LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS

MOLEKULINĖS BIOLOGIJOS KATEDRA

VILŪNĖ ATKOČIŪNAITĖ

PLAZMINOGENO AKTYVATORIAUS INHIBITORIAUS (I)

GENOTIPO ĮTAKA KREŠĖJIMO SISTEMOS AKTYVUMUI

LIGONIAMS, SERGANTIEMS IŠEMINE ŠIRDIES LIGA

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Vacis Tatarūnas

KAUNAS, 2016

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS

MOLEKULINĖS BIOLOGIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. Dr. Vitalis Briedis

PLAZMINOGENO AKTYVATORIAUS INHIBITORIAUS (I)

GENOTIPO ĮTAKA KREŠĖJIMO SISTEMOS AKTYVUMUI

LIGONIAMS, SERGANTIEMS IŠEMINE ŠIRDIES LIGA

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Dr. Vacis Tatarūnas

Darbą atliko

Magistrantė

Vilūnė Atkočiūnaitė

Recenzentas

KAUNAS, 2016

3

TURINYS

SANTRAUKA ..................................................................................................................................................... 5

SUMMARY ......................................................................................................................................................... 6

1. SANTRUMPOS ............................................................................................................................................ 8

SĄVOKOS ........................................................................................................................................................... 9

2. ĮVADAS ...................................................................................................................................................... 10

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ....................................................................................................... 11

Darbo uždaviniai: ....................................................................................................................................................... 11

4. LITERATŪROS APŽVALGA ...................................................................................................................... 12

4.1 Plazminogenas ....................................................................................................................................... 12

4.2 Fibrinolizės aktyvinimas ....................................................................................................................... 13

4.3 Sąveika tarp PAI-1 ir t-PA su fibrinu .................................................................................................. 14

4.4 PAI-1 genų polimorfizmas .................................................................................................................... 14

4.4 IŠEMINĖ ŠIRDIES LIGA .................................................................................................................... 16

4.6 ASPIRINAS .......................................................................................................................................... 17

4.6.1 Veikimo mechanizmas ...................................................................................................................................... 17

4.6.2 Farmakologija .................................................................................................................................................... 18

4.5 Darbe naudotų metodų apžvalga ........................................................................................................... 18

4.5.1 DNR tyrimas, ekstrakcija: ................................................................................................................................. 18

4.5.2 DNR polimorfizmo nustatymas: DNR išskyrimas ............................................................................................ 18

4.5.3 DNR kokybės nustatymas ........................................................................................................................... 19

4.5.4 Tikro laiko PGR .......................................................................................................................................... 19

5. TYRIMO METODIKA IR METODAI ...................................................................................................... 21

5.1. Tyrimų objektas .................................................................................................................................... 21

5.2 Trombocitų agregacijos tyrimas su adenozindifosfatu ir epinefrinu ..................................................... 23

5.3 Genotipo tyrimas tikro laiko PGR metodu ........................................................................................... 23

5.3 Sekoskaitos metodo taikymas tikro laiko PGR metodo patvirtinimui .................................................. 24

4

5.3.1Pradmenų kūrimas .............................................................................................................................................. 25

5.3.2 Statistinė analizė ................................................................................................................................................ 26

6. REZULTATAI IR JŲAPTARIMAS .......................................................................................................... 27

6.1 PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui ................................................................. 27

6.2 Greta vartojamų vaistų ir genotipo įtaka trombocitų agregacijai .......................................................... 28

6.3 PAI-1 4G alelio itaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui ................................................................ 31

6.4 Tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo pasiskirstymas tarp vyrų ir moterų ............................................ 32

REZULTATŲ APTARIMAS ............................................................................................................................ 34

7. IŠVADOS ................................................................................................................................................... 36

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS .......................................................................................................................... 37

5

SANTRAUKA

Vilūnės Atkočiūnaitės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr.Vacis Tatarūnas; Lietuvos

sveikatos mokslų universiteto, Kardiologijos institutas, Molekulinės biologijos laboratorija– Kaunas.

Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitoriaus (I) genotipo įtaka krešėjimo sistemos aktyvumui

ligoniams, sergantiems išemine širdies liga.

Tikslas: Šio darbo tikslas nustatyti kokią įtaką daro (I) tipo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius kraujo krešėjimo

sistemos aktyvumui.

Uždaviniai: 1. Nustatyti PAI-1 4G/5G genotipo įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į trombocitų

agregacijos, paveikus ADF ir ADR rodiklius, bei TNS.

2. Nustatyti bendrą PAI-1 4G/5G genotipo ir greta vartojamo antiagreganto aspirino įtaką kraujo krešėjimo

sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į trombocitų agregacijos, paveikus ADF ir ADR rodiklius, bei TNS.

3. Įvertinti tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo dažnį vyrams ir moterims.

Tyrimo metodika: Tyrimo metu tirti tie ligoniai, kuriems po atliktų širdies vožtuvų operacijų buvo

skiriamas gydymas antiagregantais ir antikoaguliantais. Visiems ligoniams buvo nustatytas PAI-1 4G/5G -

675 (rs1799889) geno polimorfizmas tikro laiko PGR metodu. Trombocitų agregacija vertinta paveikus

agregacijos induktoriais ADF ir ADR Vertintas tarptautinis normalizuotas santykis – TNS.

Rezultatai: Nustatėme naują biožymenį, kuris daro reikšmingą įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui,

gydant ligonius antikoaguliantais ir antiagregantais po širdies vožtuvų operacijos. PAI-1 darė statistiškai

reikšmingą įtaką TNS rodikliui. Ligoniai, turintys 5G/5G turėjo aukštesnius TNS 2,7± 1,29, palyginus su

ligoniais, turinčiais 4G/5G TNS 1,70± 0,69 (p=0,003) . Nustatėme tendenciją (p= 0, 07), kad ligoniai,

turintys 4G/4G taip pat turėjo žemesnius TNS - 1, 90± 0, 61, nei 5G/5G turintys.

Išvados: Rezultatai parodė, kad aukštesnius TNS rodiklius turėjo 5G/5G ligoniai, nei 4G/5G ar 4G/4G

turintys ligoniai. Greta vartojamas aspirinas šio tyrimo metu nedarė reikšmingos įtakos kraujo krešėjimo

sistemos aktyvumui. PAI-1 4G/5G genotipo dažnis vyrams ir moterims reikšmingai nesiskyrė.

6

SUMMARY

Vilūnė’s Atkočiūnaitė’s master's Final Thesis / research leader dr.Vacis Tatarūnas; Lithuanian University of

Health Sciences, Institute of Cardiology, Laboratory of Molecular Biology , Kaunas.

Plasminogen activator inhibitor (I) genotype influence to coagulation system activity to patients with

coronary heart disease.

The aim: The aim of this research is to set how (I) type of plasminogen activator inhibitor do the influence to the

blood coagulation system activity.

The objectives of the study 1) To identify PAI-1 4G / 5G genotype effect for the blood coagulation system

activity, according to platelet aggregation, exposured by ADP, ADR indicators and INR.

2) To identify the total PAI-1 4G / 5G genotype and adjacent used antiaggregant aspirin effect on the blood

coagulation system activity, according to platelets aggregation, exposured with ADP, ADR indicators and

TNS.

3) To evaluate examined patients PAI-1 4G / 5G genotype frequency in men and women.

Research methodology: During the test we examined the patients who after valve surgery were being

treated with atiagreggants and anticoagulation drugs. The aim of our study was to evaluate the association of

clinical and genetic factors with coronary artery occlusion in patients with myocardial infarction.All patients

had the PAI-1 4G / 5G -675 (rs1799889) polymorphisms detection was achieved by using Sanger sequencing

in a sample. Platelet aggregation was evaluated after exposure aggregation inducers of ADP and ADR.

Evaluated the international normalized ratio - INR.

Results: We found new biomarkers that have a significant impact on the blood coagulation system activity in

patients who were in treatment with anticoagulants and antiplatelets after heart valve surgery. PAI-1 had a

statistically significant effect on INR. Patients with 5G / 5G, had a higher INR 2.7 ± 1.29 compared with

patients having a 4G / 5G INR 1.70 ± 0.69 (p = 0.003). However we determined a tendency (p = 0, 07) that

patients with the 4G / 4G also had lower INR 1, 90 ± 0, 61 comparing with 5G / 5G.

Conclusion:

The results showed that higher INR indicators had 5G / 5G patients than the 4G / 5G or 4G / 4G patients.

