Polimeráz láncreakció

Készítette: Feigl Viktória

PCR (polymerase chain reaction)• A speciális, kiválasztott DNS szekvencia

amplifikációja enzimes reakciók ismétlődésével in vitro körülmények között.

• Szelektív módszer, előnye a hagyományos technikákkal szemben, hogy speciális DNS fragment vizsgálatát teszi lehetővé.

• Minden egyes PCR ciklusban a DNS mennyisége a reakcióelegyben megduplázódik, azaz 30 ciklus után 109-szerese a kezdeti DNS mennyiségnek.

• A reakció végterméke gélelektroforézissel vizsgálható.

PCR története

Kary B.Mullis (Cetus) fedezte fel 1983-ban

1985-ben jelent meg a cikk

1993-ban kémiai Nobel-díj

Ötlet: olyan eljárást kellene kifejleszteni, amely a DNS-t mesterségesen megsokszorozza a DNS-polimeráz enzim segítségével, megismételt duplikációs ciklusok által.

A DNS polimeráz enzim:• Megtalálható az élő szervezetekben

• Funkciója a DNS lemásolása a sejt osztódásakor

• A DNS egyik szálához kötődve létrehozza a komplementer szálat.

Az eredeti eljárás:A kettős szálú DNS két szálra választása

96°C-ra történő hevítéssel

96°C-on a DNS polimeráz lebomlott

enzimet minden ciklusban pótolni kellettKevéssé hatékonyIdőigényesNagy DNS-polimeráz fogyasztásFolyamatos figyelem

Megoldás: Thermus aquaticus•Yellowstone Parkban izolálták (1969) •Thomas Brock és Hudson Brock fedezte fel

• Magas hőmérsékleten stabilis DNS-polimeráz – nem bomlik le a hevítési lépésben, nem szükséges minden ciklusban újat hozzáadni

• Eljárás leegyszerűsödése

• Automatizálhatóság

Taq polimeráz• 1976-ban izolálták a T.

aquatcus-ból• Hőmésékleti optimuma 80°C• Hátránya: hibázik, mutációk• Nem rendelkezik 3’→5’

hibajavító exonukleáz aktivitással

Helyette: Archea• Pfu, Pwo, de lassabbak• Megoldás: Taq és Pfu

kombinációja (gyors és pontos)

Mire van szükség a PCR reakcióhoz?

• DNS-templát vagy cDNS– ez tartalmazza a DNS-szakasz amplifikálandó régióját

• Két primer – amely meghatározza az amplifikálandó szakasz elejét és végét

• DNS-polimeráz – amely lemásolja az amplifikálandó szakaszt

• Nukleotidok – amelyekből a DNS-polimeráz felépíti az új DNS-t

• Puffer – amely biztosítja a DNS-polimeráz számára megfelelő kémiai környezetet

A primerek

• Segítségükkel határozható meg az amplifikálandó DNS szakasz

• Komplementerek az amplifikálandó DNS szakasz elejével és végével

• Rövid, mesterséges DNS szálak

• Hosszuk: 17-30 bp

• Nem tartalmaznak komplementer régiót (egymással nem képeznek primer-dimert)

Primertervezés• Optimális olvadási hőmérséklet: 60-75 °C

– Olvadási hőmérséklet: Ahol a primer kötőhelyeinek fele foglalt– Nő a primer hosszával– Túl magas (80°C felett): DNS polimeráz kevéssé aktív – limitált

hossz– Legtöbb primer G+C tartalma >50% → magasabb olvadáspont– Két primer egyező olvadási T → nem specifikus termékek elkerülése

és mindkét primer felől azonos amplifikáció– Rövid primerek: több helyre kapcsolódhatnának →nem specifikus

kópiák

• Optimális hossz: 20-40 nukleotid• Specifikus gén vagy egy adott mikroorganizmus faj

detektálásához – A keresett DNS-re specifikus primer, amely kizárólag a target szekvenciához kapcsolódik

