Pirogênio - University of São Paulo

Pirogênio

Disciplina de Controle de Qualidade de Produtos Farmacêuticos e de Cosméticos

Ribeirão Preto - 2020

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Profa. Dra. Márcia E. S. Ferreira

Bloco S – Sala 13 – Térreo – Ramal: 150265

[email protected]

Devido à grande importância dos pirogênios em produtos estéreis, vamos falar um pouco sobre o que é e como impedir a presença dessas substâncias em produtos estéreis.

PIROGÊNIO

exógeno

Lipopolissacarídeo

(endotoxina) bactérias,

fungos, vírus, componentes

de bactérias Gram (-) e (+),

alguns fármacos, esteróides,

frações do plasma

endógeno

resposta a pirogênio

exógeno

produzido pelo

hospedeiro

Mediador primário da febre



Pirogênio é uma substância que, quando administrada em um ser vivo, induz ao aumento da temperatura corporal. Os pirogênios são divididos em pirogênios endógenos e exógenos.

O pirogênio endógeno é aquele produzido pelo hospedeiro em resposta ao estímulo por pirogênios exógenos. Ele é considerado o mediador primário da febre e é produzido por diferentes células do hospedeiro.

Os pirogênios exógenos são aqueles que se originam fora do corpo e induzem elevações térmicas quando injetados em animais ou no homem. Como fonte de pirogênio exógeno menciona-se grande variedade de origens desde bacteriana, fungos, vírus bem como alguns fármacos, esteroides e frações do plasma. Embora o lipopolissacarídeo (endotoxina) seja o mais significativo, existem outros produtos, de constituição química diversa, que também produzem elevação da temperatura corporal quando injetados, sob condições apropriadas.

ENDOTOXINA / LIPOPOLISSACARÍDEO

Alto peso molecular

Membrana externa da parede celular de bactérias Gram (-)

Purificadas – lipopolissacarídeos (LPS)

Termoestáveis

Inativação - ciclos extensos de calor seco, condições alcalinas ou ácidas

Atividade biológica de amplo espectro - porção lipídica



Endotoxina é uma toxina que é parte integrante da parede celular de algumas bactérias e só é libertada após a destruição da parede celular dessa bactéria. Nas Gram-negativas (G-) é o LPS e nas Gram-positivas (G+), menos frequente, é o peptideoglicano.

A molécula de LPS é composta por uma cadeia lateral de polissacarídeo (Antígeno O), e ligada à região do core, um oligossacarídeo (2-ceto-3-ácido deoxioctônico); este por sua vez está ligado a uma molécula lipídica (Lipídeo A). O antígeno “O“ varia entre as espécies de bactérias G-, tanto em composição como em comprimento, enquanto as regiões do core e do lipídeo A são mais conservadas entre as diferentes espécies de bactérias G-. A atividade biológica, de amplo espectro, está associada à porção lipídica da molécula (Lipídeo A), principal componente ativo e tóxico da molécula.

As endotoxinas são complexos de alto peso molecular associados à membrana externa da parede celular de bactérias G- e se constituem na mais significante fonte de pirogênio para a indústria farmacêutica. Quando purificadas são chamadas de lipopolissacarídeos, para enfatizar sua natureza química.

Embora termoestáveis, as endotoxinas são inativadas por ciclos extensos de calor seco, além de serem inativadas por condições alcalinas ou ácidas.

Níveis de endotoxinas - Limites aceitáveis (FDA)

• Água estéril para irrigação - 0,25 UE/mL

• Água para injeção - 0,25 UE/mL

• Administração intratecal - 0,2 UE/mL

• Solução salina - 0,5 UE/mL

• Solução glicose injetável 5% - 0,5 UE/mL

• Água para hemodiálise - 1 UE/mL



Nesse slide podemos encontrar alguns limites aceitáveis para endotoxinas, de acordo com o FDA. Cinco unidades de endotoxina (UE) equivale a 1 ng.

• Água estéril para irrigação - 0,25 UE/mL

• Água para injeção - 0,25 UE/mL

• Administração intratecal - 0,2 UE/mL

• Solução salina - 0,5 UE/mL

• Solução glicose injetável 5% - 0,5 UE/mL

• Água para hemodiálise - 1 UE/mL

PROCESSOS DE DESPIROGENIZAÇÃO

INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS

. Hidrólise ácido-base

. Oxidação

. Alquilação

. Calor seco

. Radiação ionizante REMOÇÃO DAS ENDOTOXINAS

. Lavagem

. Destilação

. Ultrafiltração

. Osmose reversa

. Carvão ativo

. Atração eletrostática



Os processos de despirogenização podem se dar por inativação das endotoxinas ou pela remoção das mesmas.

