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KISEP Rhinology Korean J Otolaryngol 2000;;;;45::::957-62

호흡기 상피세포에서 PKC-MEK/ERK 활성화를 통한

IL-1β에 의한 Cyclooxygenase-2 발현

영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실,1 생화학분자생물학교실2

김용대1·송시연1·백석환2·조길성1·우현재1·윤석근1

IL-1ββββ-Mediated Cyclooxygenase-2 Expression through Activation of PKC-MEK / ERK in Human Airway Epithelial Cells

Yong-Dae Kim, MD1, Si Youn Song, MD1, Suk-Hwan Baek, PhD2, Gil Sung Cho, MD1, Hyun Jae Woo, MD1 and Seok-Keun Yoon, MD1 1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery and 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, Yeungnam University, Daegu, Korea ABSTRACT

Background and Objectives：Cyclooxygenase-2 (COX-2) plays an important role in the biosynthesis of prostaglandin, which is an important inflammatory mediator in human airway inflammatory disease. We observed that interleukin-1β (IL-1β) induces COX-2 gene expression and protein production in NCI-H292 cells in the previous experiment and designed this study to investigate the signal transduction pathway of the IL-1β-mediated COX-2 expression in human airway epithelial cells. Materials and Method：In the cultured human airway NCI-H292 epithelial cells, the IL-1β-mediated COX-2 gene and protein expression were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot. To identify the signal transduction pathway of the IL-1β-mediated COX-2 expression, we used specific inhibitors. Results：PD98059, MEK/ERK inhibitor sup-pressed IL-1β-mediated COX-2 gene and protein expression, but SB203580, p38 inhibitor did not suppress it. Ro31-8220, PKC inhibitor attenuated IL-1β-mediated COX-2 gene and protein expression. Ro31-8220 suppressed ERK phosphorylation, but did not inhibit phosphorylation of p38 and JNK. PKC were involved at upstream of ERK in the IL-1β-mediated COX-2 expression. PI3K inhibitor, LY294002 and tyrosine kinase inhibitor, genistein did not suppress COX-2 expression. Conclusion：IL-1β-in-duced COX-2 gene and protein expression is up-regulated through activation of PKC-MEK/ERK cascade in human airway NCI-H292 epithelial cells. ((((Korean J Otolaryngol 2002;45:957-62)))) KEY WORDS：Interleukin-1β·Cyclooxygenase-2·Protein Kinase C·MEK/ERK.system.

서 론

염증반응에 관여하는 prostaglandin의 생합성과정은 여

러 가지 사이토카인이나 염증성 매개 물질이 관여하는 아주

복잡한 과정으로 이 중 cyclooxygenase(COX)가 중요한

역할을 담당한다.1) COX는 두 가지 형태가 존재하며 COX-

1은 대부분의 세포에서 발현되어 세포의 항상성 유지에 관

여하고,2) COX-2는 특정세포에서 염증성 전구사이토카인3)

이나 lipopolysaccharide,2)4) 성장인자5) 등에 의해서 발현

이 증가되어 염증반응을 진행시키는데 중요한 역할을 하는

효소이다.

사람의 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현은 염증성 전

구사이토카인에 의해서 이루어지며1) 이러한 COX-2의 발

현과정에는 여러 단계의 신호전달(signal transduction) 물

질이 관여할 것으로 생각된다. 한편, 염증반응에서 COX-2

발현에 관여하는 신호전달체계를 이해하는 것은 사람의 호

흡기 염증반응을 조절하는데 필수적이라고 생각된다.