• Mikroorganizmus csoport detektálásához – DNS konzervált régiójára tervezni

Degenerált primerek

• Hasonló, de nem azonos primerek keverékei• Ha ugyanazt a gént különböző

organizmusokból kell amplifikálni (hasonló, de nem azonos gének)

• Ha a tervezésnél a fehérjeszekvenciát veszik figyelembe (egy aminosav több kódon)

• Csökkentik a PCR amplifikálás specifitását• Problémát részben megoldja a Touchdown

PCR

PCR eljárás

1. Denaturáció (94-96°C, 1-2 perc)– A két DNS szálat összekötő H-hidak felbomlanak (1.

ciklus előtt hosszabb denaturálás a teljes szeparációhoz)

2. Primertapadás / annealing (55-60°C, 1-2 perc)– A primerek hozzákapcsolódnak a DNS szálakhoz– Hőm. ált. 5°C-kal van a primerek olvadási

hőmérséklete alatt

3. Lánchosszabbítás (72°C, 1-2 perc)– A DNS-polimeráz létrehozza a hiányzó szálat– T és t függ a DNS-polimeráztól, t az amplifikálandó

szakasz hosszától (ált. 1000 bp/perc)– Utolsó ciklus után hosszabb lánchosszabbítás

A PCR-ciklus sematikus ábrája.

(1) Denaturálás (2) Primertapadás(3) Meghosszabbítás

(P=polimeráz). (4) Az első ciklus véget

ért. Az eredményül kapott két DNS-szál a következő ciklus templátja lesz, azaz minden ciklusban megkétszereződik a DNS mennyisége.

Detektálás - Gélelektroforézis

A PCR-termék összehasonlítva a DNS-létrával agargélen. A DNS-létra (1. sáv), a PCR-termék alacsony koncentrációban (2. sáv) és magas koncentrációban (3. sáv)Helmut W. Klein, Biokémiai Intézet, Kölni Egyetem, Németország

Nested PCRNem specifikus primerkötések,

azaz nem kívánt termékek (szennyeződés) kiküszöbölésére.

Két sorozat primer két egymást követő PCR reakcióban. A második primerpár (nested primer) az első reakció termékén belül köt („fészkel”).

Elv: Ha az első primer rossz helyre köt, nagyon kicsi az esélye, hogy a másodiknak is legyen nem kívánt kötőhelye, azaz ezután is legyen nem kívánt termék.

Touchdown PCR• A specifitás növelésére• Elv: a primertapadás hőmérséklete meghatározza annak

specifitását – alacsonyabb hőmérsékleten a primer kevésbé specifikusan köt

• A kezdeti hőmérséklet a primerek olvadási jóval hőmérséklete (Tm) fölött van

• A hőmérsékletet ciklusonként 1-2 °C-kal csökkentik; a primer a lehető legmagasabb, még elviselhető hőmérsékleten fog tapadni, itt a legnagyobb a specifitás

• Később ezek a fragmensek amplifikálódnak tovább, elnyomva a nem specifikus termékeket

• A hőmérséklet fokozatosan csökken a primer Tm-hez (touchdown hőmérséklet, ideális), utána itt folytatódik a primertapadás további 10 vagy több cikluson át

Inverz PCRHa a target szakaszon belül

ismert egy szekvencia – a két szélén nem

Emésztés (kis szakaszokra)→ önligálás (cirkuláris forma) → hasítás restrikckiós enzimmel az ismert szekvencián belül → ismert két szélső szekvencia → PCR

Szélen elhelyezkedő transzpozonok és genomikus inzerciók identifikálására

Reverz Transzkripció PCR (RT-PCR)

RNS amplifikációjára

Reverz transzkripció „primerje”: oligo dT, ami az RNS 3’ végének poliA szekvenciájához köt (helyette lehet random hexamer vagy specifikus primerek)RT: 37 °C, 1 óra; RNS lebontása RNázH-val; cDNS komplementer szálának szintetizálása magasabb T-n

