóxicos
o prohibidos como el metamidofos y el metil parathion, productos que han sido
catalogados por la OMS como plaguicidas Clase I que son extremadamente
peligrosos para los seres humanos, a este problema se adiciona el factor
ambiental por la eliminación de los envases de forma incorrecta (67%)
ocasionando la contaminación de fuentes de agua de consumo humano
(Cervantes y Huici, 2005). Por otro lado, el agricultor boliviano tiene como
costumbre ancestral el chaqueo o quema de malezas y pastizales, cuya
actividad produce entre otros compuestos, hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAP) que son también tóxicos. En este estudio el 73 % de los
agricultores de Caranavi y Guanay, chaquean 1 vez al año y el 19 % 2 veces al
año, en cuanto a la frecuencia de fumigación, el 51,7% fumigó 1 vez, el 25%
dos veces y el 22% más de 3 veces en el último mes, condiciones que suponen
un uso permanente de plaguicidas durante todo el año y por varios años,
adicionalmente están expuestos a otros factores de riesgo, hábito de masticar
coca, consumo de tabaco, alcohol entre otros. Estas condiciones cumplen las
características de la evaluación genotóxica, cuyo requisito particular es la
exposición a largo plazo y a dosis subtóxicas.
Noemí Tirado Bustillos
105
7.1 Biomarcador de exposición.
Como se mencionó en el acápite de resultados como biomarcador de exposición
se determinó los niveles de colinesterasa en suero. La colinesterasa se
considera como un buen biomarcador de exposición a carbamatos y
organofosforados ya que causan una notable depresión de los niveles del
mismo (Yeary y col., 1993). En la población estudiada los datos de estos
análisis nos muestran que no existen diferencias estadísticamente
significativas entre los controles y los expuestos. Sin embargo se encontró
diferencias estadísticamente significativas en relación a las comunidades,
siendo Guanay la población que presentó el mayor grado de toxicidad medido
por la colinesterasa en relación a Caranavi (p=0,000), seguida por la
comunidad de Palca que presentó un valor de colinesterasa inferior con
significancia estadística en relación a Caranavi (p=0,04).
7.2. Biomarcadores de efecto.
Los ensayos empleando biomarcadores son particularmente valiosos para la
detección y cuantificación de la toxicidad cuando los organismos están
expuestos a mezclas de sustancias (Walker, 1998). Entre los plaguicidas que
han sido estudiados existen 28 que producen efecto genotóxico demostrable a
nivel experimental y 19 considerados probables cancerígenos categoría B2 por
la Environmental Protection Agency (EPA). Sin embargo, es de destacar que
estos datos son producto del análisis del efecto producido por cada uno de los
plaguicidas en forma aislada pero no de sus mezclas. Frolichsthal y Piatti
(1996) evaluaron el efecto tóxico de tres insecticidas organofosforados en forma
aislada o combinada en hepatocitos de rata por medio del test de micronúcleos,
en cuyos resultados observaron que ninguno de los compuestos utilizados
evidenciaba un efecto genotóxico aplicado en forma aislada, pero detectaron un
significativo aumento en la frecuencia de micronúcleos al utilizarlos en forma
combinada.
Noemí Tirado Bustillos
106
En la presente investigación se utilizaron dos biomarcadores de efecto el
ensayo de MN y los intercambios entre cromátides hermanas.
En relación con los diferentes biomarcadores de daño citogenético, la
evaluación de la frecuencia de MN se ha propuesto como una herramienta útil
para estimar la magnitud del daño genotóxico. Dada la sensibilidad del ensayo
de MN y su relativa simplicidad y objetividad en el análisis de los resultados,
en este trabajo se utilizó para medir efecto genotóxico asociado a la exposición
a mezclas de plaguicidas. Por otro lado, se debe enfatizar que otra de las
ventajas importantes del ensayo de MN es que, además de permitir evaluar con
relativa facilidad, el efecto clastogénico de una exposición, también permite
determinar el efecto aneugénico. El ensayo de MN ha sido uno de los más
utilizados en los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas
expuestas a plaguicidas (Bolognesi y col., 1998, Au y col., 1999).
En los resultados obtenidos tal como puede observarse, la exposición a
los plaguicidas no ha supuesto un aumento significativo de las frecuencias de
MNBN, es decir, el hecho de ser agricultor laboralmente expuesto a tales
compuestos químicos no se refleja en un incremento de daño genético en
forma de MNBN, datos comparables con los resultados de estudios de
biomonitorización de poblaciones expuestas a plaguicidas publicados por
Joksic y col., 1997, Titenko-Holland y col., 1997, Calvert y col., 1998, Davies y
col., 1998, Venegas y col., 1998, Windham y col, 1998, Figgs y col., 2000 y
Pastor y col., 2001.
El hecho de no haber encontrado un incremento significativo de MN en
los agricultores expuestos a plaguicidas nos indica simplemente que no se han
producido roturas ni pérdidas cromosómicas a niveles estadísticamente
significativos. Esta falta de daño genético no se puede atribuir a una baja
exposición, ya que todas las comunidades analizadas desarrollan una actividad
agrícola intensa. Tal vez el punto más importante esté en los plaguicidas
utilizados. En las poblaciones de nuestro estudio, una amplia variedad de
Noemí Tirado Bustillos
107
productos son utilizados en mayor o menor proporción (Figura 8). La gran
mayoría están clasificados como seguros, aunque realmente muchos están
probados únicamente en animales de laboratorio y de manera individual (no
mezclas).
Al realizar el estudio por poblaciones se observó que en la comunidad de
Mecapaca existen valores inferiores en la frecuencia de MNBN en relación a
Caranavi, Guanay y Palca, notándose valores superiores en la frecuencia de
MN en Palca con una diferencia estadísticamente significativa en relación a
Caranavi (p=0,000).
Al evaluar los MN en linfocitos también se calculó el índice de duplicación
nuclear (IDN) con bloqueo de la citocinesis. El IDN da cuenta de la velocidad de
división celular y se usa como indicativo del grado de toxicidad al que se
encuentran expuestas las células ya que a mayor toxicidad disminuye la
velocidad de división celular. Un hecho interesante es que los plaguicidas
parecen influir en la cinética de proliferación celular induciendo alteraciones,
tales como retraso en el ciclo celular y reducción de la proliferación de
linfocitos (Rupa y col. 1991; Pasquini y col. 1996). En referencia al IDN, del
total de los 142 individuos, el grupo de expuestos a plaguicidas mostró un
descenso pero no significativo respecto a los no expuestos (Tabla 12). Los
resultados del IDN analizados por comunidad mostraron que los pobladores de
Caranavi presentaban mayor grado de toxicidad celular con un descenso
estadísticamente significativo en relación a los pobladores de Palca (p=0,01).
La reducción de los valores del IDN en los agricultores expuestos a
plaguicidas demuestra que estos productos tienen actividad citotóxica, que
podría manifestarse como genotoxicidad o enmascarar la posible actividad
genotóxica, ya que, según Kirsh-Volders y Fenech (2001), las exposiciones
continuas a toxinas, como podrían ser los plaguicidas, y a niveles bajos, se
puede traducir en una respuesta adaptativa relacionada con un incremento en
Noemí Tirado Bustillos
108
la sensibilidad a la apoptosis y/o un retraso más extendido del ciclo celular, lo
que daría tiempo a una reparación del daño inducido inicialmente.
Existen numerosos artículos publicados utilizando la técnica de
intercambios entre cromátides hermanas como biomarcador en biomonitoreo
de poblaciones expuestas a plaguicidas desde los años setentas tales como
Crossen y col., 1978, Carbonell y col., 1993.
Los resultados obtenidos del número de intercambios en las poblaciones de
este estudio (expuesto y control) resumidos en la tabla 13, nos muestran que
no existen diferencias estadísticamente significativas comparando ambos
grupos, datos que se corroboran con los publicados por Carbonell y col., 1995,
Hoyos y col., 1996, Joksic y col., 1997, Yu- Chen Lei y col. 2002, Jarno
Tuimala y col. 2004.
Sin embargo al realizar el análisis por comunidades se observó mayor número
de ICH en Caranavi en relación a Palca con diferencias estadísticamente
significativas (p=0,004).
Al realizar el análisis del %HFC se evidenció que no existían diferencias
estadísticamente significativas entre el grupo de expuestos y controles, sin
embargo el análisis de %HFC por comunidad mostró diferencias
estadísticamente significativas entre Caranavi y Palca (p=0,001) y entre
Guanay y Palca (p=0,032). En un estudio realizado por Shaham y col. 2001 en
un grupo de floricultores de Sharon (Israel) se reportó un incremento
significativo de SCE tanto en número como en HFC en el grupo agrícola
comparado con el control.
