Prof. dr. B. Črešnar,

Inštitut za biokemijo, MF

Biokemija II

Podvojevanje DNA-replikacija

Gradniki nukleotidov-prekurzorjev

pri sintezi nukleinskih kislin

Deoksiribonukleotidi

baza nukleozid nukleotid

adenin adenozin deoksiadenilat

gvanin gvanozin deoksigvanilat

citozin citidin deoksicitidilat

timin timidin deoksitimidilat

Povezave nukleotidov

N

N N

N

NH2

O

OHO

HH

H

CH2

Hribose

adenine

P

O

O OO

OHO

HH

H

CH2

H

N

N

NH2

O

P

O

O O

OP

O

O

O

cytosine5'

4'

3' 2'

1'

ribose3'

5'

3' end

5' end

(etc)

nucleic acid

Podvojevanje DNA je semi-

konservativno

kontinuirna sinteza

diskontinuirna sinteza

Podvojevanje DNA je semi-diskontinuirno

vodilna veriga

sledilna veriga starševski

verigi

Okazakijevi fragmenti Premikanje

replikacijskih vilic

(Okazaki 1968)

Komponente podvojevanja DNA

• matrica-vsebuje informacijo

• začetni oligonukleotid; ima prosto 3´-OH skupino

• prekurzorji 5´-dNTP-ji

• encimi: primaza, polimeraze DNA, helikaza, topoizomeraze, nukleaze, ligaza

• drugi proteini: npr.SSB, drseče objemke

Reakcija s polimerazami DNA -

nastanek fosfodiesterske vezi

reakcija

transesterifikacije

3´ 5´

PPi-pirofofosfat

Reakcija z ligazo DNA

evkarionti prokarionti NMN-nikotinamid mononukleotid

Vloga helikaze in proteinov

SSB

novi vrigi DNA

starševski verigi

odpiranje replikacijskih vilic

Delovanje topoizomeraze tipa I

Mehanizem reakcije s

topoizomerazo I

Delovanje topoizomeraze tipa II

Polimeraze DNA pri E. coli

Asimetrični dimer polimeraze DNA III

(E. coli)

polimerazna

aktivnost

polimerazna aktivnost

drseči objemki

3'-5' eksonukleaza

namestitev

in

odpiranje

objemke

povezovanje

podenot

Podvojevanje DNA pri prokariontih

Evkariontske polimeraze DNA

Velikost,

kd

3´-5´

ekzonukleazna

aktivnost

Vloga

Pol 250 da podvojevanje genomske

DNA

Pol 39 ne popravljanje DNA

Pol 170 da podvojevanje genomske

DNA

Pol 200 da podvojevanje

mitohondrijske DNA

Pol 260 da

podvojevanje in

popravljanje genom. DNA

Pol lesion bypass

Pol lesion bypass

Kompnente podvojevanja DNA

pri prokariontih in evkariontih

• SSB-proteini

• helikaza

• primaza

• polimeraza III

• polimeraze III pod.

• Polimeraze III pod. + ´

• polimeraza I

• ekzon. akt. pol. I

• ligaza DNA (NAD+)

• giraza DNA (topoiz. tip II)

• replikacijski portein A (RPA)

• helikaza

• primaza

• polimerazi /

• PCNA (drseča objemka)

• replikacijski dejanik C (RFC)

polimeraza

• RNazaH, endonukleazi

(FEN1/Dna2)

• ligaza DNA (ATP)

• topoizomeraza (tip I)

Model podvojevanja DNA pri

evkariontih

Burgers PM.J Biol Chem. 2009 Feb 13;284(7):4041-5.