In addition used aspirin in this study had no significant effect to the blood coagulation system activity.

The frequency of PAI-1 4G / 5G genotype in men and women was not significantly different.

7

PADĖKA

Noriu padėkoti savo magistrinio darbo vadovui Gerb. dr. V.Tatarūnui, kuris visapusiškai rėmė,

konsultavo įvairias klausimais ir labai daug padėjo rašant magistrinį darbą. Taip pat nuoširžiai dėkoju LSMU

Kardiologijos instituto molekulinės biologijos laboratorijos darbuotojams už Tai, kad padėjo rinkti pirminius

duomenis.

8

1. SANTRUMPOS

ADP Adenozino difosfatas

ADR Epinefrinas

COX-1 Ciklooksigenazė – 1

CYP19 Citochromo P450šeimos fermentas, aromatazė

DNR Deoksiribonukleorūgštis

iRNR Informacinė RNR

IŠL Išeminė širdies liga

PAI-1 Pirmojo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius

PGR Polimerazės grandininė reakcija

RNR Ribonukelinorūgštis

TNS Tarptautinis Normalizuotas Santykis

tPA Audinių plazminogeno aktyvatorius

uPA Urokinazės plazminogeno aktyviklis

UV Ultravioletiniai spinduliai

9

SĄVOKOS

Aleliai- skirtingi geno variantai, susidarantys dėl mutacijų lytinėse ląstelėse.

Aterosklerozė- lėtinė arterijų sienelės liga; nepastebimai prasidedantis ir tyliai besivystantis arterijų

standėjimo bei siaurėjimo procesas

Elektrofarezė- tai krūvį turinčių molekulių judėjimas elektriniame lauke.

Fibrinolizė- Procesas, kurio metu, veikiant trombinui vyksta fibrino krešulio ardymas

Glikoproteinai- baltymų molekulės, susijungusios su viena ar daugiau oligosacharidų molekulių

PGR – polimerazinė grandininė reakcija Molekulinės biologijos metodas, leidžiantis padauginti DNR in

vitro

Proteazės - fermentai, dalyvaujantys baltymų skaidyme

Termocikleris- prietaisas, kuriuo atliekamas PGR

10

2. ĮVADAS

Šiuolaikinė medicina sparčiai tobulėja ir genetikos atžvilgiu vis daugiau naujų variacijų papildo jau

atrastąjį racioną. Visoje Europoje IŠL yra svarbiausia mirties priežastis. Tačiau mirtingumo rodikliai tarp

šalių ir pačių šalių viduje labai skiriasi. Kaupiantis išeminės širdies ligos epidemiloginių tyrimų duomenims

pastebėta, kad ypač kai kurie veiskniai didina riziką susirgti šia liga. Daug tyrimų atlikta ir įrodyta, kad ligai

atsirasti reikšmės turi gyvensena: netinkama mityba, rūkymas, fizinis pasyvumas. Minėti veiksniai skatina

aterosklerozinius pokyčius. Ypač reikmšingas šiuo atvejus yra ir paveldėjimas, nes jo įtaką stiprina

netikamas gyvenimo būdas [1.1].

Šio tyrimo metu bandžiau nutatyti kaip vienas baltymas gali veikti žmogaus kraujo sistemą.

Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius-1 (PAI-1) yra gyvūninis baltymas, dalyvaujantis kraujo krešėjimo

sistemoje. Jis reguliuoja krešulių tirpinimą-fibrinolizę. Sumažėjus PAI-1 koncentracijai kraujyje suaktyvėja

fibrinolizė[2]

XX amžiuje buvo atrasta,kad rizika susirgti širdies ir kraujayslių ligomis įtakoja PAI-1 aktyvumas kraujo

sistemoje.Atlikus daug tyrimų pastebėta,kad arterijose PAI-1 aktyvumas ženkliai didesnis nei venų

trombuose. Ligoniams sergantiems cukriniu diabetu, nutukusiems žmonėms PAI-1 aktyvumas taip pat buvo

didesnis nei tiems,kurie nesirgo. Nagrinėti genotipų variantai,kurie gali turėti įtakos šio fermento aktyvumui,

daugiausia tyrimų atlikta su PAI-1 675 4G/5G. 5G/5G turinčiais asmenimis PAI-1 aktyvumas laikomas

normaliu. Ligoniams su 4G/5G ir 4G/4G PAI-1 aktyvumas padidėjęs, jie dažniau serga miokardo

infarktu,cukriniu diabetu.

Dažniausiai po atliktų širdies vožtuvų operacijų yra skiriamas gydymas antiagregantais (dažniausiai

klopidogreliu ir aspirinu) ir antikoaguliantais (varfarinu) , tačiau neretai šie vaistai veikia ne taip, kaip to iš

jų tikimąsi - yra įrodyta, kad antiagregantų veikimas priklauso nuo žmogaus genuose užkoduotos

informacijos bei aplinkos įtakos [1.3]. Genai koduoja tam tikrų kepenų fermentų išsiskyrimą, kurie lemia

viokį ar kitokį vaisto metabolizmą , poveikį [1.4]. Taigi, pagrindinė darbo problema yra ta, kad vaistų

norimas poveikis ne visada būna toks kokio norėtumėme ir tai priklauso nuo žmogaus genų. Todėl labai

svarbu ištirti kurie genai įtakoja vaistų poveikį tam, kad būtų galima parinkti kuo veiksmingesnį gydymą.

Darbo tikslas:

Nustatyti kokią įtaką daro (I) tipo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius kraujo krešėjimo sistemos

11

aktyvumui.

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Šio darbo tikslas nustatyti kokią įtaką daro (I) tipo plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius kraujo

krešėjimosistemos aktyvumui.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti PAI-1 4G/5G genotipo įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į

trombocitų agregacijos, paveikus ADF ir ADR rodiklius, bei TNS.

2. Nustatyti bendrą PAI-1 4G/5G genotipo ir greta vartojamo antiagreganto aspirino įtaką kraujo

krešėjimo sistemos aktyvumui, atsižvelgiant į trombocitų agregacijos, paveikus ADF ir ADR

rodiklius, bei TNS.

3. Įvertinti tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo dažnį vyrams ir moterims.

12

4. LITERATŪROS APŽVALGA

4.1 Plazminogenas

Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius-1 (PAI-1) (1 pav. ) yra gyvūninis baltymas, dalyvaujantis kraujo

krešėjimo sistemoje. Jis reguliuoja krešulių tirpinimą-fibrinolizę. [1] Sumažėjus PAI (I) koncentracijai

kraujyje suaktyvėja fibrinolizė. Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius (PAI-1) yra vienos grandinės

glikoproteinas (45 kDa) priklausantis serino proteazės inhibitoriaus narių super šeimai. Plazminogenas ir jo

aktyvatoriai priklauso antikoaguliacijos sistemai. Plazminogeno aktyvatoriai (inkstų audinio ir šlapimo

urokinazė,audinių plazminogeno aktyvatorius) sintezuojasi ir kaupiasi ląstelėse ir esant reikalui išskiriami į

kraują.[1.]

1 Pav. Plazminogeno aktyvatoriaus inhibitorius PAI-1

PAI-1 yra linijinis glikoproteinas, kuris yra sudarytas iš 379 amino rūgščių ,kurio molekulinė masė 48.000.