7.3. Biomarcadores de susceptibilidad
La caracterización genotípica está adquiriendo un peso importante en los
estudios epidemiológicos ambientales, así como en la interpretación de los
procesos cancerígenos. Se intenta comprender por qué los individuos
reaccionan de manera diferente frente a la exposición de un agente. Y es
Noemí Tirado Bustillos
109
entonces donde se pone en juego, entre otros aspectos, la determinación de los
perfiles metabólicos individuales.
Muchos de los cancerígenos requieren activación metabólica antes de poder ser
activos y otros sufren inactivación después de ser metabolizados. Por lo tanto,
las variaciones individuales en la capacidad metabólica son importantes en la
inducción de una mutación o en el desarrollo de un cáncer y, por consiguiente,
en los estudios de biomonitorización. Según las variantes génicas
(polimorfismos) que un individuo posea, le conferirá mayor o menor
susceptibilidad frente a sustancias con potencial genotóxico, como lo son
muchos de los plaguicidas.
La superfamilia de las glutatión transferasas (GSTs) representa uno de los
polimorfismos más analizados en los estudios de biomonitorización. Estas
enzimas de conjugación, detoxifican compuestos electrofílicos, especialmente
de estructura policíclica aromática, como los que están en el humo del tabaco
y en algunos plaguicidas.
Las dos clases más conocidas y estudiadas son la GSTM1 y la GSTT1.
Investigaciones de Brockmoller y col., 1998 y Yuille y col., 2002. Entre otras
indican que los individuos GSTM1 nulos, es decir los que no tienen ninguna
copia del gen GSTM1, tendrían un mayor riesgo de desarrollar cáncer y otras
enfermedades.
Debido a la elevada variabilidad de exposiciones y a que el fenotipo viene
determinado por un conjunto de enzimas, la evaluación de un único
polimorfismo resulta a menudo insuficiente (Bartsch y col., 1996) para poder
sacar conclusiones válidas.
Se consideró oportuno el realizar el estudio de los genes GSTM1 y GSTT1,
como fuente de variabilidad individual, que podía afectar a los resultados
Noemí Tirado Bustillos
110
citogenéticos. La metodología utilizada no permite determinar el número de
copias para el gen, simplemente la presencia o ausencia del mismo. Este
análisis se realizó en todas las poblaciones involucradas en el estudio, los
resultados obtenidos mostraron que 55 personas presentan deleción del gen
GSTM1, lo que representa un 38,6% del total de la población. Estos datos
concuerdan con frecuencias encontradas en otros estudios en el ámbito
mundial en individuos sanos donde reportan entre 23% y 41% en la población
afroamericana y africana, 33% y 69% en asiáticos, 39% y 62% en europeos,
38% – 62% en poblaciones caucásicas (Raunio y col. 1995; Gaspar y col. 2002).
Para el genotipo GSTT1 un 40.8% de la población presenta el genotipo salvaje y
un 59,2% presenta la deleción del gen, estos valores son similares a los
obtenidos en estudios realizados en poblaciones chinas (Gaspar ycol. 2002)
donde reportan de 58 – 62% de frecuencias de deleción del gen de GSTT1.
Los resultados obtenidos no muestran ninguna diferencia estadísticamente
significativa de frecuencias entre los grupos control y expuesto a plaguicidas
para GSTT1, aunque para GSTM1 se encuentra una mayor proporción de
genotipos nulos en los individuos del grupo control.
Como el cáncer es un proceso multifactorial, la presencia de los polimorfismos
de la GSTM1 y GSTT1 en una población general no siempre pueden ser los
factores determinantes para que se dé esta enfermedad, ya que puede existir la
presencia de otras enzimas metabólicas (CYP2E1 y paroxone PON) cuyas
actividades están alteradas por la presencia de polimorfismos que modifican el
metabolismo de los plaguicidas. (Sultatos 1992, Sultatos 1994, Humbert y col.
1993).
Los polimorfismos de GSTM1 y GSTT1 modifican la actividad de estas enzimas,
por lo que estas actividades podrían afectar los niveles de colinesterasa en
sangre. En este estudio la presencia de polimorfimos GSTM1 y GSTT1 no
Noemí Tirado Bustillos
111
afectaron significativamente los niveles de colinesterasa sérica estos resultados
son comparables a los obtenidos por Pastor y col. 2002.
Con relación a los parámetros citogenéticos analizados, el efecto del genotipo
GSTM1 nulo en la frecuencia de micronúcleos muestra valores inferiores a los
del genotipo GSTM1 positivo aunque estadísticamente no significativos
p=0,075, este hallazgo es comparable con los resultados del estudio realizado
por Kirsch-Volders y col. (2006) donde reportan que el efecto del genotipo
GSTM1 nulo en la frecuencia de Mn fue mínimo y sólo significativo al limite y
con los resultados de Ghita y Col. (1999).
En relación al genotipo GSTT1 nulo este presentó una frecuencia de MN igual
al genotipo GSTT1 postivo. La combinación de los polimorfismos
GSTM1/GSTT1 mostró que el genotipo nulo de ambos presenta frecuencia de
MN ligeramente inferior en relación al genotipo positivo de ambos aunque sin
diferencias estadísticamente significativas. Estos datos se asemejan a los
resultados del estudio realizado por Kirsch-Volders y col. (2006) donde los
sujetos que tenían genotipos GSTM1 y GSTT1 nulos mostraron frecuencias de
micronucleos más bajas en relación a sus contrapartes positivas cuando eran
expuestos a genotoxinas ocupacionales (p=0,039).
En relación al IDN se encontró una relación inversa entre este parámetro y la
presencia de GSTM1 y GSTT1, en los individuos expuestos. Se puede especular
sobre la formación de compuestos activos derivados del metabolismo de los
plaguicidas, que serían los responsables de una menor proliferación celular. Se
necesitan más estudios y aumentar el tamaño muestral para poder
correlacionar adecuadamente los polimorfimos con los parámetros
citogenéticos.
Los hallazgos encontrados concuerdan con Au y col. 1999 quienes analizaron
el efecto de los polimorfismos de CYP2E1, GSTM1, GSTT1 y PON en la
Noemí Tirado Bustillos
112
inducción de AC por mezclas de plaguicidas y no observaron ningún efecto de
estos genotipos en las ACs.
La influencia del GSTM1 nulo sobre los ICH se mostró como un ligero
incremento en las frecuencias de este parámetro, aunque sin significancia
estadística, mientras que la influencia del GSTT1 nulo sobre los ICH se mostró
con una ligera disminución en relación a los individuos GSTT1 positivos pero
estadísticamente no significativa, como se puede observar en los resultados.
En relación a la influencia del genotipo GSTM1 nulo sobre el porcentaje de
células con alta frecuencia de intercambios se observó con un incremento con
significancia estadística (p=0.05), para corroborar esta asociación significativa
se necesita aumentar el tamaño muestral. Al analizar los individuos con el
genotipo GSTT1 nulo en relación a los individuos GSTT1 postivos se observó
una disminución, pero con datos estadísticamente no significativos.
En cuanto al análisis realizado por comunidad, las poblaciones de Caranavi y
Palca presentaron frecuencias de polimorfismos nulos similares (25 y 23,4%)
respectivamente, en relación al daño genotóxico la comunidad de Palca
presentó mayor daño cromosómico mientras que la población de Caranavi
mostró mayor daño primario por lo que deducimos que la población de Palca
tiene daño crónico por fijación de las mutaciones que podría atribuirse a la
ausencia de los genes de detoxificación GSTM1 y GSTT1 o a la deficiencia de
los sistemas de reparación, no se debe dejar de lado la incidencia de los
factores ambientales puesto que la frecuencia de los alelos nulos de estas
enzimas es similar en ambas comunidades pero el tipo de daño es diferente.
Los trabajos publicados sobre biomarcadores de susceptibilidad y su relación
con plaguicidas son escasos (IARC, 1991) y generalmente se relacionan con
enfermedades y problemas en la salud. Solamente se conocen otros estudios
que han relacionado las GSTs con los MN e ICH en poblaciones expuestas a
Noemí Tirado Bustillos
113
plaguicidas: Scarpato y col., (1996) y Falck y col., (1999), y en ningún caso se
relaciona la frecuencia de MN en linfocitos con los alelos nulos GSTM1 y
GSTT1, lo que concuerda con nuestros resultados. Quizá los MN constituyan
un biomarcador difícil de relacionar con las GSTs. No obstante, dado el
conocimiento que tenemos de estos polimorfismos y la función que realizan,
junto con los resultados que relacionan incrementos de ICH y AC en fenotipos
nulos a determinadas exposiciones (Kelsey y col., 1995; Scarpato y col., 1997)
estos marcadores de susceptibilidad son útiles en estudios citogenéticos en
humanos aportando una información de indudable interés.
