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Versión 1 21/12/2006 Página 1 de 42

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SISTEMAS SEMIAUTOMÁTICOS DE IDENTIFICACIÓN Y ANTIBIOGRAMA (Galerias API) CONTENIDOS:

0. ÍNDICE DE CONTENIDOS

1. GALERÍAS DE IDENTIFICACIÓN

1.1. Introducción

1.2. API-CORYNE

1.3. API ID 32 GN

1.4. API 20 Strep

1.5. API 20 C AUX

1.6. API 20 A

1.7. API NH

1.8. Neisseria 4H

2. GALERÍAS DE ANTIBIOGRAMA

2.1. Introducción

2.2. ATBTM ANA

3. SISTEMA Mini-API



1. GALERÍAS DE IDENTIFICACIÓN 1.1. Introducción Los sistemas de identificación tipo API están basados en un conjunto de pruebas, bioquímicas y enzimáticas, del que se obtiene un perfil numérico. Dicho perfil al ser introducido en una base de datos ofrece la identificación del microorganismo, informando además del porcentaje de fiabilidad y de las posibles pruebas atípicas o complementarias a la identificación. LECTURA DE LAS GALERÍAS.

a) Manual. La lectura se realiza en función del viraje colorimétrico de las pruebas individuales, según un patrón establecido por el fabricante, o en función de la presencia o ausencia de turbidez debido al crecimiento del microorganismo. Los resultados se interpretan como positivos o negativos y se establece un perfil numérico.

b) Automática. El aparato MiniApi posee un lector capaz de detectar el crecimiento en los pocillos por turbidimetría. La lectura será automática.

IDENTIFICACIÓN EN FUNCIÓN DEL PERFIL DE LA GALERÍA. La interpretación del perfil obtenido puede realizarse de dos formas:

a) Automática. Se introduce en el aparato MiniApi quién, en función de su base de datos, nos ofrece una identificación.

b) Manual. En ausencia del sistema MiniApi, puede recurrirse al libro de códigos específico de cada tipo de galería, el cual nos permite llegar a una identificación según el perfil obtenido.

La lectura de las galerías y la obtención del resultado final puede combinarse de diferentes maneras en los diferentes tipos de galerías: - Lectura manual + Identificación automática : API CORYNE, lectura manual colorimétrica API 20 Strep, lectura manual colorimétrica API 20 A, lectura manual colorimétrica API 20 C AUX, lectura manual por turbidez - Lectura + identificación automáticas: ambos procesos son realizados por el aparato. API 32 GN - Lectura + identificación manuales: API NH Neisseria 4H A continuación se describen los diferentes tipos de galerías y los microorganismos que permiten identificar.

1.2. API CORYNE de Biomerieux API CORYNE SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS CORINEFORMES API CORYNE es un sistema de identificacion en 24 horas de bacterias corineformes aisladas en clínica, mediante tests estandarizados y miniaturizados, unidos a una base de datos especialmente adaptada.



Principio La galería API CORYNE está compuesta por 20 microtubos que contienen substratos deshidratados para el estudio de enzimas o la fermentación de azúcares. Los "test enzimáticos se inoculan con una suspensión densa que rehidrata los substratos enzimáticos. Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen en cambios de coloración espontánea o revelados por la adición de reactivos. Los tests de fermentación se inoculan con un medio enriquecido (conteniendo un indicador de pH) que rehidrata los substratos azucarados. La fermentación de carbohidratos entraña una acidificación que se traduce en un viraje espontáneo del indicador coloreado. Después de la incubación, 24 horas a 35-37ºC,la lectura de las reacciones se realiza visualmente con la tabla de lectura e identificación obtenida con la ayuda del programa ATB Plus, del Catálogo Analítlco API CORYNE o de la Tabla de Identificación. La caja API CORYNE permite realizar 12 tests. Se compone de : - 12 galerías API CORYNE - 12 ampollas de Suspension Medium, 3 ml - 12 ampollas de GP Medium - 1 ampolla McFartand Standard, punta 6 - 12 cámaras de incubación - 12 hojas de resultados - 1 ficha técnica Para utilizar API CORYNE, es necesario disponer de : - Reactivos NIT 1 y NIT 2, ZYM A y ZYM B , PYZ - Agua oxigenada (3 %) - Aceitee de parafina - Pipetas - Escobillones estériles - Catálogo Analítico API CORYNE o programa ATB Plus EI material de laboratorio siguiente : - Estufa a 37ºC, nevera, mechero Bunsen, rotulador. Conservación Las galerías y medios se conservan a 2-8°C hasta la fecha de caducidad indicada en el envase. Los reactivos se conservan igualmente a 2-8°C, excepto ZYM A, que se conserva a 28-30ºC (a 2-8°C, ZYM A produce un precipitado que no altera las propiedades y desaparece a 60ºC). EI reactivo ZYM B es sensible a la luz; envolver el frasco en papel aluminio. EI reactivo PYZ es muy sensible al aire; transferirlo al frasco cuentagotas y conservarlo siempre bien cerrado.

Composición de medios y reactivos Suspensión Medium Agua destilada estéril Cistina Triptona Cloruro sódico Sulfito sódico



Rojo fenol Agua destilada pH = 7,8 Reactivo NIT 1 Acido sulfanilico Acido acetico 5N Reactivo NIT 2 N-N-Dimetil-1-naftilamina Acido acetico 5N Reactivo ZYM A Tri-hidroxi-metil-amino-metano Acido clorhídrico (37%) Lauril sulfato Agua destilada Reactivo ZYM B Fast Blue BB 2-metoxi-etanol Reactivo PYZ FeCI2 Conservador Solvente organico Técnlca 1. Selecclon de colonlas:

- Aislar y verificar Ia pertenencia de la cepa al grupo de bacilos Grampositivos, no esporulados, aero-anaerobios facultativos. - Anotar.el tipo de hemollsis. - Tomar una colonia bien aislada y realizar un subcultivo en una placa de Columbia con sangre de cordero o bien realizar una suspensión bacteriana emulsionando una colonia en 3 ml de agua destilada y seguidamente inundar una placa de Columbia con sangre de cordero. - Incubar la placa 24 horas a 35-37ºC. 2. Preparaclón de la galería - Preparar una cámara de incubación (fondo y tapa). - Anotar Ia referencia de la cepa en la lengueta lateral. - Repartir aproximadamente 5 ml de agua en los alveolos del fondo. 3. Preparación del lnóculo - Abrir una ampolla de Suspension Medium. - Con la ayuda de un escobillón estéril, tomar todo el cultivo y realizar una suspensión bacteriana con una turbidez igual al punto 6 de la escala McFarland, comparando dicha suspensión con el patrón de turbidez que se incluye en la caja. 4. Inoculaclón de la galería - Once primeros tests de la galería (NIT a GEL) : repartir la suspensión anterior, evitando la formación de burbujas (incllnar la cámara de incubación hacia delante) : - Para los tests NIT a ESC, depositar 150 µl en cada cúpula (3 gotas de pipeta Pasteur). . Para el test, lIenar únicamente la parte del tubo. Para el test GEL llenar el tubo y la cúpula. - Nueve últimos tests de la galería ( a GLYG) :



. Traspasar aproximadamente 0,5 ml de la suspensión anterior a una ampolla de GP Medium. Homogeneizar muy bien. . Repartir esta nueva suspensión únicamente en los tubos. - Recubrir los tests subrayados con aceite de parafina, formando un menisco Iigeramente convexo (URE. o a GLYG). - Tapar la cámara de jncubación. - Incubar 24 horas a 35-37°C. 5. Lectura de la galería

- Añadir los reactivos : . test NIT : 1 gota de NIT 1 Y NIT 2 . test pyz : 1 gota de PYZ test PyrA, PAL, B GUR, B GAL, '" GLU, B NAG: 1 gota de ZYM A Y ZYM B. Esperar 10 minutos, después, leer las reacciones con la ayuda de la tabla de lectura. Si fuera necesario, exponer la galería a una lámpara (1000 W) 10 segundos para decolorar el reactivo en exceso de los títulos PyrA a βNAG.

- Realizar el test CATalasa (utilizarlo como test 21): añadir una gota de agua oxigenada al 3% en el test ESC o GEL. Esperar 1 minuto. La aparición de burbujas corresponderá a una reacción positiva.

- Anotar las reacciones en la hoja de resultados. 6. Interpretación La identificación puede obtenerse : - con el programa ATS Plus o el Catalogo Analítlco API CORYNE. Para ello, codificar las reacciones obtenidas en un perfil numérico: en la hoja de resultados, los tests están separados en grupos de tres y un valor 1, 2 o 4 está indicado para cada uno. Sumando en cada grupo los valores correspondientes a las reacciones positivas, se obtiene un perfil numérico de 7 cifras. - con la Tabla de Identiflcaclón : comparar las reacciones anotadas en la hoja de resultados con las de la tabla.

4212720 ActInomyces pyogenes

7. Elimlnaclón del material utlllzado Después de su utilización, ampollas, pipetas y galerías, deben ser incineradas o decontaminadas por autoclavado o inmersión en agua de lejia. Limltaclones EI sistema API CORYNE es un método destinado a la identificación de bacterias corineformes (género Corynebacterium y géneros próximos) aislados en afecciones humanas y veterinarias. La interpretación de los resultados de la galería, debe ser realizada por un analista y deberá tener en cuenta el origen de la muestra, los aspectos micro y macroscópicos y el contexto clínico.



1.3. API ID 32 GN ID 32 GN Sistema automático de identificaión para bacilos Gram negativos INTRODUCCIÓN Y OBJETO DEL ENSAYO La galería 10 32 GN es un sistema estandarizado para la identificación automática de los bacilos Gram negativos, que esta compuesta por 32 ensayos de asimilación miniaturizados, así como una base de datos. La lista completa de las bacterias que se pueden identificar por este sistema está indicada en la tabla de



porcentajes de positividad al final de esta ficha técnica. Esta galeria se utiliza exclusivamente con Ios instrumentos ATB ExpressiónTM o mini API. PRINCIPIO La galeria 10 32 GN incluye 32 cúpulas que contiene cada una un substrato carbonado en forma deshidratada. La bacteria a detectar se pone en suspensión en un media semi-sóIido. Después de 24-48 horas de incubación, el crecimiento en cada cúpula se detecta por un lector automático; la identificación se obltene mediante los instrumentos ATB ExpressiónTM o mini API.