최근 연구에 의하면 Kim 등6)은 NCI-H292 호흡기 상

피세포에서 IL-1β에 의해 COX-2 유전자 및 단백이 발현

되며 이는 전사단계에서 조절된다고 보고하였다. 한편 Lin

등7) 은 인체 호흡기 상피세포에서 IL-1β가 COX-2의 발

현을 자극하는 과정에서 protein kinase C-γ(PKC-γ)의

논문접수일：2002년 5월 29일 / 심사완료일：2002년 7월 16일 교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1

영남대학교 의과대학 이비인후과학교실

전화：(053) 620-3784·전송：(053) 628-7884

E-mail：ydkim@med.yu.ac.kr

PKC-MEK/ERK를 통한 IL-1β에 의한 Cox-2 발현

Korean J Otolaryngol 2002;45:957-62 958

관련여부를 연구하였고, Chen 등1) 은 인체 폐상피세포에서

TNF-α에 의한 COX-2의 발현에서 phospholipase C-

γ2, protein kinase C-α, tyrosine kinase 등의 관련여부

를 연구하였다. 하지만 인체 기도 상피세포에서 IL-1β가

COX-2 유전자의 발현과 단백생성을 촉진하는 과정에 있어

서 mitogen-activated protein kinase(MAPK)와 PKC가

관여하는지 여부와 두 신호전달물질간의 상호관계는 명확하

지 않다.

이에 저자들은 사람의 호흡기 상피세포에서 IL-1β에 의

한 COX-2 발현 과정에 PKC, MAPKs, tyrosine kinase,

phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K) 등과 같은 신호전달

물질이 관여하는지 여부와 각 물질간의 상호작용에 대하여

알아보고자 하였다.

대상 및 방법

세포배양 및 처치

사람의 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포(human pul-monary mucoepidermoid carcinoma cell line, American

Type Culture Collection, Rockville, MD)를 6개의 실험판

에 1×106 /ml의 세포 수로 RPMI 1640 배양액(10% fetal

calf serum, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/

ml를 추가)이 들어있는 배지에 분주하여 37℃, 5% CO2에

서 배양하였다. 배양이 어느 정도 이루어지면, 세포를 24시

간 동안 0.5% fetal calf serum을 포함하는 RPMI 1640 배

지에서 배양하고 phosphate buffered saline(PBS)으로 세

척한 후 human recombinant IL-1β(R & D Systems,

Minneapolis, MN)를 20 ng/ml의 농도로 투여하고 37℃에

서 8시간 동안 배양하여 COX-2 유전자와 단백의 발현정도

를 분석하였다.

IL-1β에 의한 COX-2의 발현에 어떠한 신호전달체계가

관여하는지를 알아보기 위하여 mitogen-activated protein

kinase kinase(MEK)/extracellular regulated kinase(ERK)

억제제인 PD98095(Biomol Research Labora-tories,

Inc., Plymouth Meeting, PA), p38 억제제인 SB203580

(Biomol Research Laboratories), protein kinase C(PKC)

억제제인 Ro31-8220(Biomol Research Laboratories),

tyrosine kinase 억제제인 genistein(Bio-mol Research La-boratories), PI3K 억제제인 LY294002(Biomol Resea-rch Laboratories) 등을 IL-1β를 투여하기 1시간 전에 각

각 전처치하고, 8시간 동안 IL-1β를 처리한 세포와 처리하

지 않은 세포에서 COX-2 유전자와 단백의 발현여부를 검

토하였다.

모든 실험과정은 같은 결과가 5회 이상 나오도록 반복하

였다.RT-PCR에 의한 COX-2 유전자의 분석

총 mRNA의 추출은 배양한 NCI-H292 세포에서 Tri-

Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를

이용하였다. COX-2 유전자의 측정은 변형된 reverse tran-scriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR) 방법을

이용하였다.8) 총 mRNA는 무작위 hexanucleotide primer

와 Moloney murine leukemia virus(MMLV) 역전사효소

(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 이용하여 cDNA로 합

성하였다. PCR과정은 94℃에서 12분간 전 처리하고 dena-turation은 95℃에서 1분, annealing은 54℃에서 1분, ex-tension은 72℃에서 1분간 22번을 반복 실시하였으며 마지

막으로 72℃에서 20분간 반응하였다. PCR의 산물은 1%

Tris-boric acid-EDTA(TBE) 완충용매와 2% agarose

gel에서 전기영동을 이용하였다.

COX-2 유전자의 primer의 염기서열은

5’：TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA AT,

3’：AGA TCA TCT CTG CCT GAG TAT CTT이다.

Western blot에 의한 단백 측정

COX-2 단백과 MAPKs 및 인산화되어 활성화된 MAPK

의 측정에 Western blot 방법을 사용하였다.

NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl <pH

7.5>, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM phenylme-thylsulfonyl fluoride)로 단백질을 추출하여 정량을 하였다.

정량한 단백을 10% SDS-polyacrylamide gel에 80 μg을

주입하여 2시간 동안 20 mA에서 전기영동을 하였다. 분리

된 단백을 300 mA로 3시간 동안 방치하여 니트로셀룰로오

스막에 이동시킨 후, 5% non-fat milk로 비특이적 단백 결

합을 방지하였다. 일차항체인 COX-2 polyclonal antibody

(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI) 및 ERK,

p38, c-Jun NH2 terminal kinase(JNK), phospho-ERK

(New England BioLabs, Beverly, MA), phospho-p38

(New England BioLabs), phospho-JNK(New England

BioLabs) 항체를 각각 1：2,000으로 희석하여 4시간 동안

반응시킨 후, 이차항체인 goat anti-rabbit IgG-horsera-dish peroxidase conjugate(Bio-rad Laboratories, Her-cules, CA)를 1：2,000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰

다. 세 번 세척 후 enhanced chemiluminescence(Amers-ham Pharmacia Biotech, Inc., Burkingham Shire, England)

시약으로 X-ray 필름에 감광시켜 COX-2 단백을 확인하

였다.

김용대 외

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결 과

IL-1β에 의한 COX-2 단백의 발현

NCI-H292 세포를 IL-1β가 0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml의

농도로 포함된 배지에서 37℃로 8시간 동안 배양하였다.

IL-1β의 처리농도가 증가함에 따라 COX-2 단백질의 발

현양이 증가하였다. COX-2 단백은 IL-1β의 농도가 0.02

ng/ml부터 증가하기 시작하여 20 ng/ml일 때 최고치에 도

달하였다(Fig. 1). 양성 대조군으로 heat shock protein

(HSP) 70을 사용하였으며 IL-1β의 농도에 관계없이 일정

하였다. 이상의 결과는 저자들의 이전 연구와 일치하였다.6)

IL-1β에 의한 MAPK의 활성화

IL-1β가 MAPK를 활성화시키는지의 여부를 알기 위해

IL-1β (20 ng/ml)를 투여한 후 MAPK인 ERK, p38, JNK

의 인산화 정도를 시간경과에 따라 측정하였다. ERK, p38,

JNK 모두 IL-1β 투여 후 인산화된 형태의 양이 증가하였

고 20분에서 30분 사이에서 최대치를 나타내었다. 따라서

NCI-H292 세포에서 IL-1β는 ERK, p38, JNK를 활성

화시킨다는 사실을 알 수 있었다. 양성 대조군으로 ERK2를

이용하였다(Fig. 2).

MAPK인 ERK, p38에 의한 COX-2 유전자 및 단백 조절

IL-1β가 COX-2의 발현을 촉진하는 과정에 ERK가

관련되어 있는지의 여부를 알기 위해서 MEK/ERK 억제제

인 PD98059(50 μM)를 전처치하고 IL-1β(20 ng/ml)를

처리한 후 ERK의 인산화 정도와 COX-2 유전자 및 단백을

관찰하였다. PD98059를 전처치한 세포에서는 ERK의 인산

화가 억제되었고(Fig. 3A), COX-2 유전자와 단백의 발현도

감소하였다(Fig. 3B).

IL-1β에 의한 COX-2 발현에 p38이 관계하고 있는지

를 알기 위하여 p38 억제제인 SB203580(10 μM)를 전

Fig. 1. Expression of COX-2 protein according to concentr-ation of IL-1β treatment. NCI-H292 cells were treated with0.02, 0.2, 2, 20 ng/ml of IL-1β for 8 hour. Analysis of produ-ction of COX-2 protein was done by Western blot. HSP 70was used as an internal positive control. COX-2 protein val-ues are representative of five independent experiments.

Fig. 2. Phosphorylation of three MAPKs (pERK, pp38, pJNK)according to time of IL-1β treatment. NCI-H292 cells weretreated with 20 ng/ml of IL-1β for 5, 10, 20, 30, 60 minutes.Analysis of phosphorylation of each protein was done byWestern blot. ERK2 was used as an internal positive control.The MAPKs phosphorylation levels are representative of fiveindependent experiments.