El análisis para el cálculo de la magnitud de asociación entre polimorfismos
de las GSTs y daño genotóxico, muestra que la población con ausencia del
GSTM1 incrementa el riesgo 0.38 veces más de presentar daño genotóxico en
relación a la población que tiene el gen. Este análisis realizado para los
polimorfismos de la GSTT1 no mostró ninguna asociación.
En relación a la magnitud de asociación entre polimorfismos GSTM1 y daño
genotóxico medido por la prueba de MN el valor de odds ratio con un intervalo
de confianza del 95% (0,897 – 5,250) nos indica que la ausencia del gen
incrementa 1.17 veces más la probabilidad de presentar daño cromosómico. En
referencia al daño citotóxico (IDN) el valor de odds ratio con un IC al 95%
(0,568 – 2,617) nos indica que la ausencia del gen GSTM1 incrementa 0.21
veces más el riesgo de presentar daño citotóxico. Sin embargo los valores de
odds ratio encontrados al incluir el uno en el IC no pueden ser extrapolados a
la población en general.
El análisis realizado sobre la magnitud de asociación entre polimorfismos de
las GSTs y otros factores adicionales a la exposición a plaguicidas como la
edad, la ocupación, el hábito de fumar, el consumo de alcohol, el sexo, el
chaqueo y la exposición a rayos x, mostraron que, el consumo de alcohol es un
Noemí Tirado Bustillos
114
factor de riesgo significativo (IC: 1,214 – 5,028), aumentando 1,47 veces la
probabilidad de presentar daño genotóxico en personas con el gen GSTT1 nulo.
Existen trabajos reportados en la literatura que hacen referencia a que el
genotipo GSTT1 nulo esta involucrado en la modulación del riesgo de cáncer
(Inoue y col. 1994, Oude 2006). Este riesgo esta fuertemente asociado al
consumo de alcohol y al hábito de fumar que incrementan la carga de toxinas
carcinogénicas. La detoxificación de tales compuestos dañinos ocurre
generalmente por la vía II de detoxificación donde están involucreadas enzimas
como las GSTs.
Finalmente, se realizó un modelo de regresión logística ajustado por las
variables GSTM1 y GSTT1 haciendo correr el modelo con covariables MN y
colinesterasa como predictoras y el resto de co-variables de estudio; mostrando
como modificadores de efecto el chaqueo, los intercambios entre cromatidas
hermanas y el porcentaje de células con alta frecuencia de intercambios, las
demás co-variables no dieron significancia y tampoco interacción.
Noemí Tirado Bustillos
115
8. CONCLUSIONES.
Tras la discusión de los resultados obtenidos, se puede llegar a las siguientes
conclusiones.
• La exposición a plaguicidas no ha inducido niveles de daño genético
detectables mediante el ensayo de MN, ni de intercambios entre
cromátides hermanas, en linfocitos de sangre periférica.
• Se determinó que la frecuencia de los alelos GSTM1 nulo 38,6% y de
GSTM1 positivo 61,4%. Para el GSTT1 nulo de 59,2% y para el GSTT1
positivo la frecuencia fue de 40.8%.
• Factores como la edad, sexo, el origen de las poblaciones, el tabaco, el
chaqueo y la irradiación diagnóstica entre otros pueden modificar la
frecuencia de BN MN y número de ICH por lo que estos factores deben
ser tomados en cuenta a la hora de realizar una evaluación citogenética.
• Existe una asociación estadísticamente significativa entre el chaqueo, los
intercambios entre cromátides hermanas y el porcentaje de células con
alta frecuencia de intercambios con los polimorfismos de la GSTM1 y la
exposición a plaguicidas.
• El consumo de alcohol como factor adicional incrementa el riesgo de
presentar daño genotóxico en poblaciones GSTT1 nulas expuestas a
plaguicidas.
• Se ha demostrado que la ausencia de los genes que codifican enzimas de
biotransformacion de xenobioticos constituye un factor importante para
determinar la magnitud del riesgo de tener enfermedades crónicas
degenerativas.
Noemí Tirado Bustillos
116
9. REFENCIAS BIBLIOGRAFICAS
• Abdel Rahman SZ, el – Zein RA., Anwar, Au WW. 1996. A multiplex PCR
procedure for polymorphyc analysis of GSTM1 and GSTT1 gens in
population studies- Cancer Letter, 107: 229-233.
• Aidoo A., Lyn – Cook, LE, Lensing S., Wamer W. 1994. Ascorbic acid
(vitamin C) modulates the mutagenic effects produced by an alkylating
agent in vivo. Environ. Mol. Mutagen., 24: 220 – 228.
• Albertini RJ. 1994. Why use somatic mutations for human biomonitoring?
Environ. Mol. Mutagen.; 23 (Suppl. 24): 18-22.
• Ames B N., Gold. L.S. 2000. Paracelsus to parascience: the environmental
cancer distraction. Mutat. Res. 447: 3-13. Antoccia A., Tanzarella C,
Modesti D., Degrassi F.1993. Citokinesis Block micronucleus assay with
kinetochore detection in colchicine treated human fibroblasts. Mutat. Res.
287: 93 – 99.
• Antoccia G.A., I.M. De Syllos Colus IM. 2000. Chromosomal aberrations
analysis in a Brazilian population exposed to pesticides. Teratogenesis,
Carcinogenesis, Mutagenesis. 20: 265-272.
• Antonucci G.A., Tanzarolla C., Modesti D, Degrassi F. 1993. Citokinesis
block micronucleus assay with kinetochore detection in colchicine treated
human fibroblasts. Mutation Res. 287: 93 -99.
• Anwar W. 1997. Biomarkers of human exposure to pesticides. Environ.
Health Perspect. 105 Suppl 4:801-6.
• Ascarrunz ME, Tirado N, Gonzáles AR, Cuti M, Cervantes R, Huici O, Jors
E. 2006. Evaluación de riesgo Genotóxico: Biomonitorización de
trabajadores agrícolas expuestos a plaguicidas de Caranavi, Guanay, Palca
y Mecapaca. Revista Cuadernos; 51:7-18.
• Au WW, Sierra-Torres CH, Cajas-Salazar N, Shipp BK, Legator MS.
Cytogenetic effects from exposure to mixed pesticides and the influence
from genetic susceptibility. Environ Health Perspec 1999; 107: 501–505.
Noemí Tirado Bustillos
117
• Bailey L, Roodi N, Verrier C, Yee C, Dupony W, Parl F. 1998. Breast cancer
and CYP1A1, GSTM1 and GSTT1 polymorphisms: evidence of a lack of
association in Caucasians and African-Americans. Cancer Res. 58 (1): 65-
70.
• Balagi M. and K. Sasikala. 1993. Cytogenetic effect of Malathion in vitro
culture of human peripheral blood. Mutat. Res.; 301:13-17.
• Bartsh H, Hietanen E. 1996. The role of individual susceptibility in cancer
burden related to environmental exposure. Environ. Health Perspect; 104
(Suppl. 3): 569 – 577.
• Bastiedas D., Mora M. 1999. Evaluación del potencial mutagénico de
mezclas de plaguicidas usadas en el Huila Suárez informe final
cofinanciación USCO – Pronatta.
• Berhame K, Widersten M, Engstrom A, Kozarich J.W, Mannervik B. 1997.
Detoxication of base propenals and other alpha, beta unsaturated aldehyd
products of radical reactions and lipid peroxidation by human glutation
transferases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 1480-1484.
• Berrino 1995, Survival of Cancer Patients in Europe. The Eurocare Study,
International Agency for Research on Cancer, Lyon.
• Blair A, Zahm SH. 1991. Cancer among farmers. Occup Med; 6:335–54.
• Blair A. 1990. A review of epidemiológical studies of agriculture
exposures In: Proocedings of Agricultural Occupational and
Environmental Health: Policy Strategies for the Future (Donham KJ,
Merchant JA, Kross B, eds). Am J Indust Med; 18:91-113.
• Blair A. and Zahm, S.H. 1995. Agricultural exposures and cancer.
Environ. Health Perspect., 103, 205–208
• Bolognesi C. 2003. Genotoxicity of pesticides: A review of human
biomonitoring studies. Mutat. Res. 543: 251-272.
• Bolognesi C, Parrini M, Reggiardo F, Bonassi S. 1993. Biomonitoring of
workers exposed to pesticides. Int. Arch. Occup. Env. Health; 65(S):185–
187.
Noemí Tirado Bustillos
118
• Branda RF, O’ Neill JP, Sullivan LM, Albertini RJ. 1991. Factors
influencing mutation at the hprt lócus in T-Lymphocytes women treated
for breast cancer. Cancer Res., 51: 6603 -6607.
• Brockmoller J, Cascorbi I, Kerb R, Sachse C, Roots I. 1998. Plymorphisms
in xenobiotic conjugation and disease predisposition. Toxicol. Letter; 102 –
103: 173 -183.
