Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale ( ) · 1- UR de Génétique et...
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Resp. Olivier CORITONUMR 1349 IGEPP
INRA-Agrocampus ouest-Univ Rennes 1INRA Centre de Rennes INRA Centre de Rennes INRA Centre de Rennes INRA Centre de Rennes
[email protected]@[email protected]@rennes.inra.fr
Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire
Végétale ( )
Nantes, le 28 Mars 2013
Offre actuelle, Contour
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Cytogénétique Moléculaire ?
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Cytogénétique Moléculaire ?
L’outil principal est l’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur préparation chromosomique permet une
« Analyse fine de la structure des chromosomes »
«Biologie moléculaire» et «Cytogénétique traditionnelle»
née de la rencontre
FISH
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Les outils de cytogénétique moléculaire permettent de développer des projets scientifiques d’études des génomes pour :
• Caractérisation cytogénétique du matériel végétal impliquant des hybrides interspécifiques ou des espèces polyploïdes : identification des
chromosomes parentaux ou introgression,
• Evolution structurale des génomes chez des espèces polyploïdes,
• Caractérisation des translocations chromosomiques par liaison entre la cartographie génétique et physique,
• Cartographie physique fine sur chromosomes en méiose (stade pachytène)et sur fibres d’ADN permettant la caractérisation fine de l’ordre du kb autour de locus d’intérêt ou la détection d’un remaniement chromosomique
2 à 5 Mb
1 kb
FISH
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Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes
1- Préparation des lames
-> Pour Mitose : Pointe de racine
-> Pour Méiose : Anthère (Etamine)
Sélection des lames
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Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes mitoses Multi-espèces
4X2X
2X
4X
6X8X
2X
2X
2X
Niveau de Polyploïdie :
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Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) sur chromosomes en méiose
Leptotène Zygotène Pachytène Diplotène Diacinèse Métaphase I Anaphase I Anaphase I
Métaphase II Anaphase II Télophase II Tétrade
• Stade métaphase I• Stade pachytène (les chromosomes sontappariés sur toutes leurs longueurs) Résolution x15
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Prestations proposées par la plate-forme
• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes
• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétées (FISH)
6Sv5Sv5U1U
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Prestations proposées par la plate-forme
• Localisation physique de clones BAC sur chromosomes en mitose et en méiose (BAC-FISH)
• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'ADN peignées
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Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde
Le blé tendre, Allohexaploide
A-genome
B-genome
D-genome
?
2n=6X=42
0,5 MYA
10000 YA
Ae. speltoides
T. urartu
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chromosomes
« cible »
A-probe-biotine
B-genome
D-probe-digoxgénine
?
Mix sondes ADN Génomique
A-genome
B-genome
D-genome
?
Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide
Anti-dig-Fluorescéine
Avidin- Texas red
Détection
Hybridation
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Filtre DAPI Filtre Fluorescein Filtre Texas Red
Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploïde
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Translocation4A/7B
Translocation4A/7B
Exemple 1 : Technique GISH chez un polyploide
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4A/7B
4A/7B
Chr 1A ou 5A?
Chr 1A ou 5A?