PRESENTACIÓN (envase de 25 ensayos): - 25 galerias ID 32 GN - 25 tapas de incubación - 25 ampollas de API AUX Medium .-1 ficha técnica COMPOSICIÓN Galería La composición de la galería ID 32 GN puede verse en la relación de ensayos a continuación:

- Los números indicados son los que figuran en la galería. - Se pueden ajustar las cantidades indicadas en función de los títulos de las materias primas . - Ciertas cúpulas contienen hemina de origen animal Medio API AUX Medium 7ml Sulfato amónico 2.0 g Fosfato monosódico 6.24 9 Cloruro potásico 1.5 g Agar 1.5 g Solución de vitaminas 10.5 ml



Solución de oligoelementos 10.0 ml Agua desmineralizada csp 1000 ml pH: 7.0-7.2 a 20-25°C

- A pesar de que contenga agar, el medlo APIC AUX Medium no neceslta fusión previa y se pipetea igual que cualquier medio líquido. Con el fin de Ilevar los medios a temperatura ambiente, es preferible sacar las ampollas de la nevera unas horas antes de su utilizaci6n. No agltar. - Se pueden ajustar las cantidades Indicadas en función de los títulos de las materias primas. REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Reactivos e instrumentos : - API8 NaCI 0.85 % Medium. 2 ml (ref. 20 070) - DENSIMAT (ref. 99234) 0 Densitómetro ATB - Instrumentos ATB ExpressionTM o mini API (consultar con bioMerieux) . Pipeta Electronica ATB (consultar con bioMeneux) o Inoculador ATB y Embudos (ref. 15710)

Material: - Pipetas o PSlpettes - Gradilla para ampollas - Protege-ampollas - Caja hermética - Equipo general de laboratorio de bacteriología PRECAUCIONES DE UTILlZACIÓN . Para diagnóstico in vitro y control microbiológico. . Exclusivamente para uso profesional. . Este envase contiene compuestos de origen animal. La falta de control sobre el origen y/o el estado sanitario de los animales, no nos permite garantizar de forma absoluta que estos productos no contengan algún agente patógeno transmisible, por lo que se recomienda manipularlos mediante las precauciones de utilización relativas a los productos potencialmente infecciosos (no ingerir, ni inhalar).

. Todas las muestras, cultivos baclerianos y productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecilosos y deben ser manipulados de modo apropiado. Durante toda la

manipulación, deben respetarse las normas de asepsia y tomar las precauciones habituales de manipulación para el grupo de bacterias estudiadas. Para información complementaria sobre las precauciones de manipulación. . No emplear los reactivos después de su fecha de caducidad. . Antes de su utilización, verificar la integridad del envase y de sus componentes . No utilizar galerías que hayan sufrido una alteración fisica: cúpula deformada, bolsita de deshidrante abierta… .Abrir las ampollas con delicadeza del modo siguiente. - Introducir la ampolla en el protege-ampollas - Sujetar verticalmente el conjunto en una

- Presionar a fondo el tapón - Cubrir la parte inclinada del tapón con la primera falange del dedo pulgar - Presionar con el pulgar sabre la base de la parte inclinada del tapón, con un movimiento hacia el exterior, de forma que se rompa el extremo de Ia ampolla en el Interior del tapón. - Retirar la ampolla del protege-ampollas y conservarlo para un próximo uso.



- Retirar el tapón con delicadeza. . Las prestaciones indicadas han sido obtenidas mediante la metodología expresada en la presente ficha técnica. T oda desviación de dicha metodología puede alterar los resultados.

. La interpretación de los resultados del test debe ser realizada teniendo en cuenta un contexto clínico o de otro tipo., el origen de las muestras, los aspectos macro y microscópicos de la colonla y, eventualmente, los resultados de otros ensayos, particularmente del antiblograma.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Las galerlas y los medios se conservan a 2-8ºC hasta la fecha límite de utilización indicada en el envase. MUESTRAS (TOMA Y PREPARACIÓN) La galería 10 32 GN no debe ser utilizada directamente a partir de muestras de origen clínico o de otro tipo. En una primera fase, los microorganismos a identificar deben aislarse sobre un medio de cultivo adecuado según las técnicas usuales en bacteriología. MODO DE EMPLEO Preparación de la galería . Sacar la galerla de su embalaje . Tirar la bolsa de deshidratante . Colocar la tapa . Anotar la referencia de las cepas en la lengüeta lateral de Ia galería. (NO anotar Ia referencia sobre la tapa, ya que esta puede extraviarse durante la manipulación). Preparaclón del lnóculo . Abrir una ampolla de API NaCI 0.85% Medium (2 ml) tal y como se indica en el párrafo “Precauciones de utilización”. No utilizar un tubo que contenga 2 ml de la misma solución, sin aditivo . Tomar 1 o varias colonias idénticas del medio de cultivo Utillzar preferentemente cultivos jóvenes (18-24 horas) . Preparar una suspensión de turbidez igual al patrón 05 de McFarland: medir con la ayuda del Densitómetro ATB o el DENSIMAT . Abrir una ampolla de API AUX Medium como se indica en el párrafo “Precaucjones de utilización” y transferir 200 µI de la suspensión precedente. Esta suspensión debe ser utilizada de inmediato. Inoculaclón de la galería . Inoculación AUTOMATICA: - Depositar en el porta-galerias del Inoculador ATB la galería, la ampolla de API- AUX Medium

inoculada y la Boquilla - EI inoculador realizará automáticamente la homogeneización de la ampolla y el rellenado de las cupulas (135 µL/cúpula). . Inoculación MANUAL

- Homogeneizar la ampolla de API AUX Medium sembrada e inocular la galería distribuyendo 135 µL de suspensión por cúpula mediante la Pipeta Electrónica AT8. - Poner la tapa sobre la galería. - Incubar a 29ºC +/-2ºC durante 24 horas +/- 2 horas) NOTA: Ciertas estufas ventiladas provocan una deshidratación importante del medio en las cúpulas. En este caso, colocar Ia galería en una caja hermética que contenga un pequeño volúmen de agua en un recipiente, de forma que cree una atmósfera húmeda, evitando así el secado de los test.



LECTURA E INTERPRETACION La lectura e interpretación deban realizarse mediante los instrumentos ATB Expression TM 0 minI API- que incluyen la base de datos (V3.0). EI lector busca en cada cúpula la presencia de un crecimiento detectable y transmite los datos al ordenador. Se interpreta en forma de un perfil numérico de 11 cifras y después nos indica la identificación de Ia cepa a investlgar. Reincubación Es necesaria una reincubación de 24 horas en los casos siguientes . - discriminación débil - perfil inaceptable o perfil dudoso . - si, para el perfil obtenido, se indicase Ia siguiente nota : IDENTIFICACIÓN NO VALIDA ANTES DE 48 H DE INCUBACIÓN

1.4. API 20 Strep de Biomerieux API 20 Strep Sistema de Identificación de !os Streptococcaceae y otro gérmenes emparentados INTRODUCCIÓN Y OBJETO DEL ENSAYO La galería API 20 Strep es un sistema estandarizado que asocia 20 ensayos bioquímicos de un gran poder discriminante. Permite realizar un diagnóstico de grupo o por especie de la mayoría de los estreptococos, enterococos, y para los gérmenes emparentados más corrientes. La lista complete de las bacterias que as posible identificar con este sistema se puede ver en Ia Tabla de Identificación aI final de la ficha técnica. PRINCIPIO La galería API 20 Strep se compone de 20 microtubos que contienen los substratos deshidratados para la detección de actividades enzimáticas o de fermentación de azúcares. Los ensayos enzimáticos se inoculan con una suspensión densa realizada a partir de un cultivo puro que reconstituye los medios. Las reacciones que se producen durante el periodo de incubación se traducen en variaciones de coloración, espontáneas o reveladas mediante Ia adición de reactivos. Los ensayos de fermentación se inoculan con un medio enriquecido (que contiene un indicador de pH), que rehidrata los azúcares. La fermentación de los hidratos de carbono trae consigo una acidificación que se traduce en la modificaci6n espontánea del indicador de color. La lectura de estas reacciones se lIeva a cabo utilizando la Tabla de lectura, y la identificación se obtiene con la ayuda del Catálogo Analítico o del software de identificación. PRESENTACIÓN (Envase de 25 ensayos) - 25 galerías API 20 Strep - 25 cámaras de incubación - 25 ampollas de API GP Medium - 25 hojas de resultados - 1 ficha técnica COMPOSICIÓN Galería La composición de la galería API 20 Strep puede verse en la Tabla de Identificación de la ficha técnica. Medio API GP Medium



L-cistina Triptona (origen bovino/porcino) Cloruro sódico Sulfito sódico Rojo de fenol Agua desmineralizada pH: 7,4 - 7,6 Las cantidades Indicadas pueden ajustarse en función de los títulos de las materias primas. REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Reactivos: - API Suspension Medium 2 ml (ref. 70 700) - Reactivos: NIN (ref. 70490) VP 1 + VP 2 (ref. 70422) ZVM A + ZVM B (ref. 70472) - Acelte de parafina (ref. 70 100) - McFarland Standard (ref. 70 9CK)) punto 4 0 - Catálogo Analítico API 20 STREP (ref. 20 690) o Software de Identificación - Agar Columbia con sangre (ref. 43 041) - Caldo Schaedler (eventualmente) Material: - Escobillones - Pipetas - Gradillas para ampollas - Protege-ampollas - Jarra de anaerobiosis - Equipo general de laboratorio de bacteriología PRECAUCIONES DE UTlLlZACIÓN . Para diagnóstico In vitro y control microbiológico. . Exclusivamente para uso profesional. . Este envase contiene compuestos de origen animal, la fecha de control sobre el origen y/o el estado sanitario de los animales, no nos permite garantizar de forma absoluta que estos productos no contengan algún agente patógeno transmisible, por lo que se recomienda manipularlos mediante las precauciones de utilización relativas a los productos potencialmente infecciosos: (no ingerir, ni inhalar).

. Todas las muestras, cultivos bacterianos y productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecciosos y ser manipulados de manera apropiada por personal competente. Durante toda la manipulación, deben respetarse las normas de asepsia y tomar las precauciones habituales de manipulación para el grupo de bacterias estudiadas; consultar: (NCCLS M29-A, Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue: Approved Guideline - Revisi6n en vigor). Para información complementaria sobre las precauciones de manipulación, consultar. "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC última edición." o la reglamentación vigente en el país de utilización. . No emplear los reactivos después de su fecha de caducidad. . Antes de su utilización, verificar la integridad del envase y de sus componentes. . No utilizar galerías que hayan sufrido una alteración física: cúpula deformada, bolsa del deshidratante



abierta, .... . Abrir las ampollas con cuidado del modo siguiente: - Introducir la ampolla en el protege ampollas. - Sujetar vertical mente el conjunto en una mano (tapón blanco hacia arriba). - Presionar a fondo el tapón. . Coger la parte inclinada del tapón con la primera falange del dedo pulgar. . Presionar con el pulgar sobre la base de la parte inclinada del tapón, con un movimiento hacia el exterior, de forma que se rompa el extremo de la ampolla en el interior del tapón -Retirar Ia ampolla del protege-ampollas y conservarlo para un próximo uso. - Retirar eI tapón con cuidado.

. Las prestaciones indicadas han sido obtenidas mediante Ia metodología expresada en la ficha técnica. Toda desviación de dicha metodología puede alterar los resultados.