• Brown LM, Blair A, Gibson R, Everett GD, Cantor KP, Schuman LM,
Burmeister LF, Van Lier SF, Dick F. 1990. Pesticide exposures and other
agricultural risk factors for leukemia among men in Lowa and Minnesota.
Cancer Res., 50:6585-6591.
• Brüske-Hohfeld I. 2000. Occupational lung cancer risk for men in
Germany: Results from a pooled case-control study. Am J. Epidemiol;
151:384-395
• Cajas-Salazar N, Au WW, Sierra-Torres CH, Slama SA, Alpard SK, Tyring
SK. 2003. Effects of epoxide hydrolase polymorphisms on chromosome
aberrations and risk for lung cancer. Cancer Genet. Cytogenet; 145(2):97–
102.
• Calavert G M, Talaska G, Mueller C.A, Ammenheuser M.M, Au W.W, Fajen
J.M, Fleming L.E, Briggle T, Ward E. 1998. Genotoxicity in workers
exposed to methylbromide. Mutat. Res., 417: 115- 128.
• Canalle R, Burin R, Tone L, Takahashi C, 2004. Genetic polimorphisms
and susceptibility to childhood acute lymphoblastic leukemia.
Environmental and Molecular Murgenesis. 43:100-109.
• Carbonell E, Xamena N, Creus A, Marcos R. 1993. Cytogenetic
biomonitoring in a Spanish group of agricultural workers exposed to
pesticides. Mutagenesis; 8:511–517
• Carbonell E, Valbuena A, Xamena N, Creus A, Marcos R. 1995.
Temporary variations in chromosomal aberrations in a group of
agricultural workers exposed to pesticides. Mutat. Res; 344:127–134.
Noemí Tirado Bustillos
119
• Carbonell E, Xamena N, Creus A, Marcos R, 1995. Chromosomal
aberrations and sister chromatid exchanges as biomarkers of exposure to
pesticides. Clinical Chem. 41: 1917 – 1919.
• Carbonell E, Puig F, Xamena N, Creus A, Marcos R.1990. Sister chromatid
exchange in lymphocytes of agricultural workers exposed to pesticides.
Mutagenesis. 5:403-405.
• Carpenter D, Arcaro K, Spink D. 2002. Understanding the human Health
effects of chemical mixtures. Enviromental Health perspectives. 110(1). 25-
42.
• Castillo L, Chaverry F. Manual de plaguicidas, guía para América Central.
Costa Rica. 1995: 7 – 9.
• Cervantes R. y col. 2003. Diagnostico, Tratamiento y prevención de
intoxicaciones agudas por plaguicidas; Proyecto PLAGBOL, La Paz -
Bolivia, 9 – 14.
• Cervantes R, Huici O. 2005. Documento de sistematización del proyecto
“PLAGBOL” 2001-2005. Impreso Artes gráficas Sagitario. Primera
edición.11-18 p.
• Cervantes R. 2007. Daños a la salud y al medio ambiente por el uso de
plaguicidas. Segunda Edición. Artes gráficas Sagitario. 10-12 p.
• Cervantes R, Henao G, Morales L, Varona M, Condarco G, Huici O. 2006.
Fortalecimiento de la vigilancia en salud pública de los plaguicidas entre
Colombia y Bolivia Organización Panamericana de la Salud. Organización
Mundial de la Salud; Instituto Nacional de Salud de Colombia; Instituto
Nacional de Salud Ocupacional Bolivia. 12-14p.
• Chen C.L, Liu Q. Relli ng M.V., 1996. Simultaneus characterization of
glutathione S transferase M1 and T1 polymorphisms by polimerase chain
reaction in american whites and black. Pharmacogenetics 6: 187 – 191.
• Coles B, Ketterer. 1990. The role of glutathione and glutathione
transferases in chemical carcinogenesis, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25:
47-70.
Noemí Tirado Bustillos
120
• Crossen P.E, Morgan W.F. 1978. Cytogenetic studies of pesticides and
herbicides sprayers. N.Z. Med. J. 88:192 – 195.
• Davies H.W, Kennedy S.M, Teschke K, Quintana P.J. E, 1998. Cytogenetic
analysis of South Asian berry pickers in British Columbia using the
micronucleus assay in peripheral lymphocytes, Mutat. Res. 416: 101 –
113.
• Dyer Sm, Cattani M, Pisaniello Dl, Williams Fm, Edwards Jw. 2001.
Peripheral cholinesterase inhibition by occupational chlopyritos exposure
in Australian termiticide applicators. Toxicology, 169: 177-185.
• Eaton DL. 2000. Biotransformation enzymes polymorphism and pesticide
susceptibility. Neurotoxicology, 21: 101 -111.
• Elhajouji A., Santos AP., Van Hummelen PY. Kirsch – Volders M., 1994.
Metabolic differences between whole blood and isolated lymphocytes
cultures for micronucleus (MN) induction by cyclophosfamide and
benzoapyrene. Mutagenesis 9: 307- 313.
• Elin H. Kure, Marit Thorsen and Inger-Lise Hansteen. 1999. Gene
exposure interaction in occupational and environmental epidemiology:
Results from an ongoing study. Norsk Epidemiology; 9 (1): 39-46
• Engel LS, Checkoway H, Kiefer MC, Seixas NS, Longstheth WT Jr, Scott
KC, Hudenell K, Anger WK, Camicioli R. 2001. Parkinsonism and
occupational exposure to pesticides. Occup. Environ. Med. 58: 582 – 589.
• Escriche, I. 1996. Toxicología Industrial de Alimentos, Universidad
Politécnica de Valencia, España, 56.
• Evans R.M. 1988. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily.
Science 240, 4854: 889 – 895.
• Falck G., Catalan J., Norppa H., 1997. Influence of culture time on the
frecuency and contens of human lymphocyte micorenuclei with and
without cytochalasin B. Mutat. Res., 392: 71 – 79.
• Falck G.C, Hirvonen A, Scarpato R, Saarikoski S.T, Migliore L, Norppa H.
1999. Micronuclei in blood limphoicytes and genetic polymorphisms for
Noemí Tirado Bustillos
121
GSTM1, GSTT1 and NAT2 in pesticide – exposed greenhouse workers.
Mutat. Res., 44: 225-237.
• Fenech M, 1993. The cytokinesis - block micronucleus technique: a
detailed description of the method and its application to genotoxicity
studies in human populations. Mut. Res., 285: 35-44.
• Fenech M, Morley AA. 1985. Measurement of micronuclei in lymphocytes.
Mutat. Res. 147 (1-2): 29-36.
• Fenech M, Morley AA. 1986. Cytokinesis – block micronucleus method in
human lymphocytes: effects of in vivo ageing and low dose x – radiation.
Mutat. Res., 161: 193 – 198.
• Fenech M. and Neville S. 1992. The conversion of excision-repairable DNA
lesions to micronuclei within one cell cycle in human lymphocytes.
Environ. and Molecular Mutagenesis 19: 27-36.
• Figgs L.W, Holland N.T, Rothman N, Zahm S.H, Tarone R.E, Hill R, Vogt
R.F, Smith M.T, Boysen C.D, Holmes F.F, Van Dyck K, Blair A. 2000.
Increased lymphocyte replicative index following 2,4 –
dichlorophenoxyacetic acid herbicide exposure. Cancer Causes Control,
11: 373 – 380.
• Frolichsthal P y Piatti E. 1996. Evaluation of micronuclei in primary
hepatocyte culture in rats treated with organophosphoric compounds. Boll
Chim Farm. 135 (9):541-5.
• Furlong CE, Li Brophy VH, Jarvik GP, Richter RJ, Shih DM, Lusis AJ,
Costa LG. 2000.The PON1 gene and detoxification. Neurotoxicology, 21:
581-587.
• Garaj-Vrhovac V, Zeljezic D. 2002. Assessment of genome damage in a
population of Croatian workers employed in pesticide production by
chromosomal aberration analysis, micronucleus assay and Comet assay. J
Appl Toxicol; 22:249–255.
• García, J. E. 1997. Introducción a los plaguicidas. EUNED. San José.
Costa Rica, 450 p.
Noemí Tirado Bustillos
122
• Garte S, Gaspari L, Alexandrie AK, Ambrosone C, Autrup H, Autrup JL,
Baranova H, Batum L, Benhamou S, Boffetta P, Bouchadry C, Beskvar K,
Brockmoller J, Cascorbi I, Clapper ML, Coutelle C, Daly A, Dell’ Omo M,
Dolsan V, Dresler CM, Fryer A, Haugen A, Hein DW, Hildeshein A,
Hirvonen A, Hsieh LL, Hingelman – Sundberg M, Kalina I, Kang D, Kihara
M, Kyohara C, Kremers P, Lazarus P, Le Marchand L, Lechner MC, Van
Lieshout EM, London S, Manni JJ, Maugard CM, Morita S, Nazar –
Stewart V, Noda K, Oda Y, Parl FF, Pastorelli R, Persson I, Petters WH,
Rannung A, Rebbeck T, Risch A, Roelandt L, Romkes M, Ryberg D,
Salagovic J, Schoket B, Siedegard J, Shields PG, Sim E, Sinnet D, Strange
RC, Stucker I, Sugimura H, To-Figueras J, Vineis P, Yu MC, Taioli E.