Fig. 4. Effects of p38 inhibitor, SB203580, on the expression ofIL-1β-mediated p38 phosphorylation (pp38) (A), COX-2 geneexpression and protein production (B). Analysis of p38 phos-phorylation and protein production were done by Westernblot, and COX-2 gene by RT-PCR. ERK2, HSP70 and β2 M wereused as internal positive controls. The data are representativeof five independent experiments.

Fig. 3. Effects of MEK inhibitor, PD98059, on the expression ofIL-1β-mediated ERK phosphorylation (pERK) (A), COX-2 geneexpression and protein production (B). Analysis of ERK phos-phorylation was done by Western blot, COX-2 gene by RT-PCR,and protein production by Western blot. ERK2, HSP70 and β2 M were used as positive internal controls. The data are re-presentative of five independent experiments.

AAAA

BBBB

AAAA

BBBB

PKC-MEK/ERK를 통한 IL-1β에 의한 Cox-2 발현

Korean J Otolaryngol 2002;45:957-62 960

처치하고 IL-1β(20 ng/ml)를 처리한 후 p38의 인산화

정도와 COX-2 유전자와 단백의 발현여부를 관찰하였다.

SB203580을 전처치한 경우 p38의 인산화는 억제되었으나

(Fig. 4A) COX-2 유전자와 단백의 발현은 억제하지 못하

였다(Fig. 4B).

PKC에 의한 COX-2 유전자 및 단백 조절

IL-1β에 의한 COX-2 발현과정에 PKC가 관련되어 있

는지를 검토하기 위해서 PKC 억제제인 Ro31-8220(20

μM)을 전처치하고 IL-1β를 처리한 후 MAPK들의 인산

화 정도와 COX-2 유전자 및 단백의 정도를 알아보았다.

Ro31-8220을 전처치한 세포에서는 COX-2 유전자와 단백

의 발현이 억제되었다(Fig. 5B). 또한 Ro31-8220은 MAPK

중 ERK의 인산화만을 억제하였고, p38과 JNK의 인산화는

억제하지 못하였다(Fig. 5A).

Tyrosine kinase와 PI3K에 의한 COX-2 유전자 및 단백

조절

IL-1β가 COX-2 발현을 자극하는 과정에 tyrosine

kinase가 관계하고 있는지를 알아보기 위해서 tyrosine ki-nase 억제제인 genistein(100 μg/ml)을 전처치하고 IL-

1β를 처리한 후 COX-2 유전자와 단백의 발현여부를 관찰

하였다. Genistein을 전처치한 세포와 전처치하지 않은 세

포사이에 COX-2 유전자와 단백의 발현정도의 차이는 없었

다(Fig. 6).

또한 IL-1β에 의한 COX-2 발현에 PI3K의 관련여부를

검토하기 위해서 PI3K 억제제인 LY294002(25 μM)를

전처치하고 IL-1β를 처리한 후에 COX-2 유전자와 단백

이 발현되는 양상을 관찰하였다. LY294002는 COX-2 유

전자와 단백의 발현을 억제하지 못하였다(Fig. 7).

고 찰

사람의 호흡기 염증반응에서 중요한 prostaglandin의 생

합성에서는 COX-2의 발현이 중요한 역할을 한다.9)10) 그

러므로 COX-2의 발현에 이르는 신호전달체계에 관여하는

단백을 규명하는 것은 사람의 호흡기 염증반응의 발생을 억

제하고 진행을 조절하는데 중요하다. 그래서 많은 연구자들

이 사람의 호흡기 상피세포에서 COX-2의 발현과 prostag-landin 생성 조절에 연구초점을 맞추고 있다.

저자들은 이미 이전의 실험에서 IL-1β가 전사단계를 조

AAAA

BBBB

Fig. 5. Effects of PKC inhibitor, Ro31-8220 on the expression ofIL-1β-mediated MAPK phosphorylations (pERK, pp38, pJNK)(A), COX-2 gene expression and protein production (B). An-alysis of ERK, p38, JNK phosphorylation and protein expressionwere done by Western blot, and MUC2 gene by RT-PCR. ERK2,HSP70 and β2 M were used as internal positive controls. Thedata are representative of five independent experiments.