A inativação pode ser obtida pela detoxificação da molécula de LPS usando tratamentos químicos que quebrem pontes lábeis ou bloqueiem sítios necessários para a atividade pirogênica, ou seja, resultam na desativação do Lipídeo A. Como alternativa, a molécula pode ser destruída usando-se altas temperaturas. A inativação pode ocorrer por:

. Hidrólise ácido-base

. Oxidação

. Alquilação

. Calor seco

. Radiação ionizante A utilização de cobalto 60 aumenta a possibilidade de alterações químicas desconhecidas

em fármacos e soluções parenterais e, por isto, não tem sido considerado. Nesse caso, os riscos de toxicidade decorrente do processo superam as propriedades benéficas.

Por outro lado, a remoção das endotoxinas está baseada nas características físicas da endotoxina, como tamanho, peso molecular, carga eletrostática ou afinidade da endotoxina a diferentes superfícies. A remoção pode ocorrer por:

. Lavagem

. Destilação

. Ultrafiltração

. Osmose reversa

. Carvão ativo

. Atração eletrostática

DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS

HIDRÓLISE ÁCIDA

Separa o lipídeo A do restante da molécula do LPS

Altera a conformação (lipídeo A) em sítios funcionais essenciais

HCl 0,05 N por 30 min a 100 ºC

Ácido acético 1,0% por 2-3 horas a 100 ºC

OXIDAÇÃO

H2O2 – oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPS

Inativação dependente do tempo, pH e concentração

Outros: O2 molecular, ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido

periódico, permanganato de potássio diluído, ácido nítrico



Como dito anteriormente, a inativação das endotoxinas pode ocorrer pela hidrólise ácida. Este método reduz ou elimina a atividade biológica de lipopolissacarídeos pela desativação do lipídeo A. A hidrólise separa o lipídeo A do restante da molécula do LPS e este, isolado e insolúvel no sistema aquoso, tem sua atividade reduzida ou eliminada. Por outro lado, a hidrólise ácida pode agir sobre a fração lipídeo A, alterando sua conformação em sítios funcionais essenciais ou clivando ácidos graxos, afetando a solubilidade e pirogenicidade do lipídeo. A hidrólise ácida empregando ácido clorídrico 0,05N, por 30 minutos, a 100°C ou ácido acético 1%, por 2 a 3 horas, a 100°C tem sido empregada para a despirogenização de materiais.

Para a inativação através da oxidação pode-se utilizar peróxido de hidrogênio. Embora o mecanismo de ação do H2O2 sobre o LPS seja desconhecido, é possível que decorra da oxidação dos ácidos graxos presentes no lipídeo A do LPS. A inativação depende do tempo, pH e concentração de H2O2. O H2O2 apresenta como vantagens a segurança no manuseio, pode ser facilmente eliminado da solução e age em condições não extremas (5%). Porém, pode atuar como agente oxidante e ser responsável pela degradação de componentes existentes nos produtos. Pode ser usado para a despirogenização de componentes plásticos empregados na fabricação de correlatos ou eliminação de pirogênio na água estéril para injeção. Outros oxidantes podem ser utilizados (Ex. O2 molecular, ácido hipocloroso ou hipoclorito, ácido periódico, permanganato de potássio diluído, ácido nítrico), porém com maiores limitações de compatibilidade.

DESPIROGENIZAÇÃO POR INATIVAÇÃO DAS ENDOTOXINAS

ALQUILAÇÃO

Anidrido acético e succínico - redução de 100 a 1000 vezes

Óxido de etileno - redução significativa de endotoxinas

CALOR SECO

Materiais termo resistentes: frascos de vidro e instrumentos metálicos

250 ºC por 30 min – mecanismo incineração

O aumento do tempo de exposição a temperaturas menos elevadas

(175 ºC) não reduz LPS



A alquilação é outro método que pode ser utilizado para reduzir a atividade pirogênica. Estudos realizados com anidrido acético e anidrido succínico resultaram na redução de 100 a 1000 vezes da atividade. O óxido de etileno é um forte agente alquilante, havendo indícios de redução significativa de endotoxinas, além de poder ser utilizado para a esterilização de materiais hospitalares.