2001. Metabolic gene polymorphism frequencyes in control populations
cancer Epidemiol Biomarkers. Prev., 10: 1239 – 1248.
• Gaspar PA, Hutz MH, Salzano FM, Hill K, Hurtado M, Petzl-Erler ML, y col.
2002. Polymorphisms of CYP1A1, CYP2E1, GSTM1, GSTT1, and TP53
genes in Amerindians. Am J Phys Antrophol; 119:249-56.
• Gauthier E, Fortier I, Courchesne F, Pepin P, Mortimer J, Gauvreau D.
2001. Environmental pesticide exposure as a risk factor for Azheimer`s
disease: a case-control study. Environ. Res., 86: 37-45.
• Ghita C.M. Falck, Ari Hirvonen , Roberto Scarpato, Sirkku T. Saarikoski,
Lucia Migliore, Hannu Norppa, 1999. Micronuclei in blood lymphocytes
and genetic polymorphism for GSTM1, GSTT1 and NAT2 in pesticide-
exposed greenhouse workers. Mutat. Res. 441: 225–237.
• Gómez – Arroyo S, Dias – Sánchez Y, Meneses – Perez MA, Villalobos –
Dictrini R, De León – Rodriguez J. 2000. Cytogenetic. Biomonitoring in a
Mexican floriculture worker group exponed to pesticides. Mutat. Res (386):
219 – 228.
• Gregio D’ArceLP, Colus IM. 2000. Cytogenetic and molecular
biomonitoring of agricultural workers exposed to pesticides in Brazil.
Teratogenesis, Carcinogenesis, & Mutagenesis; 20:161–170.
Noemí Tirado Bustillos
123
• Hagmar L, Bonassi S, Stromberg U, Mikoczy Z, Lando C, Hansteeen Il,
Montagud Ah, Knudsen L, Norppa H, Reuterwall C, Tinnerberg H, Brogger
A, Forni A, Hogstedt B, Lambert B, Mitelman F, Nordenson I, Salomaa S,
Skerfving S. 1998 a. Cancer predictive value of cytogenetic markers used
in occupational health surveillance programs: a report from an ongoing
study by the European Study Group on Cytogenetic Biomarkers and
Health Mutat. Res., 405 171-178.
• Hagmar L. , S. Bonassi, U. Stromberg, A. Brogger, Le Knudsen, H. Norppa
And C. Reuterwall. 1998b. Chromosomal aberrations in lymphocytes
predict human cancer: a report from the European study group on
cytogenetic biomarkers and health (ESCH). Cancer Research. 58:4117-
4121.
• Hassold T., Abruzzo M., Adkins K., Griffin D., Merrill M., Mille E., Saker.
Zaragoza M., 1996. Human aneuploidy incidence, origin and etiology.
Environ. Mol. Mutagen., 28: 167-175.
• Hayes J.D, Pulford D.J. 1995. The glutathione s-transferase supergene
family regulation of GST and constribution of the isoensyme resistence.
Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30: 445 – 600.
• Hedde J.A, 1976. Measurement of chromosome breakeage in cultured cells
by the micronucleus technique. En: Mutation – induced chromosome
damage in man. Evamns H.J, Lloyd D.S (Ed.) Univeresity press, Edimburg,
pp. 191 – 200.
• Hernández A. F, Pla A, Gómez M. A, Pena G, Gil F, Pino G. y Rodrigo L. 1998. Susceptibilidad a los insecticidas organofosforados en trabajadores
de invernadero: importancia de los marcadores bioquímicos.Dpto.
Medicina Legal y Toxicología. En: actas del III congreso de la sociedad
española de agricultura ecológica SEAE Valencia: 369 -377.
• Hirvonen A. 1997. Combinations of susceptible genotypes and individual
responses to toxicans. Environ. Health. Perspect. 105 (Suppl. 4): 775 –
758.
Noemí Tirado Bustillos
124
• Holsaple MP. 2002. Autoinmunity by pesticides: a critical review of the
state of the science. Toxicol Lett. 127, 101-109.
• Hoyos LS, Carvajal S, Solano L, Rodriguez J, Orozco L, Lopez Y, Au WW.
1996. Cytogenetic Monitoring of farmers exposed to pesticides in
Colombia. Environ Health Perspec; 104 Suppl 8:535–538.
• Hsieh B H, Deng JF, Ger J, Tsai WJ. 2001. Acetylcholinesterase inhibition
and the extrapyramidal syndrome: a review of neurotoxicity of
organophosphate. Neurotoxicology 22: 423-427.
• http://www.ine.gob.mx/dgicurg/plaguicidas/download/pytransporte.pdf.
• Hubble JP, Kurth JH, Glatt SL, Kurth MC, Schelleneberg GD, Hassanein
R, Lieberman A, Koller WC. 1998. Gene-toxin interaction as a putative risk
factor for Parkinson’s disease with dementia. Neuroepidemiology 17:96–
104.
• Humbert R, Adler DA, Disteche CM, Hassett C, Omiecinski CJ, Furlong
CE. 1993. The molecular basis of the human serum paraoxonase activity
polymnorphims. Nat. Genet. 3: 73-76.
• Huici O. 2007. El mundo de los plaguicidas. Fundamentos técnicos para el
uso y manejo correcto de plaguicidas. 2ª. ed. Bolivia.: 1- 7.
• IARC. 1991. DDT and asociated compounds En: occupational exposure in
insecticide application and some pesticides. Lyon, France: IARC
Monographs on the evaluation of carcongenic risk to humans. Vol. 53, 179
– 250.
• Infante-Rivard C, Labuda D, Krajinovic M, Sinnett D. 1999. Risk of
childhood leukemia associated with exposure to pestcides and with gene
polymorphisms. Epidemiology 10(5):481–487.
• Inoue M, Tajima K, Hirose K, Kuroishi T, Gao CM, Kitoh T. 1994. Life-style
and subsite of gastric cancer - joint effect of smoking and drinking habits.
Int J Cancer; 54:494-9.
• Jarno Tuimala, Gabor Szekely, Harriet Wikman, Hilkka Järventaus, Ari
Hirvonen, Sarolta Gundy, Hannu Norppa. 2004. Genetic polymorphisms of
Noemí Tirado Bustillos
125
DNA repair and xenobiotic – metabolizing enzymes: effect on levels of sister
chromatid exchanges and chromosomal aberrations. Mutation Research;
554: 319 – 333.
• Jensen, F. S., Skovgaard, L. T. y Viby-Mogensen, J. 1995. Identification of
human plasma cholinesterase variants in 6.688 individuals using
biochemical analysis. Acta Anaesthesiol Scand, 39: 157-162.
• Joksic G, Vidakovic A, Spasojevic-Tisma V. 1997. Cytogenetic monitoring
of pesticide sprayers. Environ Research. 75(2):113-118.
• Jors E., 2005. Intoxicacion aguda por plaguicidas en pequeños
agricultores del departamento de La Paz- Bolivia. Tesis doctoral.
• Jors E, Gonzales A.R, Ascarrunz M.E, Tirado N, Takahashi C, Lafuente E,
Dos Santos R, Bailon N, Cervantes R, Huici O, Baelum J, Lander F. 2007.
Genetic alterations in Pesticide exposed Bolivian farmers an evaluation by
analysis of chromosomal aberrations and the comet assay. Biomarker
Insights 2: 439–445.
• Kendall R, Anderson T, Baker R, Bens C, Carr J, Chiodo L, Cobb III G,
Dickerson R, Dixon K, Frame L, Hooper M, Martin C, McMurry S, Patino R,
Smith E, Theodorakis C, 2001. Ecotoxicology. En: Curtis D. Klassen.
Editorial Mc Graw Hill. Casarett and Doull’s Toxicology. Sexta Edición. Mc
Graw Hill: pp. 1018 – 1019.
• Kelsey KT, Wienke JK, Ward J. 1995. Sister Chromatid exchanges,
glutathione S-transferase θ deletion and cytogenetic sensitivity to
diepoxybutane in lymphocytes from butadiene monomer production
workers. Mutat. Res. 335: 267-273.
• Kerb R, Brockmoller J, Schlangerhaufer R, Spreger R, Roots I,
Brinkmmann U. 2002. Influence of GSTT1 and GSTM1 genotypes on
sunburn sensitivity. Am. J. Pharmacogenomics, 2: 147-154.