. La interpretación de Ios resultados del ensayo debe ser realizada teniendo en cuenta un contexto clínico ó de otro tipo, el origen de las muestras, los aspectos macro y microscópicos de la cepa y, eventualmente, los resultados de otros ensayos, particularmente del antibiograma. CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Las galerías y !os medios se conservan a 2-8ºC hasta Ia fecha limite de utilización indicada en el envase. MUESTRAS (RECOGIDA Y PREPARACIÓN) La galería API 20 Strep no debe ser utilizada directamente a partir de muestras de origen clínico o de otro tipo. En una primera fase, los microorganismos a identificar deben aislarse sobre un medio de cultivo adaptado según las técnicas usuales en bacteriología. MODO DE EMPLEO Selección de las colonias Después de aistla y verificar la pertenencia de la cepa a identificar al género Streptococcaceae (reacción de Gram, catalasa): . Anotar el tipo de hemólisis en la hoja de resultados (ensayo nº 21). . Tomar una colonia bien aislada (Nota 1) y disolverla en suspensl6n en 0.3 ml de agua estéril. Homogeneizar bien.

. Inundar una placa de agar Columbia con sangre de cordero (Nota 2) con esta suspensión (o distribuirlo mediante un escobillón estéril sobre toda la superficie del agar). . Incubar la place 24 horas a 36ºC en anaerobiosis. NOTA 1: Los Estreptococos B--hemolíticos y los Enterococos generan colonias de tamaño suficiente después de 24 horas de incubación. Para los otros Estreptococos, es preferible utilizar colonias a las 48 horas de incubación. Para las cepas de cultivo difícil (colonias extremadamente pequeñas a las 48 horas), se recomienda operar como sigue: - Cultivar Ia coIonia en 1 ml de caldo de Schaedler a 36ºC durante 5 horas. - Inundar una placa de agar Columbia con sangre de cordero con la totalidad de este cultivo inicial en caldo. Eliminar el excedente. - Incubar la placa durante 18-24 horas a 36ºC en anaerobiosis. NOTA 2: Para obtener una cantidad suficiente, es preferible preparar 2 placas cuando la cepa sea susceptible de ser un pneumococo. Preparación de la galería . Reunir fondo y tapa de una cámara de incubación y repartir aproximadamente 5 ml de agua destilada o



desmineralizada [o cualquier agua sin aditivos ni derivados susceptibles a liberar gases en los alveólos para crear una atmósfera húmeda.

. Inscribir la referencia de las cepas en la lengueta lateral de la cámara. (No transcribir la referencia sobre la tapa, ya que esta puede extraviarse durante Ia manipulación). . Sacar una galería de su envase individual. . Colocar Ia galería n Ia cámara de incubación. Preparación del lnóculo . Abrir una ampolla de API Suspension Medium (2 ml) como se indica en el párrafo "Precauciones de utilización" o bien utilizar un tubo que contenga 2 ml de agua destilada sin aditivo. . Con la ayuda de un escobillón, retirar todo el cultivo previamente preparado. . Realizar una suspensión muy densa: turbidez superior a 4 de McFartand. Esta suspensión debe ser utillizada de inmnediato después de su preparación. Inoculaclón de Ia galería . En Ia primera mitad de la galería (desde el ensayo VP al ADH), repartir la suspensión anterior, evitando la formación de burbujas (para ello inclinar la cámara de incubación hacia adelante y colocar la punta de la pipeta sobre el lateral de la cúpula): .-para los ensayos desde VP al LAP: agregar aproximadamente 100 µL en cada cúpula. .- para el ensayo ADH.: lIenar únicamente el tubo. . En la segunda mitad de la galería (desde el ensayo RIB al GLYG , abrir una ampolla de API GP Medium como se indica en el párrafo “Precauciones de utilización”. y transferir allí el resto de la suspensión, es decir, aproximadamente 0,5 ml como mínimo. Homogeneizar bien. Repartir esta nueva suspensión sólo en los tubos.

. Llenar las cúpulas de las pruebas subrayadas desde la ADH a la GLYG con aceite de parafina, provocando un menisco convexo. . Volver a cerrar Ia cámara de incubación. . Incubar a 36ºC en aerobiosis durante 4 - 4,5 horas para una primera lectura y 24 horas si fuera necesario para una segunda lectura. LECTURA E INTERPRETACIÓN Lectura de la galería Despues de 4 horas de incubación: . Añadir los reactivos: - ensayo VP: 1 gota de VP 1 Y VP 2 - ensayo HIP: 2 gotas de NIN - ensayos PYRA, aGAL, βGUR, βGAL, PAL y LAP: una gota de ZVM A Y ZVM B.

. Esperer 10 minutos pare leer todas las reacciones, remitiéndose a la Tabla de Identificación. Si es necesario, exponer la galería a una lámpara de luz intensa (1000 W) 10 segundos para eliminar eI exceso de reactivo de los tubos desde el PYRA al LAP.

Es necesario una reincubación cuando: - eI perfil no se encuentra en el Catálogo Analítico API 20 STREP - si se obtiene la nota siguiente para el perfil obtenido:

IDENTIFICACION NO VALIDA ANTES DE 24 HORAS DE INCUBACION

En este caso, volver a leer después de 24 horas las reacciones ESC, ADH y desde el RIB al GLYG, sin releer las reacciones enzimáticas (HIP, PYRA, aGAL, BGUR,



BGAL, PAL, LAP) Y VP. Anotar todas las reacciones en la hoja de resultados. Interpretaclón La Identificación se obtiene a partir del perfil numérico: . Determinación del perfil numérico En la hoja de resultados, los ensayos se separan en grupos de 3 y se aslgna para cada uno un valor 1, 2 ó 4. Sumando en el interior de cada grupo los números que corresponden a reacciones positivas, se obtienen 7 cifras que constituyen el perfil numérico.

Identificación: Se realiza a partir de Ia base de datos (V6.0): - con la ayuda del Catálogo Analítico: Localizar el perfil numérico en la lista de los perfiles. - Por medio del software de identificación: Introducir manualmente por teclado el perfil numérico de 7 cifras. NOTA: la reacci6n hemolítica constituye el ensayo nº 21; la B-hamólisis se considera como positiva y su valor numérico es 4. Cualquier otra reacción hemolítica se considera como negativa y su valor numerico es 0. Sin embargo estos caracteres tienen un valor indicativo para la Identificación de ciertas especies. LIMITES DEL ENSAYO . EI sistema API 20 Strep está destinado a la identificación de las especies presentes en Ia base de datos (ver Tabla de Identificación al final de la ficha ténica), y sólo a ellas. No puede utilizarse para tdentificar otros microorganismos ni para excluir su presencia. . Sólo se deben utilizar cultivos puros que conteogan un sólo tipo de microorganismo. ELiMINACIÓN DE LOS RESÍDUOS Eliminar los reactivos utilizados o no utilizados, así como los materiales de un solo uso contaminados siguiendo !os procedimientos relacionados con los productos infecciosos o potencialmente infecciosos. Es responsabilidad de cada laboratorio la gestión de los desechos y efluentes que produce. según su naturaleza y peligrosidad, garantizando (o hacienda garantizar) su tratamiento y eliminación según las reglamentaciones aplicables.

1.5. API 20 AUX de Biomerieux API 20 C AUX Sistema de identificación de levaduras

INTRODUCCIÓN Y OBJETO DEL ENSAYO La galería API 20 C AUX es un sistema para la identificación precisa de las levaduras que se encuentran más frecuentemente. La lista completa de las especies identificables por el sistema están indicadas en la Tabla de Identificación al final da la ficha técnica. PRINCIPIO La galería API 20 C AUX esta constituida por 20 cúpulas que contienen substratos deshidratados y permiten efectuar 19 ensayos de asimilación. Las cúpulas se inoculan con un medio mínimo semi-agar y las levaduras crecen solamente si son capaces de utilizar el substrato correspondiente. La lectura de estas reacciones se realiza por comparación con los testigos de crecimiento y la



identificación se obtiene con la ayuda del Catalogo Analítico o del software de identificación. PRESENTACIÓN (caja de 25 tests) - 25 galerías API 20 C AUX - 25 cámaras de incubación - 25 ampolias de API C Médium - 25 hojas de resultados - 1 ficha técnica COMPOSICIÓN Galería La composición de la galería API 20 C AUX puede verse en la lista de ensayos que se detalla en la ficha técnica. Medio Sulfato amónico Fosfato monopotásico Fosfatodipotásico Fosfato disódico Cloruro Sódico Cloruro cálcico Sulfato magnésico L.Histidina L.Triptófano L-Metionina Agar SoIuciçón de vitaminas SoIución de oIigo-elementos Agua desmineralizada pH final ; 6,4-6.8 (a 2O-25ºC) A pesar de contener agar, no es necesario fundir previamente el API C Médium, ya que se pipetea con la misma facilidad que cualquier medio líquido. Con el fin de lIevar los medios a la temperatura ambiente, es preferible sacar las ampollas del refrigerador algunas horas antes de su utilización. No agitar. REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Reactivos: API Suspensión Medium, 2 ml o API NaCI 0,85 % Medium, 2 ml Sabouraud Medium McFarland Standard, punto 2 Catálogo Analítico API 20 C AUX o Software de identificación

RAT Medium [Riz Agar Tween] Material:

Pipetas



Gradillas para ampollas Protege-ampollas Equipo general de laboratorio de bacteriología PRECAUCIONES DE UTILIZACIÓN . Para diagnóstico In vitro y control microbiológico. Exclusivamente para uso profesional. . Todas las muestras, cultivos de levaduras y productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecciosos y ser manipulados de manera apropiada.;Durante toda la manipulación,deben respetarse las normas de asepsia y tomar las precauciones habituales de manipulación para el grupo de bacterias estudiadas; consultar: (NCCLS M29-A, Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue; Approved Guideline December 1997). Para información complementaria sobre las precauciones de manipulación, consultar: "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication No. (COG) 93~8395, 3rd Edition (May 1993}," o la reglamentación vigente en al país de utilización. . No emplear los reactivos después de su fecha de caducidad. . Antes de su utilización, verificar la integridad del envase y de sus componentes. . No utilizar galerías que hayan sufrido una alteración física: cúpula deformada, ... . Abrir las ampollas con delicadeza del modo siguiente: - Introducir Ia ampolla en el protege-ampollas. - Sujetar verticalmente el conjunto en una mano (tapón blanco hacia arriba). - Presionar a fondo el tapón blanco. - Cubrir la parte inclinada del tapón con la primera falange del dedo pulgar. - Presionar con el pulgar sobre la base de la parte inclinada del tapón, con un movimiento hacia el exterior, de forma que se rompa el extremo de Ia ampolla en eI interior del tapón. - Retirar la ampolla del protege-ampollas y conservarlo para un próximo uso. - Retirar delicadamente el tapón.

. Los resultados presentados han sido obtenidos mediante la metodología indicada en la ficha técnlca. Toda desvlaclón de la metodología puede alterar los resultados. . La interprelación de los resultados del test debe ser realizada teniendo en cuenta un contexto clínico o de otro tipo (eI origen de las muestras, los aspectos macro y microscópicos de la colonia y, eventualmente, los resultados de otros tests, especialmente del antifungigrama).