A despirogenização por calor seco tem sido o método de escolha para materiais termorresistentes como frascos de vidro e instrumentos metálicos. A exposição a não menos que 250°C, por não menos que 30min, é capaz de inativar a endotoxina pelo mecanismo de incineração. O aumento do tempo de exposição a temperaturas menos elevadas não reduz endotoxina; portanto, condições usuais de autoclavação não são efetivas na destruição de endotoxinas. Entretanto, a autoclavação pode potencializar a ação despirogenizante, seja da ação oxidante do peróxido de hidrogênio, como da remoção pela adsorção em carvão ativo.

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS

LAVAGEM

Lavagem com solvente apirogênico – água estéril para injeção

DESTILAÇÃO

Mudança de estado físico

Moléculas de LPS são grandes e de elevado peso molecular

Água recém destilada é estéril e apirogênica

ULTRAFILTRAÇÃO

Exclusão por peso molecular

Forma monomérica – 10.000 a 20.000 daltons

Vesículas – 300.000 a 1.000.000 daltons

Aplicação: antibióticos



Além dos métodos utilizados para a inativação das endotoxinas, existem os métodos capazes de remover as endotoxinas.

A lavagem é o método mais simples. Nesse método, faz-se a lavagem do material a ser despirogenizado com solvente apirogênico. Usualmente utiliza-se água estéril para injeção. Níveis baixos de endotoxina podem ser efetivamente removidos da vidraria, tampas e dispositivos, com procedimentos adequados de lavagem. A remoção de endotoxina pela lavagem pode ser monitorada pelo teste LAL (lisado de amebócitos de Limulus).

A destilação é o método mais antigo que remove efetivamente o pirogênio da água, com mecanismo relativamente simples. A destilação envolve a mudança de estado físico de líquido para vapor e de vapor para líquido. Como as moléculas de LPS são grandes e de elevado peso molecular, elas permanecem na fase líquida. Sendo assim, a água recém destilada é estéril e apirogênica. Foi a aplicação deste conhecimento que permitiu iniciar a produção comercial de parenterais de grande volume nos EUA, nos anos precedendo à Segunda Guerra mundial.

A ultrafiltração tem seu mecanismo fundamentado nos limites de exclusão de peso molecular. Sendo assim, as endotoxinas que excedem a um valor limite de peso molecular, são retidas na superfície da membrana. A forma monomérica da endotoxina possui cerca de 10.000 a 20.000 daltons, podendo ser efetivamente removida por um ultrafiltro molecular de 10.000 daltons. Porém as formas monoméricas são raramente encontradas em soluções aquosas, pois, normalmente, as moléculas de LPS se agregam formando vesículas com peso de 300.000 a 1.000.000 daltons. Para efeito prático, a remoção de endotoxina em soluções aquosas pode ser dar pela utilização de ultra-filtros com capacidade de reter moléculas de 100.000 daltons ou maiores. A ultrafiltração tem sido aplicada, com sucesso, a uma ampla faixa de fármacos e soluções de baixo a médio peso molecular (ex. antibióticos).

DESPIROGENIZAÇÃO POR REMOÇÃO DE ENDOTOXINAS

OSMOSE REVERSA

Membrana de acetato de celulose ou poliamida

Remoção de endotoxinas por exclusão (porosidade 10 Aº)

CARVÃO ATIVO

- adsorção ao carvão ativo

- liberação de traços de carvão

ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA

pH < 2,0 – endotoxina carga negativa

Membranas com poliamidas ou aminas covalentemente

ligadas – carga positiva (pH < 9)



A osmose reversa pode ser utilizada para a remoção de endotoxinas quando se utiliza membranas, constituídas de acetato de celulose ou poliamida, com poros pequenos o suficiente para a exclusão de íons (poros de cerca de 10 A° de diâmetro, ou seja, com cerca de

1 m). É um dos dois únicos métodos, reconhecidos pela USP, para a produção de água estéril para injeção, ao lado da destilação.

O carvão ativo também pode ser utilizado para a remoção de endotoxinas, cujo mecanismo de ação é a adsorção. O carvão é adicionado à solução, agitado e removido por filtração ou sedimentação. Entretanto, pode ocorrer adsorção de ingredientes ativos e liberação de traços de carvão, necessitando na sua remoção, posteriormente.