• Ketterer B, Harris JM, Talaska G, Meyer DJ, Pemble SE, Taylor JB, Lang
NP, Kadlubar FF (1992) The human glutathione S-transferase supergene
Noemí Tirado Bustillos
126
family, its polymorphism, and its e.ectson susceptibility to lung cancer.
Environ Health Perspect 98:87±94
• Kihara M, Noda K, 1995. Risk of smoking for squamous and small cell
carcinomas of the lung modulated by combinations of CYP1A1 and GSTM1
gene polymorphisms in a Japanese population. Carconogenesis 16 (10):
2331 – 2336.
• Kirsch-Volders M, Fenech M. 2001. Inclusion of micronuclei in non-
divided mononuclear lymphocytes and necrosis/apoptosis may provide a
more comprehensive cytokinesis block micronucleus assay for
biomonitoring purposes. Mutagenesis, 16: 51- 58.
• Kirsch-Volder M., Antonina R., Roelants M., Tremp A., Zeiger E., Stefano
B. , Holland N., Peter W., Vande P., DeBoeck M., Godderis L., Haufroid V.,
Ishikawa H., Laffon B., Marcos R., Migliore L, Norppa H., Teixeira J., Zijno
A., Fenech M. 2006. The Effects of GSTM1 and GSTT1 Polymorphisms on
Micronucleus frequencies in Human Lymphocytes In vivo. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev; 15(5).
• Lan Q, He X, Costa D, Tian L, Torhman N, Hu G, Mumford JL. 2000.
Indoor coal combustion emissions, GSTM1 and GSTT1 genotypes and lung
cancer risk: A case-control study in Xuan Wei, China. Cancer
• Lin H J, Han CY, Bernstein DA, Hsiao W, Lin BK, Hardy S. 1994. Ethnic
distribution of the glutathione transferase Mu 1-1 (GSTM1) null genotype
in 1473 individuals and application to bladder cnacer susceptibility,
Carcinogenesis, 15: 1077 – 1081.
• Long J, Covington F, Delaney-Black V, Nordstrom B. Allelic variation and
environmental lead exposure in urban children. AACN Clinical Issues
2002;13(4):550–556.
• Mannervick, B. (1985). The isoenzymes of glutathione transferase. Adv.
Enzymol. 57: 357-417.
• Mannervik B, Awasthi YC, Board PG, Hayes JD, Di Ilio C, Ketterer B,
Listowsky I, Morgenstern R, Muramatsu M, Pearson WR et al. 1992
Noemí Tirado Bustillos
127
Nomenclature for human glutathione transferases. Biochem J 282:305–
306.
• Mannervik B, Danielson UH. 1988. Glutathione transferases – structure
and catalytic activity. CRC. Crit Rev. Biochem., 23: 283 – 337.
• Mannervik B. 2003.Novel polymorphisms in the glutathione transferase
superfamily. Pharmacogentics, 13: 127-128.
• Maroni M, Colosio C, Ferioli A, Fait A. 2000 Biological monitoring of
pesticide exposure. A review. Introduction. Toxicology, 143. 1-118.
• Marrs TC. 1993 Organophosphate poisoning. Pharmacol Ther. 58:51-66.
• Miller GT. 1999. Environmental science working Herat. Seven Edition.
Wad Worth. Publishing Company. ITP Canada.
• Mora MA, Papoulias D. Nava I, Buckler DR. 2001. A comparative
assessment of contaminants in fish from resacas of the Texas USA –
Tamaulipas, México border region. Environ. Int. 27: 15 -20.
• Norppa H, Renai L, Lindholm C. 1993. Detection of whole chromosome in
micronuclei of cytokinesis human lymphocytes by antikinetochore staining
and in situ hybridization. Mutageneis, 8: 519-525.
• Norppa H, Hirvonen A, Järventaus H, Uusküla M, Taw G, Ojajärvi A, Sorsa
M. 1995. Role of GSTT1 and GSTM1 genotypes in determining individual
susceptibility to sister chromatid Exchange induction by diepoxibutane in
cultured human lymphocytes. Carcinogenesis, 16: 1261 – 1264.
• Obiols Q. J. 1998. NTP 512: Plaguicidas organofosforados (I): aspectos
generales y toxicocinética.
• Ollikainen T, Hirvonen A, Norppa H. 1998. Influence of GSTT1 genotype on
sister chromatid exchange induction by styrene-7, 8-oxide in cultured
human lymphocytes. Environ. Mol. Mutagen., 31: 311-315.
• Oude Ophui Michel B, Manni Johannes J, Peters Wilbert H. M.
Glutathione S-transferase T1 null polymorphism and the risk for head and
neck cancer 2006. Acta oto-laryngol. vol. 126, No3; 311-317.
Noemí Tirado Bustillos
128
• OMS, 1991. World Health Organization. Safe use of pesticides.
Recommended classification of pesticides by hazard and guidelines to
classification Geneva. (WHO Technical Report Series).
• Paramjit G., Danadevi K., Mahboob M., Rozati R., Saleha B., Rahman MF.
2003. Evaluation of genetic damage in workers employed in pesticide
production utilizing the Comet assay. Mutagénesis. 18: 201-205.
• Pastor S, Gutierrez S, Creus A, Cebulska-Wasilewska A, Marcos R. 2001.
Micronuclei inperipheral blood lymphocytes and buccal epithelial cells of
Polish farmers exposed to pesticides. Mutat Res 495:147–156.
• Pastor BS. 2002. Biomonitorización citogenética de cuatro poblaciones
agrícolas Europeas, expuestas a los plaguicidas, mediante el ensayo de
micronúcleos. Universidad Autónoma de Barcelona. Facultad de ciencias
departamento de genética y de microbíologia. Grupo Mutagenesis. Tesis
Doctoral.
• Pastor S, Gutierrez S., Creus A., Xamena N., Piperikis S., Marcos R.
2001b. Cytogenetic analysis of Greek farmers using the micronucleus
assay in peripheral lymphocytes and buccal cells. Mutagenesis 16:539-
545.
• Pastor S, S. Gutierrez, A. Creus A. Cebuska-Wasilewska, R. Marcos. 2001
Micronuclei in peripheral blood lymphocytes and bucal epithelial cells of
polish farmers exponed to pesticides. Mutat. Res. 495 147-156.
• Paz- y -Miño C., Dávalos MV., Sánchez ME, Arévalo M., Leone P. 2002.
Should gaps be included in chromosomal aberration analysis? Evidence
based on the comet assay. Mutat. Res. 516:57-61.
• Pemble S, Schroeder KR, Spencer SR, Meyer DJ, Hallier E, Bolt HM,
Ketterer B, Tayler JB. 1994. Human glutathione S – transferase Theta
(GSTT1): cDNA cloning and the characterization of a genetic
polymorphism. Biochem. J, 300:271-276.
• Perry P and Wolf R. 1974. New giemsa method for differential staining of
sister chromatid. Nature 251: 156-158.
Noemí Tirado Bustillos
129
• Pickett CB, Lu Ay. 1989. Glutathion S-transferases: gene structure,
regulation and biological function. Annu. Rev Biochem; 58:743 – 764.
• Quiñones L, Berthou F, Varela N, Simon B, Gill L, Lucas D. 1999.
CYP2E1, CYP1A1 and GSTM1 genetic polymorfisms between French
Caucasian and Chilean populations. Cancer Lett. 141 (1-2): 167-171.
• Ramírez V, Cuenca P. 2002. DNA damage in female workers exposed to
pesticides in banana plantations at Limon, Costa Rica. Spanish. Rev Biol
Trop; 50:507–518.
• Raunio H, Pursiainen KH, Antilla S, Hietanen E, Hirvonen A, Pelkonen O.
Diagnosis of polymorphisms in carcinogen-activating and inactivating
enzymes and cancer susceptibility - a review. Gene 1995; 159:113-21.
• Rebbeck TR. 1997. Molecular epidemiology of the human glutathione s –
transferase genotype GSTM1 and GSTT1 in cancer susceptibility. Cancer
Epidemiol. Biomarkers Prev., 6: 733-743.
• Richeldi I, Sorrentino R, Saltini C. 1993. HLA-DPB1 glutamate 60: a
genetic marker of beryllium disease. Science. 262: 242-244.
• Rupa DS, Reddy PP, Sreemannarayana K, Reddi OS. 1991. Frequency of
sister chromatid Exchange in peripheral lyjmphocytes of male pesticide
applicators. Environ. Molec. Mutagen. 18: 136-138.
• Rushmore TH, Pickett CB. 1993. Glutathion S-transferase Structure,
regulation and therapeutic implications. J. Biol.Chem., 268: 11475 –
11478.
• Sailaja, N, Chandrasekhar, M, Rekhadevi, P.V. et al. 2006. Genotoxic
evaluation of workers employed in pesticide production. Mutat. Res.,
609:74–80. Sasaki, Y.F, Sekihashi, K, Izumiyama, F. et al. 2000. The
Comet Assay.