Pogoji nemotene replikacije Replikacija specifičnih področij, v primerih

okvarjene pol. in pogojih stresa

5'

3'

RFC omogoči sestavo drseče

objemke(PCNA)

Modeli zaključka sinteze sledilne

verige DNA pri evkariontih

Zheng L, Shen B.J Mol Cell Biol. 2011 Feb;3(1):23-30

nastanek

fosfodiesterske

vezi z ligazo DNA

Dna2

Encimi: nukleaze (RNaza H, FEN1, Dna2), drseča

objemka (PCNA), replikacijski protein A (RPA)

nekomplementarna

baza

ribonukleotidi

Celični cikel

Začetki in dvosmerno podvojevanje

DNA pri evkariontih

Nastanek replikacijskih vilic-1

5´ 3´

5´

pol /primaza

pol /

5´

5´ 3´

3´ 5´

5´

3´

3´

5´

Nastanek replikacijskih vilic-2

pol /primaza

pol /

pol /

pol / primaza

leve replikacijske vilice desne replikacijske vilice

Problem podvojevanja koncev

kromosomov

Ori

3' 5'

3' 5'

5'

5' 3' 3' 5'

Telomerne ponovitve pri evkariontih

Telomeraza

Podaljševanje telomere

interakcija s

starševsko DNA

komplementarna povezave

med RNA in DNA

Podaljšana telomera

obratno transkriptazna

aktivnost telomeraze

RNA telomeraze

Translokacija telomeraze

Do

lžin

a t

elo

mer

(člo

vek)

Število delitev

20

10

Celično staranje

Normalne

somatske

celice

(telomeraze -)

Krajšanje telomer

Telomere se skrajšajo po 50-60 delitvah od 10-15 kb

(zarodne celice) do 3-5 kb

Celično staranje nastopi, ko se v celicah

pojavi ena ali nekaj telomer s kritično dolžino

Model zadrževanja proteinskega dela

telomeraze s tumorskim supresorjem

PinX1. Normalne celice

Rakaste celice

Podvojevanje genomske DNA pri

evkariontih

Podobnosti s prokarionti

• sinteza poteka v smeri 5’ 3’

• potreben začetni oligonukleotid RNA

• encimske aktivnosti proteinov

Razlike

• podvojevanje pri evkariontih je počasnejše (50-

200 nt/sek).

• polimeraze so bolj specializirane in bolj

kompleksne z drugačno strukturo

• konci linearnih kromosomov se podvojujejo na

poseben način

Podvojevanje mitohondrijske DNA

pri sesalcih

nekodirajoče področje

začetka replikacije

težke verige

Začetek replikacije

lahke verige

nekodirajoče področje

ObH O-bL

začetka replikacije lahke verige

začetka replikacije težke verige

širša cona začetka

replikacije

zapisi za tRNA

zapisa za rRNA

Mesta oz. področje začetkov podvojevanje

zapisi za

polipeptide

promotor lahke

verige

Modela replikacije mtDNA

Sinteza RNA-intermediatov

vzdolž sledilne verige

Podvojevanjenje sledilne verige z

Okazakijevimi fragmenti

Prevladuje v jetrih in ledvicah

Prevladuje v srcu in skeletni mišici

Replikacijske vilice pri modelu

sinteze RNA-intermediatov vzdolž

sledilne verige

Polimeraza

heliklaza

mitohondrijski SSB

Sinteza kratkih

RNA Sinteza daljših

RNA

Inhibitorji podvojevanja

genomske DNA-1

zdravilo Mehanizem delovanja uporaba

ciprofloksacin inhibicija giraze bakterijske infekcije

novobiocin inhibicija giraze bakterijske infekcije

citozin arabinozid

(araC)

po foforilaciji je substrat

polimeraze ; po vezavi se

ustavi podaljševanje

leukemije

aciklovir (gvanin z

vezano neciklično

sladkorno komponento)

po fosforilaciji se z virusno

polimerazo DNA vgradi v

DNA in ustavi podaljševaje

Infekcije z HSV

1 in 2

ganciklovir enak kot pri acikloviru;

fosforilacija je učinkovitejša citomegalovirusne

infekcije

zdravilo mehanizem delovanja uporaba

ciklofosfamid po aktivacija v jetrih alkilira

G v DNA; verigi DNA se

povežeta

rak dojke in nekateri

limfomi ter leukemije

bleomicin omogoči tvorbo kisikovih

reaktivnih spojin; eno- in

dvoverižni prelomi

rak jačnikov in

testisov

mitomicin reduciran alkilira G v DNA;

verigi DNA se povežeta

različne oblike raka

cisplatin

karbiplatin

vezava na G v DNA; tvorba

intra- ali interverižnih DNA

aduktov

rak jačnikov,

testisov, pljuč itd

Inhibitorji podvojevanja DNA-2