Exemple 2 : Techniques FISH + GISH sur Blé dur,
tétraploide (AABB)
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Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide
B. rapa
AA, 2n=20B. oleracea
CC, 2n=18
B. napus
AACC, 2n=38
2000 YA
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B. rapa
AA, 2n=20
B. napus
AACC, 2n=38
Sonde spécifique du génome C
B. oleracea
CC, 2n=18
GISH - like
Exemple 3 : Technique GISH-like -> Le COLZA, Allotétraploide
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Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale
• Equipement / PersonnelEquipement / PersonnelEquipement / PersonnelEquipement / Personnel• Conditions d’accèsConditions d’accèsConditions d’accèsConditions d’accès• Cout des prestationsCout des prestationsCout des prestationsCout des prestations• LisibilitéLisibilitéLisibilitéLisibilité• FormationsFormationsFormationsFormations
• Démarche QualitéDémarche QualitéDémarche QualitéDémarche Qualité
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Plate-Forme de Cytogénétique Moléculaire Végétale
INRA- UMR 1349 Institut de Génétique, Environnement et Protection des Plantes
(IGEPP)- LE RHEU
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1- Équipements
• Laboratoire de Cytogénétique Moléculaire
• Microscopie
* Système d'imagerie
• Caméra refroidie (Photometrics Cool SNAP HQ)
• Logiciel d'acquisition METAVUE (UNIVERSAL IMAGING)
* Epifluorescence Axioplan 2 Zeiss
2- Personnel
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La plate-forme étant ouverte à 50% de sa capacité vers les équipes derecherche :
Site web : Un appel d’offre accompagné d’une plaquette de présentation
3- Accès
Pour la prise en charge des prestations en fonction des demandes,nous avons deux niveaux d’engagement :
• soit nous répondons à une prestation complète
• soit nous accueillons du personnel des unités demandeuses
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• Localisation sur les chromosomes de séquences d'ADN répétée (FISH)= 33 Euros/lame
• Hybridation génomique in situ (GISH) qui permet la différenciation des chromosomes parentaux chez des structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes = 38 Euros/lame
• Le BAC-Fiber-FISH qui permet l'analyse d'arrangements de séquences sur fibre d'ADN peignées (BAC Fiber-FISH) = 33 Euros/lame
• Localisation physique de clones BAC sur les chromosomes (BAC-FISH)sur chromosomes en mitose et en méiose (stade pachytène)
= 33 Euros/lame
4- Cout des prestations
-> 200 Euros pour 6 lames
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Depuis 2009« LABELLISATION DES OUTILS COLLECTIFS »
L'INRA a prévu de reconnaître 4 types d'outils collectifs en fonction de leurenvergure :
1- Plateformes Stratégiques INRA2- Plateformes INRA
3- Plateaux Techniques INRA4- Ateliers INRA
Le collège de direction a rendu son arbitrage identifiant notre outil comme Plateau Technique (PT) auprès de la CNOC :
Outil N°37 « Plate-Forme de cytogénétique moléculaire «
5- Lisibilité
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La plate-forme a également une mission de formation et d'information auprès des chercheurs, techniciens et stagiaires pour un transfert de technologie.
* Sur Bananier - Afin de caractériser des translocations, le BAC-FISH a étémis au point sur la plate-forme de cytogénétique de Montpellier (Resp. A. D’Hont).
-> L’accueil de M. Rodier nous a permis d’échanger et d'optimiser les techniques de marquage des clones BAC et de détection
* Sur Caféier diploïde (C. canephora), nous avons pu mettre au point et former V. Viader (CIRAD-IRD-Montpellier) à la technique de BAC-FISH
6- Formations
Exemples :
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7- Qualité
La PF s’est adossée à la démarche qualité mise en place par l’unité sous l’animation de deux groupes de travail « AQR » et « Métrologie » en lien avec un animateur qualité suivant le référentiel INRA (ISO 9001).
Les principales actions « qualité » mises en œuvre sur la PF ont été :
(1) Mise en place des cahiers de laboratoires,•(2) Rédaction de 30 Modes Opératoires,
(3) Document unique OPPI (Outil de Pilotage de la Prévention à l’INRA),
(4) Métrologie : Contrôle des températures (Frigo, Congélateur, Etuve) (OCEASOFT)Contrôle des balancesContrôle annuel des micropipettes METTLER TOLEDO
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FISH chez les plantes?
Exemples de projets développés au sein de l’unité
Equipe 1 - Biodiversité et Polyploïdie
Décrire et structurer la diversité génétique, l’exploitervia la recombinaison homologue et homéologue
(Resp. A-M Chèvre)
Plate forme de cytogénétiqueMoléculaire
50%
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(AABBDD,2n=6X=42) (AACC, 2n=4X=38)
Espèces diploïdes
Espèces allopolyploïdes
Stratégies :
Synthétiques
[1] Quels sont les mécanismes de spéciation et de régulation des recombinaisons homologues et homéologues :
Phase 1 : Suivi des modifications structurales qui interviennent dans les génomes lors de la stabilisation d’espèces allopolyploïdes
ANR Biodiversité
4X, 6X4X, 6X
1+1#2
10000 ans 2000 ans
?
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Quelles sont les différences entre un colza synthétique et un colza naturel ?