• Sala M, Sunyer J, Herrero C, To –Figueras J, Grimalt J. 2001. Association
between serum concentrations of hexaclorobenzene and polyclorobiphenils
with thyroid hormone and liver enzymes in a simple of the general
population. Occup. Environ. Med., 58: 172 – 177.
Noemí Tirado Bustillos
130
• Saleha Banu B, Danadevi K´rahman MF, Ahuja YR, Kaiser J.
2001.Genotoxic effect of monocrotophos to sentinel species using comet
assay. Food Chem. Toxicol., 39:361-366.
• Sandberg AA (1982) Sister chromatid exchange in human states. En:
Sandberg AA (Ed) Sister Chromatid Exchange. Liss, New York, pp 619-
651.
• Scarpato R, Migliore L, Angotzi G, Fedi A, Miligi L, Loprieno N. 1996a.
Cytogenetic monitoring of a group of Italian floriculturists: no evidence of
DNA damage related to pesticide exposure. Mutation Research. 367: 73-
82.
• Scarpato R, Migliore L, Hirvonen A, Falck G, Norppa H. 1997. Influence of
GSTM1 and GSTT1 polymorphism on the frequency of chromosome
aberrations in lymphocytes of smokers and pesticide – exposed greenhouse
workers. Mutat. Res. 389: 227-275.
• Scarpato R , Miliore L, Hirvonen A, Falck G, Norppa H. 1996b. Cytogenetic
monitoring of occupational exposure to pesticides: characterization of
GSTM1, GSTT1 and NAT2 gentoypes. Environ. Mol. Mutagen., 27: 263 –
269.
• Shaham, J., Kaufman, Z., Gurvich, R. and Levi, Z. 2001. Frequency of
sister-chromatid exchange among greenhouse farmers exposed to
pesticides. Mutat Res 491: 71-80.
• Seidegard J, Vorachek WR, Piero RW, Pearson WR. 1988. Hereditary
differences in the expression of the human Glutathion transferase active
on trans-stilbene oxide are due to gene detection, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 85: 7293 – 7297.
• Smith G, Smith CAD, Wolf CR. 1995. Pharmacogenetic polymorphisms.
En: Environmental Mutagenesis. Philips DH. Venitt S (Eds). BIOS
Scientific Publishers. Ltd., UK.
Noemí Tirado Bustillos
131
• Šram RJ. 1998. Effect of glutathione S-transferase M1 polymorphisms on
biomarkers of exposure and effects. Environ. Health Perspect, 106 (Suppl.
1): 231-239.
• Steenland K, Jenkins B, Ames RG, O'Malley M, Chrislip D, Russo J. 1994.
Chronic neurological sequelae to organophosphate pesticide poisoning. Am
J Public Health 84:731-736 (Sultatos LG. 1992. Role of glutathione in the
mammalian detoxification of organophosphorus insecticides. In: chambers
JE, Levi P (Eds) Organophosfates Chemistry, Fate and Effects. New York
Academic Press; pp: 155 – 168.
• Stocker R and BN Ames. 1987. Potential role of conjugated billers bin and
cooper in the metabolism of lipid peroxides in bile. Proc. Natl. Acad. Sci.
(USA) 84: 8130 – 8134.
• Sultatos LG.1992. Role of glutathione in the mammalian detoxification of
organophosphorus insecticides. In: Organophosphorus Chemistry, Fate
and Effects. New York: Academic Press; 155 – 168.
• Sultatos LG. 1994. Mammalian Toxicology of organophosphorous
peseticides J. Toxicol. Environ. Health, 43: 271 – 289.
• Surrallés J. Antoccia A, Degrassi F. Tanzarella C. 1994. The effect of
cytochalasyn –B concentration on the frequency of micronucleus induced
by four standard mutagens. Results from two laboratories. Mutagenesis 9:
347-353, 1994.
• Surrallés J, Catalan J, Creus A, Norppa H, Xamena N, Marcos R. 1995.
Micronuclei induced by alachlor mitomycin C and vinblastine in human
lymphocytes presence of centromeres and kinetochores and influence of
staining technique. Mutagenesis, 10: 417 – 423.
• Surrallés J, Natarajan AT. 1997. Human lymphocytes micronucleus assay
in Europe. An international survey. Mutat. Res., 392: 165-174.
• Taningher M. Malacarne D, Izzoti A, Ugolini D, Parodi S. 1999. Drug
metabolism polymorphisms as modulaitors of cancer susceptibility. Mutat.
Res., 436: 227 – 261.
Noemí Tirado Bustillos
132
• Tang J, Cao Y, Rose RL, Brimfield AA, Dai D, Goldstein JA, Hodgson E.
2001. Metabolism of chlorpyrifos by human cytochrome P450 isoforms
and human mouse and rat liver microsomes. Drug Metab. Dispos. 29:
1201 – 1204.
• Titenko-Holland N., Windham G., Kolachana P, Reinish F, Parvatham S,
Osorio A.M, Smith M.T. 1997. Genotoxicity of Malathion in human
lymphocytes assessed using the micronucleus assay in vitro and in vivo: a
study of malathion-exposed workers, Mutat. Res. 388: 85-95.
• Tomatis, L. 1997. Cancer: Causes, Occurrence and Control. IARC
Scientific Publ. No. 100. Lyon, France: IARC.
• Toruner GA, Akerli C, Ucar A, Aki T, Atsu N, Ozen H, Tez M, Cetinkaya M,
Ozcelik T. 2001. Polymorphisms of glutathione s-tranferase genes (GSTM1,
GSTT1 and GSTT1) and bladder cáncer susceptibility in the Turkish
population. Arch. Toxicol., 75: 459 – 464.
• Tsuchida S. 1997. Glutathione transferases En: Encyclopedia of cáncer.
Vol. 1 Academic Press. Inc., pp. 733-743.
• Venegas W, Zapata I, Carbonell E, Marcos R,. 1998. Micronuclei analysis
in lymphocytes of pesticide sprayers from Concepción, Chile. Teratolog.
Carcing. Mutagen. 18:123-129.
• Vogel F, Motulsky G. 1997. Human genetics. 3rd edn. Berlin: Springer-
Verlag, 1997.
• Walker CH. 1998. The use of biomarkers to measure the interactive effects
of chemicals. Ecotoxicol Environ Saf. 40 (1-2):65-70.
• Windham Gc. Titenko-Holland N, Osorio Am, Gettner S, Reinisch F, Haas
R, Smith M. 1998. Genetic monitoring of malathion-exposed agricultural
workers. Am J Med. 33(2):164-74.
• Wolf S. y Perry P. 1974. Differential giemsa staining of sister chromatids
and the study of sister chromatid exchanges without auto radiography.
Chromosoma. 48 (4): 341 – 345.
Noemí Tirado Bustillos
133
• Woodward G. 2001. Autism and Parkinson´s disease. Med Hypotheses;
56(2): 246-9.
• Yasmashita M, Tanaka J, Ando Y. 1997. Human mortality in
organophosphate poisonings. Vet Hum Toxicol 39:84-85.
• Yeary, R.A., Eaton, J., Gilmore, E., North,B. and Singell,J. 1993. A
multiyear study of blood cholinesterase activity in urban pesticide
application. J. Toxicol. Environ. Health. 39, 11–25.
• Yu-Chen Lei, Shing-Jen Hwang, Chuen-Chau Chang, Hsen-Wen Kuo, Gin-
Chyuan Luo, Ming J.W. Chang, Tsun-Jen Cheng. 2002. Effects on sister
chromatid exchange frequency of polymorphisms in DNA repair gene
XRRCC1 in somkers.Mutation Research 519: 93-101.
• Zheng T, Zahm SH, Cantor KP, Weisenburger DD, Zhang Y, Blair A. 2001.
Agricultrural exposure to carbamate pesricides and risk of non – Hodking
linphoma. J. Occup. Environ Md. 43: 641 – 649.
• Zheng W, Wen WQ, Gustafson DR, Gross M, Cerhan JR, Folsom AR. 2002.
GSTM1 and GSTT1 polymorphisms and postmenopausal breast cancer
risk. Breast Cancer Res. Treat., 74: 6-16.
