PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA
description
Transcript of PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA
![Page 1: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/1.jpg)
PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA
Nukleotydy i kwasy nukleinowe
![Page 2: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/2.jpg)
OH
OH
H
O
HH
H
OH
HOCH2
H
OH
H
O
HH
H
OH
HOCH2
ryboza2-deoksyryboza
N
1 23
45
6N
PIRYMIDYNAcytozynatyminauracyl
N
N1
234
56
N
N7
89
PURYNAadenina guaninaO
N
zasada
cukier1’
2’3’
4’
5’CH2P
O
O-
O-
reszta kwasu ortofosforowego
Nukleotydy
![Page 3: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/3.jpg)
O
N
1’
2’3’
4’
5’CH2P
O
O-
O-
nukleotyd
O
N
1’
2’3’
4’
5’CH2OH
nukleozyd
CH2P
O
O-
O-
monofoforan nukleozydu
CH2P
O
O
O-
P
O
O-
O-
difoforan nukleozydu
CH2P
O
O
O-
P
O
O-
OP
O
O-
O-
trifoforan nukleozydu
Nukleotydy
wiązanie N-glikozydowe
wiązanie estrowe
![Page 4: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/4.jpg)
koniec 5’ łańcucha
koniec 3’ łańcucha
O
cukier1’
2’3’
4’
5’fosforan N
zasada
N
O
zasada
cukier1’
2’3’
4’
5’
O
cukier1’
2’3’
4’
5’
fosforan
fosforan N
zasada
Fragment łańcucha kwasu nukleinowego
wiązanie fosfodiestrowe
wiązanie fosfodiestrowe
OH
![Page 5: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/5.jpg)
Kwasy nukleinowe
DNA
kwas rybonukleinowy
bierze udział w rozkodowywaniu
informacji zawartej w DNA
koduje informację o budowie i działaniu całego organizmu
kwas deoksyrybonukleinowy
RNA
![Page 6: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/6.jpg)
CH2P
O
O-
O-
monofoforan nukleozydu
CH2P
O
O
O-
P
O
O-
OP
O
O-
O-
trifoforan nukleozydu
DNA dATP, dGTP, dCTP, dTTP
RNA ATP, GTP, CTP, UTP
![Page 7: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/7.jpg)
Podwójna helisa DNA
G C
A T
komplementarne parowanie zasad
![Page 8: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/8.jpg)
5’ GGTACCAATTCAAAGCTTATG 3’3’ CCATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’
Enzymy restrykcyjne
Kpn IGGTACCCCATGG
5’ GGTAC 3’3’ C 5’
5’CAATTCAAAGCTTATG 3’3’ CATGGTTAAGTTTCGAATAC 5’
Hind IIIAAGCTTTTCGAA
5’ GGTACCAATTCAA 3’3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’
5’AGCTTATG 3’ 3’ATAC 5’
Alu IAGCTTCGA
5’ CTTATG 3’3’ GAATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAAAG 3’3’ CCATGGTTAAGTTTC 5’
![Page 9: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/9.jpg)
5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA
AGCTTATG 3’ | ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA
AGCTTATG 3’ | ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA |||||||||||||||||||| 3’ CCATGGTTAAGTTTCGA
AGCTTATG 3’ | ATAC 5’
Hind III AAGCTTTTCGAA
Hind III
5’ GGTACCAATTCAA 3’ |||||||||||||3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’
5’AGCTTATG 3’ ||| 3’ATAC 5’
5’ GGTACCAATTCAA 3’ |||||||||||||3’ CCATGGTTAAGTTTCGA 5’
5’AGCTTATG 3’ ||| 3’ATAC 5’
ligaza
![Page 10: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/10.jpg)
wektor
trawienie enzymem restrykcyjnym
Klonowanie DNA
DNA zawierający wstawkę, którą chcemy przeklonować
trawienie enzymem
restrykcyjnym
wstawka
ligacja wektora ze wstawką
plazmid ze wstawką gotowy do wprowadzenia do bakterii
![Page 11: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/11.jpg)
mieszanina jednoniciowych
cząsteczek DNA
jednoniciowa wyznakowanasonda komplementarna
do cząsteczki A
hybrydyzacja w warunkach ostrych
hybrydyzacja w warunkach łagodnych
tylko cząsteczka A tworzy stabilną dwuniciową cząsteczkę
cząsteczki A, C i E tworzą stabilne dwuniciowe cząsteczki
Hybrydyzacja
![Page 12: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/12.jpg)
Hybrydyzacja