Jis greitai jungiasi su t-PA ir šlapimo tipo plazminogeno aktyvatoriais,todėl yra labai svarbus fibrinolizės

lygio cirkuliacijoje reguliatorius.[2] ( 2 pav.) PAI-1 koncentracijos padidėjimas ypač rytinėmis valandomis

kraujo plazmoje yra siejamas su padidėjusia trombozių rizika minėtu paros laikotarpiu.Veiklioji forma PAI-1

yra nestabili, skilimo pusperiodis tik 30 minučių. Aktyvi PAI-1 forma yra greitai veikiantis plazminogeno

aktyvatoriaus inhibitorius, kuris yra sintetinamas kraujagyslių endotelyje, tačiau randamas ir ant trombocitų

paviršiaus.[3]Kai trombocitai yra stimuliuojami trombino, PAI-1 išleidžiamas ant trombocitų paviršiaus,

saugant kraujo krešulį nuo priešlaikinio irimo. Šis mechanizmas sukelia greitą PAI-1 koncentracijos

13

padidėjimą kraujyje. Trombinas taip pat stimuliuoja PAI-1 sintezę endotelio ląstelėse.[4]

2 pav. PAI -1 įtaka fibrinolizei . tPA ir UPA aktyvuoja plazminogeno pavertimą į plazminą, kuris reaguoja

su fibrinu ir sukelia jo degradaciją. PAI-1 veikia kaip pagrindinis reguliatorius fibrinolizėje, slopindamas

tPA ir UPA per kovalentinę jungtį. Žalios rodyklės žymi aktyvaciją , raudonos rodyklės žymi slopinimą. [5]

PAI-1 taip pat yra susijęs su kraujagyslių uždegimu ateroskleroze, ir metaboliniu sindromu, ,kuris šiuo

atveju yra padidėjęs. Suaktyvėjusi PAI-1 veikla buvo rasta tiriant aterosklerozę, ypač žmonėms,

kenčiantiems nuo nutukimo ir cukrinio diabeto II tipo. Tiriant ir lyginant ligonius,kurie sirgo cukriniu diabetu

ir turėjo išeminę širdies ligą su ligoniais, kurie cukriniu diabetu nesirgo , PAI-1 baltymo ląstelių rasta

daugiau ligonių kraujyje, kurie sirgo cukriniu diabetu [6]. Nustatyta, kad padidėjusi PAI-1 koncentracija yra

tiesiogiai susijusi su didesniu visceraliniu nutukimu. [7]

Taip pat didelė PAI-1 koncentracija yra susijusi su įvairiais krešėjimo sutrikimais [8,9] ir yra labai svarbus

faktorius priešinfarktinės būsenos stebėjimo metu pacientams, kuriems nustatytas miokardo infarktas iki 45

m. amžiaus[10].

4.2 Fibrinolizės aktyvinimas

Plazminas, fermentas, atsakingas už fibrino degradaciją, susidaro tada, kai plasminogenas iš dalies

yra suskaldomas t-PA ar šlapimo tipo plazminogeno aktyvatorių. Tiek plasminogenas ,tiek t-PA suriša

krešulį į vieną, net kai t-PA yra apsaugotas nuo slopinimo, kurį vykdo PAI-1. Šis procesas palengvina

plazminogeno aktyvaciją ir fibrino degradaciją. [11]

Plazminogenas

Plazminas

Fibrinas

Fibrino degradacijos produktai

14

4.3 Sąveika tarp PAI-1 ir t-PA su fibrinu

Kai fibrinolizės reakcijos vyksta ant trombosienelių paviršiaus, fibrinolizė yra apribota ir vyksta ne

taip sistemingai (3 pav.). Plazminogenas , t-PA ir fibrinas sudaro trijų komponentų kompleksą , kuris skatina

formavimąsi plazmino ir vėliau suirusio fibrino. Plazminas ir t-PA yra apsaugoti nuo inaktyvacijos dėl

atitinkamų inhibitorių a2 –antiplazmino ir PAI-1. Tačiau PAI-1 taip pat jungiasi su fibrinu. Jungdamasis jis

išlaiko savo aktyvumą, slopina nuo t-PA ir u-PA.PAI-1 fibrinolizėje. Monokloninių antikūnų jungimasis

prieš PAI-1 formuojant trombus skatina fibrinolizę ir sumažina trombų augimą.[12.]Kraujo apytakoje,

didelė dalis t-PA yra apribojama PAI-1, nors tik maža dalis yra laisva arba susijungusi su fibrinu.[13]

3 pav. Audinių plazminogeno aktyvatorius (t-PA) cirkuliuoja kraujo plazmoje kaip kompleksas su

plazminogeno-aktyvatoriaus inhibitoriumi 1 (PAI-1) A santykiu 1: 1. Fibrino krešulys suteikia paviršių ,

ant kurio gali vykti reakcijos. Plasminogenas aktyvuojamas t-PA ar šlapimo tipo plazminogeno

aktyvatoriaus (u-PA). Plazminogenas, t-PA, ir fibrinas sudaro trijų komponentų kompleksą, kuris

skatina plazmino susidarymą. PAI-1 taip pat jungiasi su fibrinu ir susijungęs išlaiko savo inhibitoriaus

aktyvumą prieš t-PA. a2-antiplazminas susijungęs su fibrinu kryžminiškai pagal XIII faktorių.

4.4 PAI-1 genų polimorfizmas

Žmogaus PAI-1 genas randamas 7 chromosomoje ir yra sudarytas iš devynių egzonų ir aštuonių

intronų. Duomenys apie PAI-1 genotipo įtaką krešėjimui ir kraujavimui yra įvairiapusiai. 4G alelis yra

Faktorius XIII

fibrinas

Plazminogeno

aktyvatorius

Netirpus

fibrinas

Plazminogenas Plazminas

trombinas Faktorius XIII Fibrino degradacijos

produktai

Fibrino gijos

Fibrino gijos

Tirp

us

fibri

nas

α²

Antiplazminas

t-Pa ir PAI-1

kompleksas

15

vadinamas protrombiniu aleliu, jo buvimas siejamas su tromboembolinėmis komplikacijomis. [14]

Medicininėje literatūroje aptinkama duomenų, kad heterozigotinis genotipas, priešingai nei homozigotinis

4G/4G, yra susijęs su didesne fibrinolize, nes mažiau slopina audinių plazminogeno aktyvatorių. [15].

Žinoma, kad 5G alelį turintys pacientai turi labiau išreikštą fibrinolizę bei mažesnes PAI-1 koncentracijas

kraujo plazmoje [16]. 4G/5G genotipas yra tromboembolinių komplikacijų rizikos faktorius, kaip ir 4G/4G

genotipas yra reikšmingai susiję su padidėjusia giliųjų venų trombozių rizika, o pats 4G alelis yra siejamas su

hiperkoaguliacijos išsivystymu [17].

Išskiriami trys PAI-1 genetiniai polimorfizmo tipai. Polimorfizmas apibūdinamas pagal tai, kiek

guanozino sekų turi alelių pora. Galimi variantai – aleliai, turintys po penkias arba po keturias guanozino

sekas (GGGG arba GGGGG) taip pat galimi turintys mišrius alelius. Pacientai, turintys alelius su dvejomis 4

guanozino sekomis (4G/4G), yra vadinami homozigotiniais, kaip ir po penkias guanozino sekas (5G/5G)

turintys pacientai. Mišrius alelius turintys pacientai vadinami heterozigotiniais pagal PAI-1 genotipą. [18]

4G/5G polimorfizmas -675 pozicijoje veikia transkripciją bei PAI-1 koncentraciją kraujo plazmoje.

Padidėjusi geno transkripcija yra susijusi su keturiomis guanino bazėmis (4G alelis) bei sąlygoja tik

transkripcinio aktyviklio prisijungimą prie aktyvatoriaus. (4 pav.) Dėl to PAI-1 koncentracija kraujo

plazmoje didėja. Penkios guanino bazės (5G alelis) susijusios ne tik su transkripcijos aktyviklio prisijungimu,

tačiau ir su baltymo slopintojo prisijungimu prie aktyvatoriaus, dėl to transkripcijos aktyviklio prisijungimas

sumažėja. Tokiu keliu mažėja PAI-1 inhibitoriaus koncentracija kraujo plazmoje. [19]Nustatyta, kad tokių

pacientų kraujo plazmoje yra gerokai padidėjęs PAI-1 aktyvumas (kai kurių autorių duomenimis – net iki 25

proc.[20] ), o fibrinolizė yra stipriai slopinama, lyginant su 5G homozigotiniais ar su 4G/5G heterozigotiniais

pacientais. 5G homozigotinių bei heterozigotinių PAI-1 fenotipų fibrinolizė yra slopinama mažiau, todėl

fibrinolitinis aktyvumas pas šiuos pacientus būna didesnis [21]

16

4 pav. PAI-1 geno struktūra ir 4G/5G genotipo vieta aktyvatoriaus regione [11]

4.4 IŠEMINĖ ŠIRDIES LIGA

Išeminė šidies liga- Išeminė šidires liga (IŠL) yra ūminis ar lėtinis sutrikimas, kuris atsiranda

sumažėjus miokardo aprūpinimui arteriniu krauju ir pasireiškia ūminiais ar lėtiniais išeminias sindromais.

Klinikiniai požymiai išryškėja, jei ateroskelrozinė plokštelė trikdo vainikinių arterijų hemodinamiką .