A remoção da endotoxina também pode ocorrer pelo mecanismo de atração eletrostática. Em pH<2 a endotoxina se encontra com carga negativa, podendo ser removida pela utilização de membranas carregadas positivamente. Membranas com poliamidas ou aminas covalentemente ligadas possuem carga positiva em solução aquosa, em pH<9. Produtos microporosos, comercialmente disponíveis, são empregados com sucesso na despirogenização de ampla faixa de soluções farmacêuticas.

OBTENÇÃO DE PRODUTOS APIROGÊNICOS

Processo produtivo em condições adequadas de higiene

(operadores e ambiente)

Matéria-prima com baixa carga microbiana

Processos validados

Pessoal qualificado e treinado

Boas práticas de fabricação

Monitorização do processo (métodos analíticos validados –

in vivo e in vitro)



Após conhecer os métodos despirogenizantes, ficam evidentes as limitações quanto à aplicação no produto acabado, devido a incompatibilidades de distintas naturezas, riscos envolvidos ou mesmo aspectos econômicos. Com exceção da obtenção da água apirogênica, assim como a aplicação de calor seco em condições drásticas a materiais termoestáveis (material de acondicionamento), os demais são extremamente específicos.

Portanto, deve permanecer muito fortemente sedimentada a importância em trabalhar todo o processo produtivo de produtos estéreis em condições adequadas de higiene (operadores e ambiente), utilizar matéria-prima com baixa carga microbiana, utilizar somente processos validados e pessoal qualificado e treinado, ou seja, obedecer às boas práticas de fabricação, de modo que o produto seja obtido apirogênico no primeiro processamento, dispensando preocupações quanto a reprocessos ou tratamentos adicionais.

A monitorização do processo, quanto à presença de endotoxinas, pode ser realizada por métodos in vivo (empregando coelhos) ou in vitro (empregando a técnica LAL) validados; bem como os testes das matéria-primas ou do produto terminado.

TESTE DE ENDOTOXINA - MÉTODO IN VITRO

1885 – sangue Limulus polyphemus formava um coágulo

em gel sólido

Amebócitos- única célula circulante encontrada no sangue

Posteriormente – bactérias marinhas Gram (-) provocavam

extensiva coagulação intravascular e morte destes animais

Derivado termoestável das bactérias

1964 – Levin e Bang: (1) amebócitos eram necessários para

a reação, (2) quantidades de endotoxina eram inativadas na

reação



Limulus polyphemus (Linnaeus, 1758), comumente conhecido como "caranguejos" em forma de ferradura, foram originalmente classificados como caranguejo erroneamente. Eles são, na verdade, um parente distante dos crustáceos, e são mais estreitamente relacionados aos aracnídeos, como aranhas, escorpiões e carrapatos.

Em 1885 foi verificado que o sangue de Limulus polyphemus formava um coágulo em gel sólido quando removido do animal. Vários aspectos da coagulação foram estudados, com particular referência aos amebócitos, as únicas células circulantes encontradas no sangue desse animal. Posteriormente foi verificado que bactérias marinhas G- provocavam extensiva coagulação intravascular e morte destes animais e que um derivado termoestável das bactérias era responsável por essa coagulação.

Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos que permitiram às seguintes conclusões: (1) os amebócitos eram necessários para a reação e sua lise acelerava a reação, (2) quantidades de endotoxina eram inativadas na reação.

MECANISMO DA REAÇÃO

Young e cols., 1972:

(1) reação é dependente da ativação de uma enzima de alto

peso molecular pela endotoxina (dependente de Ca++ e

outros íons bivalentes)

(2) geleifica proteínas coaguláveis de baixo peso molecular



Em 1972, Young e colaboradores concluíram que a reação é dependente da ativação de uma enzima de alto peso molecular pela endotoxina, além de cálcio e outros íons bivalentes; e que ocorria a geleificação de proteínas de baixo peso molecular.

O mais simples e amplamente utilizado dos procedimentos para detecção de endotoxinas baseia-se na geleificação. O teste é realizado misturando-se volumes iguais de reagente LAL e da solução a ser testada (0,1 mL de cada) em tubos de vidro despirogenizados. A mistura é suavemente homogeneizada e a seguir incubada em banho de água, a 37°C, por uma hora. Durante esse período, os tubos não devem ser manuseados a fim de não interferir na geleificação. O ponto final da reação é facilmente constatado pela remoção cuidadosa e individual dos tubos e sua inversão a 180 graus. Se houver a presença de gel que se mantém sólido durante a inversão, o teste é considerado positivo para endotoxinas. A sensibilidade do método varia entre 0,25 e 0,015 UE/mL.