Fig. 6. Effects of tyrosine kinase inhibitor, genistein on the ex-pression of IL-1β-mediated COX-2 gene expression (A) andprotein production (B). Analysis of COX-2 gene was done byRT-PCR, and protein by Western blot. HSP70 and β2 M wereused as internal positive controls. The data are representa-tive of five independent experiments.

AAAA

BBBB

AAAA

BBBB

Fig. 7. Effects of PI3K inhibitor, LY294002 on the expression ofIL-1β-mediated COX-2 gene expression (A) and protein pro-duction (B). Analysis of COX-2 gene was done by RT-PCR,and protein by Western blot. HSP70 and β2 M were used asinternal positive controls. The data are representative of fiveindependent experiments.

김용대 외

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절하여 COX-2 유전자와 단백을 조절한다고 보고하였다.6)

따라서, 본 연구는 IL-1β에 의한 COX-2의 발현에 관계

하는 신호전달체계를 규명하고자 일반적인 신호전달체계에

관여하는 것으로 알려진 대표적인 몇 가지 조절인자의 억제

제를 사용하여 COX-2 유전자 및 단백의 발현정도를 관찰

하였다. 비교적 상위 조절 인자로 생각되는 PKC, tyrosine

kinase, PI3K 뿐만 아니라 MAPK(ERK, p38)의 관련여부

를 알아보았다.

IL-1β와 MAPK의 관계에 대한 지금까지 연구결과를 보

면 인간의 기도 평활근에서 IL-1β투여 후 MAPK인 ERK,

p38, JNK의 인산화가 증가된다고 하였고,11) 그 외 인체의

여러 세포에서 IL-1β가 ERK, p38, JNK의 신호전달체계

를 거쳐 세포 내에 작용한다고 하였다.12-14) 하지만 호흡기

상피세포에서 COX-2의 발현과정에 관여하는 여러 가지 신

호전달물질에 대한 정확한 연구결과는 부족한 실정이며, 특

히 PKC와 MAPK와의 상호 작용에 대한 연구는 부족한 실

정이다.

본 연구에서 MAPK중에서 MEK/ERK 억제제인 PD98059

를 전처치한 경우에서는 COX-2 유전자 및 단백의 발현이

억제되었으나. p38 억제제인 SB203580를 전처치한 경우

에서는 COX-2 유전자 및 단백의 발현에 영향이 없음을 알

수 있었다. 이는 MAPK 중에서 ERK는 COX-2의 발현에 관

여하나 p38은 관여하지 않음을 나타낸다. 하지만 Newton

등15) 은 A549 세포주를 이용한 실험에서 ERK 억제제인

PD98059와 p38 억제제인 SB203580이 PGE 2의 분비는

억제하지만 IL-1β에 의한 COX-2의 발현에는 영향을 미

치지 않았다고 하여 IL-1β에 의한 COX-2 산물인 PGE

2의 분비조절은 COX-2가 직접 관여한다기 보다는 COX-

2의 윗단계(upstream)에서 조절된다고 하였다. 이에 반해

본 연구에서는 MAPK 중 ERK 억제제만이 IL-1β에 의한

COX-2 유전자 및 단백의 발현을 억제하여, ERK가 IL-1

β에 의한 COX-2 발현에 관여하는 것을 알 수 있었다.