Išeminės širdies ligos pradžia besimptomė. Atsiranda kraujagyslių sienelės pažeidimų, kuriems įtakos turi

infekcijos sukeltas uždegimas. Ant pažeistos vidinės sienelės prilimpa kraujo plokštelės ir leukocitai. Vėliau

išsiplečia lygiųjų raumenų ląstelės, kaupiasi lipidai, ištinka arterijų sienelės hipoksija (deguonies stygius), o

vėliau ir nekrozė.

Tuo tarpu ant kraujagyslės sienelės, iš vidinės jos pusės, formuojasi ateroma, o jai įplyšus –trombas. Jam

atitrūkus ir krauju nukeliavus toliau nuo pažeidimo vietos, atsiranda organo ar kūno dalies išemija. Trombui

pasiekus širdį maitinančias kraujagysles, žmogų ištinka ūmus miokardo infarktas [22].

Vainikinės Arterijos

Plokštelės susiaurina kraujo pratekėjimą į vainikines arterijas

17

5 pav. Žmogaus širdis . Vainikinėse kraujagyslėse plokštelės susiaurino kraujo pratekėjimo spindį.

Išeminės širdies ligos klasifikacija :

Remianti 10 Tarptautine statistine ligų klasifikacija / PSAO,1992 / , IŠL skirstoma:

120. Krūtinės angina

121.Ūminis miokardo infarktas

122. Kartotinis miokardo infarktas

123.Ūminio miokardo infarkto komplikacijos

124. Kitos ūminės IŠL formos

125. Lėtinė išeminė širdies liga [22]

4.6 ASPIRINAS

Aspirinas yra vienas geriausiai rinkoje ištyrinėtų preparatų. Šis vaistas jau keletą

dešimtmečių plačiai naudojamas kardiologų ir neurologų klinikinėje praktikoje visame pasaulyje.

Aspirinas daugiau nei 50 šalių yra pripažintas kaip geriausia prevencinė priemonė siekiant

apsisaugoti nuo pirmojo širdies smūgio ar insulto.

4.6.1 Veikimo mechanizmas

Acetilsalicilo rūgštis negrįžtamai slopina ciklooksigenazę – 1 (COX–1), kuri arachidono

rūgštį verčia į prostaglandiną H2. Šis prostaglandinas skatina tromboksano A2 susidarymą, kuris

jungiasi prie TXA2 receptorių ir sukelia krešėjimo procesus. TXA2 sintezė yra trombocitų atsakas į

18

tokius dirgiklius kaip kolagenas, trombinas ir adenozindifosfatas. Aspirinas blokuoja COX-1

susidarymą ir stabdo trombocitų agregaciją [30-31]

4.6.2 Farmakologija

Suaugusiems aspirinas rekomenduojamas 3-4 kartus per dieną 1-2 tabletes (500-1000 mg),

didžiausia paros dozė – 6 tabletės (3 g). Išgėrus vaisto per os, jis greitai absorbuojamas iš skrandžio

ir dvylikapirštės žarnos. Vaisto bioprieinamumas maždaug 50%. Aukščiausia koncentracija

plazmoje pasiekiama apytiksliai po 1 val. Pusinis eliminacijos laikas apie 20 min. Iš organizmo

pašalinamas per kepenis. [32]

4.5 Darbe naudotų metodų apžvalga

4.5.1 DNR tyrimas, ekstrakcija:

DNR (Deoksiribonukleorūgštis)- nukleorūgštis, kuri koduoja genetinę informaciją.

Deoksiribonukleorūgštis susideda iš nukleotidų – deoksinukleotidas ir deoksiribunukleotidas tuo tarpu

deoksinukleotidai iš 4 skirtingų azoto bazių: Adeninas (A) , timinas (T), guaninas (G) ir citozinas (C) . Azoto

bazės jungdamosis komplementariai sudaro tiltelius, tiltelių sąjuga sudaro erdvinę dvigubą spiralę.

Deoksiribonukleotidą sudaro heterociklinės azoto bazės ir angliavandenis deoksiribozė.[23]

Polimorfizmas – tai sąvoka, kuri apibūdina įvairių organizmų tam tikrų formų variacijas ir padeda atskirti

vienas organizmų rūšis nuo kitų. Genetikai naudoja sąvoką genetinis polimorfizmas, kuris apibūdina savitą

DNR seką. Ši seka kiekvieno žmogaus genomą padaro unikaliu [24]

4.5.2 DNR polimorfizmo nustatymas: DNR išskyrimas

DNR ekstrakcija – Tai procesas, kurio metu DNR yra išskiriama iš kraujo ar kitų audinių.

Tik išskyrus DNR galima nustatyti jos polimorfizmą. DNR ekstrakcija atliekama šiais etapais:

1. Ląstelių suardymas naudojant fizikinius ir cheminius metodus – maišymą, malimą, ultragarsą.

2. Lipidų pašalinimas iš membranų pridedant detergentų ar surfaktantų, kurie atlieka ląstelių lizę.

3. Baltymų pašalinimas pridedant proteazių.

4. RNR pašalinimas pridedant RNazių. [25]

19

4.5.3 DNR kokybės nustatymas

Norint nustatyti ar po DNR ekstrakcijos tiriamąjame mėginyje nėra priemaišų, yra

atliekamas kokybinis nustatymas. Šis nustatymas atliekamas gel-elektroforezės tyrimu.

Elektrofarezė – tai krūvį turinčių molekulių judėjimas elektriniame lauke. DNR ir

RNR molekulė yra įkrauta teigiamai, todėl elektriniame lauke juda link neigiamo elektrodo. [26].

Nustatant DNR kokybę šiuo metodu visų pirma pagaminamas agarozės gelis, kuris dedamas į

vonelę, pripildytą buferio (6 paveikslas). Į agarozės gelio šulinėlius įterpiami pavyzdžiai, kurie prieš

tai sumaišomi su tam tikru dažu (etidžio bromidu). Tuomet vonelė uždengiama ir įjungiamas

maitinimo blokas. Kuomet dažai pasiekia tam tikrą ribą arba gelio pabaigą, tuomet elektros

energijos šaltinis išjungiamas. Po elektroforezės agarozės gelis atsargiai išimamas iš vonelės ir

dedamas į UV šviestuvą, kuriame gelis vizualizuojamas ir nufotografuojamas [27].

6 pav. Gel elektoroforezės vonelė

4.5.4 Tikro laiko PGR

PGR - tai šiuolaikiškas ir modernus molekulinės biologijos metodas, įgalinantis tiksliai,

greitai ir patikimai gauti norimą rezultatą.Be dažniausiai naudojamo PGR galima išskirtitikro laiko

20

PGR. Tikro laiko PGR metodas atliekamas kaip ir tradicinis PGR, tačiau turi kelis skirtumus (7

paveikslas).

7 pav. Tikro laiko PGR reakcijos pagrindinė linija ir slenkstis [27]

(Applied biosystems, life technologies. Real-time PCR handbook)

Tikro laiko PGR gausinimo stebėjimui pasitelkiame fluoresncenciją. Metodas plačiai

taikomas: kiekybiniams genų nustatymams, kokybės kontrolei ir tyrimų validacijai, patogenų

aptikimui, genotipavimui, kopijų kiekio variacijoms, virusų kiekiui. Įprastas PGR metodas turi

daugiau trūkumų :mažiau tikslus, nejautresnis , žema rezoliucija, rezultatai neišreiškiami skaičiais.

Tikro laiko PGR turi didesnį dinaminį aptikimo diapazoną, aptikimo riba keičiasi iki dviejų kartų,

augimo fazė yra eksponentiška [29].

Slenkstis

Pagrindinė

linija

Ciklo numeris

21

5. TYRIMO METODIKA IR METODAI

5.1. Tyrimų objektas

Tyrimo kriterijus atitinkantys ligoniai būdavo atrenkami stacionare, gydytojo pokalbio su ligoniu

metu. Į tyrimą įtraukti ligoniai, kurie sutiko dalyvauti tyrime bei pasirašė sutikimo formas. Buvo įtraukti tie

ligoniai, kuriems po atliktų širdies vožtuvų operacijų buvo skiriamas gydymas antiagregantais (dažniausiai

klopidogreliu ir aspirinu) ir antikoaguliantais (varfarinu) ne mažiau kaip 3 mėnesių laikotarpiui. Ligoniui

grįžus iš reabilitacijos įstaigos, praėjus ne mažiau kaip 3 mėnesiams, ligonis buvo kviečiamas atvykti

tyrimams. Į tyrimą itraukti 49 asmenys, iš jų 30 vyrų (61.23%) ir 19 moterų (38,77%), (1 lentelė).