Noemí Tirado Bustillos
134
Noemí Tirado Bustillos
135
Noemí Tirado Bustillos
136
ANEXO 2 Tabla 31. Plaguicidas Prohibidos en Bolivia
Nombre del veneno Nombre Comercial DDT DDT Matador Endrin Endrín Aldrin Aldrín Mirex Mirex Dieldrin Dieldrín Lindano Lindano, Gama BHC Heptacloro Heptacloro, Clorahep Metoxicloro Metoxicloro, Marlate Hexacloro o benceno BHC Pentaclorofenol Pentaclorofenol, Dowcide Endosulfan Cyclodon, Thiodan Toxafeno Toxafeno Clordano Clordano Heptacloro Heptacloro
Fuente: Huci. 2004. El mundo de los plaguicidas. Cartilla 2. Proyecto Plaguicidas Bolivia
Tabla 32. Plaguicidas de uso permitido en Bolivia FUNGICIDAS
INGREDIENTE ACTIVO NOMBRE COMERCIAL Nº DE REGISTRO Azoxystrobin Priori 1722
Azufre Kumulus- R DF Sulflox 720
1378 1395
Benomil Benlate Benomil
362 1254
Captan Merpan 48 FW Captan 50 PM Captan 750 Merpan 80 WDG
1495 1253 1342 1487
Captan + Molibdeno Captan 250 Moly 1034
Carbendazin Bavistin FL 910
Carboxin- Thiran Vitavax 200 FF 1285
Cyproconazole Alto 100 SL 1426
Clorotalonil Bravo 720 Bravo 500 Hortyl 50
1647 724 1368
Cymoxanil + Mancozeb Curathane 1434
Difenoconazole Score 250 EC 1389
Edifenphos Hinosan 1201
Epoxiconazol + Carbendazin Duett 1448
Flusilazole Punch 1148
Flutriafol Impact Vincit F
1341 1425
Folpet Folpan 80 PM 728
Noemí Tirado Bustillos
137
HERBICIDAS
INGREDIENTE ACTIVO NOMBRE COMERCIAL Nº DE REGISTRO
2,4 D Sal amina DMA - 6 3345
Acetoclor Acetoclor 1275
Acifluorfen + Bentazon Galaxi Top 1556
Aclonifen Prodigio 1296
Alachlor Alanex 48 EC 778
Ametrina Ametrex 50 FW 1359
Atrazina Atranex 50 FW 1223
Bentazon Basagran R 600 1376
Bromacil Hyvar X 1514
Butroxydim Falcon 1622
Cicloxydim Focus Ultra 1191
Clethodim Select 24 EC 1414
Clomazone Command LE 1115
Clorimuron Spin 25 PE 1309
Dicamba Banvel 480 SL 1435
Diquat Reglone 1032
Diuron Karmex SF 1141
Fomesafen Flex 250 848
Metribuzin Sencor 480 1295
MSMA Arsonex 96 1301
Paraquat Gramoxone 365
Folpan 80 WDG 1343
Folpet + Prochloraz Mirage - F 1344
Fosetil Aluminio Defense 80 WP 1418
Iprodione Rovral 744
Iprodione + Thiram Rovrin 1002
Kasugamicina Kasumin 1379
Mancozeb Dithane Dithane M - 45 Manzate 200 Tiozeb Manzeb
978 384 661 1654 1552
Mancozeb + Metalaxil Metaman WP Hieloxil Mix 72
1370
1551
Metiran Polyram DF 1501
Ofurace + Mancozeb Patafol 1259
Oxicloruro de Cobre Cupravit Cobox Kupoxil Roxicop Fungicobre
1290 1600 1082 1512 1464
Prochloraz Mirage 45 EC 1264
Propiconazole Bumper 25 EC 1263
Propineb Antracol 1210
Propineb + Cymonaxil Fitoraz 1209
Sulfato de Cobre Pentahidratado Pitón- 27 1711
Tebuconazole Folicur 259 EC Folicur 250 EW
1337 1700
Thiabendazol Tecto 100 1261
Noemí Tirado Bustillos
138
INSECTICIDAS
INGREDIENTE ACTIVO NOMBRE COMERCIAL Nº DE REGISTRO
Aldicarb Temik 1506 1294
Carbaryl Sevin 480 1074
Ciflutrina Baytroid 50 1286
Cipermetrina Arrivo 25 EC 1672
Clorpirifos Lorsban 48 EC 876
Deltametrina Decis 5 1266
Dianizon Diazol 60 EC 1415
Dimetoato Dimetoxion 1553
Endosulfan
Thiodan 35 Thiosulfan Endozol
1276 1272 1713
Fentoato Elsan 906
Fipronil Regent 20 G 1351
Lufenuron Match 50 EC 1373
Metamifodos Tamaron 600 1280
Methomil Lannate 90 1515
Profenofos Curacron 500 EC 513/1335
Triclorfon Dipterex 1233
Triflumuron Alsystin 25 PM 1205
Noemí Tirado Bustillos
139
ANEXO 3. Hoja de información a los participantes en el estudio
PROYECTO: POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO MODIFICADORES DE RIESGO MUTAGÉNICO EN AGRICULTORES EXPUESTOS A PLAGUICIDAS N° de identificación………………….
HOJA DE INFORMACIÓN
Estimado señor (a): El Instituto de Genética y el proyecto Plaguicidas Bolivia se encuentran realizando un proyecto
de investigación para evaluar el riesgo genotóxico y la susceptibilidad genética por exposición a plaguicidas
mediante los métodos de micronúcleos e Intercambios entre cromatides hermanas en linfocitos de sangre periférica
y genotipificación.
Las comunidades de Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca, tienen a la agricultura como la principal actividad
económica. Para la producción de diferentes productos usan diferentes agroquímicos y plaguicidas. Sólo un
pequeño porcentaje de los plaguicidas aplicados, alcanza su objetivo, acabando generalmente en el aire, en el agua
de beber, en los alimentos y en organismos sobre los que no se tenía ninguna intención de hacer llegar el plaguicida,
entre ellos el hombre. La exposición a plaguicidas representa un riesgo potencial para las personas que viven en el
las comunidades de Caranavi, Guanay, Mecapaca y Palca, ocasionando daños en la salud, provocando neuritis,
manifestaciones neurológicas y psiquiátricas, trastornos hepatorrenales, y otras enfermedades. Se ha determinado
que en la comunidad donde Ud. vive se encuentra lo suficientemente cerca de la exposición de plaguicidas y podría
estar siendo contaminado por ellos. En un primer estudio piloto, se ha encontrado que el grupo expuesto a
plaguicidas, presenta daño genotóxico, es decir que tiene riesgo de contraer en el futuro alguna enfermedad crónica
degenerativa; además en este estudio se evaluará la susceptibilidad genética a través de la identificación de las
diferencias interindividuales que hacen que un individuo sea más susceptible o responda de manera diferente, con
mayor riesgo para la salud, frente a la exposición a plaguicidas.
Por estas razones, es que solicitamos su participación en este estudio. Con ello Ud. contribuirá al conocimiento
sobre estos contaminantes y permitirá que se le diagnostique oportunamente cualquier alteración en su salud Si Ud.
acepta participar, le pediremos contestar preguntas sobre sus datos personales y sus hábitos, para determinar su
exposición a plaguicidas encuesta. Además de eso, permitirnos la toma de una muestra de sangre y mucosa bucal.
Las muestras de sangre y mucosa bucal serán obtenidas por una persona profesional, y analizadas en un laboratorio
de alta calidad y sin costo para usted, pero tampoco usted recibirá ningún tipo de retribución por participar en el
estudio.
Su participación es absolutamente voluntaria, y si Ud. decide hacerlo le rogamos firmar su consentimiento en las
líneas siguientes. Esperamos contar con su colaboración, ya que los resultados de este estudio irán en directo
beneficio de Ud. y de la comunidad.
Dra. Noemí Tirado Bustillos
CI: 2369439 L.P. INVESTIGADORA PRINCIPAL.
Noemí Tirado Bustillos
140
Consentimiento informado
PROYECTO: POLIMORFISMOS GENÉTICOS DE LA GSTM1 Y LA GSTT1 COMO MODIFICADORES DE RIESGO MUTAGÉNICO EN AGRICULTORES EXPUESTOS
A PLAGUICIDAS
N° de identificación………………….
CONSENTIMIENTO INFORMADO
Yo _____________________________ con CI: __________________
Dirección: ------------------------------------------- Comunidad: …………………………………
Tengo conocimiento del trabajo de investigación que están realizando el Instituto de Genética y
el proyecto Plaguicidas Bolivia, para evaluar el riesgo genotóxico y la susceptibilidad genética
por exposición a plaguicidas en agricultores de las comunidades de Caranavi, Guanay,
Mecapaca y Palca.
Después de haber leído y haberme informado en detalle del estudio, doy mi consentimiento
para participar en el estudio.
Entiendo que mi participación es voluntaria.
______________________________________________
Nombre, CI y Firma del participante.
__________________________
Dra. Noemí Tirado Bustillos.
CI: 2369439 L.P.
INVESTIGADOR PRINCIPAL.
_____________________________________________
Tec. Sup. Marina Cuti.
RESPONSABLE DE TOMA DE MUESTRA.
______ de ______________ de 200___
Noemí Tirado Bustillos
141
ANEXO 4. Mapas de las comunidades de estudio
Mapa de Caranavi
Noemí Tirado Bustillos
142
Mapa de Mecapaca
Noemí Tirado Bustillos
143
Mapa de Palca