Coll Moulon, IJPB-Versailles, URGV-Evry, Univ Rennes1, Brno-Czech Republic
2- Modifications fonctionnelles dès l’hybridation. Le chocgénomique se traduit par des modifications au niveau desséquences ribosomiques liées à une régulationépigénétique.
B. Rapa (Navet)
AA, 2n=2X=20
B. Oleracea (choux)CC, 2n=2X=18
AACC, 2n=4X=38
B. Napus (colza)
S0
1- Modifications structurales : Le GISH-like a montré d’des irrégularités méiotiques avec des appariements entreles génomes A et C permettant la formation detranslocations dès la 1ere méiose -> Caractérisation desréarrangements a pu être validée par BAC-FISH.
Nicolas et al, 2008, 2009Leflon et al, 2010Szadkowski et al 2010, 2011Ksiazczyk et al, 2011Suay et al, 2013
C1
A1
C1
C1
C1
A1
C1
C1
x
ANR Biodiversité
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Quelles sont les différences entre un blé synthétique et un blé naturel ?
Mestiri et al 2010, 2013 Chagué et al, 2010 Chelaifa et al, 2013
×
AABB
2n = 4X= 28
DD (Aegilops tauschii)
2n = 2X= 14
AABBDD
2n = 6X= 42
1- Stabilité méiotique : le GISH n’a pas montré d’importantes irrégularités, défaut partiel d’appariement homologue conduisant
à la formation d’aneuploides,
2- Modifications structurales : aucun réarrangement ou élimination de séquence d’ADN n’a été observé chez les blés synthétiques au cours des trois premières générations,
3- Expression des gènes (transcrits) : additivité majoritairepas d’effet générationpas d’effet du génome Dpeu de différences avec blé tendre
Blé tendre
Coll URGV-Evry
Blé dur
x
ANR Biodiversité
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(AABBDD, 2n=42)
Mécanismes impliqués dans la stabilisation d’une espèce
polyploïde
(AACC, 2n=38)
* Résistance aux nématodes à partir de Aegilops variabilis
(Coriton et al, 2009)
* Recombinaison entre chromosomes homéologues de Blé :Caractérisation de lignées isohoméoalléliques pour les gluténines de hautpoids moléculaire (Dumur. J et al, 2009b, 2009b)
Optimisation d’introduction de gènes d’intérêt
Les connaissances acquises permettent
Evaluation de flux de gènes
Effet de la position des (trans)gènes sur le flux
1B 6B 5DAdded
chromosome
[2] les transferts de gènes entre espèces
1A /1D
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FISH chez les plantes?
Projets développés en collaborationavec des équipes extérieures
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La plate-forme est ouverte à 50% de sa capacité :
Collaboration à différents projets de recherche extérieurs
INRA- EvryMUSEUM- ParisINRA- Versailles
INRA, CNRSUniv- Rennes INRA- Colmar
INRA- Angers
INRA- Bordeaux
INRA- Clermont-Fd
INRACIRADIRD Montpellier
INRA- Toulouse
INRA- Lusignan
A. Mason, M. Nelson University of Queensland Brisbane – AUSTRALIA
G. King, C. Ryder– Univ Warwick - UK
A. Kovarik, Academy of Sciences, Brno – CZECH REPUBLIC
R. Freuda-Agyeman, H. Rahman - University of AlbertaCANADA
PFMCV
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PROJETS : Structures hybrides interspécifiques ou polyploïdes ?