1 Lentelė.

Rodiklis Vyrai Moterys Bendras vidurkis

Amžius 65,37 ± 9,82 66,53 ± 13,35 65,82 ± 11,2

Svoris 86,23 ± 13,62 74,68 ± 10,69 81,76 ± 13,69

TNS 1,98 ± 0,98 2,04 ± 0,92 2,01 ± 0,95

ADP 71,40 ± 18,32 79,21 ± 12,09 74,43 ± 16,50

ADR 74,07 ± 24,30 83,11 ± 21,07 77,57 ± 23,31

TNS -Tarptautinis Normalizuotas Santykis

ADP – trombocitų agregacija paveikus adenozindifosfatu

ADR – trombocitų agregacija paveikus epinefrinu

22

Visiems tyrime dalyvauti pakviestiems ligoniams buvo nustatytas PAI-1 4G/5G -675 (rs1799889)

geno polimorfizmas tikro laiko PGR metodu. Trombocitų agregacija (TA) vertinta paveikus agregacijos

induktoriais ADF (adenozindifosfatu) ir ADR (epinefrinu).

Ligonių kraujas tyrimams būdavo imamas LSMU MA Kardiologijos poliklinikoje. Į du 4,5 ml tūrio

kraujui imti skirtus mėgintuvėlius su natrio citratu buvo imamas kraujas trombocitų agregacijos tyrimams

atlikti. Į 1 mėgintuvėlį su koaguliantu imamas kraujas biocheminiams tyrimams. Į vieną 3 ml tūrio

mėgintuvėlį su kalio etildiaminotetraacetatu imamas kraujas hematologiniams tyrimams.

Ligoniai buvo sveriami, matuojamas jų ūgis.

Gydytojas kardiologas apžiūrėdamas ligonį surinkdavo šiuos duomenis:

1. Įvertindavo gretutines ligas

2. Vartojamus vaistus ir jų dozę.

3. Ligonio įpročius, vartojamus maisto papildus

23

5.2 Trombocitų agregacijos tyrimas su adenozindifosfatu ir epinefrinu

Tyrimas trombocitų funkcijai nustatyti buvo atliekamas LSMU MA Kardiologijos instituto

Molekulinės kardiologijos laboratorijoje, remiantis validuotu, standartiniu Born`o metodu, paveikus ADF

(adenozindifosfatu) ir ADR (epinefrinu). Trombocitų agregacijai sužadinti naudotas ChronoLog (JAV) ADF

(3,8 mmol/l) ir epinefrinas (3,8 mmol/l).

Tyrimas atliktas naudojant agregometrą „Chrono-Log 490-2D“ (JAV), matuojant trombocitinės

plazmos optinio tankio pokytį agregacijos eigoje, lyginant su betrombocitine plazma, kurios šviesos

pralaidumas laikytas lygus 100 proc. Pokytis išreikštas kaip agregacijos procentas (proc.agr).

Trombocitinė plazma ruošta centrifūguojant 100G 15 min. Betrombocitinė plazma, iš kurios pašalinti

trombocitai, ruošta pakartotinai centrifūguojant trombocitinę plazmą 1000G 30 min.

5.3 Genotipo tyrimas tikro laiko PGR metodu

Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos instituto

Molekulinės kardiologijos laboratorijoje naudojant tikro laiko PGR termociklerį ABI 7900HT Fast Real-

Time PCR (ABI, JAV) bei komercinius Taqman molekulinius žymenis (LifeTechnologies, JAV), skirtus

PAI-1 rs1799889 polimorfizmui tirti.

Tikro laiko polimerazės grandininė reakcija atlikta standartinėmis gamintojo rekomenduojamomis

sąlygomis (laikantis temperatūros režimo bei sudėtinių reakcijos komponentų koncentracijų, pagal gamintojo

pateiktą protokolą). Naudotas universalus Taqman 2x (LifeTechnologies, JAV arba Thermo Fisher Scientific,

Lietuva) mišinys. Tirtosios DNR buvo imama 10ng, kaip ir rekomenduojama gamintojo.

Kiekvieną kartą atliekant reakcijas, siekiant išvengti klaidų, buvo dedami sekoskaitos būdu nustatytų

genotipų standartai. Standartinės reakcijos sąlygos genotipavimo reakcijai paruošti :

1. TAQMAN žymenų - 1,25µl (20x) (Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė)

2. Taqman 2x universalaus reakcijos mišinio – 12,5µl (Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė arba

Thermo Fisher Scientific, Lietuva)

24

3. PGR grynumo vandens - 10,25µl (Fermentas, Lietuva)

4. 1 µl ligonio genominės DNR (10 ng/tyrimui).

8 pav. Rezultatų vaizdinimas tikro laiko PGR metodu

5.3 Sekoskaitos metodo taikymas tikro laiko PGR metodo patvirtinimui

Sekoskaita atlikta Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Kardiologijos

instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje naudojant 8 kapiliarų ABI 3500 Genetic Analyzer

sekvenatorių (ABI, JAV). Sekoskaitai atlikti naudoti 3500 serijai skirti reagentai ir priemonės. Sekoskaitos

būdu buvo identifikuojami 3 skirtingą genotipą turintys ligoniai, kurių DNR naudota tikro laiko PGR reakcijų

atlikimo patikrinimui.

25

2 Paveikslas. 4G/4G homozigotas

3 Paveikslas. 4G/5G heterozigotas

4 Paveikslas. 5G/5G homozigotas

5.3.1Pradmenų kūrimas

Sekos pradmenų kūrimui buvo paimtos iš JAV Nacionalinio biotechnologinės informacijos centro

(National Center for Biotechnology Information, JAV) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Pradmenys reikiamam

geno fragmentui pagausinti, buvo kuriami atsižvelgiant į pradmenų kūrimo taisykles [1].

26

Sekoskaitos reakcijų paruošimas ir sekoskaita:

1. DNR pagausinamas įprastinio PGR metodu. Dedami sekai specifiniai pradmenys

2. Reakcijos mišinys valomas silikagelio kolonėlėmis, skirtomis pašalinti reakcijos liekanas. Gel-

elektroforezės metodu frakcionuojamas PGR produktas ir vertinama jo kokybė.

3. Ruošiamas reakcijos mišinys su BigDye (LifeTechnologies, JAV) terminatoriumi, kuris į seką įterpia

dideoksinukleotidus

4. Reakcijos mišinys valomas specialiomis kolonėlėmis, skirtomis pašalinti reakcijos komponentų

liekanas

5. Reakcijos mišinys dedamas į specialiai tam skirtas reakcijos plokšteles ir nuskaitomos fragmentų

sekos. Vertinamas ir interpretuojamas rezultatas.

5.3.2 Statistinė analizė

Tyrimo rezultatai pateikti kaip vidurkis±standartinis nuokrypis (SN). Ligonių genotipo dažnis

pateiktas procentais. Pearson`o χ2 ir Fisher`io tikslusis testas taikyti kategorinių kintamųjų analizei.

Skirtumas laikytas statistiškai reikšmingas, kai p≤0,05.

27

6. REZULTATAI IR JŲAPTARIMAS

Moterų ir vyrų amžius nesiskyrė, tačiau vyrai svėrė daugiau, nei moterys (1 lentelė). Trombocitų

agregacijos rodikliai paveikus ADP ir ADR buvo aukštesni moterims, nei vyrams.

6.1 PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui

Lyginome kraujo krešėjimo sistemos aktyvumą, atsižvelgiant į PAI-1 genotipą ir šiuos rodiklius:

ADP, ADR ir TNS. Šis genotipas nedarė jokios įtakos trombocitų agregacijos rodikliams, paveikus ADP ir

ADR. Duomenys pateikiami lentelėse 2, 3. PAI-1 darė statistiškai reikšmingą įtaką TNS rodikliui (4 lentelė

). Ligoniai turintys 5G/5G, kurių buvo 26, 5 proc. turėjo aukštesnius TNS 2, 7± 1, 29, palyginus su ligoniais,

turinčiais 4G/5G TNS 1, 70± 0, 69(p=0,003). Nustatėme tendenciją (p= 0, 07), kad ligoniai, turintys 4G/4G

taip pat turėjo žemesnius TNS 1, 90± 0, 61, nei 5G/5G turintys. 4G/4G ligonių buvo 22, 5 proc., o 4G/5G -

51proc.