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Las galerías y los medios se conservan a 2-8°C hasta la facha limite de utilizacón ndicada en el envase. MUESTRAS (RECOGIDA Y PREPARACIÓN) EI API 20 C AUX no debe ser utilizado directamente a partir de muestras de origen clínico o de otro tipo. Los microorganismos a identificar debe aislarse en una primera fase sobre un media de cultivo apropiado según las técnicas usuales de bacteriología. MODO DE EMPLEO Preparación de la galería . Reunir fondo y tapa de una cámara de Incubación y repartir aproximadamente 5 ml de agua destilada o desmineralizada (o cualquler agua sin aditivos ni derivados susceptibles de liberar gases] en los alveolos para crear una atmósfera húmeda.



. Inscribir la referencia de Ia cepa en Ia lengueta lateral de la cámara. (No inscribir Ia referencia sobre la tapa, ya que esta puede resultar desplazada durante Ia manlpulación). . Retirar la galería de su envase individual y depositarla en la cámara de incubaclón. Preparaclón del lnúculo . Abrir una ampolla de API Suspension Medium (2 ml) o una ampolla de API NaCI 0.85% Medium (2 ml) como se indica en el párrafo “Precauciones de utilización” de Ia ficha técca, o utilizar un tubo que contenga 2 ml de la misma soIución sin aditivo.

. Con Ia ayuda de una pipeta, extraer una fracción de coIonia por aspiración o por toques sucesivos. Utilizar preferentemente cultivos jóvenes (18-24 horas).

. Realizar una suspensión de levaduras de turbidez igual a la del patrón 2 de McFarland. Esta suspensión debe ser utilizada inmediatamente después de su preparación.

. Abrir una ampolla de API C Medium tal y como se indica en el párrafo “Precauciones de utilización” y transferir a él 100 µI de la suspensión anterior. Homogeneizar con Ia pipeta evitando la formación de burbujas.

Inoculación de la galería . lIenar las cUpulas con la suspensión obtenida en el API C Medium. Evitar la formación de burbujas colocando la punta de la pipeta sobre la zona lateral de la cúpula. Cuidar que se cree un nivel horizontal o ligeramente convexo pero jamás cóncavo. Las cúpulas parcial o excesivamente lIenas son causa de resultados incorrectos. . Volver a cerrar Ia cámara de Incubadón e incubar 48-72 horas (+/- 6 horas) a 29ºC +/- 2ºC. LECTURA E INTERPRETACIÓN Lectura de Ia galería Después de 48 horas de incubación, o de 72 horas (si los ensayos, en particular la glucosa no resultan muy claros después de 48 horas), observar el crecimiento de las levaduras comparativamente con la cúpula 0, testigo negativo. Una cúpula con mayor turbidez que la de control nos indica una reacción positiva que ha de ser anotada en Ia hoja de resultados. Con el fin de evitar toda contaminación durante una reincubación, levantar Ia tapa exclusivamente durante el periodo de lectura. Ensayo Morfológico Determinar la presencia de hifas (micelio) o de pseudohifas (pseudomicelio) con la ayuda del medio RAT (Riz Agar Tween]. Depositar una gota de la suspensión de levaduras sobre el medio RAT, o seguir las recomendaciones del fabricante. Este ensayo constituye el nº 21 de la galería. Se considera positivo en caso de evidencia de la presencia de hifas o de pseudohifas. Interpretación La identificación se obtiene a partir del perfil numérico. Determinación del perfil numérico: En la hoja de resultados, los tests están separados en grupos de tres y se asigna para cada uno un valor 1, 2 ó 4, Sumando al interior de cada grupo los números que corresponden a reacciones positivas, se obtienen 7 cifras que constituyen el perfil numérico.

Identificación: Se realiza a partir de Ia base de datos (V 3.0). - Con la ayuda del Catálogo Analítico Localizer el perfil numérico en Ia lista de los perfiles.



- Por medio del software de identificación -Introducir manualmente por teclado el perfil numérico de 7 cifras.

2764 774 Trichosporon asahii LiMITES DEL ENSAYO EI sistema API 20 C AUX está destinado a la identificación de las levaduras presentes en Ia base de datos (ver Tabla de Identificación al final de Ia ficha técnica) y exclusivamente a ellas. No puede utilizarse para identifiesr otros microorganlsmos nl para exduir su presencia. SóIo se debe utilizar los cultivos puros que contengan un sólo tipo de microorganismo. ELIMINACIÓN DE LOS RESIDUOS Es responsabilidad de cada laboratorio la gestión de Ios resíduos y efluentes que produce, según su naturaleza y peligrosidad, garantizando (o haciendo garantizar) su tratamiento y eliminación según las reglamentaciones aplicables.

1.6. API 20 A de Biomerieux API 20 A Sistema de identificación de bacterias anaerobias INTRODUCCIÓN Y OBJETO DEL ENSAYO EI sistema API 20 A permite estudiar rápida y fácilmente 21 caracteres destinados a la identificación bioquímica de las bacterias anaerobias. Otros caracteres, tales como el crecimiento en agar en profundidad, aspecto de las colonias, morfología celular y coloración Gram, deben ser determinados e integrados en la metodología que se emplea para una completa identificación. La lista completa de las bacterias que es posible identificar por el sistema esta indicada en la Tabla de Identificación al final de la ficha técnica. PRINCIPIO La galería API 20 A incluye 20 microtubos que contienen substratos deshidratados. Los microtubos se inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye los medios. Las reacciones que se producen durante la incubación se traducen en cambios de color, bien espontáneos o bien provocados mediante la adición de reactivos. La interpretación de estas reacciones se realiza con la ayuda de la Tabla de Identificación, y el reconocimiento se consigue mediante un software de identificación.

PRESENTACIÓN (caja de 25 tests) - 25 galerías API 20 A - 25 cámaras de incubación - 25 ampollas de API 20 A Medium - 25 hojas de resultados - 1 ficha técnica



COMPOSICIÓN Galería La composición de la galería API 20 A puede verse en la Tabla de identificación de la ficha técnica. Medio API 20 A Medium 4ml Tripticasa Extracto de levadura Cloruro sódico L-triptófano L-cistina Hemina (origen porcino) Vitamina K1 Sulfito sódico Agua desmineralizada pH 6,9-7,3

REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Reactivos: - Aceite de parafina (ref. 70 100) - Reactivos: BCP (ref. 70 510) EHR (ref. 70 520) XYL (ref. 70 530) - McFarland Standard (ref. 70 900) - Catálogo Analítico API 20 A (ref. 20 390) o Software de Identlficación - Agua oxigenada sol. al 3% de concentración

Material: Escobillones Plpetas Sistema generador de anaerobiosis Gradillas para ampollas Protege-ampollas Equipo general de laboratorio de bacteriología incluyendo lámpara UV (365 nm) PRECAUCIONES DE UTILIZACIÓN . Para diagnóstico in vitro y control microblológico. . Exclusivamente para uso profesional. . Este envase contiene compuestos de origen animal. La falta de control sobre el origen y/o el estado sanitario de los animales, no permite garantizar de forma absoluta que estos productos no contengan algún agente patógeno transmisible, por lo que se recomienda manipularlos mediante las precauciones de utilización relativas a los productos potencialmente infecciosos: (no ingerir, ni inhalar).

. Todas las muestras, cultivos bacterianos y productos Inoculados deben ser considerados como potencial mente infecciosos y ser manipulados de manera apropiada. Durante toda la manlpulaclón, deben respetarse las normas de asepsia y tomar las precauciones habituales de manipulación para el grupo de bacterias estudiadas; consultar: (NCCLS M29-A, Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmined by Blood, Body Fluids, and Tissue; Approved Guideline -December 1997). Para información complementaria sobre las precauciones de manipulación, consultar: "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication No. (CDG) 93-8395. 3rd Edition (May 1993),o la reglamentación vigente en el país de utillzación.



. No emplear los reactivos después de su fecha de caducidad.

. Antes de su utilización, verificar la integridad del envase y de sus componentes.

. No utilizar galerías que hayan sufrido una alteración físlca: cúpula deformada. ....

. Abrir las amplilas con cuidado del modo siguiente: . Introducir la ampolla en el protege-ampollas.

Sujetar verticalmente el conjunto en una mano (tapón blanco hacia arriba). Presionar a fondo el tapón. Cubrir la parte inclinada del tapón con la primera falange del dedo pulgar. Presionar con el pulgar sobre la base de la parte inclinada del tapón, con un movimiento hacia el exterior, de forma que se rompa el extremo de la ampolla en el interior del tapón. Retirar la ampolla del protege-ampollas y conservarlo para un próximo uso. Retirar el tapón con delicadeza.

. Las prestaciones indicadas han sido obtenidas mediante la metodología expresada en la ficha técnica. Toda desviación de dicha metodología puede alterar los resultados.

. La interpretación de los resultados del test debe ser realizada teniendo en cuenta un contexto clínico o de otro tipo, el origen de las muestras, los aspectos macro y microscópicos de la colonia y, eventualmente, los resultados de otros tests, particularmente del antibiograma.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Las galerías y los medios se conservan a 2-4ºC hasta la fecha limite de utilizaclón indicada en el envase.Ó MUESTRAS (RECOGIDA Y PREPARACI6N) La galería API 20 A no debe ser utilizada directamente a partir de muestras de origen clínico o de otro tipo. En una primera fase, los microorganismos a identificar deben aislarse en una primera fase sobre un medio de cultivo apropiado, según las técnicas usuales en bacteriología. MODO DE EMPLEO Preparaclón del inóculo . Abrir una ampolla de API 20 A Medium como se indica en el párrafo "Precauciones de utilización”..

. Con la ayuda de un escobillón, extraer todas las colonias obtenidas sobre el agar de sangre en anaerobiosis. Utilizar preferentemente cultivos jóvenes (18-24 horas). Verificar bien la pureza de la cepa (eventualmente realizar un subcultivo a partir de una colonia bien aislada).

. Sostener la ampolla verticalmente y emulsificar los germenes frotando el escobillón mediante rotaciones contra la pared de la ampolla mientras se mantiene dentro del medio de suspensión.



La turbidez final debe ser superior o igual 3 de McFarland. Esta suspensión debe ser utilizada de inmediato. Las bacterias de crecimiento lento pueden necesitar varias placas de agar de sangre para subcultivar y así obtener un inóculo de la densidad necesaria. NOTA: Para mantener una cierta anaerobiosis, conviene evitar la introducción de aire durante la homogeneización del medio. Preparación de la galería . Reunir fondo y tapa de una cámara de Incubación y repartir aproximadamente 5 ml de agua destilada o desmineralizada [o cualquier agua sin aditivos ni derivados susceptibles a liberar gases, en los alveólos para crear una atmósfera húmeda.

. Inscribir la referencia de las cepas en la lengueta lateral de la cámara. (No inscribir las referencias sobre la tapa, ya que esta puede extraviarse durante la manipulaclón). . Sacar una galería API 20 A de su envase y depositarla en la cámara de incubación.

. Con la ayuda de una pipeta estéril, inocular la galería con la suspensión API 20 A Medium preparada, evitando la formación de burbujas al inclinar ligeramente la galería. - Para el test GEL, lIenar el tubo y la cúpula. - Para el test IND rellenar solamente el tuba con API 20 A Medium y lIenar la cúpula con aceite de parafina, para evitar la evaporación del indol formado.

. Cerrar la cámara de incubación y cultivar durante 24 horas (+/- 2 horas) a 36ºC +/- 2°C en cámara anaerobia, en tarro o en bolsa individual.