Preparo do lisado do amebócito de Limulus (LAL)

Sangria do animal

Lavagem do amebócito

Liberação do conteúdo intracelular do amebócito

Liofilizado (estável a 4oC por 3 anos)

LAL introduzido na USP XX e 4a. Edição Farmacopéia Brasileira 1996



O teste in vitro, com a utilização do reagente LAL no método para avaliar a presença de endotoxina, foi introduzido na 20ª edição da USP e na 4ª edição da farmacopeia Brasileira (1996).

O reagente LAL (lisado do amebócito de Limulus) é obtido através da sangria do animal que, após o procedimento, podem ser devolvidos à água. É introduzida uma agulha estéril e apirogênica através do músculo entre as regiões céfalo-torácica e abdominal do animal. A hemolinfa flui para um recipiente com anticoagulante e estabilizador osmótico (cloreto de sódio), que estabiliza a membrana frágil do amebócito. A seguir, é submetido à centrifugação, por 10min, e o sobrenadante é desprezado. É feita a lavagem dos amebócitos com cloreto de sódio (3%) para remoção do anticoagulante e componentes do soro. A seguir, ocorre a liberação do conteúdo intracelular do amebócito pela adição de água destilada apirogênica, que promove o choque osmótico e lise da célula. O material é, então, liofilizado e armazenado, a 4°C, por até 3 anos.

MÉTODOS ANALÍTICOS

Ponto final de geleificação (LAL + solução teste incuba

a 37 ºC por 1 hora observa formação do gel (inverte o

tubo a 180º)

Ensaio limite

Sensibilidade: 0,25 a 0,015 EU/mL

Ensaio turbidimétrico (0,005 EU/mL)

Método colorimétrico de Lowry

Método nefelométrico

Método cromogênico



Além do método convencional para a detecção de endotoxinas, que é feito observando-se a formação do gel com vista desarmada, existem variações que permitem aumentar a sensibilidade do método.

O ensaio turbidimétrico é um método baseado no fato de que qualquer aumento na concentração de endotoxinas causa um aumento proporcional na turbidez, devido à coagulação das proteínas coaguláveis. A leitura é realizada em um espectrofotômetro e permite melhor medida quantitativa da endotoxina, em grande faixa de concentrações.

O método colorimétrico de Lowry é um teste quantitativo, que é baseado na observação de que concentrações crescentes de endotoxina irão precipitar proporcionalmente as proteínas do reagente LAL, coagulando proteínas que serão quantificadas pelo método de Lowry para proteínas.

O método nefelométrico emprega um nefelômetro a laser, planejado para quantificar concentrações de proteínas coaguladas. Este método emprega luz relativa dispersa. Assim como o método colorimétrico de proteína de Lowry, não tem sido aceito como promissor.

O método cromogênico é um método quantitativo que apresenta vantagem quanto à especificidade da enzima de coagulação ativada (ação amidase específica para resíduos glicina-arginina carboxiterminais). Nesse caso, a substância cromogênica + amostra irá resultar na liberação de p-nitroanilina, proporcional às concentrações de endotoxina (cromóforo lido em 405nm). Embora seja um método extremamente acurado em ampla faixa de concentrações de endotoxina, a velocidade de reação proíbe que se conduzam testes com grande número de amostras, sem introduzir significante variação entre as primeiras e últimas amostras.

VALIDAÇÃO DO MÉTODO

- Sensibilidade do LAL

- Efeito de substâncias presentes na amostra

APLICAÇÃO (LAL)

Utilizado em produtos parenterais, água para injeção e em

fluidos biológicos

Método extremamente sensível, específico, preciso e exato,

simples e rápido.



O método LAL é utilizado para detectar a presença de endotoxinas em produtos parenterais, água para injeção e em fluidos biológicos. É um método extremamente sensível, específico, preciso e exato, simples e rápido.

Validações do teste LAL, objetivando liberação de produto terminado quanto ao limite de endotoxinas, envolvendo medicamentos, correlatos e biológicos, abrangem a comprovação da sensibilidade do LAL e a determinação de efeitos inibidores ou exacerbantes provocados pelas substâncias integrantes da amostra. O ensaio LAL é baseado na reação de coagulação induzida pela endotoxina. Sendo assim, não surpreende encontrar produtos que provoquem a inibição ou que potencializem a reação. Assim, a inibição ou potencialização devem ser determinadas para cada formulação, antes que seja empregada a metodologia para liberação final do produto. A determinação consiste em contaminar, propositalmente, a concentração mais usada do medicamento com o padrão de endotoxina e realizar o ensaio.