2 lentelė. PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo aktyvumui pagal ADP

PAI-1 genotipas N (proc.) ADP vidurkis Standartinis nuokrypis

4G/4G 11 (22,45) 74.73 21.25

4G/5G 25 (51,02) 75.00 15.01

5G/5G 13 (26,53) 73.08 16.13

Iš viso 49 (100) 74.43 16.51

28

3 lentelė. PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo aktyvumui pagal ADR

PAI-1 genotipas N (proc.) ADR vidurkis Standartinis nuokrypis

4G/4G 11 (22,45) 82.91 17.97

4G/5G 25 (51,02) 78.92 22.67

5G/5G 13 (26,53) 70.46 28.12

Iš viso 49 (100) 77.57 23.31

4 lentelė. PAI-1 genotipo įtaka kraujo krešėjimo aktyvumui pagal TNS

PAI-1 genotipas N (proc.) TNS vidurkis Standartinis nuokrypis

4G/4G 11 (22,45) 1.90 0.61

4G/5G 25 (51,02) 1.70 0.69

5G/5G 13 (26,53) 2.70 1.29

Iš viso 49 (100) 2.01 0.95

Statistiškaireikšmingas skirtumas nustatytas tarp šių genotipų: 4G/5G vs 5G/5G: p=0,003;

4G/4G vs 5G/5G: p=0,071

6.2 Greta vartojamų vaistų ir genotipo įtaka trombocitų agregacijai

Lyginome ADP, ADR ir TNS reikšmes vartojantiems ir nevartojantiems aspiriną asmenims.

Lentelėse 5,6,7 matome ,kad aspirinas nedarė jokios įtakos kraujo krešėjimo aktyvumui atsižvelgiant į

ADP,ADR, TNS.

29

5 lentelė. PAI-1 genotipo ir kartu vartojamo aspirino įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui,

atsižvelgiant į ADP

PAI-1 genotipas Aspirinas N (proc.) ADP vidurkis Standartinis

nuokrypis

4G/4G Nevartojo 11 (100) 74.73 21.25

Iš viso 11(100) 74.73 21.25

4G/5G Nevartojo 23 (92) 75.57 15.08

Vartojo 2 (8) 68.50 17.68

Iš viso 25(100) 75.00 15.01

5G/5G Nevartojo 10 (76,9) 76.50 14.61

Vartojo 3 (23,1) 61.67 18.61

Iš viso 13(100) 73.08 16.13

Iš viso Nevartojo 44 (90) 75.57 16.32

Vartojo 5 (10) 64.40 16.29

Iš viso 49(100) 74.43 16.51

6 lentelė. PAI-1 genotipo ir kartu vartojamo aspirino įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui,

atsižvelgiant į ADR

PAI-1 genotipas Aspirinas N (proc.) ADR vidurkis Standartinis

nuokrypis

4G/4G Nevartojo 11 (100) 82.91 17.97

30

Iš viso 11(100) 82.91 17.9

4G/5G Nevartojo 23 (92) 82.09 20.04

Vartojo 2 (8) 42.50 24.75

Iš viso 25(100) 78.92 22.67

5G/5G Nevartojo 10 (76,9) 77.20 22.32

Vartojo 3 (23,1) 48.00 38.97

Iš viso 13(100) 70.46 28.12

Iš viso Nevartojo 44 (90) 81.18 19.75

Vartojo 5 (10) 45.80 30.36

Iš viso 49(100) 77.57 23.31

7 lentelė. PAI-1 genotipo ir kartu vartojamo aspirino įtaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui,

atsižvelgiant į TNS

PAI-1 genotipas Aspirinas N (proc.) TNS vidurkis Standartinis

nuokrypis

4G/4G Nevartojo 11 (100) 1.89 0.61

Iš viso 11(100) 1.89 0.61

4G/5G Nevartojo 23 (92) 1.76 0.68

Vartojo 2 (8) 1.01 0.01

Iš viso 25(100) 1.70 0.69

5G/5G Nevartojo 10 (76,9) 2.71 1.46

31

Vartojo 3 (23,1) 2.64 0.57

Iš viso 13(100) 2.69 1.29

Iš viso Nevartojo 44 (90) 2.01 0.96

Vartojo 5 (10) 1.97 0.99

Iš viso 49(100) 2.01 0.95

6.3 PAI-1 4G alelio itaka kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui

Lyginome ADP, ADR ir INR reikšmes atsižvelgiant į PAI-1 alelius. Alelis neturėjo jokios įtakos

ADP (8 lentelė) ir ADR (9 lentelė). 5G alelį turintiems asmenims TNS buvo aukštesnis , nei 4G alelį

turintiems asmenims (10 lentelė).5G alelį turintiems TNS buvo aukštesnis 2,70±1,29, palyginus su 4G alelį

turinčiais ligoniais – 1,76±0,66, p=0,0017.

8 lentelė. Kraujo krešėjimo sistemos aktyvumas pagal ADP, atsižvelgiant į PAI-1 kombinacijas

PAI-1 kombinacija N (proc.) ADP vidurkis Standartinis nuokrypis

4G/4G ir 4G/5G 36 (73,4) 74.92 16.84

5G/5G 13 (26,6) 73.08 16.13

Iš viso 49(100) 74.43 16.51

9 lentelė. Kraujo krešėjimo sistemos aktyvumas pagal ADR, priklausomai nuo PAI-1 kombinacijos

PAI-1 kombinacija N (proc.) ADR vidurkis Standartinis nuokrypis

4G/4G ir 4G/5G 36 (73,4) 80.14 21.18

32

5G/5G 13 (26,6) 70.46 28.12

Iš viso 49(100) 77.57 23.31

10 lentelė. Kraujo krešėjimo sistemos aktyvumas pagal TNS, atsižvelgiant į PAI-1 kombinacijas

PAI-1 alelis N (proc.) TNS vidurkis Standartinis nuokrypis

4G/4G ir 4G/5G 36 (73,4) 1.76 0.66

5G/5G 13 (26,6) 2.70 1.29

Iš viso 49(100) 2.01 0.95

Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas tarp šių genotipų : 4G vs 5G: p=0,0017

6.4 Tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo pasiskirstymas tarp vyrų ir moterų

Gauti rezultatai parodo,kad 4G/5G genotipo dažnis tarp lyčių reikšmingai nesiskyrė, χ2=0,574, p=

0,751 (11 lentelė). Gauti rezultatai parodo, kad 4G/5G alelių dažnis tarp lyčių reikšmingai nesiskyrė,

χ2=0,478, p= 0,489 (12 lentelė).

11 lentelė. Ligonių pasiskirstymas pagal lytį ir PAI-1 genotipą

PAI-1 genotipas

Iš viso 4G/4G 5G/5G 5G/5G

Lytis

Vyras 6 (54,5) 15 (60) 9 (69,2) 30

Moteris 5 (45,5) 10 (40) 4 (30,8) 19

Iš viso 11 (100) 25 (100) 13 (100) 49 (100)

33

12 lentelė. Ligonių pasiskirstymas pagal lytį ir PAI-1 kombinaciją

Kombinacijos Iš viso

4G/4G ir 4G/5G 5G/5G

Lytis

Vyras 21 (58,3) 9 (69,2) 30

Moteris 15 (41,7) 4 (30,8) 19

Iš viso 36 (100) 13 (100) 49

34

REZULTATŲ APTARIMAS

Nustatėme naują biožymenį, kuris daro reikšmingą įtaką kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui,

gydant ligonius antikoaguliantais ir antiagregantais po širdies vožtuvų operacijos. Šio tyrimo metu parodėme,

kad PAI-1 5G/5G genotipą turintiems TNS rodikliai buvo reikšmingai didesni, nei kitokį genotipą turintiems

ligoniams. Nustatyti PAI-1 genotipui, priešingai nei kiti autoriai, naudojome pažangesnį tikro laiko (TL)

PGR (tuo tarpu, dažniausiai kitų autorių naudotas metodas buvo – restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmo

PGR metodas). Sanger metodo sekoskaitą naudojome patvirtinti gautus rezultatus [33-34].

Klinikinėje praktikoje po širdies vožtuvų operacijų skiriami antikoaguliantai ir antiagregantai, kad

nuslopinti kraujo krešėjimo sistemos aktyvumą ir išvengti trombozių, kurios gali būti pavojingos gyvybei.