. EI resto de API 20 A Medium puede servir para verificar la pureza y la viabilidad de la cepa, inoculando un agar en profundidad o un juego de 2 placas de medio de cultivo, incubando una en aerobiosis y la otra en anaerobiosis. .

LECTURA E INTERPRETACIÓN Lectura de la galería Muchas de las bacterias anaerobias generan una respuesta clara y facil de Interpretar en 24 horas pero ciertas cepas de crecimiento lento sólo se pueden identificar tras 48 horas de incubación. . Después de la incubación, la lectura de la galería debe reallzarse con referencia a la Tabla de Identificación. . Anotar en la hoja de resultados todas las reacciones espontáneas (que no necesiten la adición de reactivos). . Realizar los ensayos que precisen la adiclón de reactivos : - EI BCP del medio de reaccion puede resultar descolorido por reducción. En este caso, lIevar a cabo la reacción de acidificación al agregar 1 gota del reactivo BCP en todos los microtubos que contengan carbohidrato. Una coloración amarilla o verde-amarillenta indica una reacción positiva que debe anotarse en la hoja de resultados.

- Prueba IND: agregar 1 gota del reactivo XYL. Mezclar y esperar 2-3 minutos. Agregar 1 gota del reactivo EHR. EI reactivo debe permanecer en la superficie de la mezcla xileno-aceite de parafina al nivel de la cúpula (para no diluir la coloración en el microtubo). Leer durante los siguientes 5 minutos. Un color rojo indica una reacción positiva que debe anotarse en la hoja de resultados.

- Prueba CAT: La producción de catalasa se hace evidente después de exponer la galería al aire libre durante 30 minutos. Agregar 2 gotas de H202 al 3 % en el tubo positivo. La aparición de burbujas indica una reacción positiva que debe anotarse en la hoja de resultados. Interpretación La identificaclón se obtiene a partir del perfil numérlco: . Determinación del perfil numérico:



La hoja de resultados reproduce el diseño de la galería API 20 A con sus 20 ensayos, más la reacción de la catalasa y 3 ensayos de morfología: SPOR para esporas (+, -), GRAM (+. -) y COCC para cocos (+, -). En la hoja de resultados, los tests están separados en grupos de tres y se asigna para cada uno un valor 1, 2 ó 4. Sumando al interior de cada grupo los números que corresponden a reacciones positivas, se obtienen 8 cifras que constituyen el perfil numérico.

. Identificación: Se realiza a partir de la base de datos (V3.0). . Con la ayuda del Catálogo Analítico: -Localizar el perfil numérico en la lista de los perfiles. . Con la ayuda del software de identificación: -Introducir manualmente mediante el teclado el perfil numérico de 8 cifras.

LÍMITES DEL ENSAYO . EI sistema API 20 A esta destinado a la identificación bioquímica de las bacterias anaerobias presentes en la base de datos (ver Tabla de Identificación al final de la ficha técnica), y exclusivamente a ellas. No puede utilizarse para identificar otros microorganismos ni para excluir su presencia. . sölo se deban utilizar cultivos puros que contengan un sólo tipo de microorganismo. ELiMINACIÓN DE LOS DESECHOS Es responsabilidad de cada laboratorio la gestión de los desechos y efluentes que produce, según su naturaleza y peligrosidad, garantizando (o haciendo garantizar) su tratamiento y eliminación según las reglamentaciones aplicables.

1.7. API NH de Biomerieux API NH Sistema de identificación de Neisseria y Haemophillus UTILIZACIÓN API NH es un sistema de identificación de Neisseria, Haemophillus y Branhamella catarrhalis (Moraxella catarrhalis) utilizando tests estandarizados y miniaturizados, así como una base de datos específica. Las especies que pueden identificarse mediante el sistema están indicadas en la Tabla de identificación al final de la ficha técnica. API NH permite igualmente realizar el biotipaje de Haemophillus influenzae y Haemophillus parainfluenzae, así como la investigación de penicilinasa. PRINCIPIO La galería API NH está formada por 10 microtubos conteniendo substratos de forma deshidratada, para realizar 12 tests de identificación (reacciones enzimáticas o fermentaciones de azúcares), así como la investigación de una penicilinasa (Haemophillus influenzae, Haemophillus parainfluenzae, Branhamella catarrhalis (Moraxella catarrhalis) y Neisseria gonorrhoeae). Las reacciones producidas durante la incubación se traducen en cambios de color espontáneo o revelado por la adición de reactivos. Después de una incubación de 2 horas a 35-37ºC, la lectura de las reacciones se realiza visualmente y la



identificación se obtiene consultando la lista de perfiles de la ficha técnica o los programas de identificación correspondientes. REACTIVOS Composición del envase (10 tests): - 10 galerías API NH - 10 ampollas de NaCI 0,85 % Medium (2 mL) - 1 ampolla de reactivo JAMES - 1 ampolla de reactivo ZYM B - 10 escobillones - 10 cámaras de incubación - 10 hojas de resultados - 1 ficha técnica . La utilización de estos escobillones está estrictamente limitada a la toma de colonias de microorganismos obtenidas a partir de medios de cultivo. No utilizarlas para tomas directamente de los pacientes. Productos complementarios no incluídos - McFarland Standard, punta 4 - Aceite de parafina - Pipetas - Gradilla para ampollas - Protege-ampollas - Programa informático para identificación

Material de laboratorio necesario: - Estufa a 35-37ºC - Nevera - Mechero Bunsen . Rotulador PRECAUCIONES . Destinado únicamente al diagnóstico in vitro. . No pipetear las muestras ni los reactivos con la boca. . Evitar el contacto de los reactivos con la piel, los ojos y la ropa. . No utilizar los reactivos después de la lecha de caducidad. . Después de sacarlos de la nevera, dejar que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (20-30ºC) antes de utilizarlos. . Abrir las ampollas con cuidado procediendo como sigue: - Colocar la ampolla en el protege-ampollas. - Sujetar el conjunto verticalmente en una mano (tapón en la parte superior). - Apretar bien el tapón. - Cubrir la parte inclinada del tapón con la primera falange del pulgar. - Presionar con el pulgar sobre la base de la parte inclinada del tapón con un movimiento . hacia el exterior con el fin de que la extremidad de la ampolla se rompa dentro del tapón. - Retirar la ampolla del protege-ampollas y o conservar el protege-ampollas para una utilización posterior. * Ampollas sin tapón cuentagotas: - Quitar suavemente el tapón. * Ampollas con tapón cuentagotas: - Invertir la ampolla y mantenerla en posición vertical. - Aplicar una presión lateral sobre el tapón para transferir la totalidad del reactivo al frasco cuentagotas.



NOTA: Antes de invertir la ampolla debe presionarse el tapón para evitar que se derrame el líquido por el exterior.

. Todos los productos inoculados deben ser considerados potencialmente infecciosos y deben par lo tanto ser manipulados de manera apropiada. .

. Las muestras y cultivos bacteria nos deben ser considerados como potencialmente infecciosos y deben ser manipulados de manera apropiada par personal cualificado. Las técnicas asépticas y las precauciones habituales de manipulación para el grupo bacteriano estudiado deben ser respetadas durante toda la manipulación; remitirse a "NCCLS M29-A, Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids, and Tissue; Approved Guideline - December 1997". Para información complementaria sobre las precauciones de manipulación. remitirse al "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, HHS Publication No. (CDC) 93-8395, 3rd Edition (May 1993)," a la reglamentación vigente en el País de utilización.

. Al terminar el Test después de la lectura e interpretación, todas las muestras, objetos contaminados y productos inoculados (ampollas, escobillones, pipetas, cámaras y galerías) deben ser sometidos a autoclave, incinerados 0 sumergidos en un desinfectante antes de eliminarlos.

. Los resultados presentados se obtienen con la metodología indicada en esta ficha técnica. Toda desviación en la metodología puede alterar los resultados.

. La interpretación de los resultados del test debe ser realizada par un microbiólogo teniendo en cuenta el contexto clínico, el origen de la muestra, los aspectos macro y microscópicos y, eventualmente, los resultados de otros tests, en particular el antibiograma.

CONSERVACIÓN DE LOS GALERÍAS Y MEDIOS Las galerías y los medios se conservan a 2-8ºC hasta la techa de caducidad indicada en el envase. CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Los reactivos se conservan en oscuridad a 2-8ºC hasta la fecha de caducidad indicada en el envase. Después de la apertura de las ampollas y la transferencia de los reactivos a las frascos cuentagotas, los reactivos pueden conservarse 1 mes (o hasta la fecha de caducidad en caso de que esta sea menor): anotar la techa de apertura en la etiqueta de los frascos. Los reactivos ZYM B Y JAMES son muy sensibles a la luz: conservar envuelto en papel aluminio. No sacar los reactivos de la nevera más que durante el tiempo de utilización. No dejarlos mucho tiempo sobre la mesa de trabajo. EI reactivo ZYM B presenta un tono amarillo en condiciones normales. Eliminar dicho reactivo cuando se observa un cambia de color a rosa (signa de alteración). UTILIZACIÓN DE LOS REACTIVOS Dejar los reactivos a temperatura ambiente (20-30'C) antes de su utilización. 1. Reactivo ZYM B: . Abrir la ampolla de reactivo como se indica en el párrafo "Precauciones" (ampollas sin tapón cuentagotas). . Echar una gota de reactivo. . Cerrar bien el frasco después de su usa y conservarlo como se indica en el párrafo "Conservación de los reactivos". 2. Reactivo JAMES: . Abrir la ampolla de solvente asociada al reactivo JAMES como se indica en el párrafo Precauciones" (ampolla sin tapón cuentagotas).



. Retirar el contenido de la ampolla con una pipeta muy seca y transferir este solvente al frasco cuentagotas (contiene el principia activo deshidratado). . Adaptar el tapón cuentagotas. . Cerrar bien el frasco. . Agitar. . Esperar 5-10 minutos para la disolución completa del principio activo. . Utilizar el reactivo así reconstituido, cerrar bien el frasco después de utilizarlo y conservarlo como se indica en el párrafo "Conservación de los reactivos". TÉCNICA Selección de colonias Verificar que la cepa a estudiar pertenece a las géneros: - Neisseria (Cocos Gram negativos agrupados en pares). - Branhamella catarrhalis (Moraxella catarrhalis) presenta los mismos caracteres morfológicos y fisiológicos. - Haemophilus (pequeños bacilos Gram negativos polimorfos). Estas bacterias requieren factores de crecimiento y se cultivan habitualmente en agar chocolate can PolyVitaleX en atmósfera de C02. La metodología API NH necesita un inocula ajustado al 4 de McFarland, es generalmente necesario de realizar un subcultivo. Pueden utilizarse los medios de aislamiento siguientes antes de utilizar la galería API NH: - agar chocolate PolyViteX a derivado (Thayer Martin Medium) con a sin antibiótico.