denaturacja DNA w celu uzyskania jednoniciowych cząsteczek
inkubacja błony z jednoniciową wyznakowaną radioaktywnie sondą DNA
![Page 13: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/13.jpg)
Sekwencjonowanie DNA
denaturacja
dwuniciowy DNAGCATATGTCAGTCCAG
CGTATACAGTCAGGTC5’3’
3’5’
GCAT
CGTATACAGTCAGGTC
5’3’ 5’
3’
jednoniciowy DNA(matryca do sekwencjonowania)
GCATATGTCAGTCCAG
CGTATACAGTCAGGTC
5’
3’
3’
5’
GCAT5’ 3’przyłączenie znakowanego startera
![Page 14: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/14.jpg)
Sekwencjonowanie DNAGCAT
CGTATACAGTCAGGTC
5’3’ 5’
3’dATP, dTTP, dCTP, dGTP +
ddATP ddGTPddCTPddTTPpolimeraza DNA polimeraza DNApolimeraza DNApolimeraza DNA
GCAT
GCAT
GCAT
A
ATGTCA
ATGTCAGTCCA
GCAT
GCAT
GCAT
AT
ATGT
ATGTCAGT
GCAT
GCAT
GCAT
ATGTC
ATGTCAGTC
ATGTCAGTCC
GCAT
GCAT
GCAT
ATG
ATGTCAG
ATGTCAGTCCG
elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
![Page 15: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/15.jpg)
Sekwencjonowanie DNAddATP ddTTP ddCTP ddGTP
A T C G
GACCTGACTGTA 5’
3’
![Page 16: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/16.jpg)
bufor
Reakcja PCRmieszanina reakcyjna
dNTPstarter1 starter2 polimeraza Taq
dwuniciowa matryca DNA
sekwencja docelowa
![Page 17: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/17.jpg)
Cykl syntezy DNA w reakcji PCR
etap 1 - denaturacja matrycy
etap 2 - przyłączenie starterów
etap 3 - wydłużanie starterów
![Page 18: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/18.jpg)
CYKL 1 denaturacja 94C
jednoniciowa matryca DNA
![Page 19: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/19.jpg)
CYKL 1 przyłączenie startera do matrycy 40-65C
starter 1 starter 2
![Page 20: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/20.jpg)
CYKL 1 wydłużanie startera 72C
starter 1 starter 2
powstają cząsteczkidłuższe od sekwencji docelowej
![Page 21: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/21.jpg)
CYKL 2 denaturacja matrycy 94C
matryca
DNA, który powstał w cyklu 1
![Page 22: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/22.jpg)
CYKL 2 przyłączenie startera do matrycy 40-65C
![Page 23: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/23.jpg)
CYKL 2 wydłużanie starterów 72C
powstają cząsteczkidłuższe od sekwencji
docelowej
powstają cząsteczkio długości sekwencji
docelowej
![Page 24: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/24.jpg)
94°C15s
94°C3 min
65°C15s
72°C30s
tem
pera
tura
czas
15x
72°C30s
4°C
1x 1x
94°C15s
94°C3 min
65°C15s
72°C30s
tem
pera
tura
czas
15x
72°C30s
4°C
1x 1x
Profil termiczny reakcji PCR
cykl podstawowy
cykle dodatkowe
![Page 25: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/25.jpg)
plazmid pUC18/cDNAPPRas2ze wstawką 0,8 kp
mieszanina A: startery A1 i A2
A1 A2
B2B1
0,6 kb
0,35 kb
Część praktyczna
mieszanina B: startery B1 i B2
![Page 26: PODSTAWY BIOCHEMII DLA OCHRONY ŚRODOWISKA](https://reader034.fdocument.pub/reader034/viewer/2022051417/56814d79550346895dbad850/html5/thumbnails/26.jpg)
1 - wzorce wielkości2, 3, 4 - produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii)5 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji A, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu6 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji A, do której nie dodano żadnej matrycy 7 - produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto lizatu bakterii)8 - kontrola pozytywna, czyli produkty reakcji B, w której jako matrycy użyto czystego plazmidu9 - kontrola negatywna, czyli produkty reakcji B, do której nie dodano żadnej matrycy 10 - wzorce wielkości
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1,35 kb1,08 kb0,87 kb
0,6 kb
0,28 kb0,23 kb0,31kb
0,6 kb
0,35 kb
0,19 kb
A B