Neretai vartojami vaistai veikia ne taip, kaip to iš jų tikimąsi. Ne visuomet aiškūs veiksniai, kurie daro įtaką

kraujo krešėjimo sistemą veikiančių vaistų efektyvumui. Naujausių tyrimų duomenimis, didelę įtaką tinkamo

vaisto ir jo dozes parinkimui daro ligonio genai.

Klinikinėje praktikoje antikoaguliantų – varfarino efektyvumas vertinamas atsižvelgiant į tarptautinį

normalizuotą santykį (TNS, angl. INR). Priklausomai nuo operacijos pobūdžio, gretutinių ligų, TNS gali

įvairuoti nuo 2 iki 4, 5. Mūsų tirtų ligonių vidutinis TNS buvo: 2, 01±0, 95. Detaliau išnagrinėję mūsų

tiriamuosius, t.y. ištyrę jų PAI-1 genotipą, nustatėme, kad TNS statistiškai reikšmingai priklausė nuo PAI-1

genotipo. Atsižvelgiant į PAI-1 4G/5G genotipą, mūsų tirtų ligonių, po širdies vožtuvų operacijų, TNS buvo

aukštesnis bent TNS=1 tiems ligoniams, kurie turėjo 5G/5G variantą, nei turintiems bent vieną 4G alelį.

Turinčių 5G/5G variantą buvo ketvirtis visos tirtų ligonių imties. Tai sudaro reikšmingą populiacijos dalį.

Antiagregantų efektyvumas vertinamas atsižvelgiant į trombocitų agregacijos rodiklius. Trombocitų

funkcija vertinama atsižvelgiant į trombocitų agregaciją paveikus agregacijos induktoriais: ADF -

adenozindifosfatas, ADR – adrenalinas, ARA – arachidono rūgštis. ADR rodiklis nurodo bendrą trombocitų

agregaciją ir dalinį aspirino antiagregacinį poveikį, o ADF – klopidogrelio, tikagreloro, prasugrelio

antiagregacinį efektyvumą. ARA – tik aspirino antiagregacinį efektyvumą. Atsižvelgiant į PAI-1 4G/5G

genotipą, ADF, ADR ir ARA rodikliai mūsų tirtiems ligoniams nesiskyrė.

Lietuvoje jau anksčiau buvo atlikti tyrimai, kurių tikslas buvo nustatyti kaip nuo PAI-1 genotipo, o

tuo pačiu ir šio fermento aktyvumo priklauso vainikinių kraujagyslių okliuzijos laipsnis [39]. Nustatyta, kad

1,6 karto dažniau vainikinių arterijų okliuziją turėjo tie ligoniai, kurie turėjo PAI-1 4G/5G genotipą.

Kumar ir bendraautorių [39] atlikto tyrimo metu nustatytas PAI-1 4G/5G genotipo dažnis lietuvių

populiacijos ligonių, kurie patyrė miokardo infarktą imtyje. Tirtų lietuvių ligonių imties PAI-1 4G/5G

genotipo dažnis buvo panašus į kitų pasaulio šalių miokardo infarktu sergančių ligonių PAI-1 genotipo dažnį.

Palyginus šio tyrimo metu tirtų ligonių PAI-1 4G/5G genotipo dažnį, akivaizdu, kad 4G/4G ligonių, kuriems

atliktos širdies vožtuvų operacijos buvo mažiau, o 5G/5G turinčių ligonių buvo daugiau, nei miokardo

infarktu sergančių ligonių imtyje, kuri tirta Kumar ir bendraautorių [39].

35

Palyginus PAI-1 4G/5G genotipo dažnį kitose populiacijose, šiaurės Afrikoje 4G/4G turinčių asmenų

buvo daugiau (42 %) nei Lietuvoje (32 %) (13 lentelė). Tuo tarpu, 4G/5G turinčių ligonių dažnis buvo

panašus (47,4 % ir 49,5%). 5G/5G turinčių asmenų Lietuvoje buvo daugiau (14% vs 18%), bet pietų

Afrikoje 5G/5G variantas dažniau, nei Lietuvoje (34% vs 18%). Pietų Amerikoje 4G/4G alelį turinčių

asmenų buvo ženkliai mažiau nei Lietuvoje (13,3% vs 32,4%) (13 lentelė). 4G/5G turinčių ligonių buvo

netgi 2 kartus daugiau Lietuvoje, tačiau 5G/5G buvo dažnesnis Pietų Amerikoje (56,7% vs 18,1%).

Palyginus lietuvių populiacijos ligonius su azijiečiais, 4G/4G ir 4G/5G turinčių žmonių santykis buvo

panašus, tačiau 5G/5G Azijoje buvo dažnesnis netgi 1,7 karto, nei Lietuvoje.

13 Lentelė. PAI-1 4G-675 5G genotipo pasiskirstymo dažnis skirtingose populiacijose tarp sveikų žmonių ir

Lietuvoje tirtų asmenų.

Regionas N

(Iš viso)

4G/4G

N %

4G/5G

N %

5G/5G

N %

Šiaurės

Afrika

[35]

198

83 41,9 94 47,4 28 14,1

Pietų

Afrika[36]

300

65 21,6 132 44,0 103 34,3

Pietų

Amerika

[37]

127

17 13,3 38 29,9

72 56,7

Azija

[38]

344

97 28,2 142 41,2 105 30,5

Lietuva

[39]

376 122 32,4 186 49,5 68 18,1

Pietų

Europa

[40-41]

481

105 21,8 214 44,5 162 33,7

36

7. IŠVADOS

1. Tyrimų rezultatai parodė, kad PAI-1 genotipas nedarė reikšmingos įtakos trombocitų agregacijos rodikliams

paveikus ADP ir ADR. PAI-1 4G darė įtaką TNS rodikliams. Aukštesnius TNS rodiklius turėjo 5G/5G

ligoniai, nei 4G/5G ar 4G/4G turintys ligoniai.

2. Greta vartojamas aspirinas šio tyrimo metu nedarė reikšmingos įtakos kraujo krešėjimo sistemos aktyvumui.

3. Tirtas PAI-1 4G/5G genotipo dažnis vyrams ir moterims reikšmingai nesiskyrė.

37

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1.1Barker DJP. Fetal origins coronary heart dicease.Br Med J 1995; 311: 171-4.

1.3 Droppa M, Tschernow D, Karin A. L. Müller et al. Evaluation of Clinical Risk Factors to PredictHigh

On-Treatment Platelet Reactivity andOutcome in Patients with Stable CoronaryArtery Disease (PREDICT-

STABLE). PLoS ONE. 2015; 10(3): e0121620.

1.4. Wurtz M, Lordkipanidz M, Grove L. Pharmacogenomics in cardiovascular disease: focus on aspirin and

ADP receptor antagonists. J Thromb Haemost, 2013;11:1627 – 1639.

1. Y. Aso, “Plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 in vascular inflammation and thrombosis,” Frontiers in

Bioscience, vol. 12, no. 8, pp. 2957–2966, 2007

2. Pannenkoek, H.; Veerman, H.; Lambers, H.; Diergaarde, P.; Verweij, C. L.; van Zonneveld, A. J.; van

Mourik, J. A. Embo. J. 1986, 5, 2539-2544.

3. Michaels L. Aetiology of coronary artery disease: an historical approach. Br Heart J 1966; 28:258-64

4. Kruithof EKO. Plasminogen activator inhibitors — a review. Enzyme 1988; 40:113-21.

5. Gelehrter TD, Sznycer-Laszuk R. Thrombin induction of plasminogen activator-inhibitor in cultured human

endothelial cells. J Clin Invest 1986; 77:165-9.

6. . Gardell, S. J.; Krueger, J. A.; Antrilli, T. A.; Elokdah, H.; Mayer, S.; Orcutt, S.J.; Crandall, D. L.; Vlasuk,

G. P. Mol. Pharmacol. 2007, 72, 897-906.

7. Y. Aso, “Plasminogen activator inhibitor (PAI)-1 in vascular inflammation and thrombosis,” Frontiers in

Bioscience, vol. 12, no. 8, pp. 2957–2966, 2007

8. S. Hazra, V. Stepps, A. D. Bhatwadekar et al., “Enhancing the function of CD34+ cells by targeting

plasminogen activator inhibitor-1,” PLoS ONE, vol. 8, no. 11, Article ID e79067, 2013.

9. Wiman B, Ljungberg B, Chmielewska J, Urden G, Blomback M,Johnsson H. The role of the fibrinolytic

system in deep vein thrombosis.J Lab Clin Med 1985;105:265-70.