- agar sangre (Columbia, Trypcase-Soja, New York City Medium) teniendo en cuenta a la hora de la lectura, que la intensidad de algunas reacciones bioquímicas pueden modificarse. - si se utilizan otros medias de aislamiento. realizar un subcultivo en uno de los medios anteriormente citados. La incubación del subcultivo debe realizarse en atmósfera de C02 durante 18-24 horas a 35-37ºC (con el fin de obtener de las bacterias una expresión enzimática óptima en la galería API NH). NOTA: Las bacterias para las que es necesario tener precauciones particulares de manipulación (ej.: Brucella, Francisella) no forman parte de la base de datos API NH. Conviene utilizar otras técnicas para confirmar a excluir su presencia. Preparación de la galería . Reunir el fondo y la tapa de una cámara de incubación. . Anotar la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara. (No anotar la referencia en la tapa, porque puede ser desplazada durante la manipulación). . Sacar la galería de su envase individual. . Poner la galería en la cámara de incubación. . Quitar el deshidratante. Preparación del inóculo. Abrir una ampolla de NaCI 0,85 % Medium (2 mL) como se indica en el párrafo "Precauciones" (ampolla sin tapón cuentagotas).

. Con la ayuda de un escobillón, tomar varias colonias bien aisladas y realizar una suspensión homogénea con una turbidez igual al 4 de McFarland. . La suspensión debe utilizarse inmediatamente después de su preparación. Inoculación de la galería. Repartir la suspensión bacteriana realizada anteriormente en las cúpulas, evitando la formación de burbujas (para ello inclinar la cámara de incubación hacia adelante y colocar la punta de la pipeta en el borde de la cúpula):



- lenar únicamente el tubo de los 7 primeros microtubos (PEN a URE): 150 µI aproximadamente. - llenar tubo y cúpula de los 3 últimos microtubos LIP/ProA, PAL/GGT, GAL/IND: 150 µl aproximadamente procurando no crear un menisco convexo. . llenar los 7 primeros tests (PEN a URE) con aceite de parafina (tests subrayados). NOTA: La calidad del llenado es muy importante: los tubos insuficientemente o demasiado llenos son causa de resultados falsamente positivos o negativos. . Cerrar la cámara de incubación. . Incubar 2 horas a 35-37°C en atmósfera aerobia. Lectura de la galería Después de 2 horas de incubación, leer las reacciones con ayuda de la Tabla de Lectura de la ficha técnica: . Leer las reacciones espontáneas y anotarlas (+ ó - ) en la hoja de resultados. Atención: los 3 últimos microtubos son bifuncionales y permiten realizar 2 reacciones en el mismo tubo: - 8. LIP(reacción espontánea) / ProA (reacción después de la adición de reactivo) - 9. PAL (reacción espontánea) / GGT (reacción después de la adición de reactivo) - 10. βGAL(reacción espontánea) / IND (reacción después de la adición de reactivo). Los resultados de las reaccionesLIP,,PAL y βGAL deben anotarse antes de la adición de reactivo.

. Añadir 1 gota de reactivo ZYM B en los microtubos 8 y 9: LIP/ProA y PAL/GGT

. Añadir 1 gota de reactivo JAMES en el microtubo 10: βGAL/IND

. Esperar 3 minutos y leer las reacciones con la ayuda de la Tabla de Lectura de la ficha técnica y anotartas en la hoja de resultados. - Si la reacción lLIP es positiva (color azul), interpretar la reacción IProA como negativa, se haya aiiadido o no el ZYM B.

- Si después de 2 horas de incubación, varias reacciones son dudosas (fermentación, penlcllinasa), reincubar la galería 2 horas más y leer de nuevo estas reacciones (los tests enzimáticos no se leerán en este caso). Interpretación . La identificación se obtiene a partir del perfil numérico:

- Determinación del perfil numérico: En la hoja de resultados, los tests están separados en grupos de tres y un valor 1, 2 ó 4 esta indicado para cada uno. Sumando en el interior de cada grupo los valores correspondientes a las reacciones positivas, se obtiene un perfil numérico de 4 cifras. Atención: no codificar el primer test (penicilinasa). EI primer grupo incluye los tests GLU, FRU,- MAl.

- La identificación se obtiene con el programa de identificación o buscando el perfil numérico en la lista de perfiles de la ficha técnica. En caso de débil discriminación entre varias especies, se indican los tests complementarios que pueden realizarse para separarlos (Tablas 1 y 2). Los resultados de estos tests están extraídos de la literatura.

3 424 Haemophilus Influenzae

. EI biotipaje de H. influenzae y H. parainfluenzae se realiza con la ayuda de la Tabla 1.

. Test penicilinasa:



- Una reacción positiva (color amarillo, amarillo-verde o amarillo-azul) indica la presencia de una penicilinasa. La presencia de esta enzima indica que no deben emplearse penicilinas (Penicilina G, amino-, carboxi- y ureidopenicilinas). Deberá realizarse un antibiograma para el resto de beta-lactámicos. - Una reacción negativa (color azul) indica ausencia de penicilinasa. LlMITACIONES EI sistema API NH esta destinado a la identificación de especies de la base de datos (ver Tabla de Identificación al final de la ficha técnica), es decir, pertenecientes a los géneros Neisseria, Haemophilus y a la especie Branhamella catarrhalis (Moraxella catarrhalis) únicamente y a ellas solas. No puede utilizarse para identificar otros microorganismos ni para excluir su presencia. 1.8. Neisseria 4H de BioRad NEISSERIA 4H IDENTIFICACIÓN DE NEISSERIA Y BRANHAMELLA EN 4 HORAS 1- INTERÉS CLÍNICO

. Las Neisseria, cocos gramnegativos, incluyen doce especies, algunas de las cuales pertenecen a la flora comensal orofaríngea o urogenital. Las dos especies patógenas para el hombre son: Neisseria meningitidis, responsable de la meningitis cerebroespinal y Neisseria gonorrhoeae, responsable de infecciones urogenitales. Las localizaciones inusuales justifican un diagnóstico bacteriológico preciso. Las otras especies pueden ser incriminadas en infecciones respiratorias, oculares o del LCR, especialmente en pacientes inmunodeprimidos.

. Branhamella catarrhalis, cocos gramnegativos de la flora comensal de las vías aéreas superiores, participa en numerosas infecciones bronquiales o del área ORL.

2- PRINCIPIO DE LA PRUEBA

Se basa en el uso por parte de las enzimas bacterianas, de sustratos secados en los pozos de una microplaca y rehidratados por el inóculo bacteriano en el momento de su uso. Los caracteres seleccionados son: a) Uso de glúcidos: glucosa [GLU], maltosa [MAL], fructosa [FRU] y sacarosa [SAC], por un proceso de oxidación: acidificación del medio y cambio de color de fenol rojo a amarillo. b) Detección de una B-galactosidasa [ONPG], mediante hidrólisis de la ONPG que libera orto-nitrofenol de color amarillo. c) Hidrólisis de tributirina [TRI] bajo la acción de una lipasa con liberación de ácido butírico que produce la acidificación del medio y un cambio de color a amarillo.

d) Sintesis de polisacaridos [PS/24h] : la presencia de polisacáridos conduce a la aparición de un color violeta a marrón cuando se añaden una o dos gotas de lugol. Esta prueba es la única que precisa una incubación durante 24 horas. e) Detección de una g-glutamiltransferasa [GGT] por hidrólisis de la (C)-glutamilparanitroanilida que libera paranitroanilida de color amarillo. f) Reducción de los nitratos a nitritos [N03], revelada por la adición de reactivos de Griess. g) Reducción de nitritos [N02 (1)] [N02 (2)] : la acción de la nitrito reductasa la marca la aparición de una coloración amarilla en el medio. Estas características permiten establecer un perfil de identificación bioquímica específico para cada especie.



3- PRESENTACIÓN - ALMACENAMIENTO - VALIDEZ · Presentación: La microplaca incluye 2 filas de 8 pozos, 12 de los cuales se usan. Cada pozo corresponde a una característica bioquímica excepto: . EI primer pozo [CONT NEG]: control negativo que permite la interpretación del cambio de color de los azúcares. (EI cambio de color del indicador de pH muestra la acidificación debida al uso de algunos glúcidos). . EI [N02 (1)], inoculado con el inóculo se transfiere entonces al pozo de [N02 (2)], en el que se desarrollara la reacción. Se usa una cubierta para limitar la evaporación durante la incubación, mientras se mantienen los intercambios gaseosos. . Conservación: a +2-8°C . Validez: hasta la fecha de caducidad indicada en la caja del equipo.

4- COMPOSICIÓN DEL EQUIPO . 10 microplates (microplacas + 10 cubiertas (envasadas individualmente); . 10 ampollas de suspension medium (medio de suspensión). . 10 micropipetas calibradas desechables. · 10 hojas de resultados

5- PROCEDIMIENTO A) MATERIAL NECESARIO PERO NO SUMINISTRADO · Tubo nº3 de la escala de turbidez de Mac Farland (0,3 ml de una solucion de BaCb2 al 1 por ciento y 9,7 ml de una solucion de H2S04 al 1 por ciento) · Reactivo de Griess: Nitrito I / Nitrito II · Reactivo de lugol . Incubador a 37°C · Tanque desinfectante B) PROCEDIMIENTO 1) Preparación del inóculo Debe realizarse de colonias puras y recientes aisladas en medio enriquecido adaptado para el cultivo de Neisseria (con o sin mezcla específica de acuerdo con la muestra usada). Se comprueba previa mente lo siguiente: · Tinción de Gram: diplococos, gramnegativos · Presencia de una citocromo oxidasa y de una catalasa EI inoculo puede prepararse entonces para la inoculación en la microplaca. Use una pipeta de Pasteur para recoger un numero de colonias suficiente para obtener, en el medio de suspensión (Ilevado a temperatura ambiente, + 18-30°C) , una turbidez al menos equivalente a la del tubo nº3 de la escala de Mac Farland. NOTAS · Debido a la fragilidad de estas bacterias, la galería debe inocularse no más tarde de 15 minutos después de la preparación del inóculo.

· Este inóculo debe considerarse como potencialmente infeccioso: Es esencial trabajar cerca de la llama de un mechero Bunsen. Debe estar siempre fácilmente disponible un desinfectante.