Alkalmazások:•Kis mennyiségben jelen lévő RNS-ek detektálása•cDNS könyvtárak létrehozása

Real-Time PCRKvantitatív módszer!Minden PCR ciklus után megadja a DNS

mennyiségét „real-time”* Fluoreszcens festék – a kettős szálú DNS-hez köt* DNS oligonukleotid próba – a kiegészítő szálhoz

kötve fluoreszkálGyakran a Reverz Transzkripció PCR-ral együtt

használják kis mennyiségű RNS (mRNS) mennyiségének meghatározására – a gén expresszió szintjének méréseHagyományos módszer: Northern blotting, hátránya, hogy csak nagy mennyiségű RNS esetén működik

Fluoreszcens festékSYBR Green - Kétszálú DNS-hez köt (egyszálúhoz és

primerhez nem) miután a DNS-polimeráz megszintetizálta a 2. szálat, fluoreszkál → detektorral mérhető

- Standard hígítási sorhoz hasonlítva mérhető a mennyiség

- Relatív mennyiséget ad meg- Hátrány: Nem sepcifikus PCR

termékekhez is köt, Előny: Relatíve olcsó– Cianid festék– Kék fénnyel indukálható (λmax = 488 nm) zöld

fényt bocsát ki (λmax = 522 nm) – Mutagén etídium-bromid helyett használható– Egyéb festékek:

SYBR Gold, YO (Oxazole Yellow), TO (Thiazole Orange), PG (PicoGreen)

Fluoreszcens oligonukleotid próba – FRET módszer Fluorescence (or Förster) Resonance Energy Transfer

Két fluorofór:

• Zöld (rövid λ): reporter dye („jelző”), 5’ végen, (gyakran GFP)

• Piros (hosszú λ) : quenching dye („elnyomó”), 3’ végen

• Az piros fluorofór elnyeli a zöld által kibocsátott fényt FRET által

• A próba hozzáköt a DNS-hez, majd a polimeráz működése közben eltávolítja. Így a zöld fluorofór eltávolodik a pirostól és a kibocsátott fény mérhető.

• Előnye: specifikus!

• Egyszerre több szekvencia is detektálható többféle színű festék használatával.

Molecular BeaconTaqMan

Különbség: A molecular beacon intakt marad, minden ciklusban újra tud kötni.Denaturáció során a hajtű szerkezet felbomlik, köt a DNS-hez és fényt emittál, mivel a zöld fluorofór eltávolodik a pirostól. (Ami nem köt az visszanyeri a hajtű szerkezetet és inaktív.)

Mennyiségi meghatározás

Minél nagyobb a kezdeti target DNS mennyisége, annál hamarabb észlelhető szignifikáns növekedés a fénykibocsátásban. A fix küszöbértéket egy adott ciklusban éri el a fluoreszcencia (CT = cycle treshold), amit logaritmikus diagramon ábrázolva standard hígítási sorhoz viszonyítva meghatározható a kezdeti DNS mennyisége (relatív – minták egymáshoz hasonlítása)

Felhasználás:A gén transzkripció érzékeny mennyiségi meghatározására. Diagnosztika: fertőző betegségek, rák, genetikai rendellenességekben szerepet játszó gének gyors detektálására.Génexpresszió változásának nyomon követése: Szövet vagy sejtkultúrák reakciója gyógyszerekre, környezeti körülmények változására – indukált mutációk (környezeti mikrobiológia – rezisztens gének detektálása).

A PCR alkalmazásai

• Genetikai ujjlenyomat - személyek azonosítása• Örökletes betegségek kimutatása• Fertőző betegségek kimutatása – fertőzést okozó

mikroorganizmus DNS-ének amplifikálása (immunválasz elmaradása vagy álpozitív eredmény esetén is)

• Ősi DNS elemzése pl. mamut, egyiptomi múmiák• Rokonság vizsgálat pl. apasági perek,

evolúciókutatás• Génklónozás