Lin 등7)은 A549 세포주를 사용한 실험에서 PKC 억제제

인 Go6976(3∼20 μM)과 Ro31-8220(3∼20 μM)을 사

용한 경우 IL-1β에 의한 COX-2 단백의 발현이 억제된다

고 하였다. NCI-H292 세포주에서 TNF-α가 COX-2 단

백의 발현을 촉진한다고 보고한 Chen 등1)은 PKC 억제제인

staurosporine(30 or 100 nM)을 사용한 경우에서 TNF-

α에 의한 COX-2 단백의 발현이 억제되었다고 하였다. 이

번 실험에서는 PKC 억제제인 Ro31-8220을 전처치하고

IL-1β를 처리하였을 경우, IL-1β에 의한 COX-2 유전자

및 단백의 발현이 억제되었다. 이는 COX-2의 발현에 PKC

가 신호전달체계로 관여하고 있음을 나타낸다. 또한 이때

ERK의 인산화가 억제된 것으로 보아 PKC가 ERK보다 상

위 단계에서 COX-2의 발현에 관여한다는 사실도 알 수

있었다. 한편 Ro31-8220은 PKC를 억제하는 효과 이외에

도 mitogen- and stress-activated protein kinase-1

(MSK1)를 비롯한 다양한 protein kinase를 억제한다고 알

려져 있으므로,16) Ro31-8220에 의한 COX-2 억제작용이

반드시 PKC를 억제하는 것에만 의하지 않고 다른 protein

kinase를 억제함으로써 나타날 가능성도 배제할 수 없을 것

이다.

본 실험에서 tyrosine kinase 억제제인 genistein은 COX-

2 유전자 및 단백의 발현에 영향을 미치지 않았다. 그러나 이

러한 결과는 A549 세포주에서 tyrosine kinase 억제제인

genistein과 tyrphostin AG126을 사용한 경우 IL-1β에 의

한 COX-2 단백의 발현이 억제된다.7)11)17)는 것과는 상반되

는 양상이었다. 이러한 상반되는 결과는 아마도 세포주의 차이

이거나 처리한 억제제의 농도차이나 혹은 자극제로 사용된

사이토카인의 차이일 가능성이 있다.

대부분 PKC보다는 상위에 존재하여 세포의 성장과 분화

에 관여하는 것으로 잘 알려져 있는18)19) PI3K의 억제제인

LY294002를 전처치한 경우에서도 IL-1β에 의한 COX-2

유전자 및 단백의 발현에 영향을 미치지 않았다.

이상의 결과로 볼 때 배양 호흡기 상피세포인 NCI-H292

세포에서 IL-1β에 의한 COX-2 유전자와 단백의 발현에

는 PKC와 ERK가 신호전달체계에 관여하며, PKC가 ERK

의 상위 단계에서 조절에 관여한다. 그러나 IL-1β에 의한

COX-2의 발현과정에서 신호전달체계에 관여하는 단백들

의 특이적 억제제를 사용했을 때 COX-2 유전자 및 단백의

발현이 완전하게 억제되지는 못하였다. Phosphatidylcho-line-specific phospholipase C(PC-PLC)의 경우, Lin 등7)

은 A549 세포주를 사용한 실험에서 PC-PLC 억제제인 D609

를 사용한 경우 IL-1β에 의한 COX-2 단백의 발현이 억제

된다고 하였으나, NCI-H292 세포주에서 TNF-α에 의한

COX-2 단백의 발현과정에 대한 연구에서는 D609에 의해

COX-2 단백의 발현이 억제되지 않았다.1) 또 Pype 등20)

은 인간 호흡기 평활근세포에서 IL-1β의 COX-2 유도작용

에 p38과 nuclear factor(NF)-κB의 활성이 필요하다고

하였다. 그러므로 앞에서 언급된 신호전달체계 이외에 PL-

PLC, NF-κB 등과 같은 다른 신호전달물질도 IL-1β에

의한 COX-2 발현에 관여할 가능성이 많으므로 이에 대한

추가적인 연구도 필요할 것이다. IL-1β에 의한 COX-2 유

전자와 단백의 합성에는 여러 단계의 조절 단백이 참여하고

있으며 이러한 단백들은 특이적 억제제에 의해서 어느 정도

조절될 수 있으므로 이를 기반으로 사람의 호흡기 염증을 치

PKC-MEK/ERK를 통한 IL-1β에 의한 Cox-2 발현

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유하는 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.

결 론

사람의 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 IL-1β

에 의한 COX-2 유전자와 단백의 발현은 PKC-MEK/ERK

신호전달체계에 의해 조절됨을 알 수 있었다.

중심 단어：Interleukin-1β·Cyclooxygenase-2·Pro-tein kinase C·MEK/ERK.

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