10. . Auwerx J, Bouillon R, Collen D, Geboers J. Tissue-type plasminogen activator antigen and plasminogen

activator inhibitor in diabetes mellitus. Arteriosclerosis 1988;8:68-72.

11. Margaglione M, Di Minno G, Grandone E, et al. Abnormally high circulation levels of tissue plasminogen

activator and plasminogen activator inhibitor-1 in patients with a history of ischemic stroke. Arterioscler

Thromb 1994;14:1741-5.

38

12. Hoylaerts M, Rijken DC, Lijnen HR, Collén D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue

plasminogen activator: role of fibrin. J Biol Chem 1982; 257:2912-9.

13. . Levi M, Biemond BJ, van Zonneveld A-J, ten Cate JW, Pannekoek H. Inhibition of plasminogen activator

inhibitor-1 activity results in promotion of endogenous thrombolysis and inhibition of thrombus extension in

models of experimental thrombosis. Circulation 1992; 85:305-12

14. Wagner OF, de Vries C, Hohmann C, Veerman H, Pannekoek H. Interaction between plasminogen activator

inhibitor type 1 (PAI-1) bound to fibrin and either tissue-type plasminogen activator (t-PA) or urokinase-type

plasminogen activator (u-PA): binding of t-PA/PAI-1 complexes to fibrin mediated by both the finger and the

kringle-2 domain of t-PA. J Clin Invest 1989;84:647-55.

15. Strandberg L, Lawrence D, Ny T. The organization of the humanplasminogen-activator-inhibitor-1 gene:

implications on the evolution of the serine-protease inhibitor family. Eur J Biochem 1988; 176:609-7.

Ranellou K, Paraskeva A, Kyriazopoulos P, Batistatou A, Evangelou A, El-Aly M, et al. Polymorphisms in

prothrombotic genes in young stroke patients in Greece: a case-controlled study. Blood coagulation &

fibrinolysis: an international journal in haemostasis and thrombosis. 2015;26(4):430-5.

16. Sirgo G, Morales P, Rello J. PAI-1 gene: pharmacogenetic association of 4G/4G genotype with bleeding

after cardiac surgery--pilot study. European journal of anaesthesiology. 2009;26(5):404-11.

17. Akhter MS, Biswas A, Ranjan R, Meena A, Yadav BK, Sharma A, et al. Plasminogen activator inhibitor-1

(PAI-1) gene 4G/5G promoter polymorphism is seen in higher frequency in the Indian patients with deep

vein thrombosis. Clinical and applied thrombosis/hemostasis: official journal of the International Academy of

Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 2010;16(2):184-8.

18. Kohler HP, Grant PJ. Plasminogen-activator inhibitor type 1 and coronary artery disease. The New England

journal of medicine. 2000;342(24):1792-801.

19. Dawson S, Hamsten A, Wiman B, Henney A, Humphries S. Genetic variation at the plasminogen activator

inhibitor-1 locus is associated with altered levels of plasma plasminogen activator inhibitor-1 activity.

Arteriosclerosis and thrombosis: a journal of vascular biology / American Heart Association.

1991;11(1):183-90.

20. Pannenkoek, H.; Veerman, H.; Lambers, H.; Diergaarde, P.; Verweij, C. L.; van Zonneveld, A. J.; van

Mourik, J. A. Embo. J. 1986, 5, 2539-2544.

21. . I. Mertens, A. Verrijken, J. J. Michiels, M. Van der Planken, J. B. Ruige, and L. F. Van Gaal, “Among

inflammation and coagulation markers, PAI-1 is a true component of the metabolic syndrome,” International

Journal of Obesity, vol. 30, no. 8, pp. 1308–1314, 2006.

22. Rūta Babarskienė, (2009). Išeminė širdies liga. Petras Zabiela, Širdies ligos (19;24), Kaunas: UAB

“Kardiologijos projektai”

39

23. Bhagavan N.V., Ha C.E. Essentials of medical biochemistry: with clinical cases. Amsterdam,

Boston et al.: Elsevier;2011. p. 275 – 279,282.

24. Weinberg, Robert A. (Robert Allan), 2013 "The biology of cancer". 2nd edition, Garland Science, Taylor &

Francis Group, LLC ISBN 978-0-8153-4219-9.

25. Dahm R. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early yearsof nucleic acid research. Human

Genetics. 2008; 122: 565–581. doi:10.1007/s00439-007-0433-0

26. Kryndushkin DS, Alexandrov IM, Ter-Avanesyan MD, Kushnirov VV. Yeast [PSI+] prion

aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. Journal of Biological

Chemistry. 2003; 278 (49): 49636–43. doi:10.1074/jbc.M307996200. PMID 14507919.

27. Thermo Fisher Scientific. Horizontal Systems Models B1A, B1, B2 and B3: Operating and Maintenance

Manual 7007309 Rev. 0. 2012; 2-1 – 4-1

28. Applied biosystems, life technologies. Real-time PCR handbook. 2014. p. 2 – 3.

29. http://www.thermofisher.com/lt/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/qpcr-vs-digital-pcr-

vs-traditional-pcr.html#2

30. LukasikM. and Owecki MK. Efficacy of Antiplatelet Treatment in Stroke Prevention:Past, Present, and

Future. Drug developmentresearch. 2013; 74: 428–439.

31. Becattini C., Agnelli G. Aspirin for prevention and treatment of venous thromboembolism. Blood

Reviews. 2014; 28: 103–108.

32. Berger JS, Lala A, Krantz MJ, Baker GS, Hiatt WR. Aspirin for the prevention of cardiovascular

eventsin patients without clinical cardiovascular disease: a meta-analysis of randomized trials. Am

Heart J. 2011; 162(1):115–24.e2. doi: 10.1016/j.ahj.2011.04.006 PMID: 21742097.

33. Morange P. E., Saut N., Alessi M. C., et al. Association of plasminogen activator inhibitor (PAI)-1

(SERPINE1) SNPs with myocardial infarction, plasma PAI-1, and metabolic parameters: the

HIFMECH study. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2007;27(10):2250–2257.

doi: 10.1161/atvbaha.107.149468.

34. Ahmed W., Malik M., Saeed I., et al. Role of tissue plasminogen activator and plasminogen

activator inhibitor polymorphism in myocardial infarction. Molecular Biology

Reports. 2011;38(4):2541–2548. doi: 10.1007/s11033-010-0392-8

40

35. Abboud N., Ghazouani L., Saidi S., et al. Association of PAI-1 4G/5G and -844G/A gene

polymorphisms and changes in PAI-1/Tissue plasminogen activator levels in myocardial infarction:

a case-control study. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 2010;14(1):23–27. doi:

10.1089/gtmb.2009.0039.

36. Pegoraro R. J., Ranjith N. Plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) and platelet glycoprotein

IIIa (PGIIIa) polymorphisms in young Asian Indians with acute myocardial

infarction. Cardiovascular Journal of South Africa. 2005;16(5):266–270.

37. Isordia-Salas I., Leaños-Miranda A., Sainz I. M., Reyes-Maldonado E., Borrayo-Sánchez G.

Association of the plasminogen activator inhibitor-1 gene 4G/5G polymorphism with ST elevation

acute myocardial infarction in young patients. Revista Espanola de Cardiologia. 2009;62(4):365–

372. doi: 10.1016/s0300-8932(09)70893-0

38. Ahmed W., Malik M., Saeed I., et al. Role of tissue plasminogen activator and plasminogen

activator inhibitor polymorphism in myocardial infarction. Molecular Biology Reports. 2011;

38(4):2541–2548. doi: 10.1007/s11033-010-0392-8

39. T.K.Parpugga, V.Tatarunas, V.Skipskis, N.Kupstyte. D.Zaliaduonyte-Peksiene and V.Lesauskaite.

The Effect of PAI-1 4G/5G Polymorphism and Clinical Factors on Coronary Artery Occlusion in

Myocardial Infarction. Dis Markers. 2015; 2015: 260101

40. Ardissino D., Mannucci P. M., Merlini P. A., et al. Prothrombotic genetic risk factors in young

survivors of myocardial infarction. Blood. 1999; 94(1):46–51.

41. Onalan O., Balta G., Oto A., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 4G4G genotype is associated

with myocardial infarction but not with stable coronary artery disease. Journal of Thrombosis and

Thrombolysis.2008; 26(3):211–217. doi: 10.1007/s11239-007-0083-z.

=

60