2) Inoculación de las microplacas



· Lleve la bolsa que contiene la microplaca a temperatura ambiente (+ 18-30°C) · Abra la bolsa y saque la microplaca. · Escriba en la etiqueta las referencias del paciente o de la cepa aislada. . Use la micropipeta para distribuir tres gotas (100 µl en cada pozo, incluído el pozo de [N02 (1)]. . Usando una pipeta de Pasteur, mezcle inmediatamente el contenido de esta varias veces, para solubilizar el sustrato y transferirlo al pozo de [N02 (2)]. La lectura puede realizarse en este pozo. · Ponga la cubierta sobre la microplaca. . Coloque la microplaca durante 4 horas a 37°C en el incubador sin C02. . Tire la ampolla y la pipeta al contenedor para residuos contaminados (para someter a autoclave). 3) Lectura de los resultados Lea los resultados despues de 4 horas (excepto el pozo debominado "Síntesis de los polisacáridos", cuyo desarrollo, si es necesario, se realizara a las 24 horas. En la etiqueta de las microplacas, escriba para cada pozo el resultado (+) ó (-) . Luego, desarrolle la reducción de los nitratos [N03] añadiendo en sucesión en el pozo: 1 gota de nitrito I y una gota de nitrito II. Cambio de color de los azúcares EI cambio de color para la hidrólisis de los glúcidos se valorara siempre por comparación con el color del pozo control. Algunas cepas tienen acidificación baja y el cambio del color del indicador coloreado no será muy notable (narania). Esto es cierto para algunas cepas saprófitas. N.subflava, N. f/ava. Cualquier coloración correspondiente a una acidez mayor que la del control se consideraran entonces como positivo. . ONPG: La reacción es rápida y muy a menudo aparece ya al 10º minuto. .. Síntesis de polisacáridos: la lectura se hace después de la adición de una o más gotas de Lugol. A veces puede observarse ya a la 4ª hora. La positividad puede ser marcada por la presencia de una red coloreada (violeta a marrón en el medio, a veces limitada a la periferia del pozo). ... Reducción de los nitratos: la revelación y lectura de este caracter debe hacerse al final una vez que se hayan añadido los reactivos de Griess. De hecho, estos reactivos son ácidos y pueden conducir a modificaciones del color en los pozos adyacentes. ......... La coloración amarilla (que indica la presencia de una nitrito reductasa) puede a veces desaparecer con el tiempo debido a exposición a la luz. Anote el resultado en cuanto retire la microplaca del incubador.

6- INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS Los resultados anotados en la etiqueta se comunicaran en la hoja de resultados y se interpretaran de acuerdo con la tobla 2.

:I: : Puede variar dependiendo de las cepas N02: Resultados obtenidos con una concentracion de nitrito al 0,1%. ( ) : La mayoria de las cepas presentan esta caracterfstica Si es necesario, incube de nuevo la microplaca durante 24 horas para poner de manifiesto la sintesis de polisacaridos. Si el perfil observado no se clasifica en la Tabla 2, compruebe la pureza de la cepa y las caracteristicas especificas de 105 generos de Neisseria y Branhamella: Diplococos Gram (-), Oxidasa (+).

8- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE Todos los reactivos fabricados se elaboran según nuestro sistema de calidad, que va desde la recepción de las materias primas hasta la comercialización final del producto. Cada lote se somete a valoraciones de control de calidad y sale al mercado solo cuando está de acuerdo con los criterios de aceptación



predefinidos. Los registros relativos a la producción y al control de cada lote se conservan en Bio-Rad.

2. GALERIAS DE ANTIBIOGRAMA 2.1. Introducción Cuando haya que llegar a la identificación y antibiograma de un microorganismo anaerobio, PNT-11, se realizará la identificación mediante el anteriormente descrito API 20 A y el antibiograma mediante el ATBTM ANA. Actualmente, las normas de la CSLI sólo admiten sistema de dilución para la determinación de las C.M.I.s, y por tanto del antibiograma, de los microorganismos anaerobios. Una buena aproximación comercial la constituyen los sistemas comerciales como el APITM ANA de Biomerieux. Esta galería consiste en la determinación de la sensibilidad a un determinado antibiótico, indicado para anaerobios, mediante microdilucion. Debido al lento crecimiento de este tipo de microorganismos y las condiciones anaerobias de incubación, se realizará una placa control del crecimiento de la galería. Esta placa consistirá en agar Schadler con discos de: - Penicilina - Amoxicilina-clavulánico - Cefoxitina - Piperacilina - Imipenem - Cloramfenicol - Clindamicina - Vancomicina - Metronidazol Aunque esta placa de difusión en agar no tiene validez como antibiograma, por no existir criterios de interpretación de halos de inhibición para anaerobios en la actualidad, servirá como control de pureza, indicador de cinética de crecimiento y confirmación del grupo de anaerobios a estudiar. A continuación se describe el sistema de microdilucion comercial utilizado en este laboratorio. 2.2. ATBTM ANA ATB™ ANA de Biomerieux Antibiograma para bacterias anaerobias estrictas INTRODUCCIÓN Y OBJETIVO DE LA PRUEBA La galería ATB ANA permite determinar la sensibilidad de las bacterias anaerobias estrictas a los antibióticos en medio semi-sólido en condiciones muy próximas a las técnicas de referencia de dilución en agar o de microdilución (según las recomendaciones de CASFM o CLSI/NCCLS). PRINCIPIO La galería ATB ANA s compone de 16 pares de cúpulas. EI primer par, sin antibiótico, sirve de testigo de crecimiento. Las 14 cúpulas siguientes contienen antibióticos a una o varias concentraciones. EI último par no se utiliza. La bacteria a estudiar es puesta en suspensión y después transferida al media de cultivo e inoculada en la galería. Después de incubar, la lectura del crecimiento se hace o bien visualmente, o bien con el sistema automático ATB o MiniAPI. EI resultado obtenido permite clasificar la cepa como Sensible, Intermedia o Resistente.



PRESENTACIÓN (Equipo para 10 antibiogramas): - 10 galerías ATB ANA en embalaje individual con deshidratante - 10 tapas de incubación - 10 ampollas de ATB S Medium - 10 hojas de resultados - 1 ficha técnica COMPOSICIÓN Galerías La composición de la galería ATB ANA se indica en la tabla Medlo ATB S médium: Triptona (origen animal) Gelatina (origen animal) Extracto de levadura Glucosa Cloruro sódico L-arginina Piruvato de sodio Menadiona Hemina (origen animal) Agar Agua desmlneralizada pH: 7.0-7.4

REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO Reactlvos e Instrumentos - API NaCI 0.85 % Medium - API 20 A Medium - Patrón McFarland - Pipeta Electr6nica ATB - Sistema automático ATB o mini API con programa

Material - Pipeta - Protege-ampollas - Gradilla para ampollas - Sistema de anaerobiosis - Equipamiento general del laboratorio de bacteriología REACTIVOS COMPLEMENTARIOS Cefinasa PRECAUCIONES DE UTILIZACIÓN . Para diagnóstico in vitro únicamente. . Para uso profesional únicamente. . Este equipo contiene componentes de origen animal. EI certificado de origen y/o el estado sanitario de los animales no pueden garantizar de forma absoluta que estos productos no contienen ningún agente patógeno transmisible, se recomienda manipularles con las precauciones de uso relativas a los productos potencialmente infecciosos (no ingerir ; no inhalar).

. Las muestras, cultivos bacterianos y productos inoculados deben ser considerados como potencialmente infecciosos y deben ser manipulados de manera apropiada. Las técnicas asépticas y las



precauciones habituales de manipulación para el grupo bacteriano estudiado deben ser respetadas durante toda la manipulación: consultar a " CLSI/NCCLS M29-A, Protection of Laboratory Workers from Instrument Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids. and Tissue: Approved Guideline Revisión en vigor", Para información complementaria sobre las precauciones de manipulación, consultar "Biosafety In Microbiological and Biomedical Laboratories. COC/NIH - Ultima edici6n," o a la reglamentación vigente en el país de utilización. . No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad. . Antes de utilizar, comprobar la integridad del embalaje y de los componentes. . No utilizar las gaterías que hayan sufrjdo una alteración física (cúpula deformada, bolsa del deshidratante abierta…) . Antes de utilizar, dejar que los medios alcancen temperatura ambiente. . Abrir las ampollas cuidadosamente como se indica a continuación : - Colocar la ampolla en el protege-ampolla. - Sujetar la ampolla verticalmente en una mano (tapón en la parte superior). - Apretar bien el tapón. . Modelo 1 : Cubrir la parte inclinada del tapón con la primera falange del pulgar. Ejercer una presión con el pulgar en la base de la parte inclinada del tapón para romper la extremidad de la ampolla. . Modelo 2 Ejercer una presión horizontal con el pulgar en la parte estriada del tapón para romper la extremidad de la ampolla. Retirar la ampolla del protege-ampolla y conservar el mismo para una utilización posterior. Quitar suavemente el tapón.

La interpretación y la validación de los resultados del antibiograma deben hacerse teniendo en cuenta el contexto clínico, el origen de la muestra, la identificación de la cepa , eventualmente los resultados de pruebas complementarias y las recomendaciones locales en vigor. La interpretación y la validación son facilatados por el sistema Expert ATB.

CONDICIONES DE CONSERVACION Las galerias y los medios se conservan a 2_8°C en oscuridad hasta la fecha de límite de utilización indicada sobre el equipo MUESTRAS (TOMA DE MUESTRA Y PREPARACIÓN) La galería ATB ANA no debe ser utilizada directamente a partir de las muestras de origen clínico u otra procedencia. Los microorganismos a estudiar deben en primer lugar ser aislados en un medio de cultivo adecuado según las técnicas usuales de bacteriología.

Modelo 1 Modelo 2



MODO DE EMPLEO Preparación de la galería . Sacar la galería de su embalaje. . Anotar la identificación de la bacteria sobre la lengüeta lateral de la galería. Preparación del inóculo . Preparar una suspensi6n bacteriana con una turbidez equivalente al patrón 3 de la escala de McFarland . Comparar con al testigo de turbidez del equipo Patrón McFarland Dos métodos : - cultivo en caldo hasta obtener la turbidez indicada; - puesta en suspensión de 1 o varias colonias (utilizar preferentemente cepas cultivadas recientemente) en una ampolla API 20 A Medium o de API NaCI 0,85 % Medium (abrir la ampolla como se indica en el párrafo "Precauciones de utilización" de la ficha técnica del producto). Esta suspensión debe ser utilizada en el momento. NOTA: se recomienda controlar la pureza del inóculo y reaislar en caso de cultivos mixtos. . Transferir 200 µI de esta suspensión en el ATB S Medium con la ayuda de una pipeta. INOCULACIÓN DE LA GALERÍA Inoculación manual - Homogeneizar ATB S Medium con una Pipeta evitando formar burbujas.

- Inocular la galería distribuyendo 135 µI de ATB S Medium por cúpula (aproximadamente 2 x 107

gérmenes/ml o 3 x 106 gérmenes/cúpula). Inoculación AUTOMÁTlCA: Consultar el manual de utilización del inoculador ATB.

. Colocar la tapa sobre la galería.

. Incubar 24-48 horas a 37°C en anaerobiosis. NOTA: EI plazo de obtención de la anaerobiosis debe ser lo más corto posible. Se recomienda la utilización de una cámara anaerobia o de bolsas individuales da anaerobiosis. LECTURA E INTERPRETACIÓN Buscar en cada cúpula la presencia de turbidez (+) por lectura visual o automática por el sistema ATB o mini API (consultar los manuales de utilización). Para los antibióticos estudiados a dos concentraciones :

Aspecto de las cúpulas Resultados Cepa 1 2 c C claro claro - - SENSIBLE turbio claro + - INTERMEDIA turbio turbio + + RESISTENTE

Se recomienda efectuar para las bacterias anaerobias Gram negativas, una búsqueda de beta lactamasa con la ayuda de un método cromogénico (prueba de Cefinasa). En caso de positividad, las pruebas Penicilina G y Amoxicilina (AMO) deben ser informadas como resistentes

. Concentraciones especifícas han sido añadidas a la segunda parte con el fin de permitir, para ciertos antibióticos, una interpretación conforme con las recomendaciones de los expertos franceses. Se les encuentra bajo el trazo horizontal situado por debajo de la molécula METRONIDAZOL 8-16 mg/L.