1- UR de Génétique et d'amélioration des plantes fourragères - LUSIGNAN
Projet : Analyse de la dynamique de la diversité génétique au sein de peuplement
de Ray-grass introgressé par la Fétuque
2- UMR Diversité et génome des plantes cultivées – MONTPELLIER
Projet : Suivi de populations d’Aegilops au contact de blés cultivés et étude des
phénomènes d’introgression
3- UR 419 sur les Espèces fruitières et la Vigne, « Analyse des génomes de Fragaria » -BORDEAUX
Projet : Utilisation de la cartographie physique pour définir l’origine du génome des espèces polyploïdes au sein du genre Fragaria en particulier chez le fraisier cultivé F. x ananassa (Espèce octoploïde)
4 - UMR GenHort – INH ANGERSProjet : Hybridation somatique interspécifique chez
pélargonium - caractérisation cytogénétique et moléculaire
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5- UMR 1095 Amélioration et Santé des Plantes – CLERMONT-FERRAND
Projets : Elements transposables et Histoire évolutive de Triticum sp-
6- UR Génomique Végétale (URGV) - EVRY
Projets : Etude de l’activation des Éléments transposables chez le blé tendre
Projet 1: Evaluation de l’implication des rétrotransposons dans la variation de la taille des génomes chez des espèces de lupins écologiquement divergentes
7- UMR CNRS 6553 Ecobio « Evolution des Genomes et Speciation - RENNES
Projet 2 : Origine de la polyploïdie dans le complexe Hordeum murinum en Afrique du Nord : Diversité et évolution
PROJETS : Dynamique des génomes chez des espèces polyploïdes- Eléments Transposables
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PROJETS : Cartographie physique fine de locus sur chromosomes
8- UMR SVQV- Génétique et d'Amélioration de la Vigne - COLMAR
Projet : Localisation des contigs de séquences de l’assemblage du génome
10- UMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSE
Projet : Assignation de BAC par FISH en appui pour le séquençage du chromosome 7 de la Tomate
Projet : Etude des conséquences de la polyploïdie sur le fonctionnement et la croissance cellulaire au cours du développement du fruit
9- UMR619 Biologie du Fruit - BORDEAUX
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Exemple de projet de Cartographie Physique
UMR990 INRA/INP-ENSAT Génomique et Biotechnologies des Fruits - TOULOUSE
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Chromosome 7 project
Genomic and Biotechnology of Fruit
UMR990 INRA/INP-Toulouse FranceFarid Regad, Mondher Bouzayen (Project leader)
chr
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Genome Structure
• Diploid specie
• 12 chromosomes pairs
• Genome size 950MB
• Repeat sequence 30%
• Sequencing of gene-rich euchromatic region - 220MB
• Estimated number of BACs to be sequenced: 277
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FISH mapping status
FISH :Plate-Forme RennesS. Stack (Colorado, USA) Z. Cheng (Pékin, Chine)
050 BACs clones will be or not on
the chromosome 7
4 situations
0
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(1)
BAC LE_ HBa 0104E22 + 309B15
(2)
BAC LE_ HBa 0006H17 + 309B15 BAC LE_ HBa 0224G23 + 309B15
(3)
BAC LE_ HBa 0027G01 + 309B15
(4)
BAC LE_ HBa 0173A21+ 309B15 BAC LE_ HBa 0116J06
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FISH mapping status
• BACs are in the process on the chromosome
0
High-resolution FISH strategies on pachytene chromosomes
K7
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92110K7 subtelomeric site on the long arm of
chromosome 7.pBeloBAC
11LE_HBa0309B15
?pBeloBAC
11LE_HBa0195N01
63,5110pBeloBAC
11LE_HBa0046G04
56118pBeloBAC
11LE_HBa0102J11
104129pBeloBAC
11LE_HBa0309F18
??pBeloBAC
11LE_HBa0018L21
85,5?
pBeloBAC
11
LE_HBa0048M11
??pIndigoBA
C-5SL_EcoRI0127B09
position cM
insert size (kb) DetailsplasmidBAC name
Infos:
15 BACs
Renferme la séquence centromérique TGR4 LE_HBa0057J04
LE_HBa0024K03
LE_HBa0006H17
LE_HBa0030C22
LE_HBa0028P04
LE_HBa0224G23
LE_HBa0140O20
pBeloBAC
11
34 52
121 ?pBeloBAC
11
pBeloBAC
11
pBeloBAC
11
pBeloBAC
11
pBeloBAC
11
147 54
114 22,5
137 72
? ?
?
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Mitose
-> La résolution des chromosomes en mitose n’est pas suffisante (impossible de visualiser le pool de BAC)
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Méiose
Steve stack (US)
Hans deHong (NL)
K7
K7
BAC 309B15
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Steve stack (US)
Hans deHong (NL)
K7MéioseK7
BAC 309B15
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MERCI DE VOTRE ATTENTION
Plate-forme de Cytogénétique Moléculaire
Végétale ( )
http://www.biogenouest.org/contenu/plates-formes/bio-imagerie/cytogenetique