Deve ser lembrado que o teste em coelhos avalia a presença de endotoxina e outras substâncias que são capazes de promover reação febril (pirogênios) enquanto o ensaio LAL mede exclusivamente a concentração de endotoxinas.

TESTE DE PIROGÊNIO - MÉTODO IN VIVO

- Ensaio limite

- Aprovar ou rejeitar uma amostra

☻ Cada grupo de animais (3 coelhos) recebe injeção

intravenosa da amostra e é observado durante um período de

3 horas



- Grande volume e líquidos extratores: 10 mL/Kg

- Velocidade da injeção: 4 a 6 mL/min (não ultrapassar 4 min)

- Temperatura da amostra: 37 a 38 ºC

Produtos incompatíveis com essa técnica: Fármacos que

atuam sobre o sistema termorregulatório

O teste de pirogênio em coelhos, apesar de delegado apenas a situações às quais não é aplicável a metodologia alternativa, deve ser mantido. Vantagem: envolve toda a reação fisiológica do animal, constituindo-se não somente em teste de pureza para substâncias pirogênicas, mas também em teste de segurança para os produtos injetáveis, líquidos para infusão e perfusão, materiais cirúrgicos e descartáveis em geral.

Estudos científicos demonstraram que a dose pirogênica mínima de endotoxina purificada foi comparável em coelhos adultos e humanos, sugerindo que o sistema termorregulatório desse animal possui as mesmas características do ser humano. Embora se admita equivalência para dose-limite na reação pirogênica de coelhos e do homem, quando sob doses consistentemente mais altas a relação dose-resposta observada no ser humano é mais intensa, podendo ser até 10 vezes maior.

Pode-se dizer que o método in vivo persiste como um teste limite, sem constituir determinação quantitativa, com a chance de aprovar ou rejeitar uma amostra mediante informações obtidas de um grupo de coelhos e que devem atender a um padrão de estado febril.

No teste, cada grupo de animais (geralmente inicia-se com 3 coelhos/grupo) recebe injeção intravenosa (na veia marginal da orelha) da amostra a ser testada e o grupo é observado, quanto à variação da temperatura corporal, durante um período de 3 horas.

Neste teste é possível testar grandes volumes de amostra (10 mL/kg do animal), o que aumenta a representatividade da amostra. Podem ser testados parenterais de grande volumes e líquidos extratores utilizados para a lavagem de correlatos. A velocidade de injeção deve ser de 4 a 6 mL por minuto e não deve ultrapassar a 4 minutos. A temperatura da amostra deverá estar em torno de 37 a 38°C.

USP LV

Se algum dos três animais apresentar elevação térmica > ou igual

0,5 oC - reteste

RETESTE

+ 5 animais – não mais que 3 animais devem acusar elevação térmica

crítica > ou igual a 0,5 oC

Valor da somatória (8 animais) não deve exceder a 3,3 oC

INTERPRETAÇÃO



Se algum animal apresentar elevação da temperatura corporal maior ou igual a 0,5°C, deve-se proceder ao reteste. No reteste deverão ser utilizados outros 5 animais. De todos os oito animais utilizados, no máximo 3 poderão ter elevação da temperatura corporal acima de 0,5°C e a somatória da elevação da temperatura corporal de todos os oito animais não poderá exceder a 3,3°C para que a amostra seja considerada apirogênica.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

- Pinto, T.J.A.; Kaneko, T.M.; Pinto, A.F. Controle biológico de qualidade de

produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. 3ª Ed. Ateneu Editora,

São Paulo, 2010.

- Farmacopéia Brasileira, 6ª Ed., ANVISA, 2019.

- United States Pharmacopoeia. 40th Ed. Rockville: United States

Pharmacopoeia Convention, 2017.

- www.anvisa.gov.br

- LEVIN, J.; BANG, F.B. A description of cellular coagulation in the

Limulus. Bull Johns Hopkins Hosp., v.115, p.337-45, 1964.

- YOUNG, N.S.; LEVIN, J.; PRENDERGAST, R.A. An invertebrate

coagulation system activated by endotoxin: evidence for enzymatic

mediation. J Clin Invest., v.51, p.1790-7, 1972.



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