. Antes de efectuar la lectura automática, se aconseja eliminar las eventuales gotitas sobre la parte central de la galería con el fin de permitir el reconocimiento del código de la galería por el lector. . La ausencia de crecimiento en una ( dos ) cúpula(s) testigo invalida el antibiograma que debe ser



repetido. . Un resultado c(-) C(+) sería un contrasentido (N); repetir la prueba can una nueva galería. . En lectura visual, un crecimiento limitado a la periferia de la cúpula debe ser interpretado como negativo. . Una galería donde las cúpulas estén parcialmente desecadas tras la incubación puede inducir resultados falsos. EI antibiograma debe ser repetido. . Las cepas pertenecientes a los géneros Eubacterium y Peptostreptococcus pueden presentar un crecimiento insuficiente, incluso después de 48 horas de incubación. LÍMITES DE LA PRUEBA . Un tiempo de espera entre las diversas etapas de la manipulación (de la preparación del inóculo a la incubación de la galería) puede afectar a los resultados.

. Solo se deben usar cultivos puros con un solo tipo de microorganismo. Los cultivos mixtos o contaminados pueden afectar a los resultados.

. Ciertas cepas pertenecientes al género Bacteroides pueden aparecer como Sensible a las asociaciones Amoxicilina-Acido Clavulanico (AMC) y Ticarcilina.Acido Clavulanico (TCC) en lugar de Resistente. Se recomienda verificar estos resultados para las cepas productoras de β-Iactamasa que aparecen como intermedias o Resislentes frente a la Piperacilina (PIC). RESULTADOS ESPERADOS Los perfiles de resistencia de las pruebas frente a antibióticos varian en función de la zona geográfica, los resultados esperados son directamente dependientes de la ecología microbiana local (especies I mecanismos de resistencia). PRESTACIONES TÉCNICAS Las prestaciones técnicas de la galería ATB ANA han sido determinadas utilizando una colección de cepas que incluye los siguientes géneros: - Bacteroides - PrevotelJa . Fusobacterium . Vell/onella - Clostridium - Eubacterium - Bifidobacterium - Propionibacterium - Peptostreptococcus Este estudio ha permitido establecer el nivel de concordancia de las categorizaciones para cada antibiótico. Las categorizaciones de referencia han sido determinadas a partir de los resultados de CMI obtenidos con el método de dilución en agar, y comparados con los establecidos por la galería ATB ANA. Hay concordancia cuando las categorizaciones clínicas de los dos métodos son idénticas. Un resultado se dice reproducible si los 3 resultados de categorización determinados de manera independiente son idénticos. Nlvel de concordancia EI nivel de concordancia de la galería ATB ANA es del 95 % siguiendo las recomendaciones de CLSI/NCCLS. Los niveles de errores significativo y muy significativos obtenidos con la galería ATB ANA son respectivamente 0,5 % y 0,8 % siguiendo los criterios de la CLSI/NCCLS (ver "Límites de la prueba"). Reproductibilidad EI nivel de reproductibilidad global de la galería ATB ANA es de 99 % (establecido con un mínimo de 10



cepas par antibiótico). ELiMINACION DE DESECHOS Las galerías no utilizadas pueden ser eliminadas como desechos no peligrosos. Eliminar todos los reactivos utilizados o las ampollas de ATB S Medium no utilizadas así como el material de un solo uso contaminado siguiendo los procedimientos relativos a los productos infecciosos o potencialmente infecciosos. Es responsabilidad de cada laboratorio la gestión de sus desechos y efluentes según su naturaleza y peligrosidad, garantizando (o haciendo garantizar) su tratamiento y eliminación, según las reglamentaciones aplicables. 3. SISTEMA Mini-API

Descripción funcional de mini API@ Descripción I objetivo mini API está destinado a la realización de identificaciones y de antibiogramas automatizados con los reactivos de la gama ID 32, rapid ID 32, A TB y rapid ATB.

Permite también la interpretación asistida por ordenador de las galerías de lectura visual de la gama APl. 1 -mini API" 2 –Teclado 3 -Pipeta electrónica 4 -Densitómetro DENSIMAT

Figura 2.1: composición del instrumento



Composición del instrumento mini API es un automático completo de identificación y de antibiograma, constituido por: el material, el programa y los consumibles. EI material: EI instrumento comprende: - mini API, módulo analítico autónomo que permite: la medida de los test de las galerías, la gestión de los resultados y datos y la impresión de los resultados obtenidos. - un densitómetro DENSIMAT para ajustar la turbidimetría del inóculo (o, en su ausencia, un patron Mac Farland) - una pipeta electrónica para distribuir el volumen de inóculo necesario en cada cúpula de las galerías de las gamas de identificación y antibiograma (55 µL o 135µL EI programa: EI programa mini AP lrealiza: - el tratamiento de las medidas, - la interpretación de los resultados de las galerías (identificación o antibiograma), - la "expertización" del antibiograma, - el almacenamiento de los resultados en el disco duro, - la impresión de los resultados, - la extracción de datos, Los consumibles: EI conjunto de los consumibles mini API comprende: - unas galerías y sus medios, reactivos asociados - cintas y papel de impresora, - adaptador para la pipeta. Principio de funcionamiento mini API satisface dos tipos de lectura: Lectura turbinefelométrica: Está destinada a las galerías "turbinefelométricas". Ejemplo: - ID32 GN - ID 32 C - ATB ANA

mini API efectúa entonces los dos tipos de medidas siguientes:

Turbidimetría: medida de la intensidad de la luz transmitida (T), inversamente proporcional al crecimiento bacteriano. Nefelometría: medida de la intensidad de la luz difundida (D) a 30º, directamente proporcional al crecimiento bacteriano. Ambas medidas permiten evaluar la densidad bacteriana en el medio de cada cúpula. EI ciclo de una lectura turbinefelométrica se hace en dos etapas:



1ª etapa: Entrada del carro portagalerías. Detección del código de la galería. 2ª etapa: Medida en la posición sin filtro. Salida del carro portagalerías. Cuando el ciclo de lectura ha terminado, el programa procesa las medidas efectuadas. Lectura colorimétrica Está destinada a las galerías "colorimétricas". Ejemplo: - ID 32 A - ID 32 STREP mini API efectúa para cada cúpula una medida de transmisión de la luz en cuatro regiones del espectro visible. EI ciclo de una lectura colorimétrica se desarrolla en 4 etapas: 1ª etapa: primera entrada del carro portagalerías: - Detección del código de la galería, - Medida con el filtro K60. 2ª etapa: 1ª salida del carro portagalerías: - Medida con el filtro K40. 3ª etapa: 2ª entrada del carro portagalerías: - Medida con el filtro DT azul. 4ª etapa: 2ª salida del carro portagalerías: - Medida con el filtro DT verde. Cuando el ciclo de lectura ha terminado, el programa procesa las medidas efectuadas. Utilización de mini A.PI Procedimiento de utilización: 1ª etapa: Antes de efectuar la lectura de las galerías, hay que: - Poner en marcha mini API con el interruptor de alimentación "encendido/apagado" situado detrás del aparato. . - Esperar por lo menos 15 minutos (calentamiento) antes de empezar la lectura de las galerías. 2ª etapa: Preparación de las galerías para la lectura: - Quitar la tapa de las galerías. - Añadir los reactivos necesarios para evidenciar algunos tests (véanse las instrucciones de utilización de las galerías). 3ª etapa: Sacar el aro de protección. Es imperativo sacar completamente el aro de protección para sacar el carro portagalerías.EI aro de protección delimita la superficie para el libre desplazamiento del carro portagalerías; no debe utilizarse como asa para desplazar el aparato. No ponga nada encima del aro de protección cuando esté sacado. La salida del carro portagalerías se efectúa automaáicamente por el programa mini API en el momento de



la lectura automática de las galerías. 4ª etapa: Poner la galería sobre el carro portagalerías. 5ª etapa: Lectura de las galerías: - La lectura de las galerías es iniciada por el programa mini API. - La lectura de las galerías es automática. - Se lee el código de la galería y se interpretan los resultados, generando así el procesado correspondiente a la galería: Lectura turbinefelométrica o colorimétrica. Para una galería de lectura turbinefelométrica, el cicIo de lectura comprende una entrada y una salida de la galería en el lector en el carro portagalerías. Para una galería de lectura colorimétrica, el cicIo de lectura comprende dos entradas y salidas de la galería en el carro portagalerías. AI final de la lectura de las galerías, el carro portagalerías está fuera. Vuelve a entrar automaticámente cuando el usuario sale del módulo de entrada de resultados del programa mini API. EI aparato esta equipado con un ventilador que permite dejarlo conectado cuando no se utiliza. Por lo tanto, el aparato está siempre listo para ser utilizado.

1 - Carro portagalería 2 - Arco de protección 3 - Lector de disquete 4 - Impresora

Figura 5-1: Posicionamiento del carro portagalerías y del aro de protección



Lectura de una galería sin registrar los resultados Introducción

Acceso . Colocar el cursor en "api/ATB" con el cursor . Pulsar <Enter>.

Con este módulo se puede: Efectuar lecturas de las galerías de identificación o de antibiograma sin crear informes de paciente. No se registran los resultados para la identificación y el antibiograma Los resultados del antibiograma no se validan. Identificar un microorganismo en lectura visual (API) y automática (ID 32, rapid ID 32). Leer un antibiograma en lectura automática (ATB ANA)

Identificación de un microorganismo

Lectura visual - Pulsar la tecla <F1 >. Los resultados de los tests bioquímicos se introducen del mismo modo que en el módulo "ENTRADA DE



DATOS" Antes de realizar una lectura automática, es necesario sacar el aro de protección. Después de cada lectura, retire la galería del carro portagalerías.

Lectura automática -Pulsar la tecla <F2>. - EI carro portagalerías sale. - Poner la galería encima del carro portagalerías. - Pulsar <Enter> . - Retirar la galeria. Impresión del resultado de la identificación EI resultado de la identificación puede imprimirse con una referencia. - Pulsar la tecla <F6>. Aparece la pantalla siguiente: Referencia: . .... - pulse <Enter>. - Entre una referencia que Ie permita reconocer el resultado. - Pulsar <Enter>.

* Esta impresión contiene: - Perfil numérco y resultado de cada test. - Comentarios. - Taxones seleccionados. - Indice de identificación - Detalle de los tests en contra (si procede) - Indicación de los tests complementarios (si es necesario) Lectura de un antibiograma

Antes de realizar una lectura automática, es necesario sacar el aro de protección. Después de cada lectura, retire la galería del carro portagalerías.

Lectura automática: - Pulsar la tecla <F3>.



- Poner la galería encima del carro del lector. - Pulsar <Enter>. - Retirar la galería del carro portagalerías. Impresión de los resultados del antibiograma: Los resultados del antibiograma pueden imprimirse. - Pulsar la tecla <F4>. - Pulsar la tecla <F1>.

PNT 34 Api MiniApi -...

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